法律状态公告日
法律状态信息
法律状态
2015-08-05
授权
授权
2012-09-12
实质审查的生效 IPC(主分类):A61K49/00 申请日:20101005
实质审查的生效
2012-07-11
公开
公开
【技术领域】
本发明涉及光声成像用造影剂和使用所述光声成像用造影剂的光 声成像方法。
【背景技术】
近年作为光学诊断成像方法报道了光声成像。此方法使用超声波 的相比光在体内(在样品中)散射少的性质，及以高分辨率成像吸收 的光能的体内密度分布。特别是，方法涉及：用脉冲光照射活体；检 测自吸收了体内传播的/扩散的脉冲光的能量的生物学组织形成的声 波(超声波)的信号；及分析这些信号以获得吸收的光能的体内密度 分布。光声成像是方便的和非侵袭的诊断方法。但是，由于在生物学 组织中的光散射及吸收，入射光的能量以依赖于离身体表面的距离的 方式在体内大大衰减。结果，有关活体深区的信息难以获得。从组织 穿透的观点预期了使用近红外光的光声成像的实现。
已报道用于改善光声成像中的检测灵敏度或对比度的光声成像用 造影剂(非专利文献1)。施用于活体的造影剂分布在待观察的生物 学组织中。然后造影剂可通过吸收照射组织的脉冲光的能量来产生声 波。由此，光声成像用造影剂可增加含有此造影剂的组织的表观吸收 系数，即，可将源于光声成像用造影剂的声波添加到源于内源性组织 的声波。此改善待观察组织的检测灵敏度。非专利文献1公开含有氧 化铁粒子的粒子，作为用于光声成像用造影剂的化合物的一例。在此 文献中，已从主要由磁赤铁矿(γ-Fe2O3)组成的含有氧化铁粒子的粒 子得到光声信号，展示了光声成像用造影剂的实用性。
而且，已报道在损伤区中特异性表达的分子光声成像用造影剂(例 如，专利文献1和非专利文献2)。具有可特异性结合于特定分子的配 体分子的造影剂结合于靶分子。有关靶分子的存在或缺失和量的信息 和其位置信息可通过检测自造影剂的光声信号来获得。
专利文献1和非专利文献2公开用近红外线荧光染料，作为光声 成像用造影剂中的光声信号-发送部标记的肽或抗体。此荧光染料-标 记的肽或抗体的应用被认为达到光声成像，因为此肽或抗体致使造影 剂特异性结合于靶分子。但是，此光声成像具有光声成像用造影剂低 敏感的问题，即，造影剂的每分子吸收系数低。当靶分子的表达水平 低或当靶分子存在于活体深区时，此问题变得更严重。另一方面，相 比全抗体单独，单链抗体单独具有降低结合性能。而且，大量的有机 染料可结合于全抗体。得到的抗体具有不足的抗原结合性能。由此， 需求甚至以结合染料的形式也具有足够的抗原结合性能的光声成像用 造影剂。
而且，专利文献2公开了其上固定抗-CD227(MUC1)抗体的单 链抗体片段的含有氧化铁粒子的粒子。但是，专利文献2的粒子旨在 用于肿瘤的热疗。作为成像用造影剂的最佳分子设计及其光声发送能 力未通过任何方式公开。
氧化铁粒子已通过使用其物理性质应用于医疗领域。氧化铁粒子 已通过使用其超顺磁性作为磁共振设备(MRI)的造影剂用于实际应 用。已确认氧化铁粒子作为MRI造影剂的有效性和生物学安全性。
而且，已尝试使用Resovist(注册商标)，含有氧化铁粒子的葡 聚糖粒子(非专利文献3)的光声成像。此方法使用氧化铁粒子吸收 光而产生声波的机理。
此外，特异性结合于特定组织的配体分子可固定于氧化铁粒子及 用作诊断用途的探针。特定受体在癌组织中表达，不像正常组织。表 皮生长因子受体2(HER2)在癌组织中受体特异性表达。已报道可如 下实现癌成像：将针对HER2的抗体固定于含有氧化铁的造影剂；并 通过MRI检测蓄积到癌的造影剂(专利文献2)。
专利文献2公开了抗-CD227(MUC1)抗体的单链抗体片段固定 到氧化铁纳米级粒子的粒子。但是，专利文献2的粒子旨在用于肿瘤 的热疗。未通过任何方式公开作为成像用造影剂的最佳分子设计及其 光声发送能力。
【现有技术文献】
【专利文献】
PTL 1：National Publication of International Patent Application No.2003-500367
PTL 2：WO2008/134586
【非专利文献】
NPL 1：IEEE Ultrasonics Symposium 393，(2006)
NPL 2：Bioconjugate Chem.，19(6)，1186-1193(2008)
NPL 3：Biomedizinische Technik(Biomedical Enginee ring)2009， 54：83-88
【发明内容】
【发明要解决的技术课题】
作为非专利文献1中描述的光声成像用造影剂氧化铁粒子无配体 分子，由此，原理上难以特异性成像靶分子。
专利文献1和非专利文献2中描述的荧光染料-修饰的抗体或肽能 特异性结合于靶分子。不过，由于自荧光发射的入射光能量的损失和 低的荧光染料的每分子吸收系数而不可获得足够的光声信号。此外， 用许多荧光染料的抗体或肽的修饰减少抗体或肽与靶分子的结合能 力，导致灵敏度的有限的改善。
由此，本发明旨在提供能高度结合于靶分子及发送高光声信号的 新光声成像用造影剂。
而且，在非专利文献3中，将Resovist(注册商标)，含有氧化 铁粒子的葡聚糖粒子，用作光声成像用造影剂。但是，在此文献中使 用的Resovist是已以通过MRI成像肝的目的开发的造影剂。氧化铁 粒子具有小至1～10nm的粒径，其适合于MRI成像。由此，此光声 成像用造影剂呈现了获得的信号强度弱的问题。
由此，本发明旨在提供具有氧化铁粒子的光声成像用造影剂，其 中氧化铁粒子具有15nm～500nm的粒径。
【解决课题的技术方案】
本发明提供式1所代表的光声成像用造影剂：
MNP-((L)l-(P)m)n(式1)
其中，
MNP代表含有氧化铁粒子的粒子；
L代表接头分子；
P代表配体分子；
l代表0或1；及
m和n代表1或更大的整数，
光声成像用造影剂包括：
吸收近红外线区的光的含有氧化铁粒子的粒子；及
固定于含有氧化铁粒子的粒子的至少一个或更多配体分子，其中 配体分子的固定密度等于或大于靶分子的细胞表面密度。
本发明也提供具有氧化铁粒子的光声成像用造影剂，其中氧化铁 粒子具有15nm～500nm的平均粒径。
【发明效果】
本发明的光声成像用造影剂包括固定了配体分子的吸收高近红外 线区的光的含有氧化铁的粒子。因此，可将本发明的光声成像用造影 剂用作高度敏感光声成像用造影剂。
特别，HER2-结合分子作为配体分子的使用可允许造影剂大量位 于表达HER2的细胞表面或细胞或其邻域中。结果，自表达HER2的 细胞表面或细胞或其邻域之内的光声信号相比其他位点的更强。
而且，作为结合于含有氧化铁的粒子的抗体的单链抗体的使用可 提供具有更高抗原结合性能的光声成像用造影剂。
本发明使用发射强光声信号的氧化铁粒子，并可因此提供相比常 规技术的那些发射更优良的光声信号的造影剂。
【附图说明】
[图1]图1是显示包括配体分子和含有氧化铁粒子的粒子的本 发明的光声成像用造影剂的示意性模式图。
[图2]图2是显示作为本发明的光声成像用造影剂的一例的固 定了抗体的氧化铁粒子的每细胞表面HER2分子的抗体数(抗体 /HER2摩尔比)的图。
[图3A]图3A显示评价作为本发明的光声成像用造影剂的一例的 固定了抗体的氧化铁粒子的HER2结合能力和结合特异性的结果。
[图3B]图3B显示评价作为本发明的光声成像用造影剂的一例的 固定了抗体的氧化铁粒子的HER2结合能力和结合特异性的结果。
[图4A]图4A显示测量固定了抗体的氧化铁粒子的光声信号的结 果。
[图4B]图4B显示测量固定了抗体的氧化铁粒子的光声信号的结 果。
[图4C]图4C显示测量固定了抗体的氧化铁粒子的光声信号的结 果。
[图5]图5显示施用于患癌的小鼠的固定了配体分子的氧化铁 粒子的药代动力学(在施用后24小时)的结果。
[图6]图6显示施用于患癌的小鼠的具有改变粒径的固定了 scFv的氧化铁粒子的药代动力学(在施用后24小时)的结果。
[图7A]图7A是(1)显示粒子的光声信号和摩尔吸收系数之间 的关系的图及是(2)显示粒子的摩尔吸收系数和粒子中的铁含量(每 粒子铁量)之间的关系的图。
[图7B]图7B是(1)显示粒子的光声信号和摩尔吸收系数之间的 关系的图及是(2)显示粒子的摩尔吸收系数和粒子中的铁含量(每粒 子铁量)之间的关系的图。
[图8]图8是显示施用于患癌的小鼠的具有改变的粒径的固定 了scFv的氧化铁粒子的肿瘤蓄积(在施用后24小时；以％ID/g表示) 的图。
[图9]图9显示施用于患癌的小鼠的固定了HER2-结合肽的含 有氧化铁粒子的粒子HBP-EO-NP-200的药代动力学(在施用后24小 时)的结果。
[图10]图10显示施用于患癌的小鼠的scFv-EO2k-NP-200和 scFv-EO5k-NP-200的药代动力学(在施用后24小时)的结果。
[图11]图11是用于小动物的生产的光声成像设备的简化图。
[图12]图12显示在小鼠皮肤下scFv-EO-NP-200的光声成像的结 果。
[图13A]图13A是显示本实施方式的光声成像用造影剂的结构 的示意性模式图。
[图13B]图13B是显示本实施方式的光声成像用造影剂的结构 的示意性模式图。
[图13C]图13C是显示本实施方式的光声成像用造影剂的结构 的示意性模式图。
[图13D]图13D是显示本实施方式的光声成像用造影剂的结构 的示意性模式图。
[图13E]图13E是显示本实施方式的光声成像用造影剂的结构 的示意性模式图。
[图13F]图13F是显示本实施方式的光声成像用造影剂的结构 的示意性模式图。
[图13G]图13G是显示本实施方式的光声成像用造影剂的结构 的示意性模式图。
[图13H]图13H是显示本实施方式的光声成像用造影剂的结构 的示意性模式图。
[图13I]图13I是显示本实施方式的光声成像用造影剂的结构的示 意性模式图。
[图13J]图13J是显示本实施方式的光声成像用造影剂的结构 的示意性模式图。
[图14A]图14A是显示产生本实施方式的光声成像用造影剂的 方法的一例的图。
[图14B]图14B是显示产生本实施方式的光声成像用造影剂的 方法的一例的图。
[图15]图15显示光声信号强度的波形。
[图16A]图16A显示相对于氧化铁粒子的粒径的摩尔吸收系 数。
[图16B]图16B显示相对于氧化铁粒子的粒径的摩尔吸收系 数。
[图16C]图16C显示相对于氧化铁粒子的粒径的光声信号。
[图16D]图16D显示相对于氧化铁粒子的粒径的光声信号。
[图17A]图17A显示评价用于光声成像的造影剂1(NP1)的结 果。
[图17B]图17B显示评价用于光声成像的造影剂1(NP1)的结 果。
[图18A]图18A显示评价用于光声成像的造影剂2(NP2)的结 果。
[图18B]图18B显示评价用于光声成像的造影剂2(NP2)的结 果。
[图19]图19是用于光声成像的造影剂3(NP3)的冷冻-TEM图 像。
[图20A]图20A是显示光声成像用造影剂的粒径和光声信号之 间的关系的图。
[图20B]图20B是显示光声成像用造影剂的粒径和光声信号之 间的关系的图。
【实施方式】
下文中，会参照附图等描述本发明的实施方式。这些实施方式个 别公开了本发明的光声成像用造影剂和使用造影剂的光声成像的例。 本发明的技术范围不限于它们。
(第1实施方式)
根据第1实施方式的光声成像用造影剂如式1所示，且包括：吸 收近红外线区的光的含有氧化铁粒子的粒子；及固定于含有氧化铁粒 子的粒子的至少一个或更多配体分子，其中配体分子的固定密度等于 或大于靶分子的细胞表面密度。
