一种复杂基质水体样品中雌激素及壬基酚、辛基酚、双酚A的共检测方法

摘要

本发明涉及一种水环境中内分泌干扰物的检测技术，特别是涉及一种采用液相色谱-串联质谱联用技术对复杂基质水体样品中雌酮、17β-雌二醇、雌三醇、17α-乙炔基雌二醇、壬基酚、辛基酚和双酚A定量分析的技术。本方法将采集好的水体样品，采用HLB固相萃取小柱富集并用甲醇洗脱，再将洗脱液氮吹干，用Florisil净化，最后利用液相色谱-串联质谱联用分析。该方法环境友好、易于操作、且回收率较高，能够快速分析复杂基质水体样品中痕量存在的雌酮、17β-雌二醇、雌三醇、17α-乙炔基雌二醇、壬基酚、辛基酚和双酚A。

说明书

技术领域

本发明涉及一种水环境中有机污染物的检测技术领域，特别是涉及复杂基质水体样品中 雌激素及壬基酚、辛基酚、双酚A的提取、净化和仪器检测方法。

背景技术

近年来，天然与合成雌激素雌酮(Estrone，E1)、17β-雌二醇(17β-Estradiol，E2)、17α- 乙炔基雌二醇(17α-Ethinyl Estradiol，EE2)，以及类雌激素活性物质壬基酚(Nonylphenol，NP)、 辛基酚(Octylphenol，OP)双酚A(BisphenolA，BPA)作为典型的环境中内分泌干扰物引起 了学术界的广泛关注。相关调查研究表明，水环境中ng/L浓度水平的雌激素足以导致水生生 物的雌性化。而由人和哺乳动物的尿液和粪便排放的雌激素以及制造奶瓶等食具、电子器件 的包覆材料、纸水杯、金属饮料罐的保护涂层、食品包装材料等产生的类雌激素物质壬基酚、 辛基酚和双酚A等的排放是不可避免的。

生活污水的集中处理和排放以及规模化畜禽养殖，是造成河流或土壤环境中雌激素污染 的最重要原因。欧美等国对多家污水处理厂雌激素浓度及去除效率的调查结果显示，在污水 处理厂出水及受纳水体中残留着ng/L浓度水平的雌激素。因此，调查和研究污水和畜禽养殖 废水中的雌激素及类雌激素物质浓度对于该类物质的控制和去除具有重要意义。但这些废水 基质组成复杂，而雌激素又痕量存在，这对样品前处理提出了较高的要求。

近年来，痕量有机物的仪器检测技术有了很大的提高，如气相色谱-质谱联用 (GC/MS)、气相色谱-串联质谱联用(GC/MS/MS)、液相色谱-质谱联用(LC/MS)、液相 色谱-串联质谱联用(LC/MS/MS)等，具有较高的灵敏度和精确度。然而，对于实际环境 样品，由于基质干扰作用，使分析方法的精确性和精密性大大降低。如何将复杂水样中痕量 存在的雌激素富集并净化，成了水环境中雌激素分析的一个瓶颈。因次，建立回收率高、重 现性好的适用于分析复杂基质水体中痕量存在的雌激素及壬基酚、辛基酚、双酚A的前处理 方法是十分必要的。

发明内容

本发明的目的是针对复杂基质水体样品中雌激素痕量存在、基质干扰大、前处理技术难 度大等问题，拟开发一种回收率高、灵敏度高、准确、快速的分析技术，实现对雌酮、17β- 雌二醇、雌三醇、17α-乙炔基雌二醇、壬基酚、辛基酚和双酚A的定量测定。

本发明的技术方案如下：

一种检测复杂基质水体样品中痕量雌酮、17β-雌二醇、雌三醇、17α-乙炔基雌二醇、壬 基酚、辛基酚和双酚A的定量测定方法。其特征在于该方法包括如下部分：

(1)HLB柱富集

水样采用GF/F玻璃纤维滤膜进行过滤，并用盐酸调节pH为3；利用固相萃取装置活化 Waters公司的HLB固相萃取柱(200mg，6cc)，活化的顺序为：5mL色谱纯乙酸乙酯、5mL 色谱纯甲醇及10mL超纯水，流速为1mL/min；采用已活化的固相萃取柱对水样进行固相萃 取富集，控制流速为3mL/min；富集完成后，首先用40％甲醇水溶液淋洗，再用甲醇/氨/水溶 液淋洗，所述甲醇/氨/水溶液v/v/v＝10/2/88；淋洗结束后真空抽干10min，然后用甲醇洗脱， 并将洗脱液氮吹干。

