植物生长发育相关蛋白ABP7及其编码基因与应用

摘要

本发明公开了一种与植物生长发育相关的蛋白质及其编码基因与应用。本发明所提供的蛋白质为下述1)或2)：1)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；2)将1)所限定的蛋白质的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加，且与植物生长发育相关的由1)衍生的蛋白质。实验证明，本发明所提供的蛋白质能够加速植物生长发育，提高植物产量，具体体现在：叶片面积变大、开花时间缩短、种子萌发时间缩短、初生根伸长、种子体积增大、种荚变长、种子的千粒重增加。

说明书

技术领域

本发明涉及一种与植物生长发育相关的蛋白质及其编码基因与应用，特别涉及一 种来源于玉米的与植物生长发育相关的蛋白质ABP7及其编码基因与应用。

背景技术

玉米是分布最广泛的粮食作物之一，产量居世界粮食作物的首位。中国的玉米产 量仅次于美国居世界第二位。近年来，我国玉米的主要用途是用于生产配合饲料和工 业原料，并且这种需求正在快速增长。据预测，2020年我国对玉米的需求将达到2.14 亿吨，如果仍然按照目前的生产水平发展，届时国内的玉米生产能力只能达到1.63亿 吨，有5100万吨的缺口。鉴于以上情况，在土地资源有限的前提下，发展玉米生产， 培育具有优良性状的玉米新品种成为我国粮食产业的主要任务之一。

植物的生长发育和形态建成是一个十分复杂的过程，其归根结底是由基因控制 的，是基因的选择性表达及大分子的修饰和更新的过程。以下仅举几个例子说明基因 对植物生长发育的调节作用：

一、植物侧根的形成和发育相关基因

植物侧根的形成被大量的基因所调控，其中，ALF4基因编码一种未知功能的蛋白， 这种蛋白被认为可以使中柱鞘细胞有能力进行侧根的起始；slr突变体有正常的主根而 没有侧根，SLR基因编码IAA14(一种转录抑制蛋白)，它在侧根起始方面具有特殊作 用。近年的研究表明，两类转录调节蛋白生长素反应因子(ARF)和Aux/IAA在生长 素控制的植物侧根发育中起着重要的作用。生长素促进Aux/IAA蛋白与SCF^TIR1复合 体之间的相互作用，从而促进Aux/IAA的泛素化和降解，这样就让ARF在生长素诱 导的转录中起作用。NAC基因家族中的新成员NAC1能受生长素的诱导，可调节生长 素信号转导而促进侧根的发育。NAC1是一个转录激活因子，由一个N末端保守的NAC 区域和C末端激活区域组成，NAC区域能与DNA结合。NAC1能激活两个下游的生 长素反应基因(DB和AIR3)的表达。转基因植物(表达反义NAC1 cDNA)表现为侧 根形成减少，而且TIR1诱导的侧根发育能被反义NAC1 cDNA的表达所阻断，NAC1  的超表达能恢复生长素反应突变体tir1的侧根形成，表明NAC 1在TIR1的下游起作 用。

目前的研究表明，二十余种基因调控侧根的发育，其中包括ABA1、ABI1、ABI4、 ABI5、ALF、AUX1、AXR1、AXR4等，但是人们目前对植物调控这些基因的机制仍不 十分清楚。

二、控制花分生组织的基因

现已发现有一小群基因对花的分生组织的发生是必须的。当它们突变后，茎或类 茎的结构将取代花的结构。目前已知有5个基因：lfy(leafy)、apl(apetala1)、ap2(apetala2)、 cal(cauliflower)和ufo(unusual floral organs)。这五个基因中，以lfy作用最强、表达最早。 弱的lfy等位基因的突变能把最底层的花分生组织完全转变为花序枝条；强的lfy等位 基因则可以产生异常的花，花被类叶的苞片包裹。稍后表达的是ap1基因，ap1突变 体的特征是：仅个别的基底花转变为花序枝条，而且不象正常枝条那样包被在叶腋之 中；上部的花转变为小花簇，数朵花簇生于小柄之上。值得注意的是lfy和ap1双突变 体的花分生组织无论在基底部还是在上部都完全转变为花序枝条。cal基因的作用似乎 与ap1类似。例如，cal与弱的ap1的双突变体类似于一个强的ap1突变体，而cal与 强的ap1则类似于一个更强的ap1突变现象。ap2对花分生组织的决定作用不如以上 三个基因那么清楚。弱的、异质的等位基因ap2-1类似于一个强的ap1等位基因；它 们与lfy间的作用方式相似。