MNP-((L)l-(P)m)n(式1)，其中MNP代表含有氧化铁粒子的粒 子；L代表接头分子；P代表配体分子；l代表0或1；及m和n代表1 或更大的整数。
本实施方式的光声成像用造影剂已关注于含有氧化铁粒子的粒子 在近红外线区的高吸收系数而实现。此造影剂的特征是：吸收近红外 线区的光的含有氧化铁粒子的粒子可用于在光声成像中与配体分子组 合；及配体分子的固定密度等于或大于靶分子的细胞表面密度。
本发明首次显示：包括含有氧化铁粒子的粒子及靶向分子的复合 物适合作为光声成像用造影剂；及具有等于或高于靶分子的细胞表面 密度的固定密度的靶向分子适合于光声成像用造影剂。
(光声成像用造影剂)
在本发明中，″造影剂″定义为可增强样品中主要要观察的组织或 分子和它们的相邻组织或分子之间的对比度，及改善要观察的组织或 分子的形态学或位置信息的检测灵敏度的化合物。在此情景中，″光 声成像用造影剂″是指在光声成像中使用的造影剂。
(氧化铁粒子)
在本实施方式中使用的氧化铁粒子不特别限制，只要氧化铁粒子 吸收600nm～1300nm的近红外线波长区的光，以发送光声信号及无 害于人身体。可使用Fe3O4(磁铁矿)，γ-Fe2O3(磁赤铁矿)之一和 其混合物。特别，可使用磁铁矿。磁铁矿已知相比磁赤铁矿在近红外 线波长区具有更高摩尔吸收系数，由此认为发射更强光声信号。磁铁 矿作为信号-发送部的使用，相比常规光声成像用造影剂，可改善灵敏 度。而且，氧化铁粒子可为选自下列的晶体状态：单晶，多晶和无定 形。而且，氧化铁粒子数可为1。或者，可使用包括2个或更多氧化 铁粒子的次级粒子。氧化铁粒子可具有大的粒径，例如，50nm。在该 情况中，摩尔吸收系数/mol铁原子的值和光声信号测量的/mol铁原子 的值随着造影剂中含有的氧化铁粒子数增加而增加。另一方面，氧化 铁粒子可具有5nm的粒径。在该情况中，摩尔吸收系数及测量的光声 信号/mol铁原子的值甚至当造影剂中含有的氧化铁粒子数增加也不怎 么改变。
可在本实施方式中使用的氧化铁粒子具有如下粒径：1～1000nm， 特别1～100nm。氧化铁粒子的粒径可通过本领域已知的方法测量， 诸如透射电子显微镜(TEM)观察或X-射线衍射。氧化铁粒子可通过 本领域已知的氧化铁粒子制备方法适当制备用于使用。或者，可使用 可商购的产品。
在此情景中，近红外光或近红外线区的光是指具有在近红外线区 中600～2500nm的波长的电磁波。在本实施方式中，可使用具有600～ 1300nm的波长的近红外线区的光。特别，可使用具有700～800nm的 波长的近红外线区的光。这是因为此波长区的光被样品中分子低吸收， 可相对深深穿透样品组织，且对样品是安全的。
本实施方式的光声成像用造影剂的吸收区可为但不限于近红外线 区中的600～2500nm。紫外光和700nm或更低的可见区中的光也可用 于施用到样品之后待观察的受试者的样品内观察或样品外观察。
(含有氧化铁粒子的粒子)
在本实施方式中，含有氧化铁粒子的粒子是指仅由氧化铁粒子组 成的粒子或在基质诸如聚合物中(例如，葡聚糖)或氧化硅中含有氧 化铁粒子的粒子。根据本实施方式的含有氧化铁粒子的粒子从水动力 观点可具有1～1000nm的直径。在此情景中，″基质″是指能在其中含 有或保留氧化铁粒子，并与氧化铁粒子形成复合物的化合物。基质可 为任何化合物，只要化合物可稳定地在其中含有或保留氧化铁粒子。 从水溶解度或水分散性的观点来看，基质可为亲水聚合物诸如葡聚糖， 聚氨基酸，聚乙二醇，聚(乳酸-共-乙醇酸)，白蛋白或胶原。它们之中， 特别，可使用葡聚糖。
构成含有氧化铁粒子的粒子的基质(例如，葡聚糖)与氧化铁粒 子(基质(g)/氧化铁(g))之间的重量比可为1或更大。此值代表氧 化铁粒子的包被的状态。所述值越小，氧化铁粒子表面更可能暴露， 导致粒子的更差的分散稳定性。此重量比可通常为0.1～10，特别在1～ 5的范围内。
而且，基质可为具有抑制含有氧化铁粒子的粒子聚集的效应且具 有用于固定配体分子的官能团的化合物。例如，化合物可为葡聚糖， 及官能团可选自：羧基，氨基，马来酰亚胺和羟基。官能团可根据本 领域已知的化学修饰方法导入葡聚糖。例如，可将葡聚糖粒子交联于 表氯醇，然后用氨处理，以制备具有氨基的葡聚糖粒子。含有氧化铁 粒子的粒子可通过本领域已知的含有粒子的粒子制备方法适当制备用 于使用。或者，可使用可商购的产品。
(配体分子)
″配体分子″是指可特异性结合于靶分子的化合物。而且，本文所 述的短语″特异性结合″定义为对于靶分子1μM或更低的解离常数KD (值越低表示结合亲和力更高)。配体分子不特别限制，只要配体分 子是具有对于靶分子1μM或更低解离常数的化合物。其例包括酶，抗 体，受体，细胞因子，激素和血清蛋白。从低解离常数和分子结构稳 定性的观点出发，本实施方式的配体分子特别可为抗体。
本文所述的″抗体″是由免疫系统应答特定抗原或物质诱导的免 疫球蛋白家族的蛋白的总称。抗体是可识别特定靶分子并结合于此靶 分子的物质。抗体可选自：小鼠，人，人源化的及嵌合抗体或可源于 其他物种。而且，抗体可选自：单克隆和多克隆抗体。此外，可使用： 抗体片段，部分抗体，其是能结合于靶分子的抗体的更低-分子量衍生 物。抗体片段的例包括Fab片段(下文中，也缩写为″Fab″)，Fab′ 片段(下文中，也缩写为″Fab′″)，F(ab′)，F(ab′)2，单独重链可变(VH) 结构域，单独轻链可变(VL)结构域，VH-VL复合物，骆驼化的VH 结构域，及含有抗体互补决定区(CDR)的肽。
它们中，特别，可使用具有经肽接头连接的重链可变区和轻链可 变区的单链抗体(scFv)。此外，可特别使用人源化的单链抗体。单 链抗体可根据各种抗原经济地和便利地制备且相比通常抗体具有更小 分子量。由此，单链抗体的使用可增加每个含有氧化铁粒子的粒子的 固定的抗体量。此外，单链抗体是抗体的无Fc结构域(恒定区)，并 可因此减少抗原性(接收本发明的光声成像用造影剂的个体中的抗原 性)。因此，单链抗体可特别用作本实施方式的光声成像用造影剂中 的配体分子。
(靶分子)
本实施方式的光声成像用造影剂可，特别在受影响的组织诸如肿 瘤的诊断用光声成像中使用。由此，在本实施方式中，″靶分子″不特 别限制，只要靶分子是源于样品生物的分子。靶分子是指在样品中的 损伤区特异性表达的分子，特别是在样品中的肿瘤位点特异性表达的 分子。其例包括肿瘤抗原，受体，细胞表面膜蛋白，蛋白酶和细胞因 子。根据本实施方式的靶分子可为肿瘤抗原。
肿瘤抗原的特定例包括血管内皮生长因子(VEGF)家族，血管 内皮生长因子受体(VEGFR)家族，前列腺特异性抗原(PSA)，癌 胚抗原(CEA)，基质金属硫蛋白酶(MMP)家族，表皮生长因子受 体(EGFR)家族，表皮生长因子(EGF)，整联蛋白家族，1型胰岛 素-样生长因子受体(IGF-1R)，CD184抗原(CXC趋化因子受体4： CXCR4)，及胎盘生长因子(PlGF)。特别，可使用EGFR家族的 表皮生长因子受体2(HER2)。
特异性结合于肿瘤抗原的配体分子可由本领域技术人员容易获 得。例如，抗体可通过本领域已知的抗体制备方法用抗原或其部分肽 作为免疫原适当制备用于使用。从制备的抗体的基因序列信息，也可 通过基因重组方法获得作为重组蛋白的单链抗体。或者，可使用可商 购的产品。
(含有氧化铁粒子的粒子和配体分子之间的结合反应)
含有氧化铁粒子的粒子通过常规熟知的与作为反应性基团的存在 于含有氧化铁粒子的粒子表面的官能团(例如，羧基，氨基，马来酰亚 胺或羟基)的偶联反应直接结合于配体分子。直接结合的特定例包括 酰胺化反应。此反应，例如，通过羧基或其酯衍生物与氨基的缩合来 进行。羧基可使用碳二亚胺稠合剂诸如N，N′-二环己基碳二亚胺或1- 乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐直接酰胺化。或者，羧基 也可使用N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)预先转变为活性酯，以促进酰胺 化反应。
此外，也可使用硫氢基和马来酰亚胺基之间的结合反应。在此反 应中，可在中性区进行有效和选择性结合反应。通过反应结合于配体 分子的含有氧化铁粒子的粒子可通过超滤或凝胶过滤层析洗涤或纯 化。而且，含有氧化铁粒子的粒子的铁磁形式可通过磁分离使用永久 磁体洗涤或纯化。另一方面，呈现超顺磁性的含有非常小氧化铁粒子 的粒子可使用磁柱在高-梯度磁场下洗涤或纯化。
(接头分子)
而且，在本实施方式的光声成像用造影剂中，含有氧化铁粒子的 粒子和配体分子之间的结合不限于直接结合，而且可为经接头分子的 适当的结合。在此情景中，″接头分子″定义为将含有氧化铁粒子的粒 子连接到配体分子的化合物。可使用的接头分子选自：双官能短-链烷 (例如，链烷二巯基和链烷二胺)和双官能聚环氧乙烷。例如，接头 分子的末端基团可结合于含有氧化铁粒子的粒子的官能团，而接头分 子的另一末端基团可结合于配体分子的官能团。
在式1中，l所代表的接头分子数是0或1。当l是0时，含有氧 化铁粒子的粒子直接结合于配体分子。在此情况中，m是1及等于n， 并且固定于粒子的配体分子数是n。另一方面，当l是1，含有氧化铁 粒子的粒子经接头分子L结合于配体分子。当l和m二者是1时，固 定于粒子的配体分子数是n。但是，接头分子可为多官能分子。在该 情况中，每接头分子结合多个配体分子。特别是，当l是1且m是2 或更大时，固定于粒子的配体分子数是m×n。特别，l和m可为1。
将含有氧化铁粒子的粒子和配体分子结合于接头分子的方法和接 头分子类型不特别限于上述那些，且可为由本领域技术人员从各种可 利用的结合方法和本领域中已知的接头分子适当选择的。从样品内使 用的观点出发，本发明的光声成像用造影剂可旨在水中稳定地分散。 在这点上，可特别使用水溶性接头分子。例如，可使用双官能聚环氧 乙烷。如在下述实施例中所述，聚环氧乙烷作为接头分子的使用不仅 提高造影剂粒子的产率(最终纯化产物量与投料量的比)，而且提高 水中光声成像用造影剂的分散稳定性。只要不损伤含有氧化铁粒子的 粒子和配体分子的功能，聚环氧乙烷的分子量可任意选择。聚环氧乙 烷的分子量的过量的增加会减小配体分子与含有氧化铁粒子的粒子表 面的结合反应的效率。由此，可使用具有100～2000的平均分子量， 特别，300的平均分子量的聚环氧乙烷。由此，其平均分子量可为 100～10000，特别，在100～5000的范围内。具有300的平均分子量 的聚环氧乙烷更适合。
(光声成像用造影剂的粒径)
从水动力观点出发，本实施方式的光声成像用造影剂的平均粒径 是1～500nm且可为10～200nm。造影剂粒径的增加会增强造影剂的 吞噬，减少其血中半衰期，及减少组织扩散。造影剂可通过根据靶分 子的位置位点适当调整最佳粒径来使用。例如，对于存在于血管中的 靶分子，造影剂的粒径可大至约1μm。另一方面，对于血管外靶分子， 造影剂的水动力平均粒径可为1～500nm，特别，10～200nm。从光 声信号强度的观点出发，高的每粒子铁含量是适当的。因此，从药代 动力学和光声信号的观点出发，可使用100～500nm的粒径。如在下 述实施例中所述，具有高的铁含量且具有171.7nm(数平均分布)靶 向分子的氧化铁粒子被确认具有高吸收系数，高的向靶分子的结合能 力，及有利的肿瘤蓄积，展示其作为光声成像用造影剂的高实用性。
