一种促进水稻生长和提高水稻产量的方法

摘要

本发明提供一种促进水稻生长或提高水稻产量的方法，该方法包括以下步骤：(1)构建过量表达核苷酸序列为SEQ ID NO：1的基因序列的载体；(2)以步骤(1)构建的载体转化水稻植株。本发明发现SEQ ID NO：1基因一方面能够明显促进水稻植株的长势，另一方面能够显著提高水稻的单产，将其用于水稻遗传改良上将会有助于解决粮食危机的难题，进而产生巨大的经济效益和社会效益。

说明书

技术领域

本发明涉及一种促进水稻生长或提高水稻产量的方法，具体来说，涉 及一种通过转基因技术促进水稻生长或提高水稻产量的方法。

背景技术

全球性的粮食短缺、产量锐减、价格涨幅过快造成了世界范围内的粮 食危机，以致于形成了近40年来前所未有的粮食恐慌。联合国粮食及农 业组织、世界粮食计划署联合公布的年度报告显示，全球共有37个国家 面临粮荒，2009年全球饥饿人口突破10亿，达到过去40年来的最高值。

水稻是我国乃至世界上的重要粮食作物之一，提高水稻的产量是解决 我国乃至世界粮食危机的一个重要途径。长期以来，水稻的产量被认为是 由多基因共同控制的一种复杂性状，很难通过生物技术手段针对某一特定 基因进行改造而达到提高产量的效果。然而，最近的研究结果却表明，水 稻的产量是可以由单一基因来调控的。中、日科学家在各自独立的研究中 都发现通过调控水稻单一基因可以提高水稻的产量，他们的研究成果于 2010年5月在Nature Genetics杂志上在线发表，实验表明水稻产量可以由 单一基因来调控。

2009年，我国公开颁发了水稻的转基因安全证书，这为利用生物技术 手段来改良水稻的产量提供了新的契机和信号。寻求和开发更多调控水稻 产量的基因，并应用于水稻的遗传改良，从而提高水稻的产量，是解决我 国乃至世界粮食危机的一个捷径。

发明内容

因此，本发明的目的是提供一种促进水稻生长或提高水稻产量的方 法。

用于实现上述目的的技术方案如下：

一种促进水稻生长的方法，该方法包括以下步骤：

(1)构建过量表达核苷酸序列为SEQ ID NO：1的基因序列的载体；

(2)以步骤(1)构建的载体转化水稻植株。

优选地，上述方法还包括以下步骤：

(3)将步骤(2)转化的水稻植株与其它水稻植株进行杂交。

在上述方法中，优选地，步骤(1)包括以下步骤：

(a)以水稻基因组cDNA为模板，采用PCR方法扩增核苷酸序列为 SEQ ID NO：1的基因序列；更优选地，在PCR方法采用引物中，上游引 物的核苷酸序列为SEQ ID NO：2，下游引物的核苷酸序列为SEQ ID NO： 3；

(b)将扩增的基因序列克隆到植物双元表达载体中。

优选地，步骤(2)包括采用农杆菌侵染水稻植株，所述农杆菌包含 携带核苷酸序列为SEQ ID NO：1的基因序列的植物双元表达载体。

本发明的另一目的是提供一种提高水稻产量的方法，该方法包括以下 步骤：

(1)构建过量表达核苷酸序列为SEQ ID NO：1的基因序列的载体；

(2)以步骤(1)构建的载体转化水稻植株。

优选地，上述方法还包括以下步骤：

(3)将步骤(2)转化的水稻植株与其它水稻植株进行杂交。

在上述方法中，优选地，步骤(1)包括以下步骤：

(a)以水稻基因组cDNA为模板，采用PCR方法扩增核苷酸序列为 SEQ ID NO：1的基因序列；更优选地，在PCR方法采用引物中，上游引 物的核苷酸序列为SEQ ID NO：2，下游引物的核苷酸序列为SEQ ID NO： 3；

(b)将扩增的基因序列克隆到植物双元表达载体中。

优选地，步骤(2)包括采用农杆菌侵染水稻植株，所述农杆菌包含 携带核苷酸序列为SEQ ID NO：1的基因序列的植物双元表达载体。

本发明经过大量实验研究发现水稻OsBTFL1(GenBank中其mRNA 序列Locus：NM_001055244，CDS序列见SEQ ID NO：1(528bp)。Gene  ID：4331347，全基因序列Locus：NC_008396 Os03g0109600，基因全长序 列见SEQ ID NO：4(2306bp)，mRNA序列见SEQ ID NO：5(870bp)。基 因注解为“Similar to Transcription factor homolog BTF3-like protein； contains InterPro domain(s)：IPR002715；supported by AK121478”)具有两种 突出的生物学功能特性，一是OsBTFL1基因能够显著提高水稻的单产， 二是OsBTFL1基因能够明显促进水稻植株的长势，证明将水稻OsBTFL1 基因用于水稻遗传改良上将会有助于解决粮食危机的难题，进而产生巨大 的经济效益和社会效益。具体来说，过量表达OsBTFL1的水稻转基因植 株产量提高，而利用RNAi技术降低OsBTFL1的表达水平，则转基因水 稻植株的产量明显降低。这一特性表明水稻OsBTFL1基因影响了水稻产 量的高低。OsBTFL1的表达水平还影响了转基因水稻植株的生长状态，过 量表达OsBTFL1的水稻转基因植株长的明显高大、粗壮；而利用RNAi 技术降低OsBTFL1的表达水平后，转基因水稻植株长的明显偏矮、细小。 因此，过量表达OsBTFL1可以增加水稻产量的特性可用在水稻品种的遗 传改良上，可以构建OsBTFL1的过量表达载体直接转化水稻生产品种， 将遗传稳定的转基因材料应用于生产。另一方面，构建OsBTFL1的过量 表达载体转化水稻材料，将获得的转基因水稻材料与其它水稻生产品种进 行杂交，从而达到水稻遗传改良的作用。

