致病性大肠杆菌检测试剂盒及致病性大肠杆菌检测方法

摘要

本发明适用于微生物技术领域，提供了一种致病性大肠杆菌检测试剂盒及致病性大肠杆菌检测方法。该试剂盒包括含有引物与荧光探针的PCR反应液。本发明致病性大肠杆菌检测试剂盒及致病性大肠杆菌检测方法能与传统的培养法相比具有快速、灵敏、安全等优点，可应用于致病性大肠杆菌的检测。

说明书

技术领域

本发明属于微生物技术领域，尤其涉及一种致病性大肠杆菌检测试剂盒及致病性大肠杆菌检测方法。

背景技术

致病性大肠杆菌(EPEC)是一种以粪口途径传播的，能导致人类多系统感染的肠道致病菌，尤其是引起婴幼儿的腹泻，成人的肠道及泌尿系统感染。自七十年代以来，EPEC已成为医院获得性感染中一种活跃的病原微生物。致病性大肠杆菌是婴儿腹泻的主要病原菌，不产生毒素，有高度传染性，严重者可致死，成人少见。致病性大肠杆菌根据是否含有EPEC黏附因子(EPEC adherencefactor，EAF)的质粒而被分成典型致病性大肠杆菌(typical EPEC)和非典型致病性大肠杆菌(atypical EPEC)。非典型致病性大肠杆菌既可以感染人也可以感染牲畜；典型致病性大肠杆菌以人为唯一宿主，而且多见于发展中国家，发达国家较少见。

目前对该致病性大肠杆菌监控方法一般是采用国际上通用的培养法，也即是国际上通用的鉴定细菌的方法，其具体的方法步骤如下：

(1)增菌：

样品采集后应尽快检验。除了易腐食品在检验之前应预冷藏外，一般不冷藏。以无菌手续称取检验25g，加在225mL营养肉汤中，以均质器打碎1min或用乳钵加灭菌砂磨碎。取出适量，接种乳糖胆盐培养基，以测定大肠菌群MPN，其余的移入500mL广口瓶内，于36±1℃培养6h。挑取1环，接种于1管30mL肠道菌增菌肉汤内，于42℃培养18h。

(2)分离

将乳糖发酵阳性的乳糖胆盐发酵管和增菌液分别划线接种麦康凯或伊红美蓝琼脂平板；污染严重的检样，可将检样匀液直接划线接种麦康凯或伊红美蓝平板，于36±1℃培养18～24h，观察菌落。不但要注意乳糖发酵的菌落，同时也要注意乳糖不发酵和迟缓发酵的菌落。

(3)生化试验

①自鉴别平板上直接挑取数个菌落分别接种三糖铁琼脂(TSI)或克氏双糖铁琼脂(KI)。同时将这些培养物分别接种蛋白胨水、半固体、pH7.2尿素琼脂、KCN肉汤和赖氨酸脱羧酶试验培养基。以上培养物均在36℃培养过夜。

②TSI斜面产酸或不产酸，底层产酸，H₂S阴性和尿素阴性的培养物为大肠杆菌。TSI底层不产酸，或H₂S、KCN、尿素有任一项为阳性的培养物，均非大肠杆菌。必要时做氧化酶试验和革兰氏染色。

(4)血清学试验

用致病性大肠杆菌多价O血清做玻片凝集试验，如呈现强凝集反应，即为试验阳性。

(5)结果报告

综合以上生化试验、血清学试验作出报告。

但是上述传统的培养法检测致病性大肠杆菌存在周期长(至少48小时以上操作烦琐、灵敏度低、易污染、程序复杂和所需试剂(生化试验试剂和血清)繁多等缺点，已远远不能满足快速检测致病性大肠杆菌的要求。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的上述不足，提供一种灵敏度高，且能安全、快速检测的致病性大肠杆菌检测试剂盒。

本发明的另一目的是提供一种方法简单，误差小，准确度高的致病性大肠杆菌检测方法。

为了实现上述发明目的，本发明的技术方案如下：

一种致病性大肠杆菌检测试剂盒，包括PCR反应液，所述PCR反应液包括第一反应液、第二反应液和稳定液，所述第一反应液包括致病性大肠杆菌第一上游引物、第一下游引物和第一探针以及第二上游引物、第二下游引物和第二探针；其中，