在将造影剂运输到一般的血管外肿瘤组织中，从造影剂的组织扩 散的观点出发，具有小粒径的造影剂可能对于从血管之内迁移到血管 外组织和向血管外组织中靶分子的迁移通路有利。另一方面，含有氧 化铁粒子的粒子由于固定于表面的配体分子而具有更大平均粒径。因 此，小-尺寸配体分子可适合于血管外组织中肿瘤的光声成像。由此， 相比通常抗体具有更小分子量的单链抗体可特别在本实施方式的光声 成像用造影剂中用作配体分子。而且，光声成像用造影剂的平均粒径 可通过本领域已知的方法测量诸如动态光散射。
(光声成像用造影剂的功能亲和性)
本实施方式的光声成像用造影剂每个含有氧化铁粒子的粒子具有 至少一个或更多配体分子。每个含有氧化铁粒子的粒子结合的配体分 子数(化合价)，即，配体分子的固定密度(ng/cm2)，会大大地影 响光声成像用造影剂与靶分子的结合能力。特别是，由配体分子的化 合价的增加导致的多价结合效应增强光声成像用造影剂的功能亲和性 (也称之为″表观亲和性″；下文中，也称之为″结合能力″)。由于增 强的功能亲和性，光声成像用造影剂可更强烈结合于靶分子，达到高- 对比度光声成像。而且，功能亲和性可通过如下方法评价，诸如ELISA (酶联免疫吸附测定)，光谱方法，石英-结晶微量天平(QCM)， 或表面等离子体共振(SPR)现象。光声成像用造影剂和靶分子之间 的解离常数(或″表观解离常数″)应是1μM或更低及可为10nM或 更低，特别，1nM或更低。
在式1中，固定于粒子的配体分子数由m×n表示。如下所述，由 m和n表示的更大整数适合于增强造影剂的功能亲和性。对于本发明， 有必要以等于或高于靶分子的细胞表面密度的固定密度固定配体分 子。由此，n是依赖于靶分子的细胞表面密度的值。一般而言，m可 为1，及n可选自1～300000。特别对于具有约20nm的粒径的氧化 铁粒子，m可为1，及n可在2～50的范围内。更大粒径致使更大数 的配体分子固定。例如，几百到数万配体分子可固定于200nm氧化铁 粒子。固定的配体分子数依赖于配体分子的尺寸。
而且，配体分子的固定密度会不仅影响光声成像用造影剂与靶分 子的结合能力，而且影响其分散稳定性或药代动力学。例如，表面上 具有马来酰亚胺基的含有氧化铁粒子的粒子可具有差水中分散稳定 性，这是由于其疏水性。在该情况中，配体分子的固定密度的增加可 改善含有氧化铁粒子的粒子的分散稳定性。
(光声成像用造影剂的结合能力的改善)
等于或高于存在于细胞表面的靶分子的密度的配体分子的固定密 度(细胞表面密度)可能达到高结合状态。由此，如果测定靶分子的 细胞表面密度，具有对应期望的配体分子的固定密度的光声成像用造 影剂可设计为有效产生多价结合效应。在这点上，重要的是固定的状 态的配体分子以何种程度维持其结合活性。依赖于此程度，固定密度 与结合能力之间的关系可改变。而且，可固定于含有氧化铁粒子的粒 子的表面的靶向分子数具有依赖于含有氧化铁粒子的粒子的表面积和 活性基团数的上限及还依赖于配体分子的尺寸。由此，为改善光声成 像用造影剂的结合能力，重要的是基于靶分子密度，配体分子的尺寸， 及固定之后配体分子的结合活性维持比的配体分子的合理的固定。
如在下述实施例中所述，具有对HER2的高结合能力及结合选择 性的造影剂作为本实施方式的光声成像用造影剂的一例。特别是，需 要以下结构用于使配体分子的固定密度至等于或大于HER2的细胞表 面密度：如下述实施例中所述，靶向分子以每个含有氧化铁粒子的粒 子3或更多，特别，7或更多分子的比例固定于含有氧化铁粒子的粒 子(水动力直径：20nm)。此外，选择单链抗体，及其固定于含有氧 化铁粒子的粒子使用通过诱变将半胱氨酸导入单链抗体的C-端及采 用定点固定。结果，单链抗体以超过HER2的细胞表面密度的大固定 密度固定到含有氧化铁粒子的粒子，同时维持单链抗体的结合活性。 因而，成功地大大改善含有氧化铁粒子的粒子的HER2结合能力。
(可使用的光声成像用造影剂的例)
在本实施方式的光声成像中，来自施用于样品的光声成像用造影 剂的光声信号(即，声波的声压)与光声成像用造影剂的吸收系数和 浓度成比例。由此，光声成像用造影剂需要的性质是高吸收系数和与 靶分子的高结合能力。
可在本实施方式中使用的光声成像用造影剂的一例是具有固定于 含有磁铁矿的葡聚糖基质(水动力直径：20nm)的HER2-结合单链 抗体的光声成像用造影剂。如在下述实施例中所述，单链抗体以每个 含有氧化铁粒子的粒子3或更多，特别6或更多分子的比例固定，用 于达到与HER2的高结合能力。该结构可允许单链抗体具有等于或高 于HER2的细胞表面密度的固定密度。
考虑到HER2-阳性细胞(强烈表达株)中一般的HER2的细胞表 面密度(106HER2分子/细胞和就10μm细胞直径而言1pmol HER2/cm2)，光声成像用造影剂可具有与HER2的足够的多价结合， 和可能达到强结合能力。发送高光声信号的磁铁矿(氧化铁)粒子的 使用具有如下优势：磁铁矿粒子不仅贡献于灵敏度，光声成像瓶颈的 改善，而且因为无害于样品而对剂量无严格的限制。至今未报道合理 地设计的光声成像用造影剂，及本发明首次证明其实用性。
(使用光声成像用造影剂的光声成像方法)
本实施方式的光声成像用造影剂可用于靶分子的光声成像。特别 是，本实施方式的靶分子的光声成像方法至少包括：将本实施方式的 光声成像用造影剂施用于样品或获自样品的样品；用脉冲光照射样品 或获自样品的样品；及测量源于结合于样品或获自样品的样品中存在 的靶分子的光声成像用造影剂的光声信号。
本实施方式的靶分子成像方法的一例如下：将本实施方式的光声 成像用造影剂施用于样品或添加到获自样品的样品，诸如器官。在此 情景中，样品是指每种生物，包括但不特别限于哺乳动物诸如人，实 验动物，及宠物及其他生物。样品中的样品的例可包括器官，组织， 组织切片，细胞和细胞裂解物。光声成像用造影剂施用或添加之后， 将样品等用具有近红外线范围内的波长的激光脉冲光照射。
使用声波检测器，例如，压电变换器检测来自光声成像用造影剂 的光声信号(声波)，及转变为电信号。基于此使用声波检测器获得 的电信号，可计算样品等中吸收体的位置或尺寸和光学特征值诸如吸 收系数的分布。例如，当光声信号检测为等于或高于参照阈值的值， 可假定此样品含有靶分子或产生靶分子的位点。或者，可假定样品含 有靶分子或产生靶分子的位点，或可假定源于一个样品的样品含有产 生靶分子的位点。
(光声成像用造影剂的利用)
本实施方式的光声成像用造影剂可基于上述原理用于靶分子，例 如，在肿瘤中特异性表达的肿瘤抗原的光声成像。例如，光声成像用 造影剂可用于与抗原水平具有关联的肿瘤的诊断，也可特别用于与乳 腺癌相关的肿瘤抗原的光声成像方法。用培养的细胞或组织作为测定 样品，光声成像用造影剂也可用于研究疾病目的。而且，本实施方式 的光声成像用造影剂可用于靶分子的筛选。
而且，为诊断患疾病的患者的状态或在健康个体中预防性地诊断 疾病的目的，造影剂也可通过将造影剂导入样品或获自样品的细胞或 组织来用于靶分子的光声成像方法。基于使用本实施方式的光声成像 用造影剂的光声成像的诊断方法包括：将光声成像用造影剂导入培养 的细胞，或自样品收集的细胞或组织，或样品；及检测疾病-相关的靶 分子，以监控疾病的位置和严重性。
其特定用途的例包括使用本实施方式的光声成像用造影剂，特别， 具有HER2-结合分子作为配体分子的本实施方式的光声成像用造影 剂的HER2的光声成像。本文所述的HER2也称之为ErbB2，c-Erb-B2 和p185HER2。HER2是EGFR家族的酪氨酸激酶-型受体。HER2是在 腺癌(下文中，也缩写为″表达HER2的细胞″)诸如乳腺癌，前列腺 癌，胃癌，卵巢癌和肺癌中基因-扩增的及过表达的物质(蛋白)。 HER2通过HER2分子的二聚体(也称之为同源二聚体)或HER2与 另一EGFR分子的二聚体(也称之为异源二聚体)的形成来活化。更 特别是，同源二聚体或异源二聚体形成被认为导致自磷酸化，其然后 诱导向核的细胞生长信号转导，导致细胞生长，渗透，转移，凋亡抑 制，等。
在此情景中，HER2难以与另一EGFR家族的分子形成的异源二 聚体形式内化。特别是，在此情况中，物质的HER2-介导的细胞摄取 难以发生，导致细胞外物质被表达HER2的细胞的减少的摄取。由此， HER2异源二聚体形成的抑制可能允许HER2容易迁移到表达HER2 的细胞。
在本实施方式的光声成像用造影剂中，通过将大量的HER2-结合 抗体固定到含有氧化铁粒子的粒子达到等于或高于HER2的细胞表面 密度的固定密度。因此，本实施方式的光声成像用造影剂可通过促进 HER2同源二聚体形成，通过在另一EGFR家族成员与HER2结合之 前造影剂与HER2结合，或通过由造影剂的异源二聚体的直接解离来 抑制异源二聚体形成。
特别，本实施方式的光声成像用造影剂相比其他位点，更大量位 于表达HER2的细胞或其邻域，因为造影剂结合于HER2。此外，造 影剂与HER2的结合抑制异源二聚体形成，允许HER2容易保持在表 达HER2的细胞中。因此，造影剂更可能位于表达HER2的细胞。由 于该协同效应，提高了表达HER2的细胞或其邻域中的造影剂浓度， 以产生强光声信号。
(第2实施方式)
(具有HER2-结合单链抗体的含有氧化铁粒子的粒子)
本发明的第2实施方式包括式2所代表的化合物，化合物具有： 含有氧化铁粒子的粒子；及至少一个或更多表皮生长因子受体2 (HER2)-结合单链抗体(scFv)。
MNP-(-(L)l-(P)m)n(式2)，其中MNP代表含有氧化铁粒子的粒 子；L代表接头分子；P代表表皮生长因子受体2(HER2)-结合单链抗 体(scFv)；l代表0或1；及m和n代表1或更大的整数。
可将化合物用作本发明的光声成像用造影剂和可用作磁共振成像 (MRI)的造影剂。此外，具有含有氧化铁粒子的铁磁或顺磁粒子的 化合物可通过使用特异性结合于HER2的性质用于HER2的磁分离或 纯化。
(第3实施方式)
本实施方式的光声成像用造影剂具有含有氧化铁的粒子，其中粒 子结合于单链抗体。
本发明人发现，结合于含有氧化铁的粒子的单链抗体相比结合于 含有氧化铁的粒子的全抗体具有更高结合性能。此可因为单链抗体可 在非抗原识别位点的位点结合于含有氧化铁的粒子，然而全抗体在其 抗原识别位点结合于含有氧化铁的粒子。
(第4实施方式)
本实施方式的光声成像用造影剂具有氧化铁粒子，其中氧化铁粒 子具有15nm～500nm的粒径。具有15nm或更大的粒径的氧化铁粒 子相比具有小于15nm的粒径的氧化铁粒子具有更大摩尔吸收系数及 测量的光声信号/mol铁原子的值。因此，可在光声成像方法中使用本 实施方式的光声成像用造影剂获得大光声信号。而且，氧化铁粒子可 特别具有如下粒径：20nm或更大。
根据本实施方式的光声成像用造影剂可具有15nm～1000nm的粒 径。具有1000nm或更小的粒径的光声成像用造影剂可由于EPR(增 强的通透性和保留)效应而在肿瘤位点相比在体内正常位点更大量蓄 积。结果，用光照射后，在接收了造影剂的活体中，自肿瘤位点发射 的光声信号大于自正常位点发射的那些。由此，可使用具有调整到 1000nm或更小的粒径的本实施方式的光声成像用造影剂特别检测肿 瘤位点。而且，光声成像用造影剂的粒径可为500nm或更小，特别， 200nm或更小。具有200nm或更小的粒径的光声成像用造影剂可难以 被血中的巨噬细胞合并，导致在血中增强的保留。
根据本实施方式的光声成像用造影剂可具有仅1个氧化铁粒子或 可具有2个或更多氧化铁粒子。
在本实施方式中，氧化铁粒子具有如下粒径：500nm或更小。在 本实施方式中，氧化铁粒子的粒径可特别为200nm或更小。而且，在 本实施方式中，当氧化铁粒子具有500nm的粒径时，光声成像用造影 剂可具有3个或更少氧化铁粒子。
