先天性甲状腺功能减退症大鼠模型的构建方法

摘要

本发明公开了一种先天性甲状腺功能减退症大鼠模型的构建方法，属于医学实验动物实验方法；旨在提供一种利用物理手段培育患先天性甲状腺功能减退症的大鼠，从而为该病症致病机制、诊断、治疗以及预防的研究提供一种新的途径和可能。其方法是选用成年雌性SD大鼠连续5周进行束缚、力竭、夹尾等复合刺激处理，然后与正常雄性SD大鼠合笼，繁殖下一代；繁殖的仔鼠即为先天性甲状腺功能减退症大鼠。本发明方法具有较好的稳定性和可重复性，是一种利用物理手段复制先天性甲状腺功能减退症动物模型的方法。

说明书

技术领域

本发明涉及一种医学评价、检测方法，尤其涉及一种医学实验动物实验方法。

背景技术：先天性甲状腺功能减退症是一种最常见的新生儿代谢疾病(congenital hypothyroidism,CH)，国外报道新生儿发病率为1/3000～1/4000，我国的发病率约为1/2000，主要表现为体格生长和神经精神发育障碍。早期诊断和治疗可防止神经、精神损伤的发生或发展，否则将导致严重的智力受损和代谢异常。

甲状腺是人体最大的内分泌腺体，主要作用是合成甲状腺激素。甲状腺滤泡是甲状腺的基本结构和功能单位，由外周的单层滤泡上皮细胞和被围在中央的滤泡腔组成。滤泡腔内充满胶体，其主要成分是甲状腺球蛋白，它参与甲状腺激素的合成。人体中的甲状腺激素包括三碘甲状腺原氨酸(T₃)和四碘甲状腺原氨酸(T₄)，其中T₃是它的主要活性形式，而T₄则是T₃的前体和(或)储备形式。甲状腺激素具有全面促进组织细胞分化、生长及发育成熟的作用，是机体正常生长、发育必不可缺少的因素。Gull早在1874年就认识到先天甲状腺功能低下与智力迟钝、身材矮小为特征的克汀病的关系。甲状腺功能减退患儿常表现青春期滞后。甲状腺激素是胎儿、新生儿脑发育的关键激素，尤其是对脑和骨骼的正常发育。在胚胎时期，T₃和T₄能诱导神经生长因子和某些酶的合成，能促进神经元骨架的发育，促进神经元增值分化、突起和突触的形成，促进胶质细胞的生长和髓鞘的形成。甲状腺激素可刺激骨化中心的发育和成熟，使软骨骨化，促进长骨和牙齿生长。在儿童的生长发育过程中，甲状腺激素和生长激素(GH)具有协同作用。甲状腺激素缺乏时可影响GH的正常作用，导致长骨生长缓慢和骨骺愈合延迟。此外，T₃和糖皮质激素可增强GH的基因转录，使GH的生成增加，所以缺乏T₃的动物GH和胰岛素样生长因子(IGF)的分泌均减少。人类胎儿在11周前甲状腺不具备浓集碘和合成甲状腺激素的能力，胎儿生长发育所需要的甲状腺激素必须由母体提供。啮齿类动物从胚胎期第14d至出生后4w需要足量的甲状腺激素，如果这一时期甲状腺激素功能低下或者分泌不足，就会影响胎儿大脑皮层、海马、小脑等正常的发育，会对脑的学习记忆能力造成影响。