三、细胞壁的生长相关基因

细胞壁的生长是通过细胞壁松弛和细胞壁组分的填充和结构的修饰改变来完成 的。细胞壁的松弛对细胞壁的生长是很必要的，其中木葡聚糖内转糖基化酶 (Xyloglucan endotransglycosylase，XET或XTH)和扩展蛋白(Expansin)两种酶起 着关键的作用。XET在植物体内属于一个多基因家族(拟南芥中超过22个)，有催化 转糖基化与水解的作用，目前的研究表明，XET可以通过水解细胞壁的组成成分，通 过作用于与纤维素微纤丝相连的木葡聚糖而重新调整纤维素微纤丝的网络结构，从而 达到促进细胞生长的作用。扩展蛋白是目前已知的唯一能在体外引起细胞壁扩展的蛋 白质。它们广泛存在于所有有花植物的组织中，例如拟南芥中含有26个α-扩展蛋白 和5个β-扩展蛋白。扩展蛋白受环境和激素信号的调节，在这些基因的启动子区域中 有激素调节元件，旱胁迫诱导植物根系伸长，同时也促进了扩展蛋白的mRNA含量与蛋 白含量的升高。同时，扩展蛋白基因的表达具有一定的时空特异性，不同的扩展蛋白 在植物发育的不同阶段表达；果实成熟阶段扩展蛋白基因大量表达；扩展蛋白可以使 热灭活的细胞壁松弛，恢复其酸生长与延伸性；能破坏纤维素与几种交联聚糖之间的 氢键，导致植物细胞壁延伸。

综上所述，植物特定的基因在激素、代谢物及环境因素的相互作用下，依时间和 空间顺序表达出特定的产物，这些产物或者直接构成分化的组织或器官，或者充当开 启其它基因表达的信号分子，或者作为酶催化产生有特定生理功能的组织或器官特异 的物质，由此可以看出，影响植物生长发育的基因调控网络是极其复杂的。因此，新 的发育调节基因的发现对了解植物发育机理和利用其人工改良农作物的品种资源是十 分必要的。

发明内容

本发明的目的是提供一种与植物生长发育相关的蛋白质及其编码基因。

本发明所提供的蛋白质，命名为ABP7，来源于玉米(Zea mays L.)，为下述1) 或2)的蛋白质：

1)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

2)将1)所限定的蛋白质的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和 /或缺失和/或添加，且与植物生长发育相关的由1)衍生的蛋白质。

编码所述ABP7蛋白的基因(ABP7)也属于本发明的保护范围。

编码所述ABP7蛋白的ABP7基因为如下3)-6)中任一所述的基因：

3)编码序列是序列表中序列1第124-1185位核苷酸序列的基因；

4)核苷酸序列为序列表中序列1的基因；

5)在严格条件下与3)或4)的基因杂交，且编码上述ABP7蛋白的基因；

6)与3)或4)或5)所限定的基因具有90％以上的同源性，且编码上述ABP7 蛋白的基因。

其中，序列1由1584个核苷酸组成，第124-1185位为ABP7基因的编码序列， 编码序列表中序列2所示蛋白质。序列2由353个氨基酸组成。

含有上述ABP7基因的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌也属于本 发明的保护范围。

所述重组表达载体可为在质粒pBI121中插入上述ABP7基因，得到的表达所述 ABP7基因的重组质粒(pBI121-ABP7-Full)。在本发明的一个实施例中，所述ABP7 基因具体插入到了质粒pBI121的酶切位点Sma I和EcoICRI之间，得到表达所述ABP7 基因的重组质粒pBI121-ABP7-Full。

所述表达盒由能够启动所述ABP7基因表达的启动子，ABP7基因，以及转录终止 序列组成。

所述重组菌具体可为携带有所述ABP7基因的农杆菌，如携带有所述ABP7基因 的GV3101。

所述ABP7蛋白，或所述ABP7基因，或上述重组表达载体、表达盒或重组菌在 调节植物生长发育，和/或植物产量中的应用也属于本发明的保护范围。

所述植物生长发育体现在如下a)-e)中至少一个：

a)叶片面积；

b)开花时间；

c)种子萌发时间；

d)初生根长度；

e)衰老速度；

所述叶片面积为土中生长4周的成熟苗的最大的两片莲座叶的面积，在本发明的 一个实施例中，所述叶片面积具体采用Image J软件测得。所述开花时间为从种子萌 发到开花所用的时间。所述种子萌发时间为从播种到胚根长至1cm所用时间。所述衰 老速度可从叶片表型(颜色)，以及叶绿素含量上体现：叶片失绿，叶绿素(叶绿素a 和/或叶绿素b)含量下降为植物衰老的标志。