(氧化铁粒子)
在本实施方式中使用的氧化铁粒子不特别限制，只要氧化铁粒子 吸收600nm～1300nm的近红外线波长区中的光以发送光声信号及无 害于人身体。可使用Fe3O4(磁铁矿)，γ-Fe2O3(磁赤铁矿)之一和 其混合物。特别，可使用磁铁矿。已知磁铁矿相比磁赤铁矿在近红外 线波长区具有更高摩尔吸收系数，由此认为发射更强光声信号。磁铁 矿作为信号-发送部的使用，相比常规光声成像用造影剂可改善灵敏 度。而且，氧化铁粒子可为选自如下的晶体状态：单晶，多晶和无定 形。而且，光声成像用造影剂中的氧化铁粒子数可为1或可为2或更 多。该2个或更多氧化铁粒子构成次级粒子。氧化铁粒子可具有大粒 径，例如，50nm。在该情况中，摩尔吸收系数/mol铁原子的值和光声 信号测量的/mol铁原子的值随着造影剂中含有的氧化铁粒子数增加而 增加。另一方面，氧化铁粒子可具有5nm的粒径。在该情况中，甚至 当造影剂中含有的氧化铁粒子数增加时，摩尔吸收系数及测量的光声 信号/mol铁原子的值也不大大改变。
本实施方式的氧化铁粒子的粒径可通过本领域已知的方法测量诸 如透射电子显微镜(TEM)观察或X-射线衍射。氧化铁粒子可通过本 领域已知的氧化铁粒子制备方法适当制备用于使用。或者，可使用可 商购的产品。
根据本实施方式的氧化铁粒子或氧化铁粒子的次级粒子可用表面 修饰物质表面-包被。表面修饰物质的例包括脂肪酸和两性化合物。脂 肪酸的例包括油酸。两性化合物的例包括磷脂，聚氧乙烯山梨糖醇酐 脂肪酸酯，及两性聚合物。而且，多个氧化铁粒子可包含在疏水聚合 物中，其进而结合于两性化合物。这些表面修饰物质可单独或2种或 更多组合使用。根据本实施方式的氧化铁粒子可为可商购的或可通过 如下方法获得用于使用：例如，将FeCl3和FeCl2溶于水，以制备溶 液，然后向其搅拌着补充氨水，以制备具有元素Fe和O的氧化铁粒 子。
(光声成像用造影剂)
图13A～13J分别是显示本实施方式的光声成像用造影剂的一例 的示意性模式图。如在图13A中显示，光声成像用造影剂1包括氧化 铁粒子2和两性化合物3。两性化合物3存在于光声成像用造影剂1 的表面。
使用的两性化合物3可为选自下列的单独或组合的一种或更多种 两性化合物：磷脂4，聚氧乙烯山梨糖醇酐脂肪酸酯5，或两性聚合物 6。
氧化铁粒子2可包含在选自下列的疏水聚合物7中：(1)包括具 有拥有6个或更少碳原子的羟基羧酸的单体的同聚物，或包括具有羟 基羧酸的2种单体的共聚物，(2)聚(苯乙烯)和(3)聚(甲基丙烯酸 甲酯)。
图13B是显示包括仅用磷脂4包被的氧化铁粒子2的光声成像用 造影剂1的示意性模式图。
图13C是显示包括仅用两性聚合物6包被的氧化铁粒子2的光声 成像用造影剂1的示意性模式图。
图13D是显示包括含有在疏水聚合物7中的氧化铁粒子2及还仅 用聚氧乙烯山梨糖醇酐脂肪酸酯5包被的光声成像用造影剂1的示意 性模式图。
图13E是显示包括含有在疏水聚合物7中的氧化铁粒子2及还用 两种化合物，即，磷脂4和聚氧乙烯山梨糖醇酐脂肪酸酯5包被的光 声成像用造影剂1的示意性模式图。
图13F是显示包括含有在疏水聚合物7中的氧化铁粒子2及还仅 用两性聚合物6包被的光声成像用造影剂1的示意性模式图。
在具有磷脂4的光声成像用造影剂1中，配体分子8可固定于至 少一些磷脂4。图13G和13I分别是显示光声成像用造影剂9，其为 具有固定了配体分子8的磷脂4的光声成像用造影剂1的示意性模式 图。由此获得的光声成像用造影剂9可特异性识别靶组织，细胞和物 质。
而且，在具有两性聚合物6的光声成像用造影剂1中，配体分子 8可固定于至少一些两性聚合物6。图13H和13J分别是显示光声成 像用造影剂9，其为具有固定了配体分子8的两性聚合物6的光声成 像用造影剂1的示意性模式图。由此获得的光声成像用造影剂9可特 异性识别靶组织，细胞和物质。
而且，可根据目的用途控制本实施方式的光声成像用造影剂1和 9的粒径。粒径是15nm～500nm。具有超过200nm的粒径的造影剂 灵敏于巨噬细胞的吞噬，导致血中减少的保留。因此，光声成像用造 影剂的粒径可控制为15nm～200nm，用于血管成像及将光声成像用造 影剂蓄积到癌。
(产生光声成像用造影剂的方法)
将描述产生根据本实施方式的光声成像用造影剂1的方法。
获得本实施方式的光声成像用造影剂1的方法的例可包括但不限 于以下描述的干燥和纳米乳液方法。
图14A显示通过干燥方法产生光声成像用造影剂1的过程的一 例。特别是，可通过以下(1)～(2)获得光声成像用造影剂的水分 散体：
(1)从含有添加到有机溶剂的氧化铁粒子2和磷脂4或两性聚合 物6的第1液体10蒸发有机溶剂；以及
(2)添加水13之后乳化残留物。
图14B显示通过纳米乳液方法产生光声成像用造影剂1的过程的 一例。特别是，可通过以下(1)～(3)获得光声成像用造影剂的水 分散体：
(1)将第1液体10添加到第2液体11，以获得混合的溶液，其 中第1液体10含有添加到有机溶剂的氧化铁粒子2和疏水聚合物7， 及第2液体11含有添加到水的磷脂4和聚氧乙烯山梨糖醇酐脂肪酸酯 5或两性聚合物6；
(2)乳化混合的溶液以获得O/W-型乳剂12；以及
(3)从乳剂12的分散体蒸发有机溶剂。
氧化铁粒子可用例如，油酸表面-包被。将有机溶剂加入干燥的氧 化铁粒子以制备氧化铁粒子的分散体。向此分散体，加入油酸以用油 酸包被氧化铁粒子的表面。然后，可用有机溶剂洗涤出存在于非氧化 铁粒子的表面的位点的油酸，以获得油酸-包被的氧化铁粒子。表面修 饰物质不限于油酸，只要化合物达到增强对于两性化合物3的亲和性 或在第1液体10中含有的有机溶剂中分散氧化铁粒子2的目的。
本实施方式的光声成像用造影剂可含有1个氧化铁粒子或可含有 2个或更多氧化铁粒子。本发明人还发现，通过允许光声成像用造影 剂含有多个氧化铁粒子来获得增强每铁原子的光声信号的效应。由此， 可获得更强光声信号。
(磷脂)
一些磷脂4可包括磷脂酰磷脂，所述磷脂酰磷脂具有选自下列的 官能团：氨基，羧基，NHS(N-羟基琥珀酰亚胺)，马来酰亚胺，甲 氧基和羟基，及PEG链。含有氨基，羧基，NHS或马来酰亚胺基作 为官能团的磷脂可在其上固定配体分子8。
其例可包括磷脂，诸如化学式1所代表的N-(氨基丙基聚乙二醇) 羰基-二硬脂酰磷脂酰-乙醇胺(DSPE-PEG-NH2)，化学式2所代表 的3-(N-戊二酰)氨基丙基，聚乙二醇-羰基二硬脂酰磷脂酰-乙醇胺 (DSPE-PEG-COOH)，化学式3所代表的3-(N-琥珀酰亚胺基氧基 戊二酰)氨基丙基，聚乙二醇-羰基二硬脂酰磷脂酰-乙醇胺 (DSPE-PEG-NHS)，化学式4所代表的N-[(3-马来酰亚胺-1-丙酰) 氨基丙基聚乙二醇-羰基]二硬脂酰磷脂酰-乙醇胺(DSPE-PEG-MAL)， 化学式5所代表的N-(羰基-甲氧基聚乙二醇)-1，2-二硬脂酰-sn-甘油基 -3-磷酸乙醇胺，钠盐(DSPE-PEG-CN)，及化学式6所代表的1，2- 二硬脂酰-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺-N-[聚(乙二醇)](DSPE-PEG)。
[式1]
[式2]
[式3]
[式4]
[式5]
[式6]
(聚氧乙烯山梨糖醇酐脂肪酸酯)
根据本实施方式的聚氧乙烯山梨糖醇酐脂肪酸酯5的例可包括 Tween 20(聚氧乙烯山梨糖醇酐单月桂酸酯)，Tween 40，Tween 60 和Tween 80。
(两性聚合物)
根据本实施方式的两性聚合物6的例可包括：导入有PEG链的聚 (马来酸酐-交替-十八烯)，导入有PEG链的聚(马来酸酐-共-苯乙烯)， 导入有PEG链的聚(乳酸)，导入有PEG链的聚(乳酸-共-乙醇酸)，聚 (乙二醇-共-环氧丙烷)聚(乙烯基醇)。
可适宜地使用的PEG链具有1000～100000，特别，2000～20000 的重量-平均分子量。
而且，PEG链具有选自下列的末端官能团：羟基，甲氧基，氨基， 羧基，NHS和马来酰亚胺基。含有氨基，羧基，NHS或马来酰亚胺 基作为官能团的PEG链可在其上固定配体分子8。
(疏水聚合物)
根据本实施方式的疏水聚合物7选自：包括具有拥有6个或更少 碳原子的羟基羧酸的单体的同聚物，或包括具有羟基羧酸的2种单体 的共聚物，聚(苯乙烯)，及聚(甲基丙烯酸甲酯)。可适宜地使用的这些 聚合物具有2000～1000000，特别，10000～600000的重量-平均分子 量。
(第1液体)
干燥方法中使用的第1液体10是含有分散及溶解于有机溶剂的氧 化铁粒子2和磷脂4或两性聚合物6的溶液。在纳米乳液方法中使用 的第1液体10是含有分散及溶解于有机溶剂的氧化铁粒子2和疏水聚 合物7的溶液。
任何溶剂可应用于第1液体10中含有的有机溶剂，只要溶剂是可 溶解磷脂4或疏水聚合物7及分散氧化铁粒子2的有机溶剂。可使用 挥发性有机溶剂。
该有机溶剂的特定例包括下列溶剂：卤化的烃(二氯甲烷，氯仿， 氯乙烷，二氯乙烷，三氯乙烷，四氯化碳，等)，醚(乙基醚，异丁基 醚，丁醇，等)，酯(乙酸乙酯，乙酸丁酯，等)和芳族烃(苯，甲苯， 二甲苯，等)。这些溶剂可单独使用或也可用作2种或其更多种以适 当的比的混合物。但是，第1液体10中含有的有机溶剂不限于以上所 列那些。
而且，第1液体10中磷脂4，两性聚合物6，或疏水聚合物7的 浓度在允许它们的溶解的任何范围之内不特别限制。浓度可设为，例 如，对于磷脂4是1～100mg/ml，对于两性聚合物6是1～100mg/ml， 及对于疏水聚合物7是0.5～100mg/ml。
而且，干燥方法中第1液体10中含有的磷脂4和氧化铁粒子2 之间的重量比可为10∶1～1∶10。干燥方法中第1液体10中含有的两性 聚合物6和氧化铁粒子2之间的重量比可为10∶1～1∶100。在纳米乳液 方法中在第1液体10中含有的疏水聚合物7和氧化铁粒子2之间的重 量比可为1000∶1～1∶9。
(第2液体)
在纳米乳液方法中使用的第2液体11是含有选自下列的单独或组 合的一种或更多种两性化合物的水溶液：磷脂4，聚氧乙烯山梨糖醇 酐脂肪酸酯5，或两性聚合物6，用于稳定化在与第1液体10混合中 的乳剂的目的。但是，本发明不限于此方法，只要与水混合的第1液 体10的分散体可含有磷脂4，聚氧乙烯山梨糖醇酐脂肪酸酯5，或两 性聚合物6。
而且，在纳米乳液方法中在第2液体11中含有的磷脂4和聚氧乙 烯山梨糖醇酐脂肪酸酯5的浓度依赖于与第1液体10的混合比而不 同。例如，磷脂4的浓度可设置为0.001mg/ml～100mg/ml。而且，聚 氧乙烯山梨糖醇酐脂肪酸酯5的浓度可设置为0.1mg/ml～100mg/ml。 两性聚合物6的浓度可设置为1mg/ml～100mg/ml。
(乳化)
在干燥方法中，将氧化铁粒子2和磷脂4或两性聚合物6的混合 的溶液干燥，然后补充水，及将得到的溶液乳化以获得微团。在纳米 乳液方法中，将第1液体10和第2液体11的混合的溶液乳化以获得 水包油(O/W)类型乳剂。
乳剂和微团包括可达到本实施方式的目的的范围之内的任何物理 性质的乳剂和微团。可使用具有单峰粒度分布的乳剂和微团。
该乳剂或微团可通过本领域已知的常规乳化方法制备。本领域已 知的常规方法是，例如，间歇性振摇，使用混合器诸如螺旋浆-型搅拌 器或涡轮-型搅拌器搅拌，胶体磨方法，均化器方法，及超声波辐射搅 拌。这些方法可单独或将2种或其更多种组合使用。而且，乳剂和微 团可通过一步乳化或通过多步乳化制备。但是，只要可达到本实施方 式的目的，乳化方法不限于的上述方法。