建立在病理生理机制上更接近于人类的动物模型是研究人类疾病形成和发展过程的基础。目前，复制先天性甲状腺功能减退症动物模型的方法，除了手术切除甲状腺、破坏甲状腺组织而外，还有化学药物诱导和饲喂低碘饮食限制碘摄入等方法。如：雌鼠在交配前3个月和孕期给予低浓度丙基硫氧嘧啶可诱导暂时性低甲状腺素血症动物模型，发现其仔代学习记忆功能低下；将孕鼠从妊娠第1d至仔鼠出生第30d饮用含甲硫咪唑的自来水诱导甲状腺功能低下仔鼠，发现仔鼠学习记忆能力明显减退，说明甲状腺激素对脑的发育极其重要。然而，手术切除甲状腺、破坏甲状腺组织，以及化学药物诱导虽然能够诱发甲状腺功能减退症，但这是一种特例；这种非自然因素所致甲状腺功能减退症在临床实践中并不常见。低碘摄入虽然是导致甲状腺功能减退症的一种常见因素，但只是部分致病因素，不能完整客观的反映该病症的致病原因。目前，通过物理方法培育先天性甲状腺功能减退症大鼠的相关文献未见报道。

发明内容：针对现有技术中存在的上述缺陷，本发明旨在提供一种先天性甲状腺功能减退症大鼠模型的构建方法，它能够通过物理方法培育出患有先天性甲状腺功能减退症的大鼠，从而为该病症致病机制、诊断、治疗以及预防的研究提供一种新的途径和可能。

为了实现上述目的，本发明采用的技术方案具体步骤如下：

（1）选用体重220～240g的成年SD大鼠进行适应性饲养；

（2）7d后每天对雌性SD大鼠进行复合刺激处理，连续5周；所述复合刺激处理包括：

a、束缚刺激，前3d每天用束缚笼对雌性SD大鼠进行适应性束缚30min，以后每天束缚180min；

b、力竭刺激，将雌性SD大鼠放入水温20±2℃的水池中游泳，前3d每天适应性游泳30min，以后每天游泳100min或至力竭；

c、夹尾刺激，每天用卵圆钳钳夹雌性SD大鼠尾部1min，钳夹力度以雌鼠不适、挣扎、发出哀叫为度；

（3）将经过上述复合刺激处理的雌性SD大鼠按2:1比例与雄性SD大鼠合笼，繁殖下一代；繁殖的仔鼠即为先天性甲状腺功能减退症大鼠。

在上述技术方案的基础上，还可以在步骤（2）中增加低温刺激，从而有利于同时满足血清甲状腺激素水平、生长发育特征和行为学指标要求的个体出现：将雌性SD大鼠放入4±2℃的水池中游泳，前3d每天游泳5min，以后每天游泳30min或至力竭。

同理，在上述技术方案的基础上，还可以在步骤（2）中增加在饥饿刺激：每隔4～5天随机对雌性SD大鼠禁食24h。

与现有技术比较，本发明由于采用了上述技术方案，完全采用纯物理手段培育出患有先天性甲状腺功能减退症的大鼠，从而为该病症致病机制、诊断、治疗以及预防的研究提供一种新的途径和可能。实验证明，本发明方法具有较好的稳定性和可重复性。以下是将本发明方法培育的仔鼠与正常饲养方法培育的仔鼠所作的一组对比实验：

（1）选择体重为220～260g、3月龄的雌性SD大鼠44只、雄性SD大鼠22只，适应性饲养7d后将雌性SD大鼠随机分为正常组（n=22）和模型组（n=22）；

（2）对雄性SD大鼠和正常组雌性SD大鼠正常饲养、不给予任何刺激，按本发明方法对模型组雌性SD大鼠实施束缚刺激、力竭刺激和夹尾刺激；

（3）将正常组的雌性SD大鼠22只与雄性SD大鼠11只合笼、将模型组的雌性SD大鼠22只与另外11只雄性SD大鼠合笼，合笼后查阴栓，查到阴栓为妊娠第0d，单笼饲养，合笼5d后仍未见阴栓的雌鼠也转入单笼饲养；

（4）孕鼠自然分娩后分别记录正常组及模型组每窝仔鼠数量，于第1、7、14、21、28天称取每只仔鼠体重，测量每只仔鼠身长和尾长，测量数据见表1；

（5）仔鼠出生21天后断奶，第30天随机选取正常组和模型组各12窝，每窝随机选取1只仔鼠进行旷场实验和Morris水迷宫实验，测量数据见表2；

（6）水迷宫实验结束后第2d，从正常组和模型组仔鼠中各随机选取的12只仔鼠处死，按酶联免疫吸附测定法测定血清TRH、TSH、T₃、T₄激素水平，测量数据见表3。

  