所述第一上游引物为：5’-GATCCCGTATTAAGCCAGTC-3’；

所述第一下游引物为：5’-GAATTTGACTTCCGGTACT-3’；

所述第一探针为：5’-(FAM)TTGGGAGAAATGGGGTAATG(DABCYL)-3’；

所述第二上游引物为：5’-ATTACTCATGGTTGTTATACC-3’

所述第二下游引物为：5’-TAGCTATCATGAGTTAACAGTT-3’

所述第二探针为：5’-(HEX)TGTTAATCAGAATTCATTTGCAA(DABCYL)-3’。

以及，一种致病性大肠杆菌检测方法，包括如下步骤：

获取致病性大肠杆菌的DNA样品；

进行荧光定量PCR检测，所述荧光定量PCR检测步骤中使用前述的致病性大肠杆菌检测试剂盒。

本发明致病性大肠杆菌检测试剂盒检测标本，仅需5小时即可完成检测，同时采用荧光定量PCR方法检测致病性大肠杆菌特异性较强，有效克服了致病性大肠杆菌传统培养法中存在的周期长、操作烦琐、灵敏度低、易污染、程序复杂和所需试剂(生化试验试剂和血清)繁多等缺点。

本发明致病性大肠杆菌检测方只需获取致病性大肠杆菌的DNA样品，并采用上述致病性大肠杆菌检测试剂盒检测即可，方法简单，误差小，准确度高。

附图说明

图1为本发明实施例使用Ct值的示意性图；

图2为本发明实施例致病性大肠杆菌检测方法的流程图；

图3为使用本发明实施例1的致病性大肠杆菌检测试剂盒进行检测的阳性结果；

图4为使用本发明实施例1的致病性大肠杆菌检测试剂盒进行检测的阴性结果；

图5是本发明实施例1致病性大肠杆菌检测方法中阳性对照PCR扩增图；

图6是本发明实施例1致病性大肠杆菌检测方法中阴性对照PCR扩增图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

实时荧光定量PCR在基础科学研究、临床诊断、疾病研究及药物研发等领域都有广泛应用。其基本原理为：在PCR反应体系中引入一种荧光化学物质，随着PCR反应的进行，PCR反应产物不断积累，荧光信号强度也等比例增加。每经过一个循环，收集一个荧光信号强度，这样就可以通过荧光强度变化监测产物量的变化，得到一条荧光扩增曲线图，见图1。PCR产物量的对数值与起始模板量之间存在线性关系，可进行定量分析。

基于该理论，本发明实施例开发并提供了一种致病性大肠杆菌检测试剂盒，包括PCR反应液，该PCR反应液包括第一反应液、第二反应液和稳定液，该第一反应液包括致病性大肠杆菌第一上游引物、第一下游引物和第一探针以及第二上游引物、第二下游引物和第二探针；其中，

第一上游引物序列如SEQ ID NO：1所示：

5’-GATCCCGTATTAAGCCAGTC-3’；

第一下游引物序列如SEQ ID NO：2所示：

5’-GAATTTGACTTCCGGTACT-3’；

第一探针序列如SEQ ID NO：3所示：

5’-(FAM)TTGGGAGAAATGGGGTAATG(DABCYL)-3’；

第二上游引物如SEQ ID NO：4所示：

5’-ATTACTCATGGTTGTTATACC-3’

第二下游引物如SEQ ID NO：5所示：

5’-TAGCTATCATGAGTTAACAGTT-3’

第二探针如SEQ ID NO：6所示：

5’-(HEX)TGTTAATCAGAATTCATTTGCAA(DABCYL)-3’。

本发明致病性大肠杆菌检测试剂盒检测致病性大肠杆菌具有快速、灵敏、安全等优点，有效克服了致病性大肠杆菌传统培养法中存在的周期长、操作烦琐、灵敏度低、易污染、程序复杂和所需试剂(生化试验试剂和血清)繁多等缺点。

