中国南海织锦芋螺毒素TxO10的制备及应用

摘要

本发明涉及一种中国南海织锦芋螺毒素基因TxO

说明书

技术领域

本发明涉及一种多肽及其编码基因序列、其制备方法和应用。属于生物领域。

背景技术

芋螺(cone snail)是一种生活在海洋浅水域的肉食动物，有毒，属于软体动物门 (Mollusca)、腹足纲(Gastropoda)、前鳃亚纲(Prosobranchia)、芋螺科(Conidae)、芋螺属 (Conus)。目前估计全球有约500-700种芋螺，它们分布于热带海域的浅水区域，主要是印度 洋和太平洋海域。

芋螺按其食性可分为三大类：食鱼性芋螺(piscivorous)，食软体动物性芋螺 (molluscivorous)和食虫性芋螺(vermivorous)。其中食虫性芋螺种类最多，占全部芋螺种 类的70％左右，而食鱼性芋螺虽然占芋螺总数最少，但毒性最强，至今为止报道的芋螺致死 事件基本上是该类芋螺造成的。

芋螺毒素(conotoxin，CTx)是一类来源于芋螺(Conus)毒液的活性多肽.对芋螺自 身而言，CTx主要用于捕食与防御.。近几十年来的研究表明，它主要作用于细胞膜上各种 离子通道和神经递质/激肽的受体，有很强的生物学活性。芋螺毒素具有有如下特点：分子 质量小，富含二硫键；前导肽高度保守而成熟肽具有多样性；作用靶点广且具有高度组织 选择性。芋螺毒素常被作为探针用于各种离子通道和受体的类型及亚型的分类和鉴定，也 极有望直接开发成药物或作为先导化合物用于新药的研发。

目前，国内外已明确功能的芋螺毒素只占了整个毒素库的很小一部分，但是对它们的 生理功能已经有了较为清晰的认识。芋螺毒素二硫键骨架和结构的不同，决定了它们功能 靶位的差异，已经清楚的靶位主要包括配体门控的离子通道、电压门控的离子通道及G蛋 白偶联的受体。

二十世纪八十年代初，美国犹它大学Olivera BM学者实验室最早开展了芋螺毒素全面 系统研究工作。芋螺毒素按照其结构特点(前体肽中N端高度保守的信号肽区和C端的二 硫键骨架)，可分为不同的超家族。至今已经得到分离的芋螺毒素有近千种，数十种芋螺毒 素已申请美国专利。它们在镇痛、局部缺血性保护、癫痫治疗、某些疾病诊断和受体研究 中具有广泛的应用价值，有的已进入临床研究或已被FDA正式批准为治疗新药，用作特异 诊断试剂和镇痛药。目前，由Elan公司进行开发的ω-CTX MVIIA(SNXIII，商品名： Ziconotide)，因其直接作用分布于神经组织的N-型钙离子通道，无需第二信使或蛋白，不 成瘾，已成为治疗难治性神经疼痛的新一代药物，已通过了III期临床试验，正式被FDA批 准上市。而另一个衍生于ω-CTX CVID的化合物AM336作用类似于Ziconotide，因其对 N-钙通道的选择性更强，副作用更低，已经批准作为对抗严重抗吗啡作用慢性疼痛的治疗 药物进入临床试验阶段。此外，Conantokin-G作为NMDA受体高度选择性的拮抗剂，对难 以治疗的癫痫有效，也已完成I期临床试验。

另一方面，芋螺毒素作为研究离子通道和膜受体的极好探针或工具，已经成为电压门 控型钙离子通道(VSCCs)和N型乙酰胆碱受体(nAChRs)等通道、受体鉴定和诊断的标 准工具，在神经药理学领域得到了广泛的应用。