特别，在纳米乳液方法中的乳剂12是由第1液体10和第2液体 11的混合的溶液制备的水包油(O/W)类型乳剂。在此情景中，第1 液体10和第2液体11的混合是指第1液体10和第2液体11无空间 上彼此隔绝地彼此接触存在。此混合不必然需要彼此整合。
混合的溶液中第1液体10和第2液体11之间的比不特别限制， 只要可形成水包油(O/W)类型乳剂12。第1液体和第2液体可以跨 1∶2～1∶1000的重量比混合。
(蒸发)
蒸发是去除第1液体10中含有的有机溶剂的过程。
蒸发可通过任何常规已知的方法进行。方法的例可包括通过加热 去除及使用真空设备诸如蒸发器的方法。在通过加热去除中，加热温 度可为0℃～80℃。但是，只要可达到本实施方式的目的，蒸发不限 于上述方法。
(配体分子)
在本实施方式中，配体分子8是任意选自化学品诸如生物分子和 药物的物质，例如，特异性结合于靶位点诸如癌的物质和特异性结合 于存在于靶位点邻域的物质的物质。其特定例包括抗体，抗体片段， 酶，生物活性肽，糖肽，糖链，脂质和分子识别化合物。
在本实施方式中，配体分子8化学结合于具有磷脂4或两性聚合 物6的光声成像用造影剂1而构成本实施方式的光声成像用造影剂9。 该光声成像用造影剂9的使用可达到靶位点的特异性检测或药代动力 学的监控，靶物质的定位，药物功效，及代谢。
(配体分子的固定)
配体分子8可固定于具有磷脂4的光声成像用造影剂1以获得本 实施方式的光声成像用造影剂9。
在本实施方式中，可将通过磷脂4或两性聚合物6的官能团和配 体分子8的官能团之间的反应的化学结合用作将配体分子8固定到具 有磷脂4或两性聚合物6的光声成像用造影剂1的方法。
特别是，当磷脂4或两性聚合物6的官能团是N-羟基琥珀酰亚胺 基时，配体分子8可通过N-羟基琥珀酰亚胺基与配体分子8的氨基的 反应固定于光声成像用造影剂1。配体分子8固定之后，磷脂4或两 性聚合物6的未反应的N-羟基琥珀酰亚胺基可通过琥珀酰亚胺基与具 有末端氨基的甘氨酸，乙醇胺或寡(乙二醇)或聚乙二醇的反应来灭活。
替代性地，当磷脂4或两性聚合物6的官能团是马来酰亚胺基时， 配体分子8可通过马来酰亚胺基与配体分子8的硫氢基的反应而固定 于光声成像用造影剂1。配体分子8固定之后，磷脂4或两性聚合物6 的未反应的马来酰亚胺基可通过马来酰亚胺基与具有末端硫氢基的 L-半胱氨酸，巯基乙醇或寡乙二醇或聚乙二醇的反应来灭活。
替代性地，当磷脂4或两性聚合物6的官能团是氨基时，配体分 子8可通过氨基与配体分子8的氨基的反应使用戊二醛固定于光声成 像用造影剂1。配体分子8固定之后，醛基的活性可通过与具有末端 氨基的乙醇胺或寡(乙二醇)或聚乙二醇的反应来阻断。
替代性地，氨基可通过N-羟基琥珀酰亚胺或马来酰亚胺基来取 代，通过该过程配体分子8被固定。
(使用光声成像用造影剂的成像)
可将根据本实施方式的光声成像用造影剂1和9用作使用近红外 光的光声成像用造影剂。
光声成像用造影剂1和9可分散于溶剂诸如盐水或可注射的蒸馏 水中而使用。而且，如果必需，可向其中适当添加药理学可接受的添 加剂。可将这些光声成像用造影剂通过静脉内或皮下注射导入活体。
下文中，会参照实施例更具体描述本发明。但是，本发明不限于 这些例。物质，组成条件，反应条件等等可在产生具有相同的功能或 效应的光声成像用造影剂的范围之内任意变化。
(光声成像方法)
本实施方式的光声成像方法包括：
(i)用600nm～1300nm的波长区的光照射接收了光声成像用造 影剂的样品；以及
(ii)检测产生自样品中存在的造影剂的声波。
在此情景中，用于检测声波的设备不特别限制。例如，可使用超 声探针。
【实施例】
在下实施例中，列出在本发明的光声成像用造影剂中使用的特定 剂和反应条件。但是，这些试剂或反应条件可变化，及这些变化合并 在本发明的范围内。由此，下例旨在辅助理解本发明及不通过任何方 式限制本发明的范围。
(含有氧化铁粒子的粒子的制备)
大量的含有氧化铁粒子的粒子是可商购的，本领域技术人员可容 易获得及适当使用。而且，大量的文献公开产生含有氧化铁粒子的粒 子的方法。由此，含有氧化铁粒子的粒子可参照这些文献容易合成。 例如，含有混合及溶解于其中的FeCl3·6H2O(25.5g)和FeCl2·4H2O (10.2g)的水溶液(600ml)，粉状葡聚糖(分子量：10000Da，360g) 和30％NH4OH溶液(30ml)可用于根据美国专利No.5262176的方 法制备含有氧化铁粒子的葡聚糖粒子的胶体溶液。而且，各种接头分 子也可结合于含有氧化铁粒子的粒子的表面。例如，将碳二亚胺稠合 剂1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(3.6mg)和3，6-二噁 辛烷二酸(3.6mg)溶于0.5M β-吗啉代乙磺酸缓冲液(1.25ml，pH＝6.3) 并于50℃温育10分钟。将溶液加入葡聚糖粒子悬浮液并于室温反应2 小时。含有氧化铁粒子的粒子可使用磁体纯化以获得具有寡环氧乙烷 作为具有末端羧基的接头分子的含有氧化铁粒子的粒子。
(单链抗体hu4D5-8scFv的制备)
基于HER2-结合IgG可变区的基因序列(hu4D5-8)，制备编码 单链抗体(scFv)的基因hu4D5-8scFv。首先，制备包括经编码肽 (GGGGS)3的cDNA连接的hu4D5-8的VL和VH基因的cDNA。将 NcoI-及NotI限制性位点分别导入其5’和3’端。核苷酸序列示于下。
5’-CCATGGATATCCAGATGACCCAGTCCCCGAGCTCCCT GTCCGCCTCTGTGGGCGATAGGGTCACCATCACCTGCCGTG CCAGTCAGGATGTGAATACTGCTGTAGCCTGGTATCAACAGA AACCAGGAAAAGCTCCGAAACTACTGATTTACTCGGCATCCT TCCTCTACTCTGGAGTCCCTTCTCGCTTCTCTGGATCCAGAT CTGGGACGGATTTCACTCTGACCATCAGCAGTCTGCAGCCGG AAGACTTCGCAACTTATTACTGTCAGCAACATTATACTACTC CTCCCACGTTCGGACAGGGTACCAAGGTGGAGATCAAAGGC GGTGGTGGCAGCGGTGGCGGTGGCAGCGGCGGTGGCGGTA GCGAGGTTCAGCTGGTGGAGTCTGGCGGTGGCCTGGTGCAG CCAGGGGGCTCACTCCGTTTGTCCTGTGCAGCTTCTGGCTTC AACATTAAAGACACCTATATACACTGGGTGCGTCAGGCCCCG GGTAAGGGCCTGGAATGGGTTGCAAGGATTTATCCTACGAAT GGTTATACTAGATATGCCGATAGCGTCAAGGGCCGTTTCACT ATAAGCGCAGACACATCCAAAAACACAGCCTACCTGCAGATG AACAGCCTGCGTGCTGAGGACACTGCCGTCTATTATTGTTCT AGATGGGGAGGGGACGGCTTCTATGCTATGGACTACTGGGG TCAAGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCGGCGGCCGC-3’(SEQ ID NO：1)
(限制位点加了下划线。)
将基因片段hu4D5-8scFv插入质粒pET-22b(+)(Novagen，Inc.) 的T7/lac启动子的下游。特别是，将cDNA与用限制酶NcoI-及NotI 消化的pET-22b(+)(Novagen，Inc.)连接。
将大肠埃希氏菌(Escherichia coli)BL21(DE3)用此表达质粒转 化以获得用于表达的细菌株。将获得的细菌株在4ml的LB-Amp培养 基中预培养过夜。然后，将其全量添加到250ml的2xYT培养基中和 以120rpm于28℃振摇培养8小时。然后，以1mM的终浓度添加IPTG (异丙基-β-D(-)-硫代吡喃半乳糖苷)之后，细菌株于28℃过夜培养。 将培养的大肠埃希氏菌(Escherichia coli)以8000×g于4℃离心30 分钟，及收集培养溶液的上清液。向获得的培养溶液添加60重量％的 硫酸铵，并通过盐析沉淀蛋白。使经历盐析的溶液于4℃静置过夜然 后以8000×g于4℃离心30分钟以收集沉淀物。将获得的沉淀物溶于 20mM Tris·HCl/500mM NaCl缓冲液及对1L的相同的缓冲液透析。 将由此透析的蛋白溶液加入装载了His·Bind(注册商标)树脂 (Novagen，Inc.)的柱并通过金属螯合物亲和层析经Ni离子纯化。在 还原SDS-PAGE中确认纯化的hu4D5-8scFv而呈现单条带且具有约 28kDa的分子量。制备的抗体的氨基酸序列示于下。下文中， hu4D5-8scFv也缩写为scFv。
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAVAWYQQKPG KAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYY CQQHYTTPPTFGQGTKVEIKGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESG GGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWVARI YPTNGYTRYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVY YCSRWGGDGFYAMDYWGQGTLVTVSSAAALEHHHHHHGGC
(SEQ ID NO：2)
(单链抗体hu4D5-8scFv和氧化铁粒子之间的结合)
将由此制备的scFv的缓冲液用含有5mM EDTA的磷酸缓冲液 (2.68mM KCl/137mM NaCl/1.47mM KH2PO4/1mM Na2HPO4/5mM EDTA，pH7.4)取代。然后，将scFv使用10倍摩尔量的三(2-羧乙基) 膦(下文中，也缩写为TCEP)于25℃还原约2小时。此由此还原的 scFv于25℃与nanomag(注册商标)-D-spio(生产自Micromod Partikeltechnologie GmbH；平均粒径：20nm)，马来酰亚胺-表面修 饰的含有氧化铁粒子的粒子(下文中，缩写为NP-马来酰亚胺)反应 约2小时。反应以1，4，10和15的投料的反应摩尔比(scFv/含有氧 化铁粒子的粒子)进行。在此情景中，″投料″是指添加到反应系统的 物质。″投料的反应摩尔比″是指添加到反应系统的scFv和含有氧化铁 粒子的粒子之间的摩尔浓度比。反应之后，将未结合于含有氧化铁粒 子的粒子的scFv通过使用具有100kDa的孔径的Amicon Ultra-4 (Nihon Millipore K.K.)的超滤去除，以获得scFv和含有氧化铁粒 子的粒子的复合物。超滤之后，固定于含有氧化铁粒子的粒子的scFv 的量通过定量滤出液中含有的未反应的scFv来计算。而且，由样品在 490nm处的吸光度使用具有已知的浓度的含有氧化铁粒子的粒子的溶 液的标准曲线测定粒子产率。下文中，获得的粒子缩写为scFv-NP。 通过动态光散射将scFv-NP的平均水动力直径测定为30～40nm(数 平均分布)。
(抗体和氧化铁粒子之间的结合)