优选地，作为本发明的实施例，上述第一反应液还包括灭菌超纯水、缓冲液、氯化镁、dNTPs。第二反应液包括DNA聚合酶、灭菌超纯水及显色液。

具体的，上述第一反应液中的灭菌超纯水、缓冲液、氯化镁、dNTPs、第一上游引物、第一下游引物、第一探针、第二上游引物、第二下游引物和第二探针的体积含量优选如下：

上述第二反应液各组分体积优选为：

DNA聚合酶  0.15～0.3μl/管

显色液     0.01～0.02μl/管

灭菌超纯水 1.84～1.68μl/管。

其中，第一反应液中的该缓冲液优选为10×Buffer(宝生物工程(大连)有限公司)，其不含有镁离子，体积更优选为2.5μl/管；氯化镁的浓度优选为25mM，体积更优选为3.5μl/管；dNTPs的体积更优选为2.0μl/管(浓度2.5mM)；第一上游引物的浓度优选为50μM，体积更优选为0.1μl/管；第一下游引物的浓度优选为50μM，体积更优选为0.1μl/管；第一探针的浓度为优选50μM，体积更优选为0.1μl/管；第二上游引物的浓度优选为50μM，体积更优选为0.1μl/管；第二下游引物的浓度优选为50μM，体积更优选为0.1μl/管；第二探针的浓度优选为50μM，体积更优选为0.1μl/管。

第二反应液中的DNA聚合酶优选为普通Taq酶，其浓度优选为5U/ul，体积更优选为0.2μl/管；显色液优选为溴酚兰，其体积更优选为0.02μl/管。该优选的DNA聚合酶能有效使得PCR的反应简捷、降低成本。

优选地，作为本发明的实施例，上述稳定液优选为石蜡，更优选为固体石蜡(熔点高于50℃)与液体石蜡的比值为1∶4～12(w/v)的石蜡，其体积优选为20～25μl/管，更优选为20μl/管。通过该优选石蜡稳定液将上述第一反应液和第二反应液分隔开，从而使得第二反应液中的DNA聚合酶尤其是Taq酶与第一反应液分离，有效保证了DNA聚合酶的活性，延长了本发明试剂盒的保存时间。其中，该第一反应液位于石蜡的下层，第二反应液位于石蜡的上层。在PCR反应过程中，由于温度在95℃，石蜡熔融，使得第一反应液和第二反应液混合，PCR反应得以进行。该优选石蜡的具体内容见专利(200910190112.7)。

进一步优选地，上述致病性大肠杆菌检测试剂盒还包括致病性大肠杆菌DNA提取液、致病性大肠杆菌的阴性对照液和阳性对照品。该致病性大肠杆菌DNA提取液可方便致病性大肠杆菌的DNA提取；该阴性和阳性对照可用于检测时的自我检验，防止检出误差的出现。请参阅图1和图2，图1显示试剂盒中阳性对照的PCR扩增图谱，图2显示试剂盒中阴性对照的PCR扩增图谱。

该致病性大肠杆菌DNA提取液具体成分为：Tris-EDTA缓冲液(0.01～0.02M pH8.0)，含0.01～0.02％NP-40。该DNA提取液可以设置成5ml/管，采用5ml普通离心管(配蓝色盖)。

该阴性对照液不含有致病性大肠杆菌基因的Tris-EDTA缓冲液，其浓度为0.01M～0.015M，pH为8.00～8.02，如浓度为0.01M，pH8.0。该阴性对照液可以设置成40μl/管，采用0.6ml普通离心管(紫色透明)。

该阳性对照品为使用致病性大肠杆菌和/或致病性大肠杆菌DNA提取制备的DNA阳性模板，该阳性对照品可以设置成40μl/管，采用0.6ml普通离心管(橙红色透明)。进行PCR时，将该阳性对照品使用Tris-EDTA缓冲液(0.01M pH8.0)稀释后冷冻保存。