发明内容

本发明的目的是提供一种中国南海织锦芋螺毒素基因TxO₁₀，其基因序列如序列表中序 列1所示。

本发明的另一个目的是提供上述织锦芋螺毒素基因TxO₁₀编码的多肽TxO₁₀，其氨基酸 序列如序列表中序列2所示。

本发明的另一个目的是提供一种重组表达载体pTRX-TxO₁₀。

本发明的再一个目的是提供一种多肽的表达方法，从表达、分离和纯化几个方面对原 有的多肽表达方法进行改良。

本发明的第五个目的在于提供上述芋螺毒素多肽TxO₁₀在神经生物学研究药物开发中 的应用。

本发明使用的织锦芋螺采自中国海南省三亚市。

本发明通过构建cDNA文库和测序的方法，从中国南海织锦芋螺毒管中分离得到中国 南海织锦芋螺毒素基因TxO₁₀。

本发明提供一种重组表达载体pTRX-TxO₁₀，通过以下方式合成：

首先，将织锦芋螺毒素基因TxO₁₀的cDNA序列分拆为两对互补序列作为模板母链， 在该母链基因的5’端和3’端分别加入限制性内切酶KpnI和NotI的酶切位点；另外，在5’ 端加入了Ek酶的识别位点，而在3’端还加入了两个终止密码子(TAA)，上述该两对引物 经PCR扩增后分为互补配对的两组分别进行磷酸化与退火，合成出全长的织锦芋螺毒素基 因TxO₁₀。

其次，通过限制性内切酶KpnI和NotI双酶切法对质粒pTRX-Neu5进行酶切，切除 Neu-5片段后得到线性化的载体pTRX。

最后，利用T4DNA连接酶连接上述织锦芋螺毒素基因TxO_10和上述线性化的载体 pTRX，得到重组表达载体pTRX-TxO₁₀。

本发明还提供一种多肽的表达方法，具体实施步骤为：

(1)将重组表达质粒pTRX-TxO₁₀转化大肠杆菌BL21(DE3)；

(2)培养转化后的大肠杆菌BL21(DE3)；

(3)对培养后的大肠杆菌BL21(DE3)进行超声裂解，收集上清；上清液经镍柱亲和层析纯 化，得到重组融合蛋白；

(4)重组融合蛋白经肠激酶(Enterokinase，EK酶)酶切，酶切的产物经层析过滤和HPLC 纯化得到目的蛋白——芋螺毒素多肽TxO₁₀。

上述多肽的表达方法使用重组表达载体pTRX-TxO₁₀作为表达质粒，表达效率较高， 且优化了培养条件和纯化分离方式，有效提高了芋螺毒素多肽TxO₁₀的表达量。

本发明通过青蛙坐骨神经动作电位实验发现，一定浓度的芋螺毒素多肽TxO₁₀促进动 作电位的作用，因此本发明还提供一种芋螺毒素多肽TxO₁₀在神经生物学研究及药物开发 中的应用。

附图说明

图1重组表达载体pTRX-TxO₁₀合成过程示意图

图2重组表达载体pTRX-TxO₁₀的菌落PCR阳性克隆琼脂糖凝胶图

图3重组表达载体pTRX-TxO₁₀的测序结果图

图4重组融合蛋白分离纯化亲和层析图

图5重组融合蛋白的诱导表达及纯化的SDS-PAGE电泳图谱

图6酶切后的芋螺毒素多肽TxO₁₀反相高效液相色谱图

图7芋螺毒素多肽TxO₁₀的MALDI-TOF质谱图

图8MTT法测定芋螺毒素多肽TxO₁₀对细胞存活率影响结果分析图

图9芋螺毒素多肽TxO₁₀蛙坐骨神经干动作电位实验结果分析图

具体实施方式

以下结合具体实施例，来进一步说明本发明的技术方案。应理解，以下实施例只用于 说明本发明而不以任何形式限制本发明。

实施例1：织锦芋螺毒管组织总RNA的提取及毒素cDNA克隆

总RNA的提取参照Gibcol BRL公司的LS试剂说明书进行。LATaq DNA聚 合酶、10×PCR Buffer，DNA ladder购买自TaKaRa公司，dNTP购自鼎国公司，pGEM-T Easy  Vector Systems购自Promega公司；PCR引物由Invitrogen公司合成；其他有机试剂均为国 产分析纯，购自广州化学试剂厂。

取活螺体，用石工锤破碎螺壳，暴露出螺肉，冰上小心并快速分离毒管组织，称重后 迅速放入液氮并充分研磨，加入15倍重量体积的LS试剂(即1g组织中加入15ml)， 冰浴中充分匀浆，-80℃冰箱中保存以备提取总RNA。取50-100mg组织样品，用1ml LS试剂匀浆，15-30℃静置5min。然后加入0.3mL氯仿，剧烈振荡3min后，15-30℃ 静置10min。4℃、12,000rpm离心10min，取上层水相。加入0.5ml异丙醇，冰上静置10min 后，4℃、12,000rpm离心10min，弃上清。再加1ml 75％乙醇漂洗沉淀，4℃、7,500rpm离 心5min，弃上清，真空干燥去除样品中痕量的乙醇，加入适量无RNase的去离子水。取1μl 进行1％琼脂糖胶电泳，1μl用紫外分光光估算RNA的浓度与纯度，-80℃保存备用。