所述植物产量体现在如下f)-h)中至少一个：

f)种子体积；

g)种荚长度；

h)种子的千粒重。

所述种子的千粒重为1000粒同一株系种子的重量。

在本发明的实施例中，所述植物生长发育的调节具体体现在叶片面积增大、开花 时间缩短、种子萌发时间缩短、初生根伸长、衰老速度加快；所述植物产量的调节具 体体现在种子体积增大、种荚变长、种子的千粒重增加。

本发明的另一个目的是提供一种培育生长发育加速和/或产量提高的转基因植物 的方法。

该方法包括如下步骤：将所述ABP7基因导入目的植物中，得到表达生长发育速 度快于所述目的植物，和/或产量高于所述目的植物的转基因植物。

所述生长发育体现在如下a)-e)中至少一个：

a)叶片面积；

b)开花时间；

c)种子萌发时间；

d)初生根长度；

e)衰老时间；

所述叶片面积为土中生长4周的成熟苗的最大两片莲座叶的面积，在本发明的一 个实施例中，所述叶片面积具体采用Image J软件测得。所述开花时间为从种子萌发 到开花所用的时间。所述种子萌发时间为从播种到胚根长至1cm所用时间。所述衰老 速度可从叶片表型(颜色)，以及叶绿素含量上体现：叶片失绿，叶绿素(叶绿素a 和/或叶绿素b)含量下降为植物衰老的标志。

所述产量体现在如下f)-h)中至少一个：

f)种子体积；

g)种荚长度；

h)种子的千粒重。

所述种子的千粒重为1000粒同一株系种子的重量。

所述植物为拟南芥，如columbia型拟南芥。

实验证明，本发明所提供的ABP7蛋白能够加速植物生长发育，提高植物产量， 具体体现在：叶片面积增大、开花时间缩短、种子萌发时间缩短、初生根伸长、种子 体积增大、种荚变长、种子的千粒重增加。

附图说明

图1为ABP7转基因拟南芥不同纯系的生长表型及其表达量差异。其中，A为ABP7 转基因拟南芥不同纯系的生长表型；B为ABP7转基因拟南芥不同纯系中ABP7基因 的表达量。A和B中，1均表示对照系(转入pBI121空载体的拟南芥)；2均表示ABP7 转基因系2-2；3均表示ABP7转基因系4-8；4均表示ABP7转基因系6-9。

图2为种子相关表型测量结果。其中，A为显微镜下的种子；B为种子千粒重的 统计结果；C为种荚长度比较结果；D为种荚长度统计结果。A-D中，1均表示对照 系(转入pBI121空载体的拟南芥)；2均表示ABP7转基因系2-2；3均表示ABP7转 基因系4-8；4均表示ABP7转基因系6-9。

图3为叶面积测量结果。其中，A为叶片宽度；B为叶片长度；C为叶片面积。

图4为花期表型结果。其中，A为开花时间的表型体现；B为自萌发到开花时间 统计结果；C为开花时的莲座叶数目统计结果。A-C中，1均表示对照系(转入pBI121 空载体的拟南芥)；2均表示ABP7转基因系2-2；3均表示ABP7转基因系4-8；4均 表示ABP7转基因系6-9。

图5为衰老速度比较。其中，A为衰老速度的表型体现；B为叶绿素a和叶绿素 b含量的测定结果。A和B中，1均表示对照系(转入pBI121空载体的拟南芥)；2均 表示ABP7转基因系2-2；3均表示ABP7转基因系4-8；4均表示ABP7转基因系6-9。 A中1-4，从左侧至右侧均为新叶至成熟叶片。

图6为种子萌发时间。其中，横坐标数值表示时间(单位：h)。

图7为初生根伸长结果。其中，A为初生根伸长的表型体现；B为初生根根长统 计结果。A和B中，1均表示对照系(转入pBI121空载体的拟南芥)；2均表示ABP7 转基因系2-2；3均表示ABP7转基因系4-8；4均表示ABP7转基因系6-9。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1、ABP7基因的获得

玉米材料：选用玉米自交系齐319(利用外源种质选育优良玉米自交系及强优 势杂交种的实践与思考，《山东农业科学》，叶金才，03：11-13，2000，公众可从中 国农业科学院生物技术研究所获得。)授粉后17天(17dpp)的幼胚。