(2)Florisil柱净化

用正己烷/二氯甲烷＝3/1(v/v)溶液重新溶解氮吹干后的残渣，然后通过预先用正己烷活 化好的Florisil固相萃取柱(500mg，6cc)，再用正己烷/二氯甲烷＝3/1(v/v)淋洗，最后用 丙酮/二氯甲烷＝2/8(v/v)为洗脱剂进行洗脱，洗脱液用氮气吹干；残渣用甲醇定容，漩涡混 合后过0.22μm的尼龙滤头待测。

(3)液相色谱-串联质谱分析

液相色谱-串联质谱联用仪器为：Agilent 1100高效液相色谱系统，包括四元输液泵，美 国Agilent公司的自动进样器；3200QTRAP型液相色谱/串联质谱仪，配有电喷雾离子化源 (ESI)以及Analyst 1.4.1数据处理软件；

色谱柱：Nova-Pak C18，3.9mm×150mm×4μm，Waters公司；离子源：电喷雾离子化源 (ESI)，负离子方式检测；离子喷射电压：-4500V；温度：450℃；源内气体1(GS1)，N₂， 压力：45psi；源内气体2(GS2)，N₂，压力：45psi；气帘气体为N₂，压力：20psi；扫描方 式为多重反应监测(MRM)；碰撞气N₂的压力为：Medium；HPLC流动相梯度洗脱条件如表 1所示：

表1HPLC流动相梯度洗脱条件

(4)标准曲线的绘制，以外标法进行定量测定

所述的外标法标准曲线的绘制：利用分析天平准确称量4种雌激素及壬基酚、辛基酚、 双酚A，溶于色谱纯乙腈内，配置成系列浓度的标准溶液，采用液相色谱-串联质谱联用进行 分析，分别以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标进行回归，得到标准曲线，用于测定样品中分 析物的量。

(5)样品及回收率的测定

采集某污水处理厂水样，按步骤1对水样中的目标化合物进行富集，再按步骤2进行提 取物的净化，然后用液相色谱-串联质谱联用检测，并与步骤4得到的标准曲线比较，通过换 算最终得到待测水体样品中雌激素及壬基酚、辛基酚、双酚A的含量。

采用同样的污水样品，按50ng/L的添加量加入标准溶液，进行上述预处理并测定雌激素 及壬基酚、辛基酚、双酚A含量，按照下式进行回收率计算：

$R=\frac{C-C_0}{50}\times 100\%---\left(1\right)$

R-回收率，％；

C-添加标准溶液水体样品的目标物含量，ng/L；

C₀-未添加标准溶液水体样品的目标物含量，ng/L。

本发明所述的雌激素为雌酮、17β-雌二醇、雌三醇、17α-乙炔基雌二醇。

本发明的有益效果是采用HLB柱进行富集，再用Florisil柱进行净化，最后采用液相色 谱-串联质谱联用进行检测，检测限低，具有较高的灵敏度和精确度。本发明提供一种检测限 低、重现性好、灵敏度高、回收率较好、操作简单易行的分析方法，适用于分析复杂基质水 体样品中的雌激素及壬基酚、辛基酚、双酚A。本方法的回收率与最低检测限，如表2所示

表2本方法的回收率和最低检测限

现有技术中雌激素的分析介质通常是河流或湖泊水体中的水样，而对于基质复杂的污水 处理厂的污水样品，由于其成分复杂、基质干扰强、回收率低等问题，必须对污水样品进行 净化，因此污水中雌激素等物质的分析比河流等较干净水样品的分析程序更为困难和复杂。 实验证明，不经过净化的样品基质抑制效应非常明显。针对高基质干扰问题，本发明增加和 优化了Florisil柱净化步骤。经过HLB富集污水样品后再用Florisil柱进一步净化，使分析 目标化合物在污水中的回收率明显提高，并且检测限低、重现性好、灵敏度高、操作简单易 行。