1)cDNA第一链的合成

cDNA第一链的合成使用Clontech公司的SMART^TM PCR cDNA Synthesis Kit，按照说明 书进行试验。在5μl反应体系中加入下列组分(于冰上操作)：1μg螺毒管总RNA，SMART  III olignucleotide和CDS III/3’PCR引物各1μl，以超纯水补齐体积，混匀，短暂离心。72℃ 温育2min，冰浴2min，短暂离心，使混合物集于管底。再依次加入2μl 5×First Strand Buffer、 1μl 20mmol/L的DTT、1μl 10mmol/L的dNTP Mix和1μl PowerScript RT(CLONTECH)后 轻弹管壁，混匀并短暂离心。置PCR仪42℃反应1h逆转录合成第一链，冰浴终止反应，-40℃ 保存。

2)O-超家族芋螺毒素的cDNA克隆

PCR引物序列如下表1所示：

上游引物5’CACTGTGTCTTTCGCATCA 3’

下游引物5’TGTGCTGTCGCTTTATTTGG 3’

表1

取5ul PCR产物用1.8％的琼脂糖凝胶电泳检测扩增结果，如有特异性条带则将剩余的 PCR产物进行目的片段的回收。

3)PCR产物的纯化

上述PCR反应产物用1.5％的凝胶进行纯化，电压120V电泳30分钟。切下含目标核酸带 (约300-500bp)的琼脂糖凝胶块，按OMEGA BIOTEK公司的GEL EXTRACTION KIT说 明书操作。将琼脂糖凝胶块称重，按1g/ml换算，加4-5倍胶体积的Binding Buffer缓冲液， 于55-60℃溶解7min，直到完全融溶，将凝胶液加入到HiBind^TM DNA柱上(可结合25μg的 DNA)，每次可加入700μl样品(可重复加入)，10,000g离心1min；加300μl的Binding Buffer 于HiBind^TM DNA柱中，10,000g离心1min，弃滤液；用750μl经乙醇稀释的DNA wash buffer 洗柱一次，10,000g离心1min，弃液，再重复用DNA wash buffer洗柱一次；将空的HiBind^TMDNA柱在10,000g离心1min，弃痕量溶液；用20μl灭菌去离子水或TE缓冲液洗柱，10,000rpm 离心1min收集DNA，DNA溶液在-20℃保存。鉴定回收产物浓度。

4)PCR产物克隆到T-载体

按DNA Ligation Kit说明将目的条带连入pGEM-T Vector。

连接体系如下表2所示：

表2

  组分  体积(μl)   目的片断  3.5   pGEM-T Vector  1   2×Rapid Ligation Buffer  5   T4DNA Ligase  0.5   总体积  10

4℃，连接过夜。

5)连接产物转化

将连接产物转化大肠杆菌DH5α菌株。

首先用CaCl₂法制备大肠杆菌DH5α感受态细胞。挑取大肠杆菌DH5α单菌落接种于不 含抗生素的LB液体培养基中，37℃振荡培养16-18小时活化菌株，然后以1∶50的体积接 种于50ml不含氨卞青霉素的LB液体培养基中，37℃、250rpm振荡放大培养2-3小时左 右，在OD₆₀₀＝0.3左右时，将菌液冰浴40分钟，4℃4000rpm离心10分钟，倒置去尽上清， 加入相当于原培养物1/2体积的预冷的100mM CaCl₂重悬沉淀，冰浴10分钟，4℃，4,000rpm 离心10分钟，弃上清，再以相当于原培养物体积1/25的预冷的100mM CaCl₂重悬沉淀。 每管加入20％的甘油，分装为200μl，置-80℃冰箱2小时后可用。

取100μl的感受态细胞，加入连接产物，混和均匀后，冰浴30分钟，42℃热击90秒， 冰浴2分钟，加入700μl Amp^-的LB液体培养基，37℃温和振摇复苏细胞40分钟，4000rpm 离心4min，弃培养基，200μl LB培养基重悬菌体，全部涂布于Amp⁺的LB平板上，37℃倒 置于培养箱培养16小时，观察菌落生长情况。 6)菌落PCR鉴定阳性克隆