由上述，上述致病性大肠杆菌检测试剂盒的规格优选如下：

阴性对照的规格为1管，40μl/管；阳性对照的规格为1管，40μl/管；DNA提取液的规格为1管，5ml/管；PCR反应液为8管/条×6条，20μl/管(不包含稳定液石蜡体积)。当然，根据致病性大肠杆菌检测的量，可以对该致病性大肠杆菌检测试剂盒的规格进行适应的增大或缩少。

本发明实施例进一步提供一种致病性大肠杆菌检测方法，该检测方法进行检测的流程图如图2，包括如下步骤：

步骤S01，增菌培养和标本处理：

提供致病性大肠杆菌的DNA样品；

步骤S02，实时荧光PCR：

进行实时荧光定量PCR检测，该荧光定量PCR检测步骤中使用上述的致病性大肠杆菌检测试剂盒。

具体地，步骤S01在无菌条件下操作。

该步骤S01中，采集样本，该样本中可能含有致病性大肠杆菌，也可能不含有，需要本发明实施例的检测方法进行检测确定。因此，本步骤S01中，致病性大肠杆菌的DNA样品中可能含有致病性大肠杆菌的DNA，也可能不含有。

将采集后的标本放置37℃恒温室内进行3小时增菌培养；然后在进行如下DNA裂解处理：

取1ml增菌液加入DNA提取液50μL，反复抽吸3次充分混匀标本。

具体地，步骤S02中，取步骤S01中所得到的上清液，进行荧光定量PCR分析，本步骤中所使用的荧光定量PCR设备没有限制，ABI系列、Bio-Rad系列(ICycler/MJ Opticon 2)、Stratagene MX系列、Roche LightCycler、CepheidSmartCycler、Corbett Rotor-Gene、杭州博日系列等。

步骤S02中PCR反应的条件为：

50～55℃：2～5min；

94～95℃：2～3min；

94～95℃：5～10S；

55～60℃：40～80S；(35～40循环)。

优选地，在上述实施例致病性大肠杆菌检测方法中，每次检测还均设置试剂盒中的阳性对照和阴性对照的步骤。这样，自我检验，防止检出误差的出现。

以下结合具体实施例对上述致病性大肠杆菌检测方法进行详细说明。

实施例1

致病性大肠杆菌检测试剂盒的制备

(1)按以下序列合成引物探针：

第一上游引物(37F)为：5’-GATCCCGTATTAAGCCAGTC-3’；

第一下游引物为(37R)：5’-GAATTTGACTTCCGGTACT-3’；

第一探针(37A)为：

5’-(FAM)TTGGGAGAAATGGGGTAATG(DABCYL)-3’；

第二上游引物(38F)为：5’-ATTACTCATGGTTGTTATACC-3’

第二下游引物(38R)为：5’-TAGCTATCATGAGTTAACAGTT-3’

第二探针(38H)为：

5’-(HEX)TGTTAATCAGAATTCATTTGCAA(DABCYL)-3’。

(2)配制含引物探针的PCR反应液：

先配制第一反应液、第二反应液的配制，再将第一反应液加入PCR反应液管内，接着在第二反应液面上加入20微升/管的石蜡，待石蜡冷凝后，在石蜡液面上加入第二反应液，PCR反应液管规格为8管/条×6条，20μl/管(20μl/管是第一反应液和第二反应液的体积，石蜡不计其内)；其中，

第一反应液组分的体积如下：

第二反应液组分的体积如下：

Taq酶           0.2微升/管

溴酚兰          0.02微升/管

灭菌超纯水      1.78微升/管；

(3)配制DNA提取液：0.01M Tris-EDTA缓冲液，pH8.0，含0.01％NP-40，置于DNA提取液管内，规格1管，5ml/管；

(4)阳性对照DNA：提取致病性大肠杆菌基因组DNA，置于EPEC阳性对照管内，规格1管，40μl/管；

(4)阴性对照液：不含有致病性大肠杆菌基因的Tris-EDTA缓冲液(0.01MpH8.0)，规格1管，40μl/管。

实施例2

采用上述实施例1的致病性大肠杆菌检测试剂盒对致病性大肠杆菌检测方法包括如下步骤：

1.检测组：采集致病性大肠杆菌的样本，该样本数为22个，其中一些样本中含有致病性大肠杆菌，一些样本没有致病性大肠杆菌。将采集后的标本放置37℃恒温室内进行3小时增菌培养；然后在进行如下DNA裂解处理：