                                   表1：仔鼠0-4周生长发育情况

从上述数据可以看出：模型组仔鼠0～4周体重、身长、尾长低于正常组，均有极显著性差异（P＜0.01）。旷场实验显示，模型组仔鼠爬行格数较少，与正常组相比具有统计学差异（P＜0.05）；模型组仔鼠学习记忆力下降，定位航行试验与正常组相比具有显著性差异（P＜0.05），空间搜索试验与正常组相比具有显著性差异（P＜0.05）。模型组仔鼠血清TRH、TSH含量与正常组相比无显著性差异（P＞0.05）；T₃含量明显降低，与正常组相比有极显著性差异（P＜0.01）；T₄水平较正常组低，有显著性差异（P＜0.05）。

实验研究表明：模型组仔鼠在旷场实验中爬行格数、直立次数较正常组减少，其活动度降低，对新环境的探究能力降低；Morris水迷宫实验定位航行时间较正常组相比明显延长，空间搜索次数较正常组明显减少，其学习记忆能力降低；仔鼠出生时以及1～4周体重、身长和尾长均值较正常组低，具有极显著性差异（P＜0.01）；仔鼠TRH、TSH血清含量较正常组相比较高，但无显著性差异（P＞0.05），血清T₃水平降低，与正常组相比具有极显著性差异（P＜0.01），血清T₄含量降低，与正常组相比具有显著性差异（P＜0.05）。另外，在第21d断奶离窝后，模型组有18只仔鼠死亡，而正常组死亡数为0，可能与神经发育受限有关。而仔鼠本身的甲状腺轴功能紊乱是其生长发育迟缓，学习记忆力减退的重要原因。

具体实施方式：下面结合具体的实施例对本发明作进一步说明：

实施例1

1、选择体重为220～260g、3月龄的雌性SD大鼠44只、雄性SD大鼠22只，适应性饲养7d后将雌性SD大鼠随机分为正常组（n=22）和模型组（n=22）；

2、对雄性SD大鼠和正常组雌性SD大鼠正常饲养、不给予任何刺激，对模型组雌性SD大鼠实施以下复合刺激处理，连续5周：

（1）束缚刺激，前3d用束缚笼对雌性SD大鼠进行适应性束缚，每天束缚30min，以后每天束缚180min；所述束缚笼是长度约20cm的圆锥形结构，该圆锥形的大头直径约8cm，设有可关闭的笼盖；小头直径约4cm，呈封闭状；

（2）力竭刺激，将雌性SD大鼠放入水温20±2℃的水池中游泳，前3d为适应性游泳，每天游泳30min，以后每天游泳100min或至力竭；

（3）夹尾刺激，每天用卵圆钳钳夹雌性SD大鼠尾部1min，钳夹力度以雌鼠不适、挣扎、发出哀叫为度；

3、将正常组的雌性SD大鼠22只与雄性SD大鼠11只合笼、将模型组的雌性SD大鼠22只与另外11只雄性SD大鼠合笼，分别繁殖下一代；繁殖的仔鼠即为先天性甲状腺功能减退症大鼠。

实施例2

在上述实施例的基础上，还可以在步骤（2）中增加低温刺激：将雌性SD大鼠放入4±2℃的水池中游泳，前3d每天游泳5min，以后每天游泳30min或至力竭。

实施例3

在上述两实施例的基础上还可以在步骤（2）中增加饥饿刺激：每隔4～5天随机对雌性SD大鼠禁食24h。 

上述三个实施例虽然选择的是SD大鼠，但对于其它品种的大鼠同样可以实施，因为其它品种大鼠与SD大鼠具有相似的一般特性、解剖学特点和生理学特点。