菌种：大肠杆菌E.coli DH5α，DH10B、JM109及酵母菌株yWAM2(Leu^-His^-Trp^-) (Sikorski R.S.and Hieter P.，A System of Shuttle Vectors and Yeast Host Strains  Designed for Efficient Manipulation of DNA in Saccharomyces cerevisiae.Genetics， 1989，vol.122：19-27，公众可从中国农业科学院生物技术研究所获得)

载体：pBluescript II SK+(美国STRATAGENE公司，产品目录号212205)、 pRS315HIS(Wang M.M.and Reed R.R.，Molecular cloning of the olfactory neuronal  transcription factor Olf-1 by genetic selection in yeast.Nature 364(6433)，121-126， 1993，公众可从中国农业科学院生物技术研究所获得)及pPC86(S.T.Cooper and I. M.Hanson，A screen for proteins that interact with PAX6：C-terminal mutations disrupt  interaction with HOMER3，DNCL1 and TRIM11，BMC Genetics 2005，6：43，公众可从 中国农业科学院生物技术研究所获得)

工具酶和修饰酶：各种限制性内切酶和修饰酶购自Promega公司，New England  Biolab公司和Gibco公司。

化学试剂：酵母培养用试剂均购自Sigma公司和Oxford公司；其它化学药品 均为国产分析纯。

试剂盒：质粒DNA提取用Promega公司的Wizard^TM Minipreps DNA Purification  System和Wizard^TM Maxipreps DNA Purification System；回收DNA用鼎国公司的 DNA片段快速纯化/回收试剂盒；RNA提取用Promega公司的RNAgents Total RNA  Isolation System kit和PolyATtract mRNA Isolation System；文库构建用GibcoBRL公司 的SuperScript^TM Plasmid System for cDNA Synthesis and Plasmid Cloning kit。

引物合成：由北京赛百盛生物工程公司和上海博亚生物技术有限公司合成。

测序：由上海博亚生物技术有限公司完成。

以下为玉米ABP7基因的获得过程：

1、玉米总RNA的提取和mRNA的分离：

玉米总RNA的提取和mRNA的分离分别按Promega公司的RNAgents Total RNA  Isolation System kit和PolyATtract mRNA Isolation System进行。取玉米自交系齐319 的17dpp幼胚1g，提取总RNA2.834mg，共分离出mRNA43.7μg。

2、玉米幼胚17dpp cDNA文库的构建：

按GibcoBRL公司的SuperScript^TM Plasmid System for cDNA Synthesis and Plasmid  Cloning kit进行。取出5μg 17dpp的mRNA用于cDNA文库构建，反转录引物用： Not I adapter：5’-pGACTAGTTCTAGATCGCGAGCGGCCGCCC(T)15-3’，

双链合成后加Sal I adapter：5’-TCGACCCACGCGTCCG-3’；

3’-GGGTGCGCAGGCp-5’；

再用Not I酶切，构建到经Sal I和Not I酶切纯化后的pPC86(Trp⁺)载体上。转化 E.coli.DH10B，得到库容量为5.2×10⁶cfu的cDNA文库。

3、cDNA文库的扩增：

配2×LB培养基4L(Bacto-胰蛋白胨20g/L，Bacto-酵母膏10g/L，NaCl 10g/L， SeaPrep琼脂糖3g/L，pH 7.0)，121℃灭菌30min后，37℃温育2小时；加入氨苄青 霉素至终浓度200mg/L；加入上述步骤2所得的cDNA文库中至浓度为10⁶cfu/L；混 匀后，分装20～30mL到50mL的培养管中；冰浴1小时；30℃培养40小时；8000rpm 离心10min，收集菌体；弃上清，加入200mL 2×LB(含甘油12.5％)悬浮细胞，分 装成10mL一份于-70℃保存备用。

4、4mer ABRE诱饵载体的构建

合成引物ABRE(+)：5′-GAAGTCCACGTGGAGGTGG-3′和ABRE(-)： 5′-TCCCACCTCCACGTGGACT-3′，各取20μl(1μg/μl)ABRE(+)和ABRE(-)，混匀， 加4μl浓度为3M的NaOAc和100μl的无水乙醇，-20℃，30分钟后12000rpm离心， 沉淀DNA，70％乙醇洗一次，干燥，加6.5μl无菌水，1μl的10×的T4多核苷酸激酶 缓冲液，退火：条件是88℃，2min；65℃，10min；37℃，10min；25℃，5min；加 1.5μl 20mM的ATP和1μl T4多核苷酸激酶，37℃反应2小时，加苯酚-氯仿和氯仿 各抽提一次，用无水乙醇沉淀DNA。再加2μl的10×连接酶缓冲液，1μl连接酶 (5units/μl)，17μl无菌水，16℃连接过夜，用2％的琼脂糖电泳，分离大小约为80bp 的DNA片段，克隆到pBluescript II SK+载体上(经Spe I酶切，补平)，测序，获得 pA4质粒。

pRS315His(Leu⁺)载体及pA4质粒均用BamHI、Xba I双切后纯化，把4mer ABRE 克隆到pRS315HIS，得到诱饵载体pRSA4(Leu⁺)质粒。