取1ml增菌液加入DNA提取液50μL，反复抽吸3次充分混匀标本，得到致病性大肠杆菌的DNA样品；取5μl所得的DNA样品，在检测反应器中加入到18μl含引物探针的PCR反应液中；

2.阴性对照组：取5μl Tris-EDTA缓冲液(0.01M pH8.0)，加入至18μl含引物探针的PCR反应液中，该含引物探针的PCR反应液与步骤1相同；

3.阳性对照组：取5μl阳性对照DNA，加入至18μl含引物探针的PCR反应液中，该含引物探针的PCR反应液与步骤1相同；

4.将步骤1-3所得的各组混合物同时放入荧光定量PCR仪中进行反应，荧光定量PCR反应条件为：

50-55℃：2-5min；

94-95℃：2-3min；

94-95℃：5-10S；

55-60℃：40-80S；(35循环)。

根据扩增图谱判定结果，参见图3至图6，其中：

图3为检测组中致病性大肠杆菌阳性结果：扩增曲线图Ct值≤35，并有明显指数增长；

图4为检测组中致病性大肠杆菌阴性结果：扩增曲线图Ct值＞35或无Ct值。

图5为阳性对照组PCR扩增图，图6为阴性对照组PCR扩增图。

实施例3

本发明实施例致病性大肠杆菌检测方法包括如下步骤：

1.采集致病性大肠杆菌的样本，该样本数为22个，其中一些样本中含有致病性大肠杆菌，一些样本没有致病性大肠杆菌。将采集后的标本放置37℃恒温室内进行3小时增菌培养；然后在进行如下DNA裂解处理：

取1ml增菌液加入DNA提取液50μL，反复抽吸3次充分混匀标本，得到致病性大肠杆菌的DNA样品；

2.取上述PCR反应液，该PCR反应液中各个组分为：

第一反应液：

第二反应液：

Taq酶         0.15升/管

溴酚兰        0.01微升/管

灭菌超纯水    1.84微升/管。

在如下条件下进行实施荧光定量PCR反应，并进行检测：

50-55℃：2-5min；

94-95℃：2-3min；

94-95℃：5-10S；

55-60℃：40-80S；(40循环)。

对比实例

本对比实例致病性大肠杆菌检测方法包括如下步骤：

1、采集含有致病性大肠杆菌的样本，该对比例的样本和实施例一的样本一致，将采集后的标本放置37℃恒温室内进行3小时增菌培养；然后在进行如下DNA裂解处理：

取1ml增菌液加入DNA提取液50μL，反复抽吸3次充分混匀标本，得到致病性大肠杆菌的DNA样品；

2、按照前面背景技术所讲的国际通用方法进行检测。

请参阅下表，下表显示应用实施例2和对比实例的方法检测22例样本的结果：

从该表中可以看出，本发明实施例1的方法和对比例的方法接侧结果可知，实施例1试剂盒检测的结果为阳性共12个，阴性共10个；但是传统培养法检测结果为阳性共10个，阴性共12个。由此可知，运用本发明实施例试剂盒检测致病性大肠杆菌的灵敏度更高。分析其缘由是除了传统培养法林敏度相对较低之外，还可能是因为样本中的致病性大肠杆菌已经死掉，传统的培养法没有办法检测出来(在平板上长不出来)，但是它的DNA通过PCR法也即是本发明实施例试剂盒仍是可以检测到的！

另外，采用本发明实施例的检测试剂盒进行致病性大肠杆菌检测只需要约5h，且本发明的检测试剂盒的检测结果与传统培养法检测结果一致，而传统培养法检测致病性大肠杆菌则需要48h以上，因此，从以上结果可以看出，本发明实施例的致病性大肠杆菌检测试剂盒与传统的培养法相比，在检测致病性大肠杆菌方面具有快速、灵敏、安全等优点，可应用于致病性大肠杆菌的检测。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。