取20个灭菌1.5ml小管，加入20μl LB培养基，在超净台中挑取20个阳性克隆分别 到各个小管中。

PCR体系及PCR程序如下表3所示：

表3

7)阳性菌落的扩大培养和质粒提取

取菌落PCR阳性的菌液加到5ml的含Amp LB培养基中，37℃摇床培养过夜，用 OMEGA mini plasmid extraction kit提取质粒。取5ml菌液，10,000g离心1min；弃上清， 加入250μl溶液I/RNase，重悬细胞；加入250μl溶液II，轻柔颠倒4-6次混匀，裂解细胞； 加入350μl溶液III，混匀直到出现白色沉淀；10,000g离心10min后，将上清转移到置于 2ml离心管套管上的HiBind^TM DNA柱上；10,000g离心1min，弃液；用500μl HB buffer洗 柱，10,000g离心1min，弃液；用750μl经乙醇稀释的DNAwash buffer洗柱一次，10,000g 离心1min，弃液，重复洗柱一次；空HiBind^TM DNA柱10,000g离心1min，弃痕液；30μl 灭菌去离子水洗柱两次，10,000g离心1min，溶解质粒。

8)含插入片断的T载体质粒测序

采用Perkin Elmer公司的ABI PRISM 3730自动测序仪进行测序工作，测序反应按ABI PRISM BigDye^TM Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kits的说明书进行操作，使用 T7和SP6primer进行双向序列测定。

实施例2：中国南海织锦毒素多肽TxO₁₀融合表达载体的构建

1)质粒与菌株：

大肠杆菌(Escherichia coli)DH5α购自Invitrogen公司，由本实验室保存，其基因型为： DH5α：supE44Mac U169hsdR17recA1endAl gyrA96thi-1relA1；大肠杆菌 表达宿主菌BL21(DE3)购自Stratagene公司，基因型为：BL21(DE3)：F-ompT hsdSB(r-B， m-B)dcm galλ(DE3)。

2)试剂与其他材料：

限制性内切酶KpnI、NotI及T4DNA连接酶购自TaKaRa公司；Taq DNA聚合酶、 10×PCR Buffer和dNTP购自鼎国公司；Gel Extraction Kit和Plasmid Miniprep Kit为 OMEGA BIOTEK公司产品；BCA^TM Protein Assay Kit为PIERCE公司产品；Trans2K DNA Marker购自TransGen公司；低分子量标准蛋白14,400～108,000kD购自凯基生物；EK酶购自 中大南海海洋生物技术国家工程研究中心；色谱级TFA(三氟乙酸)购自Sigma公司；氨卞 青霉素钠盐购自华北制药厂；Tryptone和Yeast Extract购自Oxoid公司；T7promoter sequencing primer(T7)，TxO₁₀基因的寡聚核苷酸引物由Invitrogen公司合成；其它试剂均为 国产分析纯试剂。

3)实验方法：

(1)中国南海织锦芋螺毒素基因TxO₁₀的合成

引物合成：将织锦芋螺毒素基因TxO₁₀分为(a)、(b)、(c)、(d)四段互补片段，在该 基因的5′端和3’端分别加入了限制性内切酶KpnI和NotI的酶切位点。另外，在5’端加入了 Ek酶的识别位点，而在3′端还加入了两个终止密码子(TAA)，以防止发生核糖体的跳跃， 引物序列如下所示：

(a)5’C GAT GAT GAT GAT AAA TGC AAA CAA GCT GAT GAA CCT TGT GAT ATA TTT 3’

(b)3’CATGG CTA CTA CTA CTA TTT ACG TTT GTT CGA CTA CTT GGA ACA CTA TAT AAA AGT GAA 5’

(c)5’TCA CTT GAA TGC TGC ACC GGC ATA TGT CTT GGA TTC TGC ACG TGG TAA TAA GC 3’

(d)3’CTT ACG ACG TGG CCG TAT ACA GAA CCT AAG ACG TGC ACC ATT ATT CGCCGG 5’