5、玉米幼胚17dpp cDNA文库的筛选

制备酵母菌株yWAM2(Leu^-His^-Trp^-)感受态细胞，把步骤4所得的诱饵载体 pRSA4(Leu⁺)转化到酵母菌株yWAM2(Leu^-His^-Trp^-)中，转化方法参照Two Hybrid  System TRAFO Protocol进行。获得含有pRSA4的酵母菌株yA4(His^-，Trp^-)。用所得的 含有诱饵载体pRSA4的yA4酵母对步骤3的cDNA文库进行筛选，转化方法同上， 将转化细胞涂到His^-选择培养基上，28℃培养3～5天。待酵母长出(进行文库筛选时， 转入的cDNA文库中含有目的cDNA克隆(pPC86-ABP7)，其编码蛋白(ABP7)与 pRSA4上的ABRE结合导致下游报告基因HIS3表达，因此目的酵母克隆可在His^-选 择培养基上长出)后，提酵母质粒(候选目的cDNA克隆pPC86-ABP7)，提取方法参 照Method I：Quick Plasmid DNA Preparations from Yeast(Christine Guthrie 1991)。将酵母 质粒转化E.Coli DH5α，从中提取质粒，酶切分析，测序可知所获得的阳性克隆的DNA 序列，再对序列进行分析，从而获得阳性克隆pPC86-ABP7。测序表明，ABP7基因的 序列如序列表中序列1所示，其中第124-1185位为编码区序列，编码得到序列表中序 列2所示蛋白质(ABP7蛋白)。

实施例2、转ABP7基因拟南芥生长发育表型分析

YEB液体培养基：5g胰蛋白胨，1g酵母提取物，5g蔗糖，0.5g MgSO4，用1M  NaOH调节pH值至7.2-7.5，定容于1L的去离子水中，121℃高压灭菌15min。

YEB固体培养基：在每升YEB液体培养基中加入琼脂15g，121℃高压湿热灭菌 15min。

1/2MS培养基：1.65g NH₄NO₃，1.9g KNO₃，0.37g MgSO₄·7H₂O，0.17g KH₂PO₄， 0.44g CaCl₂·2H₂O，5ml(200×)有机元素，5ml(200×)微量元素，5ml(200×)铁盐，20g 蔗糖，2L定容至；用1M的KOH调pH至5.7-5.8，加入琼脂糖至终浓度0.8％(w/v)； 121℃高压灭菌20min。

一、重组表达载体pBI121-ABP7-Full的构建

以实施例1的阳性克隆pPC86-ABP7中的ABP7基因(序列1)为模板，以 ABP7-FW 1：5’-cggatatcgtcgctttcccccaaatcc-3’(划线部分序列为EcoR V酶切识别位点) 和ABP7-RV1：5’-cagttaacacttggactttcgtcatc-3’为上下游引物(划线部分序列为Hpa I酶切 识别位点)，进行PCR扩增。用Sma I和EcoICRI双酶切pBI121载体(北京天恩泽基 因科技有限公司，产品目录号111010-2)，并回收大片段。将上述PCR扩增得到的产 物经EcoR V和Hpa I双酶切后与pBI121载体酶切回收的大片段按照3∶1连接，16℃ 过夜，转化到大肠杆菌DH5α中，得到的重组质粒经酶切、测序，鉴定正确的克隆命 名为pBI121-ABP7-Full。

二、农杆菌介导的拟南芥基因转化

1、重组表达载体pBI121-ABP7-Full热激转化农杆菌

将冻存的农杆菌GV3101(Biovector Science Lab，Inc.，产品目录号Biovector-822) 感受态细胞置于冰上融化，200μl GV3101感受态细胞中加入约10μl的DNA(步骤一 构建的重组表达载体pBI121-ABP7-Full)；冰浴5min；液氮冻5min；37℃水浴中 5-10min；加入800μl SOC液体培养基，28℃，200rpm培养2-4h；将菌液涂于含有相 应抗生素的YEB固体培养基上，28℃暗培养2天。从长出的农杆菌菌落中提取质粒 DNA，用引物ABP7-FW1和ABP7-RV1进行PCR鉴定。将鉴定正确(PCR产物大小 约为1581bp)，表明转入重组表达载体pBI121-ABP7-Full的农杆菌命名为 GV3101/pBI121-ABP7-Full。同时设置转入pBI121空载体的农杆菌对照，将其命名为 GV3101/pBI121。