将抗体(也缩写为IgG)通过碳二亚胺方法结合于含有氧化铁粒 子的粒子。20mg的1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐和将 24mg的N-羟基琥珀酰亚胺溶于1ml的0.5M β-吗啉代乙磺酸缓冲液 (pH＝6.3)。接下来，将溶液添加到7ml的以5mg/ml的粒子浓度含 有nanomag(注册商标)-D-spio COOH(生产自Micromod Partikeltechnologie GmbH；平均粒径：20nm)(下文中，缩写为 NP-COOH)的粒子悬浮液。将此粒子悬浮液于室温搅拌1小时。然 后，活化的含有羧基的含有氧化铁粒子的粒子从低-分子量试剂使用 PD-10脱盐柱(生产自GE Healthcare Biosciences)分离。使用的显 影剂是碳酸钠缓冲液(pH8.0)，及同时用其进行缓冲液交换。接下 来，向此粒子悬浮液，添加赫赛汀(注册商标)(生产自Chugai药 学Co.，Ltd.)(曲妥珠单抗)作为抗-HER2抗体。以1，4，10和20 的投料(IgG/含有氧化铁粒子的粒子)的反应摩尔比进行反应。将此 粒子悬浮液于室温搅拌4小时。然后，以1mM的最终甘氨酸浓度添 加1M含水甘氨酸溶液之后，将混合物于室温搅拌30分钟以阻断含有 氧化铁粒子的粒子的表面残留的活性位点。将获得的固定了赫赛汀(注 册商标)的含有氧化铁粒子的粒子通过凝胶过滤层析(Superdex 200GL10/300柱，生产自GE Healthcare Biosciences)纯化。使用的显 影剂是磷酸盐缓冲液(PBS，pH＝7.4)。将固定了赫赛汀(注册商标)的 含有氧化铁粒子的粒子洗脱到外水体积级分，然后将其收集。固定于 含有氧化铁粒子的粒子的IgG量通过由来源于其的峰面积定量未反应 的抗体浓度来计算。而且，由样品在490nm处的吸光度使用具有已知 的浓度的含有氧化铁粒子的粒子的溶液的标准曲线测定粒子产率。粒 子产率(相对于投料的粒子量的收集的粒子量)是20～40％。下文中， 固定了赫赛汀(注册商标)的含有氧化铁粒子的粒子称作IgG-NP。 IgG-NP的平均水动力直径通过动态光散射测定为50～60nm(数平均 分布)。
(抗体和具有环氧乙烷接头的氧化铁粒子之间的结合)
将抗体根据段落“抗体和氧化铁粒子之间的结合”结合于具有环氧 乙烷接头的含有氧化铁粒子的粒子。进行如与段落”抗体和氧化铁粒子 之间的结合”相同的过程，除了使用的含有氧化铁粒子的粒子是 nanomag(注册商标)-D-spio COOH-PEG(生产自Micromod Partikeltechnologie GmbH；平均粒径：20nm，PEG接头分子量：300) (下文中，缩写为NP-EO-COOH)之外。粒子产率(相对于投料粒子 量的收集的粒子量)是70～80％。下文中，固定了赫赛汀(注册商标) 的含有氧化铁粒子的粒子称作IgG-EO-NP。IgG-EO-NP的平均水动 力直径通过动态光散射测定为30～60nm(数平均分布)。而且，粒 子在PBS中具有-4.5mV的ζ电位。
(对照抗体和氧化铁粒子之间的结合)
根据段落″抗体和具有环氧乙烷接头的氧化铁粒子之间的结合″ 将对照抗体结合于含有氧化铁粒子的粒子。在此情景中，使用的对照 抗体是纯化的人IgG(多克隆，生产自Dainippon Sumitomo Pharma Co.，Ltd.)。反应以10投料的反应摩尔比(IgG/含有氧化铁粒子的粒 子)进行。固定于含有氧化铁粒子的粒子的IgG量是4(IgG/含有氧 化铁粒子的粒子)。下文中，固定了对照抗体的含有氧化铁粒子的粒 子称作cIgG-NP。
【实施例1】
(固定了抗体的氧化铁粒子的特征性评估)
将由此制备的固定了抗体的氧化铁粒子的固定的抗体量，结合效 率，抗体固定密度，及粒子产率总结于表1。
表1
可通过增加抗体与氧化铁粒子的投料比来增加固定的抗体量。在 具有IgG作为配体分子的IgG-NP和IgG-EO-NP中，固定的抗体量相 对于投料比非常低。特别是，它们的结合效率低至11～33％。另一方 面，当配体分子是scFv时，结合效率非常有利(64～85％)。在此情 景中，使用的氧化铁粒子具有20nm的平均粒径，及固定的最大IgG 量从表面积评估为约8～10分子(IgG假定为直径10nm的球形分子)。 由此，50～70％的结合效率可对于具有20的投料反应摩尔比的IgG 系统正确。
而且，说到粒子产率(相对于投料的粒子量的收集的粒子量)， 具有寡环氧乙烷(分子量：300)作为接头分子的固定了抗体的氧化铁 粒子呈现高达71～85％的产率。另一方面，无接头分子的IgG-NP具 有减少至10～30％的产率。此可为因为：由于抗体分子作为结合剂而 IgG向粒子的固定反应导致粒子聚集；或粒子表面上固定的IgG的变 性引发粒子聚集。类似现象似乎在scFv-NP中发生。实际上，在抗体 固定反应之后确认IgG-NP和scFv-NP系统产生聚集的粒子沉淀。另 一方面，具有寡环氧乙烷接头的IgG-EO-NP可能具有有利的粒子之 中分散性，导致抑制的粒子间聚集。有趣的是，在scFv-NP系统中， 粒子产率随着抗体和粒子之间的投料比的增加而增加。此可为因为含 有马来酰亚胺基的含有氧化铁粒子的粒子不稳定，及大量的scFv片段 的固定改善粒子的分散性。
对于IgG系统的抗体固定密度是7.5～320.5ng/cm2，对于scFv系 统是6.9～104.9ng/cm2。在此情景中，计算HER2的细胞表面密度。 首先，当HER2-阳性细胞(强烈表达株)中HER2的数定义为106分 子/细胞和细胞直径定义为10μm时，HER2的细胞表面密度计算为 1pmol/cm2。抗体固定密度也独立地转变为摩尔密度，然后将其除以 HER2的细胞表面密度(1pmol/cm2)以计算每HER2分子的抗体数(抗 体/HER2摩尔比)。此结果示于图2。(抗体/HER2摩尔比)对于达 到足够的多价结合于HER2需要为至少1或更大。从图2的结果，与 HER2的多价相互作用可在scFv-NP中(12.9)预期为足够，提示可 达到强结合能力。
【实施例2】
(固定了抗体的氧化铁粒子的结合特异性评估)
通过荧光免疫染色评价制备的固定了抗体的氧化铁粒子的对 HER2的结合活性和结合特异性。使用的细胞是作为HER2-阳性细胞 (HER2+)的N87。使用的HER2-阴性细胞(HER2-)是MDA-MB-231。 使用的测试粒子是IgG-NP(6.7)，IgG-EO-NP(5.3)，scFv-NP(12.9)， 及cIgG-NP。将赫赛汀(注册商标)用作阳性对照。使用的检测抗体 (荧光标记的抗体)是Alexa Fluor(注册商标)488-标记的抗-人IgG 抗体(对于赫赛汀(注册商标)，IgG-NP，IgG-EO-NP或cIgG-NP检 测)，抗-His标记抗体(小鼠)，及Alexa Fluor(注册商标)488-标 记的抗-小鼠IgG抗体(对于scFv-NP检测)。将各细胞在24-孔板中 过夜培养，然后在5％多聚甲醛(PFA)中固定。将细胞用PBS洗涤。 然后，在添加固定了赫赛汀(注册商标)或固定了各抗体的氧化铁粒 子之后，将混合物在生长培养基中于37℃温育1小时。然后，将细胞 用生长培养基洗涤，然后用检测抗体温育(1小时，37℃)。洗涤之后， 在荧光显微镜下观察细胞。
荧光免疫染色的结果示于图3A和3B。图3A显示使用固定了抗 体的本发明的氧化铁粒子获得的HER2-阳性细胞(N87，上段)和 HER2-阴性细胞(MDA-MB-231，下段)的荧光图像。在图中，荧光 间接代表抗体作为配体分子的存在，即，固定了抗体的氧化铁粒子的 存在。如从赫赛汀(注册商标)作为阳性对照的染色结果明白，确认 N87中的HER2表达，然而HER2在MDA-MB-231中表达，尽管以 无法通过此实验系统检测的足够低水平。图3B是图3A的染色结果的 表。在表中，+代表可染色的，-代表无法染色的。制备的固定了抗体 的氧化铁粒子确认为结合于HER2-阳性细胞N87。而且，cIgG-NP不 结合于N87，展示粒子的结合不是非特异性的。另一方面，HER2-阴 性细胞MDA-MB-231未用任何粒子染色，展示固定了抗体的本发明 的氧化铁粒子具有对HER2的结合特异性。
【实施例3】
(固定了抗体的氧化铁粒子的光声信号测量)
评价制备的固定了抗体的氧化铁粒子的光声信号发送能力。使用 的测试粒子是IgG-NP(6.7)，IgG-EO-NP(5.3)，scFv-NP(12.9)， 及cIgG-NP。而且，也测定非固定了抗体的氧化铁粒子(NP-马来酰 亚胺，NP-COOH和NP-EO-COOH)的光声信号发送能力。使各粒子 以至少3个浓度经历光声信号测量。将PBS用作溶剂。在光声信号测 量之前及之后测量在710nm处的吸光度。结果，它们之间的差异在 5％之内。磁铁矿含量和氧化铁粒子的粒径(即，核心粒子的粒径)在 全部粒子之中相同。
在光声测量中，将分散于PBS的样品用脉冲激光照射。使用压电 元件检测来自样品的光声信号，使用高速前置放大器放大，然后使用 数字示波器获得。特定条件如下：使用的光源是钛-蓝宝石激光器 (LT-2211-PC，生产自LOTIS LTD.)。条件涉及710nm的波长，约 10～20mJ/cm2的能量密度，约20ns的脉冲宽度，及10Hz的脉冲重 复频度。用于检测光声信号的压电元件是具有1.27cm的元件直径和1 MHz的中心频度的非-收敛-型超声变换器(V303，生产自 Panametrics-NDT)。测量容器是具有0.1cm的光路长度和约200μl 的样品体积的聚(苯乙烯)比色杯。
将测量容器和压电元件以2.5cm的间隔距离浸于填充水的玻璃容 器中。用于放大光声信号的高速前置放大器是具有+30dB的放大度的 超声前置放大器(5682型，生产自OLYMPUS CORP.)。将放大的信 号输入数字示波器(DPO4104，生产自Tektronix)。将聚(苯乙烯)比 色杯用脉冲激光从玻璃容器之外照射。由其散射的部分光使用光电二 极管检测，及作为引发信号输入到数字示波器。数字示波器设置为32 次-平均显示模式以获得32次激光脉冲辐射的平均光声信号。
测量光声信号的结果示于图4A～4C。图4A显示，作为典型例， 示波器中获得的scFv-NP(12.9)的光声信号波形。图代表不同吸光 度(即，不同scFv-NP浓度)时scFv-NP(12.9)溶液的一列结果。后 来检测的峰可受细胞内的反射影响。因此，仅第1峰作为信号有效。 如从图4A明白，确认光声信号来自测试粒子。而且，确认以光声信 号强度的scFv-NP(12.9)溶液的吸光度依赖性。同样，也可在全部 其他测试粒子中确认信号强度的光声信号发送和吸光度依赖性。图4B 显示全部测试粒子的光声信号强度对比在710nm处的吸光度的标绘 图。
从图4B确认，光声信号与测试粒子溶液的吸光度具有线性关系。 而且，由各测试粒子的信号强度和在710nm处的吸光度上的数据的近 似的线测定每单元吸光度的光声信号强度(mV/ab)及记录于图4C。 mV/ab的值代表各粒子的光声信号发送能力。这意味着具有更高 mV/ab的值的粒子是更适合作为光声成像用造影剂。从图4C确认： 光声信号发送能力在抗体固定之前及之后之间不变化(在图中，比较 NP-COOH与IgG-NP，NP-马来酰亚胺与scFv-NP，及NP-EO-COOH 与IgG-EO-NP或cIgG-NP)；及IgG和scFv之间(比较IgG-NP与 scFv-NP)的光声信号发送能力不是不同。这些结果展示，本发明的 固定了抗体的氧化铁粒子可不减少作为信号-发送部的氧化铁粒子的 光声信号发送能力地在其上固定配体分子，及发挥具有高灵敏度及结 合能力的光声成像用造影剂的功能。