附图说明

以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：

图1显示OsBTFL1 RNAi表达载体的构建图谱。其中，图1A为 OsBTFL1上片段82L的克隆图谱；图1B为OsBTFL1上片段82S的克隆 图谱；图1C为RNAi表达载体pCAMBIA1300-35S-82LS的构建图谱。

图2显示PCR扩增82L和82S DNA序列的电泳结果图。其中，M为 marker(200bp ladder)，1，2为82L；3，4为82S。

图3显示OsBTFL1转基因T1代植株中OsBTFL1表达水平的检测结 果(QRT-PCR)。其中，WT：对照株；OE：过表达OsBTFL1的植株；RI： OsBTFL1的RNAi植株，数字表示单株的序号。

图4显示OsBTFL1转基因植株T1代不同生长阶段的长势比较。左： 幼苗期，中：分蘖期，右：抽穗期。WT：对照株，OE37：过表达OsBTFL1 的植株；RI30：OsBTFL1的RNAi植株。

图5显示OsBTFL1转基因T1代植株的穗长。WT：对照株，OE37： 过表达OsBTFL1的植株；RI30：OsBTFL1的RNAi植株。

图6显示OsBTFL1转基因植株T1代的单株稻粒数。WT：对照株； OE：过表达OsBTFL1的植株；RI：OsBTFL1的RNAi植株；数字表示单 株的序号。

图7显示OsBTFL1转基因植株T1代稻米的千粒重。WT：对照株； OE：过表达OsBTFL1的植株；RI：OsBTFL1的RNAi植株；数字表示单 株的序号。

图8显示OsBTFL1转基因植株T1代的单株穗粒重。WT：对照株； OE：过表达OsBTFL1的植株；RI：OsBTFL1的RNAi植株；数字表示单 株的序号。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施 例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。

以下各实施例中，所使用的各种试验材料、试剂、载体等，均可通过 商业途径获得；所涉及的各种试验操作方法，包括RNA的提取、cDNA 的制备、克隆或表达载体的构建、酶切、连接、菌株转化、筛选等等，均 为本领域内常规的试验手段，具体可参见相关产品的目录、技术支持和产 品说明书部分，如Invitrogen、Takara等公司。

实施例1

利用反向遗传学方法证明OsBTFL1基因的表达对水稻产量以及水稻 植株长势的影响。

1、克隆OsBTFL1基因

OsBTFL1基因定位于水稻第3号染色体上，在Genbank的基因组Locus： Os03g0109600，本申请将其命名为水稻OsBTFL1(BTF3-like 1，OsBTFL1) 基因，其碱基编码序列如见SEQ ID NO：1，全基因碱基序列见SEQ ID NO： 4，mRNA序列见SEQ ID NO：5。

利用Trizol提取法提取水稻叶片总RNA，DNase处理后反转录合成 cDNA，利用该cDNA为PCR模板，扩增OsBTFL1的编码序列(SEQ ID NO： 1)，扩增用特异性引物如下：

上游引物(SEQ ID NO：2)：

5′-ATGAATGTCGACAAGCTTAAGAAG-3′；

下游引物(SEQ ID NO：3)：

5′-CTAGGACGACTCTTTCTTCTCTTCC-3′。

2、构建OsBTFL1过表达载体

利用特异性引物扩增OsBTFL1基因，以水稻cDNA为模板，引物分 别加上限制性酶切位点，序列如下：

上游引物：5′-CGGGATCCATGAATGTCGACAAGCTTAAGAAG-3′；

下游引物：5′-CGTCTAGACTAGGACGACTCTTTCTTCTCTTCC-3′。

可以利用各种带选择性标记或不带选择标记的表达载体，也可以利用 CaMV 35S强启动子或玉米Ubiquitin强启动子来驱动OsBTFL1的表达。 本实施例中将扩增产物及植物转化双元载体pCAMBIA1300-35S (pCAMBIA1300经EcoRI-SacI双酶切后插入35S启动子序列得到))分别 用特定限制性酶BamHI和XbaI酶切，T4连接酶连接后，转化大肠杆菌， 筛选、验证序列信息正确的阳性克隆，即为OsBTFL1过表达载体。