2、拟南芥的遗传转化

(1)遗传转化用拟南芥的培养：消毒的拟南芥columbia型种子播于1/2MS平板 上，4℃冰箱春化4℃处理3天，放置于培养箱(120μmol photons·m^-2s^-1，22℃，光照 16小时；18℃，暗8小时)中培养约7-10天，移至土中。当初生薹长出后从根部剪 去初生薹，使其抽出大量的次生薹，当开花较多时可用于转化，转化前一天浇饱和水 一次。

(2)拟南芥的遗传转化：挑GV3101/pBI121-ABP7-Full(或GV3101/pBI121)单 菌落，接种于5ml的YEP液体培养基(kan 50mg/L，Rif50mg/L)中，28℃，250rpm 培养约19h；将活化的菌液按1∶200的比例转接入含200ml YEP培养基(kan 50mg/L， Rif 50mg/L)的500ml锥形瓶中，28℃200rpm继续培养约14h；测量OD600值， OD600＝1.5～3.0时即可；4℃，5000rpm，离心10min，收集菌体，弃上清；加入2倍 体积10％蔗糖(含0.02％Silwet L-77，美国GE公司，产品目录号：SL77080596)，将 菌体充分悬浮；转化前剪去拟南芥中已经长出的小果荚，将菌液倒置于大培养皿中， 将花浸泡其中约40s后取出，用吸水纸将残余菌液吸去，将浸染后的拟南芥倒置避光 培养24h后正常培养，收集种子(T₀代)。

三、转基因拟南芥生长发育表型分析

1、转基因拟南芥植株抗性的筛选和PCR检测

将收集到的T₀代转基因拟南芥种子灭菌处理后，播种在1/2MS培养基上(含kan  50mg/L)，4℃春化3天，放置于培养箱(22℃，光照16小时；18℃，暗8小时)中 培养，约7天后在Kan抗性培养板上出现黄化苗和绿苗，转基因植株表现为Kan抗性， 呈正常绿色，非转基因植株呈黄色。将绿苗移至1/2MS培养板上5天恢复生长后，转 移至土中。

当转移至土中的苗长至10-12片叶子时按照如下方法提取叶片提取基因组DNA： 1)取1片叶子，置于1.5ml离心管中，加入适量液氮，用预冷的玻璃研磨棒将叶片研 磨成粉末，加入700μl的DNA提取液(100mM NaCl；100mM Tris-HCl，pH8.5；50mM  EDTA；1％SDS)，60℃水浴30min。2)加入200μl酚∶氯仿(1∶1)，充分混匀。3)4 ℃，12000rpm离心10min。4)吸上清600μl至一个新离心管中，加入600μl异丙醇， 混匀充分，-20℃沉淀15-20min。5)4℃，12000rpm离心15min。6)弃上清，75％乙 醇洗涤DNA，加入30μl超纯水(内含无DNA酶的20μg/ml的胰RNA酶)重新溶解 DNA沉淀，37℃保温30min去除RNA后，得到转基因拟南芥的基因组DNA，-20℃ 保存备用。

以上述制备的转基因拟南芥的基因组DNA为模板，利用引物ABP7-Fw3： 5′-GAACCGCCCAAGGACTAC-3′，ABP7-Rv3：5′-TCCGCTTGGTCACAGAATG-3′进行 PCR鉴定PCR扩增条件：94℃5min；94℃30s，60℃30s，72℃40s，30个循环； 72℃5min。将鉴定的阳性(目的片段约370bp)植株保留即为T₁代转基因植株，下 一代继续单株收种为T₂代种子，T₂代转基因植株继续用Kan筛选，出现黄苗∶绿苗＝1∶3 的T₂株系单株收种，T₃代植株全部表现卡那霉素抗性的T₂代单株为纯合植株。