附图说明

图1为5μg/L标准品溶液的色谱图

色谱图依次为：图1a为雌酮、图1b为17β-雌二醇、图1c为雌三醇、图1d为17α-乙炔基雌 二醇、图1e为壬基酚、图1f为辛基酚、图1g为双酚A；

图2为雌激素及壬基酚、辛基酚、双酚A的标准曲线；

图3为某污水处理厂进水中雌激素及壬基酚、辛基酚、双酚A的色谱图

色谱图依次为：图3a为雌酮、图3b为17β-雌二醇、图3c为雌三醇、图3d为17α-乙炔基雌 二醇、图3e为壬基酚、图3f为辛基酚、图3g为双酚A。

具体实施方式

下面结合实例及附图对本发明的技术方案作进一步的描述

(1)HLB柱富集

取0.5L某污水处理厂水样，采用GF/F玻璃纤维滤膜进行过滤，并用4mol/L的盐酸调节 pH为3；利用固相萃取装置活化Waters公司的HLB固相萃取柱(200mg，6cc)，活化的顺序 为：5mL色谱纯乙酸乙酯、5mL色谱纯甲醇及10mL超纯水，流速为1mL/min；采用已活化 的固相萃取柱对水样进行固相萃取富集，控制流速为3mL/min；富集完成后，首先用6mL40％ 甲醇水溶液淋洗，再用6mL甲醇/氨/水溶液淋洗，所述甲醇/氨/水溶液v/v/v＝10/2/88；淋洗 结束后真空抽干10min，然后用6mL甲醇洗脱，并将洗脱液氮吹干。

(2)Florisil柱净化

用6mL正己烷/二氯甲烷＝3/1(v/v)溶液重新溶解氮吹干后的残渣，然后通过预先用正 己烷活化好的Waters公司的Florisil固相萃取柱(500mg，6cc)，再用6mL正己烷/二氯甲烷 ＝3/1(v/v)淋洗，最后用6mL丙酮/二氯甲烷＝2/8(v/v)为洗脱剂进行洗脱，洗脱液用氮气 吹干；残渣用0.5mL甲醇定容，漩涡混合后过0.22μm的尼龙滤头待测。

(3)液相色谱-串联质谱联用分析

液相色谱-串联质谱联用仪器为：Agilent 1100高效液相色谱系统，包括四元输液泵，美 国Agilent公司的自动进样器；3200QTRAP型液相色谱/串联质谱仪，配有电喷雾离子化源 (ESI)以及Analyst 1.4.1数据处理软件；

色谱柱：Nova-Pak C18，3.9mm×150mm×4μm，Waters公司；离子源：电喷雾离子化源 (ESI)，负离子方式检测；离子喷射电压：-4500V；温度：450℃；源内气体1(GS1)，N₂， 压力：45psi；源内气体2(GS2)，N₂，压力：45psi；气帘气体为N₂，压力：20psi；扫描方 式为多重反应监测(MRM)；碰撞气N₂的压力为：Medium；HPLC流动相梯度洗脱条件如表 1。

(4)标准曲线的绘制，以外标法进行定量测定

所述的外标法标准曲线的绘制：利用分析天平准确称量4种雌激素及壬基酚、辛基酚、 双酚A，溶于色谱纯乙腈内，配置成系列浓度的标准溶液，采用液相色谱-串联质谱联用进行 分析，分别以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标进行回归，得到标准曲线，用于测定样品中分 析物的量。

(5)样品回收率的测定

采集待测污水样品，按步骤1对样品进行提取，再按步骤2进行净化，最后按步骤3用 液相色谱-串联质谱联用检测，并与上述得到的标准曲线比较，通过换算最终得到待测水样中 雌激素及壬基酚、辛基酚、双酚A的背景值。

采用同样的水样，按50ng/L的添加量加入雌激素及壬基酚、辛基酚、双酚A的混合标准 溶液，进行预处理并测定目标化合物的含量，扣除背景值后进行回收率计算。

利用本发明检测某污水处理厂进水中雌激素及壬基酚、辛基酚、双酚A的实施过程：

采集某污水处理厂原水样品，迅速装入洗净的装有叠氮化钠的4L棕色采样瓶中并放入带 有冰块的保温箱内(＜4℃)，带回实验室，按步骤1对样品进行提取，再按步骤2进行净化， 最后按步骤3用液相色谱-串联质谱联用检测，并与标准曲线比较，通过换算最终得到待测样 品中四种雌激素及壬基酚、辛基酚、双酚A的含量。

表3  实际污水中七种目标物的含量(ng/L)

注：n.d.表示未检出。