将上述(a)、(b)、(c)、(d)引物Oligo片断用原子级水溶解为10μmol/L的溶液。将引 物分为互补配对的两组分别进行磷酸化与退火。

磷酸化体系如表4所示(10μL)：

表4

  10μM Oligo   1.0μL   10×T4磷酸化酶缓冲液   1.0μL

  10mM ATP   1.0μL   T4多核苷酸激酶(10U/μL)   0.5μL   ddH₂O   6.5μL

将各磷酸化体系37℃，水浴1小时。

互补配对：将磷酸化好的互补Oligo加在一起，94℃反应3min，45℃反应5min。得到 配对好的织锦芋螺毒素基因TxO₁₀。

(2)重组载体pTRX-TxO₁₀的构建

融合表达载体pTRX，其母载体为Novagen公司的PET22b，该载体含有原核表达载体的 通用特征，是一个分泌型表达载体。融合表达载体pTRX用大肠杆菌硫氧还蛋白(thioredoxin， Trx)置换PET22b上的信号肽，并在TRX基因后加上连接区，包括柔韧区、编码6His的序列、 蛋白酶切割位点以及多克隆位点(MCS)，是一个使用方便简单且高效表达的载体。

取pTRX质粒的保种菌液在氨苄抗性的平板上划线培养，以得到活化的单菌落。挑去单 菌落接种于5ml LB加富液体培养基中，37℃振荡培养过夜后，收集菌体，提取质粒。利用 KpnI和NotI双酶切法对pTRX质粒进行线性化制备，目的是为了切除KpnI和NotI酶切位 点之间的基因片段，得到线性化的载体pTRX。载体pTRX线性化后进行胶回收和纯化操作， 利用T4DNA连接酶对上述载体pTRX和上述配对好的织锦芋螺毒素基因TxO₁₀进行连接，连 接后转入大肠杆菌DH5α中进行扩增。测序结果正确，说明重组载体pTRX-TxO₁₀构建成功 (见图3)。

i.提取的pTRX质粒DNA经限制性内切酶KpnI和NotI双酶切。

酶切反应体系如表5所示(30μL)：

表5

  质粒DNA  3.0μg   10x K Buffer  1.5μL   KpnI  2.0μL   NotI  2.0μL   0.1％BSA  3.0μL   ddH₂O  补足至30.0μL

将样品置于37℃酶切6hr，然后将酶切产物进行1％的琼脂糖凝胶电泳，切下含载体 pTRX的琼脂糖凝胶块，采用OMEGA BIOTEK公司的Gel Extraction Kit(Cat.No.D2500-02) 并按照其说明书进行胶回收操作，得到线性化的载体pTRX。

ii连接反应

利用T4DNA连接酶对上述载体pTRX和上述配对好的织锦芋螺毒素基因TxO₁₀进行连 接。

连接反应体系如表6所示(10μL)：

表6

 配对好的织锦芋螺毒素基因TxO₁₀  2.0μL  2×T4 DNA ligase Buffer   5.0μL   载体pTRX   2.0μL   T4DNA连接酶(10U/μL)   1.0μL

将样品混匀，16℃连接过夜。将连接产物加入大肠杆菌DH5α感受态细胞进行转化，测 序，结果正确，说明克隆成功，得到重组载体pTRX-TxO₁₀。

实施例3、中国南海织锦芋螺毒素多肽基因的高效原核表达

1)融合蛋白的表达

将测序正确的重组载体pTRX-TxO₁₀转化至大肠杆菌BL21(DE3)构建成工程菌株。挑取 工程菌株单菌落接种于Amp⁺LB液体加富培养基中，37℃振荡培养过夜作为种子菌。取种 子菌按1∶50体积比接种于新鲜的Amp⁺LB丰富培养基中，37℃剧烈振荡放大培养至OD600 约为0.6，加入IPTG至终浓度为0.1mmol/L，同时加入20％葡萄糖至终浓度0.2％，于18℃诱 导表达12小时。诱导结束后4℃、10,000rpm离心10min，收菌，用预冷的Lysis Buffer(50 mmol/L Tris，500mmol/L NaCl，10mmol/L咪唑，pH 7.0)以1∶10的比例重悬。以300W 功率，冰浴下超声1.5h破碎细菌细胞。超声结束后4℃，12,000rpm离心10min两次，收集含 重组融合蛋白的上清。