通过三代抗性(Kan)和PCR筛选，最终获得三个不同ABP7转基因拟南芥纯系， 分别命名为2-2、4-8和6-9。

2、转基因拟南芥不同纯系的生长表型及ABP7基因表达量差异

将上述步骤1获得的三个不同ABP7转基因拟南芥纯系(2-2、4-8和6-9)的种子， 以及对照系(转入pBI121空载体的拟南芥)种子分别播种于1/2MS平板，4℃春化三 天，于光照培养箱中生长约7天长至两片真叶时，移至含有1/2MS培养基的培养瓶中， 置于培养箱中生长两周后，移至土中，约4周后观察其生长表型(如图1中A所示)， 之后取整株，液氮冷冻，贮存于-80℃冰箱中。参照实施例1中玉米总RNA的提取及 反转录获得cDNA的方法提取转基因拟南芥的总RNA并进行反转录，获得cDNA。

以Actin2作为内参基因，使用引物Actin2-Fw1：5′-CCAACAGAGAGAAGATGACT- 3′；和Actin2-Rv1：5′-ATGTCTCTTACAATTTCCCG-3′均一化模板；PCR体系如下： 10×PCR缓冲液2μl，cDNA 1μl，2.5mM dNTP 2μl，10μl Actin2-Fw10.5μl，10μl Actin2-Rv1 0.5μl，Taq酶(2.5U/μl)0.5μl，ddH₂O补至20μl。PCR反应条件：94℃5min； 94℃30s，60℃25s，72℃30s，28个循环；72℃10min。根据用Actin2引物获得的 PCR产物电泳结果调整模板cDNA的用量；用ABP7基因内部引物ABP7-Fw3： 5′-GAACCGCCCAAGGACTAC-3′，ABP7-Rv3：5′-TCCGCTTGGTCACAGAATG-3′扩增 cDNA模板，分析不同ABP7过表达拟南芥株系中ABP7基因的表达水平。

图1为三个不同ABP7转基因拟南芥纯系，即2-2、4-8和6-9和转入pBI121空载 体的拟南芥的生长表型(图1中A所示，其中转入pBI121空载体的拟南芥的生长表 型与未经转基因的拟南芥表型一致)，以及ABP7基因的表达量(图1中B所示)。这 一结果显示，其中2-2和4-8两个系ABP7基因的表达量相似，6-9的表达相对较弱， 而它们的生长表型强弱与ABP7基因表达量的多少呈现一致性。

3、转基因拟南芥植株生长发育表型观察与统计(一)

将同一时期的上述步骤1获得的三个不同ABP7转基因拟南芥纯系(2-2、4-8和 6-9)的种子，以及对照系(转入pBI121空载体的拟南芥)种子分别播种于1/2MS平 板，春化(4℃)三天，于光照培养箱中生长约7天长至两片真叶时，移至含有1/2MS 培养基的培养瓶中，置于培养箱中生长两周后，转入土中生长至成熟。从以下几个方 面进行生长发育表型的观察与统计：

(1)种子相关表型测量：统计千粒重和种荚长度，对比转基因系(2-2、4-8和 6-9)和对照系(转入pBI121空载体的拟南芥，以及未转基因的拟南芥)。具体的，待 三个转基因株系(2-2、4-8和6-9)和对照系的拟南芥植株种子成熟后，分别收获种荚， 一方面，测量种荚长度，另一方面分别收集种子，测量1000粒种子的重量。测量种荚 长度设三次重复，每次重复每个株系的拟南芥选择10株，每株上采集最长的5个种荚， 测量结果取三次重复实验的平均值。测量种子千粒重也设三次重复，每次重复每个株 系的拟南芥选择20株，收集所有种子，混匀后每个株系随机选取1000粒进行测重， 测量结果取三次重复实验的平均值。

(2)叶面积测量：将土中生长至4周的成熟苗照相，使用Image J软件测量最大 的两片莲座叶长度和宽度以及面积，对比转基因系(2-2、4-8和6-9)和对照系(转入 pBI121空载体的拟南芥，以及未转基因的拟南芥)。实验设三次重复，每次重复每个 株系的拟南芥选择30株，测量结果取三次重复实验的平均值。

(3)开花时间：一是统计植株开花时的莲座叶片数目，二是统计从种子萌发到植 株开花所用的时间。对比转基因系(2-2、4-8和6-9)和对照系(转入pBI121空载体 的拟南芥，以及未转基因的拟南芥)。实验设三次重复，每次重复每个株系的拟南芥选 择20株，测量结果取三次重复实验的平均值。

