一种通过组织培养获得大量小佛肚竹再生植株的方法

摘要

本发明属于生物技术领域，具体为一种通过组织培养获得大量小佛肚竹再生植株的方法。该方法包括采用小佛肚竹幼嫩枝芽芽尖为外植体，经消毒处理后在经改良的诱导培养基上形成愈伤组织，进而诱导胚性愈伤组织的发生，然后，将胚性愈伤组织接种到改良的分化培养基上，诱导胚性愈伤组织分化出芽，再在生根培养基上分化出根，形成完整植株，最后移栽到花盆，完成小佛肚竹再生全程。本发明方法获得小佛肚竹的频率高，适宜于小佛肚竹遗传改良。

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种获得大量小佛肚竹再生苗的方法。

背景技术

小佛肚竹属簕竹属，又名葫芦竹、佛竹、密节竹，是以特形秆作为观赏性状的重要观赏竹之一。小佛肚竹一般具2种秆形：正常秆形的小佛肚竹秆下部略呈之字形曲折；畸形秆形的小佛肚竹节间短缩且肿胀呈花瓶状。后一秆形常用于制作盆景及庭院栽培作观赏用，其竹高25-60cm，直径0.5-2cm，节间较短，一般只有2-5cm，或短缩肿胀呈花瓶状，为著名的观赏竹种，具有广阔的市场前景（陈双林,杨 希.观赏竹种佛肚竹栽培及形态控制[J].福建林业科技,2001,28(1):79~80）。

然而，竹类植物开花间隔期长，开花期无法预测，且种子获取十分困难，萌发率也低。因此，竹子繁殖主要以埋鞭、埋秆、埋节等传统方法为主，这些方法具有消耗种竹多、种苗运输不便、劳动强度大、繁殖系数低等缺点，小佛肚竹也是如此。而且，小佛肚竹畸形秆的变异不稳定，利用生物技术可以高效、快速地对作物品种性状进行遗传改良，从而为小佛肚竹再生植株的培养提供一种方便、快捷和有效的方法。

竹子组织培养方面的研究，最早见于1968年，Alexander和Rao关于竹子合子胚离体培养的简报。国外比较系统开展竹子组织培养工作始于20世纪80年代。我国的竹子组织培养工作开展得较晚，20世纪90年代才开始，阙国宁等以黄竹和印度箣竹2种丛生竹的嫩节作为外植体诱导愈伤组织，最终形成完整植株。现阶段，国内通过以芽繁芽途径来实现竹子植株的再生，其技术已趋于成熟，但通过愈伤组织途径来实现植株的再生，报道并不多。

本发明针对背景技术的不足和缺陷，克服小佛肚竹组织培养过程中再生难的问题，通过不同生长调节剂的组合，设计出适合小佛肚竹再生的培养基，完成小佛肚竹植株再生的时间最快仅为15周左右。为小佛肚竹的快速繁殖和定向生物技术育种奠定了坚实的基础。具有一定的社会效益和经济效益，可以促进我国竹产业的发展。

发明内容

本发明的目的在于提供一种快速、大量获得小佛肚竹再生植株的方法。

本发明提出的获得小佛肚竹再生植株的方法，采用愈伤组织培养技术，包括小佛肚胚性愈伤组织的诱导、分化及植株再生等。具体步骤为：

（1）小佛肚竹胚性愈伤组织的诱导  

将无菌的再生芽的芽尖接种到愈伤诱导培养基进行愈伤诱导，愈伤组织形成四周后将其转接到继代培养基进行增殖培养，得到胚性愈伤组织；其中，所述愈伤诱导培养基为：以MS为基本培养基，再附加6mg/L2,4-D、0.001mg/LTDZ、0.5mg/L萘乙酸（NAA）组成，所述继代培养基为：MS，5mg/L2,4-D，0.5mg/L6-BA，1mg/L 萘乙酸，100mg/L Vc 。

（2）胚性愈伤组织的分化 

将胚性愈伤组织转接到愈伤组织分化培养基上培养，至有再生芽分化形成，一般约一个月左右时间；其中，所述愈伤组织分化培养基为：MS，3mg/L6-BA，0.5mg/LNAA。

（3）小佛肚竹的植株再生    

将已经分化出再生芽的愈伤组织转接到生根培养基中，进行生根培养，其中，所述生根培养基含MS，3mg/l NAA，(0.1-0.5)mg/l 6-BA 。

待根生长至5cm时，可进行再生苗的移栽。再生苗移栽花盆中后置于植物生长室中（湿度在60%-80%，温度（25±1℃），光周期为光照14h/黑暗10h）。

上述培养基组分中，MS为 MS培养基成分（Murashige & Skoog medium，1962，Physiol. Plant 15:473-497 ）， 2,4-D为2,4-二氯苯氧乙酸，TDZ为噻二唑苯基脲，6-BA为6-苄氨基腺嘌呤，Vc为 维生素C。

本发明方法获得小佛肚竹的频率高，适宜于小佛肚竹遗传改良。 

附图说明

图1 小佛肚竹的枝芽外植体。

图2 小佛肚竹枝芽诱导出的愈伤组织。

图3 小佛肚竹愈伤组织在增殖培养基上生长一段时间后的愈伤组织。

图4 小佛肚竹愈伤组织在分化培养基上分化一个月后长出芽体。

图5 小佛肚竹愈伤组织在分化培养基上分化三个月后长出的芽丛。

图6 小佛肚竹再生苗的生根。

图7 移栽成功的小佛肚竹再生植株。

具体实施方式

小佛肚竹组织培养的方法获得大量再生植株的方法的操作步骤如下：

（1）外植体的选择：本发明的实验中选取材料为小佛肚竹（Bambosa vantricosa）的无菌苗的再生芽。（图1）

（2）胚性愈伤组织的诱导与保持：选取无菌苗上刚萌发的再生芽，切取离芽尖约1.5cm的茎段（图2）。接到愈伤诱导培养基(MS+TDZ0.001mg/L+ 2,4-D6mg/L+ NAA0.5mg/L)，四周后愈伤组织形成，将形成的愈伤组织转接到愈伤增殖培养基（MS+5mg/L2,4-D+0.5mg/L6-BA+1mg/L 萘乙酸+100mg/LVc）进行增殖培养。（图3）

（3）胚性愈伤组织的分化：胚性愈伤组织培养30天后，将愈伤组织转接到分化培养基（MS+3mg/L6-BA+0.5mg/LNAA）上，使愈伤组织分化成芽。（图4、图5）

（4）再生芽的生根与移栽：将分化后的芽转接至生根培养基中（MS+3mg/l NAA+(0.1-0.5)mg/l 6-BA），2周后，就有不定根产生，待根生长至5cm时，可进行再生苗的移栽。再生苗移栽花盆中后置于植物生长室中（湿度在60%-80%，温度（25±1℃），光周期为光照14h/黑暗10h）（图6、图7）。

本实验中所有培养基都在灭菌前将pH调到5.8，灭菌条件为121℃下18min。培养室温度为（25±1℃）。光周期为14h/黑暗10h。培养物表面的光照强度约为3000lx。