2)织锦芋螺毒素TxO₁₀的制备

(1)重组融合蛋白的亲和层析

采用GE公司的Chelating Sepharose ^TM Fast Flow填料，以Ni²⁺为配体，层析柱的灌注及使 用前后的处理方法见说明书。

使用前，先上0.2M的NiSO₄和柱料结合，然后用水洗尽未结合的Ni，用2倍柱床体积的 Lysis Buffer平衡层析柱，整个操作过程维持2.0ml/min的恒定流速。接着将超声后的离心 上清上柱，用Lysis Buffer洗柱至紫外吸收值达到基线，过程中留取穿流峰样品。然后使 用咪唑浓度为20mmol/L的Wash Buffer进行杂蛋白洗脱，最后使用咪唑浓度为300mmol/L的 Elution Buffer洗脱目的蛋白。通过上述亲和层析步骤对上述融合蛋白纯化。

(2)重组融合蛋白的酶切

采用Pharmacia公司的Sephadex G25柱更换样品缓冲系统。层析柱的灌注及处理方法详 见说明书。整个操作过程维持2.0ml/min的恒定流速。先用2倍体积的Ek酶酶切Buffer平衡 层析柱，接着将Ni²⁺柱纯化后的融合蛋白上柱，然后继续使用Ek酶酶切Buffer(50mmol/L Tris，100mmol/L NaCl，pH 8.0)进行洗脱并收集目的蛋白峰。样品经Sephadex G25凝胶 过滤层析将缓冲液更换为酶切缓冲液后，加入1％的Ek酶在20℃酶切10h。

(3)酶切产物纯化

Sephadex G50Fine分子筛层析柱规格为Pharmacia XK50(5.0cm×100cm)，使用AKTA explorer系统进行中压层析，流速恒定为2ml/min。用50mM NH4HCO3平衡Sephadex G50层 析柱1～1.5个柱床体积，上样50ml酶切产物样品。设定自动收集程序，收集紫外吸收目标 蛋白峰，得到织锦芋螺毒素TxO₁₀。

(4)HPLC检测与纯化

冻干后的织锦芋螺毒素TxO₁₀用少量去离子水溶解后直接上C18反相柱进行检测并纯 化。线性梯度洗脱，程序如图2所示，215nm和280nm处双波长检测，收集少量洗脱峰样品 进行质谱检测(见图7)。其余样品再次进行真空冷冻干燥并保存于-20℃。

实施例4：织锦芋螺毒素TxO₁₀的细胞毒性鉴定

基本方案：MTT法

实验步骤：将MDCK(犬肾细胞)，H9C2(大鼠心肌细胞)，Chang’s liver(张氏肝 细胞)，L-02(人胎肝细胞)，L929(小鼠成纤维细胞)，PC12(大鼠肾上腺嗜铬神经瘤 细胞)以约10⁵个/ml的密度接种于96孔板，每孔接种100μl，置CO2培养箱中培养至对数生 长期。然后按预设的浓度梯度，加入分别为50μM，10μM，2μM的TxO₁₀，每一梯度至少 3个重复。对照组加入等体积的溶解样品用的溶剂。继续培养6小时后，每孔加入20μl的 MTT(5mg/ml)，然后置于37℃温育4小时。小心除去上清后，每孔加入100μl的DMSO， 振荡约10min溶解沉淀，随后用酶标仪检测OD值，波长570nm。用下式求出每一样品浓度 下的细胞存活率：存活率％＝试验组平均OD值/对照组平均OD值*100％。

结果分析：由实验结果可得，TxO₁₀作用于H9C2，MDCK，L929，PC12细胞后，细胞 存活率降低到60％-90％之间，存在显著差异(P＜0.01)，随着浓度的提高，对细胞的损伤 越大。并且各种细胞类型的不同，细胞的毒性作用也不同。说明TxO₁₀对细胞有一定的毒性 作用，并且随着作用浓度递减，毒性作用减小(见图8)。

实施例5：织锦芋螺毒素TxO₁₀的生理活性鉴定

本实施例中通过青蛙坐骨神经-动作电位实验来鉴定织锦芋螺毒素TxO₁₀的生理活性。

实验步骤：双毁髓青蛙后制备坐骨神经标本，用无菌脱脂棉给药，待测药品TxO₁₀工 作浓度为5nM。仪器参数：时间常数0.01s，滤波频率：5kHz，扫描速度1.25ms/div，单刺 激模式，刺激幅度1V，刺激波宽1.00ms，延时100ms。使用电生理实验系统为泰盟科技 BL-420F生物机能实验系统。

结果分析：如图9所示，TxO₁₀终浓度达5nM时可增大蛙坐骨神经干动作电位，可用 于制备神经生物学研究的工具药。