【实施例4】
(抗体和具有环氧乙烷接头的20nm氧化铁粒子之间的结合)
根据段落″抗体和具有环氧乙烷接头的氧化铁粒子之间的结合″ 将抗体(赫赛汀(注册商标))结合于20nm氧化铁粒子。反应以20 的投料反应摩尔比(抗体/含有氧化铁粒子的粒子)进行。含有氧化铁 粒子的粒子上固定的抗体量是5.4(抗体/含有氧化铁粒子的粒子)。 下文中，固定了赫赛汀(注册商标)的含有氧化铁粒子的粒子称作 IgG-EO-NP(5.4)。IgG-EO-NP(5.4)的平均水动力直径通过动态 光散射测定为39.4nm(数平均分布)。而且，粒子在PBS中具有-4.5mV 的ζ电位。
【实施例5】
(人工抗体和具有环氧乙烷接头的20nm氧化铁粒子之间的结 合)
根据段落″单链抗体hu4D5-8scFv和氧化铁粒子之间的结合″将人 工抗体scFv结合于具有环氧乙烷接头的含有氧化铁粒子的粒子。使用 的含有氧化铁粒子的粒子是马来酰亚胺-表面修饰的nanomag(注册商 标)-D-spio(生产自Micromod Partikeltechnologie GmbH；平均粒径： 20nm，PEG接头分子量：300)(下文中，缩写为NP-EO-马来酰亚胺 -20)。进行如在段落“单链抗体hu4D5-8scFv和氧化铁粒子之间的结 合”中的相同的过程的除了使用NP-EO-马来酰亚胺-20之外。反应以 20的投料反应摩尔比(scFv/含有氧化铁粒子的粒子)进行。粒子产率 是74％，其高于使用无环氧乙烷接头的NP-马来酰亚胺获得的粒子产 率(最大57％)。这说明，环氧乙烷接头的使用改善粒子的分散稳定 性，如用IgG-EO-NP的结果。下文中，由此获得的固定了scFv的含 有氧化铁粒子的粒子称作scFv-EO-NP-20。scFv-EO-NP-20的平均水 动力直径通过动态光散射测定为22.3nm(数平均分布)。固定于含有 氧化铁粒子的粒子的scFv的量是12.2(scFv/粒子)。而且，粒子在 PBS中具有-4.6mV的ζ电位。
【实施例6】
(固定了肽的氧化铁粒子的制备)
(HER2-结合肽和氧化铁粒子之间的结合)
将HER2-结合肽(氨基酸序列：MARSGLGGKGSC；下文中，缩 写为HBP)溶于磷酸缓冲液(2.68mM KCl/137mM NaCl/1.47mM KH2PO4/1mM Na2HPO4/5mM EDTA，pH7.4)及与NP-EO-马来酰亚胺 -20于4℃反应约16小时。反应以71的投料反应摩尔比(HBP/含有 氧化铁粒子的粒子)进行。反应之后，将未结合于含有氧化铁粒子的 粒子的HBP通过使用具有10kDa孔径的Amicon Ultra-4(Nihon Millipore K.K.)超滤去除，以获得HBP和含有氧化铁粒子的粒子的 复合物。超滤之后，固定于含有氧化铁粒子的粒子的HBP量通过定量 滤出液中含有的未反应的HBP来计算。固定于含有氧化铁粒子的粒子 的HBP量是47(HBP/含有氧化铁粒子的粒子)。下文中，由此获得 的固定了HBP的含有氧化铁粒子的粒子称作HBP-EO-NP-20。 HBP-EO-NP-20的平均水动力直径通过动态光散射测定为28.1nm(数 平均分布)。而且，粒子在PBS中具有-0.6mV的ζ电位。在此情景 中，使用的HER2-结合肽基于Int.J.Cancer，92，748-755(2001)中 报道的HER2-结合肽MARSGL设计。将此肽连接到接头序列 GGKGSC及使用C-端半胱氨酸的侧链硫氢基结合于粒子。
【实施例7】
(固定了配体分子的氧化铁粒子的HER2结合能力的评估)
使用Biacore X系统(GE Healthcare Japan Corp.)分析各粒子 和HER2之间的相互作用。使用的抗原是重组人ErbB2/Fc嵌合体 (R&D Systems，Inc.)。抗原通过胺偶联根据制造商的建议的流程固 定于CM-5芯片表面上的羧甲基葡聚糖链。固定的抗原量是约1000～ 2000RU。将PBS-T(2.68mM KCl/137mM NaCl/1.47mM KH2PO4/1mM Na2HPO4/0.005％Tween 20，pH7.4)用作电泳缓冲液。 粒子浓度作为scFv浓度设为0.1～100nM。流速设为2～4μl/min，及 结合时间设为10～20min。计算以各浓度应用的粒子的结合量，即， 应答Req。制成斯卡恰特作图，及由斜率测定表观平衡解离常数(Kd)。 结果，对于HER2的IgG-EO-NP(5.4)，scFv-EO-NP-20和 HBP-EO-NP-20的平衡解离常数(Kd)分别是0.6nM，0.01nM和 36.7nM。在固定了scFv的粒子中获得最强结合能力。
【实施例8】
(固定了配体分子的含有氧化铁粒子的粒子与表达HER2的细胞 的结合能力的评估)
评价各粒子的与表达HER2的细胞的结合能力。在评估之前一天， 将HER2-阳性细胞(N87细胞)接种到24-孔板(5×105细胞/孔)。 次日，移出培养基之后，将200μL的生长培养基放入其中，及然后将 粒子样品添加到各孔。将板在CO2温育器中于37℃静置4小时。然后， 移出含有粒子的培养基。将孔用1mL的PBS完全洗涤两次。移出PBS 之后，以150μL/孔的浓度添加1％Triton-X100/PBS溶液用于细胞裂 解。将细胞于室温温育2小时或更长。随后，以150μL/孔的浓度添加 浓盐酸(12N)，及将细胞于室温温育2小时或更长。测量样品(6N HCl 溶液，300μL)的此酸裂解物中的铁量，以测定结合于细胞的粒子的浓 度。从粒子对N87的饱和结合曲线制成斯卡恰特作图，及测定对于细 胞的粒子的表观平衡解离常数(Kd)。结果，IgG-EO-NP(5.4)， scFv-EO-NP-20和HBP-EO-NP-20对N87细胞的平衡解离常数(Kd) 分别是10nM，5.8nM和78nM。在固定了scFv的粒子中获得最强结 合能力。
【实施例9】
(固定了配体分子的含有氧化铁粒子的粒子的小鼠药代动力学的 评估)
评价如上述制备的固定了各配体分子的氧化铁粒子的在患癌的小 鼠中的药代动力学。使用的测试粒子是IgG-EO-NP(5.4)，cIgG-NP， scFv-EO-NP-20和HBP-EO-NP-20。首先，将各粒子用放射性同位素 (下文中，缩写为RI)根据本领域已知的方法标记。使用的RI核素 是从能量，半衰期和容易放射性标记的观点出发最适合于药代动力学 研究的111-铟(也缩写为111In)。将双官能螯合二亚乙基-三胺-五乙 酸(DTPA)酐(DTPA酐)用于用111In标记粒子。首先，使DTPA 酐与抗体的赖氨酸残基或粒子的氨基反应，及将反应产物使用 Sephadex G-50(生产自GE Healthcare Japan Corp.)纯化。然后， 用111-铟标记之后，将标记的粒子使用PD-10(生产自GE Healthcare Japan Corp.)纯化以获得RI-标记的粒子。
将RI-标记的粒子(470μg/100μL PBS，放射化学纯度：＞90％) 静脉内施用于患癌的小鼠模型及通过摘除其检查施用之后72小时的 药代动力学。评估的时间点设置为施用之后1，3，6，24，48和72 小时，及在各时间点使用3个或更多小鼠。使用的患癌的小鼠模型是 接收了高度表达HER2的N87细胞的皮下移植的BALB/c裸鼠。更特 别是，将5×106N87细胞皮下注射到各BALB/c Slc-nu/nu小鼠(Japan SLC，Inc.)的肩。14天后，制备具有形成的约4～6mm的N87肿瘤 的患癌的小鼠模型。在此时点，将粒子施用于小鼠。向小鼠的粒子剂 量是7.4×1013粒子/小鼠或0.22mg铁/小鼠。辐射剂量是370kBq/小鼠。
施用之后24小时的药代动力学结果示于图5。图5是显示在各组 织中蓄积(相对剂量和组织重量标准化的值)的图。肿瘤(N87细胞) 蓄积在scFv-EO-NP-20中最高(5.6％ID/g)，之后是HBP-EO-NP-20 (4.0％ID/g)，IgG-EO-NP(5.4)(2.5％ID/g)，及cIgG-NP(2.5％ID/g)。 所有的固定了抗体的粒子(IgG-EO-NP(5.4)和cIgG-NP)呈现向肝 显著的蓄积，然而固定了人工抗体或固定了肽的粒子(scFv-EO-NP-20 和HBP-EO-NP-20)呈现向肾显著的蓄积。
固定了抗体的粒子由于结合于粒子的抗体所致的抗体变性和抗体 的Fc结构域的存在而灵敏于调理素作用。因此，多数这些粒子似乎迁 移到肝和脾脏。抗体和对照抗体之间的肿瘤蓄积无差异可指示，固定 了抗体的粒子的蓄积是被动蓄积(通过EPR效应导致的肿瘤蓄积)。
另一方面，人工抗体以定点方式固定于粒子，及变性少，具有高 结合能力。也具有小尺寸的人工抗体的使用，相比固定了抗体的粒子 可抑制向肝和脾脏的迁移及提高血清浓度。此可能导致固定了人工抗 体的粒子的改善的肿瘤蓄积。向肾显著的迁移提示，由粒子表面释放 的人工抗体可能向其蓄积。肽具有小尺寸和无Fc结构域，尽管具有低 结合能力。因此，肽的使用减少向肝的蓄积。此可能导致肿瘤蓄积相 比固定了抗体的粒子提高。这些结果展示在本发明的含有氧化铁粒子 的粒子中人工抗体作为配体分子的优越性。
【实施例10】
(人工抗体和具有环氧乙烷接头的50nm氧化铁粒子之间的结 合)
根据实施例5将人工抗体scFv结合于具有环氧乙烷接头的含有 50nm氧化铁粒子的粒子。使用的含有氧化铁粒子的粒子是nanomag (注册商标)-D-spio(生产自Micromod Partikeltechnologie GmbH；平 均粒径：50nm，PEG接头分子量：300)，含有50nm氧化铁粒子的马 来酰亚胺-表面修饰的粒子(下文中，缩写为NP-EO-马来酰亚胺-50)。 进行如在实施例4中的相同的过程，除了以125的投料反应摩尔比 (scFv/含有氧化铁粒子的粒子)使用NP-EO-马来酰亚胺-50进行反应 之外。粒子产率是76％。下文中，由此获得的固定了scFv的含有氧 化铁粒子的粒子称作scFv-EO-NP-50。scFv-EO-NP-50的平均水动力 直径通过动态光散射测定为54.5nm(数平均分布)。固定于含有氧化 铁粒子的粒子的scFv的量是91(scFv/粒子)。而且，粒子在PBS中 具有-0.5mV的ζ电位。
【实施例11】
(人工抗体和具有环氧乙烷接头的100nm氧化铁粒子之间的结 合)
根据实施例5将人工抗体scFv结合于具有环氧乙烷接头的含有 100nm氧化铁粒子的粒子。使用的含有氧化铁粒子的粒子是nanomag (注册商标)-D-spio(生产自Micromod Partikeltechnologie GmbH；平 均粒径：100nm，PEG接头分子量：300)，含有100nm氧化铁粒子的 马来酰亚胺-表面修饰的粒子(下文中，缩写为NP-EO-马来酰亚胺 -100)。进行如在实施例4中的相同的过程，除了以500的投料反应 摩尔比(scFv/含有氧化铁粒子的粒子)使用NP-EO-马来酰亚胺-100 进行反应之外。粒子产率是62％。下文中，由此获得的固定了scFv 的含有氧化铁粒子的粒子称作scFv-EO-NP-100。scFv-EO-NP-100的 平均水动力直径通过动态光散射测定为114.2nm(数平均分布)。固 定于含有氧化铁粒子的粒子的scFv的量是375(scFv/粒子)。而且， 粒子在PBS中具有-3.1mV的ζ电位。
【实施例12】
(人工抗体和具有环氧乙烷接头的200nm氧化铁粒子之间的结 合)