(4)植株衰老之叶绿素测量：植物衰老时最明显的变化就是由于叶绿素合成能力 下降，叶片失绿，光合下降，逐渐使植物失去活力。而叶绿素a、叶绿素b是最重要 的两种叶绿素，它们的含量可以作为植物衰老的标志之一。摘取土中生长至6周的成 熟苗的叶片(约50mg)，置于液氮捣碎，然后用80％丙酮抽提约4小时至叶片全部漂 白，12000rpm离心5min，吸上清，于分光光度计上分别读取663nm，和647nm处 的吸光值。叶绿素a和叶绿素b含量分别由下列公式求得：叶绿素a＝12.25 A₆₆₃-2.79 A₆₄₅；叶绿素b＝21.50A₆₄₅-5.10A₆₆₃。对比转基因系(2-2、4-8和6-9)和对照系(转 入pBI121空载体的拟南芥，以及未转基因的拟南芥)。实验设三次重复，每次重复每 个株系的拟南芥选择5株，测量结果取三次重复实验的平均值。

种子相关表型的结果如图2所示：与对照系相比，转基因系(2-2、4-8和6-9)的 种子体积增大(图2中A)，种荚变长(图2中C和D)，种子千粒重显著提高(图2 中B)，且ABP7表达量高的转基因系(2-2和4-8)的粒重显著高于表达量低(6-9) 的；对种荚长度的统计结果也显示相同的趋势(转入pBI121空载体的拟南芥与未转基 因的拟南芥在种子相关表型上基本一致)。该结果说明ABP7基因过表达显著提高转基 因植株的种子粒重和种荚长度。

叶片表型的结果如图3所示：无论是叶片长度、宽度还是叶面积，转基因系(2-2、 4-8和6-9)植株与对照系植株相比都要明显变大，其中2-2和4-8的叶面积几乎是对 照系的两倍之多(转入pBI121空载体的拟南芥与未转基因的拟南芥在叶片表型上基本 一致)。以上结果说明ABP7能够增大转基因拟南芥植株的叶片面积。

花期表型结果如图4所示：转基因系(2-2、4-8和6-9)植株开花提前，且与对照 系相比速度快的很多，特别是表达较强的2-2和4-8系在开花时的莲座叶数目约为对 照系的60-70％(转入pBI121空载体的拟南芥与未转基因的拟南芥在花期表型上基本 一致)。以上结果说明ABP7能够缩短转基因拟南芥植株的开花时间。

植株衰老之叶绿素测量的结果如图5中B所示：在转基因系(2-2、4-8和6-9) 植株中的叶绿素含量严重下降，特别是2-2和4-8两个系，只有大约0.15mg/g鲜重， 而对照系大约含有0.4mg/g。同时，观察转基因系(2-2、4-8和6-9)和对照系在衰老 时期叶片的变化，发现正常生长的转基因系(2-2、4-8和6-9)的新叶和成熟叶片均有 不同程度的失绿现象，而在底部的老叶差异则较大，转基因系2-2和4-8的老叶几乎 全部失绿，对照系则几乎无太大影响(图5中A)(转入pBI121空载体的拟南芥与未 转基因的拟南芥在叶绿素测量的结果上基本一致)。以上结果说明ABP7对转基因拟南 芥植株的衰老起到了促进作用。

4、转基因拟南芥植株生长发育表型观察与统计(二)-种子萌发实验

将同一时期的上述步骤1获得的三个不同ABP7转基因拟南芥纯系(2-2、4-8和 6-9)的种子(每个系80粒)，以及对照系(转入pBI121空载体的拟南芥，以及未转 基因的拟南芥)种子(80粒)分三次重复，播种于1/2MS固体培养基上，先置于4 ℃春化3天，放于光照培养箱中培养。光照培养箱中生长，每隔十二小时统计一次， 以胚根出现1mm为标准计算萌发率。

结果如图6所示，ABP7转基因拟南芥纯系种子的萌发速度要比对照系(转入 pBI121空载体的拟南芥)种子的萌发速度快，表达较强的2-2和4-8在36小时已经达 到100％，而对照系只有80％(转入pBI121空载体的拟南芥与未转基因的拟南芥在种 子萌发的速度上基本一致)。

5、转基因拟南芥植株生长发育表型观察与统计(三)-初生根伸长实验

将同一时期的上述步骤1获得的三个不同ABP7转基因拟南芥纯系(2-2、4-8和 6-9)的种子，以及对照系(转入pBI121空载体的拟南芥，以及未转基因的拟南芥) 种子播种于1/2MS培养基，春化3天，光照培养箱中生长至子叶刚刚萌动，10天后 测量主根长度。每次实验每个系至少30株，实验设三次重复。

结果如图7所示，ABP7转基因拟南芥纯系植株的初生根长度要比对照系稍长一 些(转入pBI121空载体的拟南芥与未转基因的拟南芥在初生根长度上基本一致)。