3、构建OsBTFL1RNAi表达载体

以水稻cDNA为模板，设计特异引物，分别扩增OsBTFL1的长、短 片段(中间有重叠序列)，反向连接后形成一个茎环结构(这种结构是切 割出短的双链小片段以完成基因沉默的特征结构)，克隆入植物双元表达 载体，构成OsBTFL1的RNAi表达载体，具体的载体构建过程参见图1A 至1C，操作步骤如下：

1)长片段82L和短片段82S的PCR扩增：

针对转录因子OsBTFL1的序列，设计两个上游引物和一个下游引物， 分别扩增82L和82S片段。并在两个扩增产物5’端加上XbaI酶切位点，3’ 端加上BamHI位点。从图2可以看出，大小与目的DAN序列一致，为所 需要的PCR产物。

具体引物序列如下：

82L上游引物(SEQ ID NO：6)：

5’-TCTAGATTAAGAAGATGGCGGGTGC-3’；

82S上游引物(SEQ ID NO：7)：

5’-TCTAGACTGCTTCCAACAATCATCAACC-3’；

下游引物(SEQ ID NO：8)：

5’-GGATCCTAGGACGACTCTTTCTTC-3’。

2)目的片段82L克隆入T载体

具体操作可参见PMD^TM18-T载体(购自宝生物工程(大连)有限公司)厂 商说明。

3)目的片段82S克隆入T载体

具体操作可参见PMD^TM18-T载体(购自宝生物工程(大连)有限公司)厂 商说明。

4)含有重组片段82LS的质粒构建

利用82S和82L的酶切位点，构建含重组片段82LS的质粒。先BamHI 单酶切质粒T-82S(载体上保留有82S片段)，回收质粒并进行去磷酸化处 理(CIP)；同时用BamHI酶切消化质粒T-82L，回收目的片段82L。T4 连接酶连接，连接产物转化大肠杆菌JM109，筛选阳性克隆。

5)表达载体pCAMBIA1300-35S-82LS的构建

利用pMD^TM18-T-82LS的酶切位点，SacI和SalI双酶切切下片段82LS， 回收。SacI和SalI双酶切表达载体pCAMBIA1300-35S，回收载体。T4DNA 连接酶连接回收的82LS片段和pCAMBIA1300-35S。连接产物电转化大肠 杆菌DH5a。筛选阳性克隆，即为OsBTFL1 RNAi表达载体。

4、获得OsBTFL1过量表达和RNAi干扰的转基因水稻植株

利用碱裂解法提取OsBTFL1过量表达和RNAi干扰载体质粒，通过 电击转化法转化农杆菌感受态细胞，筛选阳性转化子。

利用携带OsBTFL1过表达的双元载体的农杆菌侵染水稻，获得转基 因植株，得到OsBTFL1表达明显增高的植株(见图3)。

利用携带OsBTFL1 RNAi干扰表达的载体的农杆菌侵染水稻，获得转 基因植株，得到OsBTFL1表达明显降低的植株(见图3)。

此外，也可以采用基因枪法转化水稻，提取表达载体质粒，用金粉包 埋后，轰击水稻组织，获得相关转基因植株。

5、检测T1代转基因植株的长势

结果表明，在水稻的不同发育时期，OsBTFL1过表达的植株明显高于 对照植株，而OsBTFL1表达降低的植株明显低于对照植株(见图4)，表 明OsBTFL1的表达影响了植株的生长状况。

6、检测T1代转基因植株的产量

OsBTFL1过表达的植株的穗更长、更大(见图5)，穗粒数也明显比 对照植株多(见图6)，过表达植株的种子千粒重明显高于对照植株(见图 7)，表明过表达植株的种子饱满度非常好，这些因素汇集在一些则导致了 过表达植株的单穗重或单株产量明显比对照植株增高，增高幅度达到 31.1％左右(见图8)；反之，OsBTFL1表达降低的植株穗比较小(见图5)， 穗粒数也明显比对照植株少(见图6)，种子千粒重明显低于对照植株(见 图7)，表明OsBTFL1表达水平降低的RNAi技术处理的植株的种子饱满 度比较差，这些因素汇集在一些则导致了OsBTFL1 RNAi技术处理的植株 的单穗重或单株产量明显比对照植株低，降低幅度平均达到28.3％左右(见 图8)。这些结果证明OsBTFL1的表达水平影响了水稻的产量和生长状况。

实施例2

先转化实验用水稻材料，通过杂交将OsBTFL1过表达性状转移到生 产品种，筛选表达水平较高植株，构建高表达稳定遗传株系。

将实施例1中获得的过量表达OsBTFL1的转基因水稻与生产品种杂 交，收获杂交一代的种子，杂交二代分离群体中挑选农艺学性状接近杂交 用生产品种，而OsBTFL1表达量高的植株；挑选出的植株经过自交后， 再继续挑选农艺学性状更接近杂交用生产品种，而OsBTFL1表达量高的 植株；如此循环几次后，使最终筛选到植株的农艺学性状与生产品种非常 接近，而OsBTFL1的表达量明显增高的植株，即为OsBTFL1高表达的稳 定遗传株系。