根据实施例5将人工抗体scFv结合于具有环氧乙烷接头含有 200nm氧化铁粒子的粒子。使用的含有氧化铁粒子的粒子是nanomag (注册商标)-D(生产自Micromod Partikeltechnologie GmbH；平均粒 径：200nm，PEG接头分子量：300)，含有200nm氧化铁粒子的马来 酰亚胺-表面修饰的粒子(下文中，缩写为NP-EO-马来酰亚胺-200)。 进行如在实施例4中的相同的过程，除了以2000的投料反应摩尔比 (scFv/含有氧化铁粒子的粒子)使用NP-EO-马来酰亚胺-200进行反 应之外。粒子产率是80％。下文中，由此获得的固定了scFv的含有 氧化铁粒子的粒子称作scFv-EO-NP-200。scFv-EO-NP-200的平均水 动力直径通过动态光散射测定为171.7nm(数平均分布)。固定于含 有氧化铁粒子的粒子的scFv的量是1460(scFv/粒子)。而且，粒子 在PBS中具有-1.8mV的ζ电位。
【实施例13】
(具有不同的粒径的scFv-NP的结合能力的评估)
根据在实施例7中描述的方法评价具有改变的粒径的scFv-NP的 HER2结合能力。结果，对于HER2的scFv-EO-NP-20， scFv-EO-NP-50，scFv-EO-NP-100，及scFv-EO-NP-200的平衡解离 常数(Kd)分别是0.01nM，0.69nM，0.36nM和0.05nM。而且，根 据在实施例8中描述的方法评价具有改变的粒径的scFv-NP的与表达 HER2的细胞的结合能力。结果，对于表达HER2的细胞的 scFv-EO-NP-20，scFv-EO-NP-50，scFv-EO-NP-100，及 scFv-EO-NP-200的平衡解离常数(Kd)分别是5.8nM，7.87nM，1.63nM 和0.09nM。如从这些结果所示，在scFv-EO-NP-200中获得最强结合 能力。
【实施例14】
(具有不同的粒径的scFv-NP的小鼠药代动力学的评估)
评价上述制备的具有改变的粒径的scFv-NP的在患癌的小鼠中的 药代动力学。使用的测试粒子是scFv-EO-NP-20，scFv-EO-NP-50， scFv-EO-NP-100和scFv-EO-NP-200。根据实施例9，制备各RI-标记 的粒子，静脉内施用于患癌的小鼠模型，并通过摘除检查其药代动力 学。给小鼠的粒子剂量是0.22mg铁/小鼠。施用的粒子数依赖于粒径 而不同和如下：对于scFv-EO-NP-20，scFv-EO-NP-50， scFv-EO-NP-100和scFv-EO-NP-200分别是7.4×1013粒子/小鼠， 5.1×1012粒子/小鼠，7.0×1011粒子/小鼠和3.2×1010粒子/小鼠。
在施用之后24小时的药代动力学结果示于图6。图6是显示在各 组织中的蓄积(对剂量和组织重量标准化的值)的图。肿瘤(N87细 胞)蓄积在scFv-EO-NP-200中最高(7.4％ID/g)，之后是 scFv-EO-NP-20(5.6％ID/g)，scFv-EO-NP-50和scFv-EO-NP-100 二者(3.3％ID/g)。scFv-EO-NP-200的高肿瘤蓄积可能是反映粒子 与N87细胞的高结合能力的结果。随着粒径的增加，向肝或脾脏的蓄 积增加，而向肾的蓄积降低。观察到粒子的血清浓度具有随着粒径的 增加而降低的趋势。肿瘤和血之间的比(对比度)在scFv-EO-NP-200 中最高(6.3)，之后是scFv-EO-NP-20(2.5)，scFv-EO-NP-100(2.3)， 及scFv-EO-NP-50(2.0)。scFv-EO-NP-200具有高肿瘤蓄积和低血 清浓度和可因此达到高对比度。从肿瘤蓄积和对比度的观点出发，显 示根据本发明的scFv-EO-NP-200作为光声成像用造影剂高度可实行。
【实施例15】
(固定了各种配体分子的含有氧化铁粒子的粒子和具有改变的粒 径的NP的摩尔吸收系数评估和光声信号评估)
评价制备的固定了各配体分子的含有氧化铁粒子的粒子的摩尔吸 收系数(ε)和光声信号(也缩写为PA信号)。在摩尔吸收系数测量 中，将粒子分散在PBS中，及在710nm的波长处测量溶液的吸光度 用于确定。而且，根据实施例3的方法进行PA信号评估。PA信号以 获得的对入射激光强度(J)和粒子浓度(nM)标准化的信号强度值 (电压：V)的值(V/J/nM)表示。结果总结于下表2和3。这些结 果与图4C中显示的结果一起展示粒子的摩尔吸收系数和PA信号依赖 于粒径(表3)，且独立于固定的配体分子(表2)。粒子的摩尔吸收 系数和PA信号随着粒径的增加而增加。这说明，PA信号和摩尔吸 收系数成比例关系。
表2
表3
图7A显示粒子的光声信号和摩尔吸收系数之间的关系(双对数 标绘图)。在所述图中，数值代表粒径。在此例中，除了以上制备的 粒子之外，显示130nm和160nm氧化铁粒子(nanomag(注册商标)-D， 生产自Micromod Partikeltechnologie GmbH；平均粒径：130nm或 160nm，PEG接头分子量：300)的数据。另一方面，图7B显示粒子 的摩尔吸收系数和粒子中的铁含量(每粒子铁量)之间的关系(双对 数标绘图)。这些图展示PA信号强度与粒子的吸收系数成比例增加， 及此粒子的吸收系数依赖于粒子中的铁量。特别是，为增强光声信号， 需要通过增加粒径来增加粒子中的铁含量及增强每单元氧化铁的吸收 系数(增加相对于磁赤铁矿的磁铁矿含量)。根据此例的固定了配体 分子的含有氧化铁粒子的粒子被合理地设计为解决这些问题。高吸收 系数必要于有效获得光声成像用造影剂的光声信号。例如，具有109(M-1×cm-1)或更高的粒子摩尔吸收系数的造影剂会容易达到高-对比 度成像。此由在大量的之前报道中作为光声成像用造影剂描述的金纳 米棒(在近红外线波长区具有约109(M-1·cm-1)的摩尔吸收系数)支 持。根据此例的固定了配体分子的含有氧化铁粒子的粒子可具有用于 达到109(M-1·cm-1)或更高摩尔吸收系数的107或更多铁原子的铁含 量。无之前报道的含有氧化铁的光声成像用造影剂或固定了配体分子 的含有氧化铁粒子的粒子具有该高铁原子含量。但是，造影剂可不需 要粒子的摩尔吸收系数高达109(M-1·cm-1)，依赖于其利用或向靶的 蓄积。该情况是，例如，在具有少噪音的系统，诸如血中进行观察， 或根据此例的造影剂具有向靶的高蓄积。
【实施例16】
(scFv-NP的肿瘤蓄积和HER2特异性的评估)
图8显示施用于患癌的小鼠的具有不同的粒径的固定了scFv的氧 化铁粒子的肿瘤蓄积(在施用后24小时；以％ID/g表示)。此图显示 肿瘤(N87细胞)中各scFv-EO-NP-20，scFv-EO-NP-50， scFv-EO-NP-100，及scFv-EO-NP-200的％ID/g(实施例14的结果) 和在HER2-阴性肿瘤(SUIT2细胞)中的scFv-EO-NP-200的％ID/g (根据实施例9和14测试，除了使用SUIT2细胞代替N87细胞之外)。 也显示测试各％ID/g的统计学地显著差异的结果(在图中，＊及#代表 显著差异)。结果，肿瘤蓄积(HER2-阳性肿瘤)在scFv-EO-NP-200 中最高，之后是scFv-EO-NP-20和scFv-EO-NP-50和scFv-EO-NP-100 (scFv-EO-NP-50和scFv-EO-NP-100之间无显著差异)。而且，确 认scFv-EO-NP-200向HER2-阴性肿瘤(SUIT2细胞)的蓄积显著少 于向HER2-阳性肿瘤(N87细胞)的蓄积。此表示此例的 scFv-EO-NP-200的肿瘤蓄积特异于HER2，展示scFv-EO-NP-200可 足以发挥可用于特别检测，例如，HER2分子的光声成像用造影剂的 功能。在scFv-EO-NP-200的测试中，N87和SUIT2肿瘤具有约1～ 3mm的尺寸。此系统中肿瘤尺寸对肿瘤蓄积的影响不清楚。但是，肿 瘤尺寸可能影响肿瘤蓄积。
【实施例17】
(HER2-结合肽和具有环氧乙烷接头的200nm氧化铁粒子之间 的结合)
使用的含有氧化铁粒子的粒子是nanomag(注册商标)-D(生产自 Micromod Partikeltechnologie GmbH；平均粒径：200nm，PEG接头 分子量：300)，含有200nm氧化铁粒子的马来酰亚胺-表面修饰的粒 子(下文中，缩写为NP-EO-马来酰亚胺-200)。将HER2-结合肽(氨 基酸序列：MARSGLGGKGSC(SEQ ID NO：3)；下文中，缩写为 HBP)溶于磷酸缓冲液(2.68mM KCl/137mM NaCl/1.47mM KH2PO4/1mM Na2HPO4/5mM EDTA，pH7.4)及与NP-EO-马来酰亚 胺-200于25℃反应约2小时。以1×106的投料反应摩尔比(HBP/含有 氧化铁粒子的粒子)进行反应。反应之后，通过超滤使用具有100kDa 的孔径的Amicon Ultra-4(Nihon Millipore K.K.)去除未结合于含有 氧化铁粒子的粒子的HBP，以获得HBP和含有氧化铁粒子的粒子的 复合物。超滤之后，固定于含有氧化铁粒子的粒子的HBP量通过定量 滤出液中含有的未反应的HBP来计算。固定于含有氧化铁粒子的粒子 的HBP量是1.8×105(HBP/含有氧化铁粒子的粒子)。下文中，将由 此获得的固定了HBP的含有氧化铁粒子的粒子称作 HBP1-EO-NP-200。HBP1-EO-NP-200的平均水动力直径通过动态光 散射测定为161.1nm(数平均分布)。而且，粒子在PBS中具有-6.5mV 的ζ电位。HBP1-EO-NP-200在710nm处具有1.1×1010(M-1×cm-1) 的摩尔吸收系数(ε)，且在710nm处具有219.1的光声信号(V/J/nM)。
【实施例18】
(其上固定具有改变的数的HER2-结合肽的200nm氧化铁粒子 的制备)
根据实施例17制备其上固定具有改变的数的HER2-结合肽的 200nm氧化铁粒子。进行如在实施例17中的相同的过程，除了以 1×105，2×104或2×103的投料反应摩尔比(HBP/含有氧化铁粒子的粒 子)进行各反应之外。获得的固定了HER2-结合肽的含有氧化铁粒子 的粒子分别缩写为HBP2-EO-NP-200，HBP3-EO-NP-200和 HBP4-EO-NP-200。固定于含有氧化铁粒子的粒子的HBP量(HBP/ 含有氧化铁粒子的粒子)分别是4.4×104，1.4×104和2.0×103(2.0×103以投料的肽的摩尔量表示)。它们的平均水动力直径和ζ电位与在实 施例17中制备的HBP1-EO-NP-200的那些几乎无差异。
【实施例19】
(固定了HER2-结合肽的含有氧化铁粒子的粒子与表达HER2的 细胞的结合能力的评估)
根据实施例8，由对N87细胞的各粒子的饱和结合曲线制成斯卡 恰特作图，及测定对于细胞的粒子的表观平衡解离常数(Kd)。结果， 对于N87细胞的HBP1-EO-NP-200，HBP2-EO-NP-200，及 HBP3-EO-NP-200平衡解离常数(Kd)分别是0.67nM，0.43nM和 0.49nM。对于其上固定具有最小数的HER2-结合肽的 HBP4-EO-NP-200，由于其弱结合而未从斯卡恰特作图获得平衡解离 常数(Kd)。对于HER2的HER2-结合肽的特定平衡解离常数(Kd) 被认为是1.0μM或更高。如在此例中显示，HER2-结合肽向粒子的大 量固定产生了能强烈结合于HER2的含有氧化铁粒子的粒子。
【实施例20】
(具有不同分子量的环氧乙烷接头的固定了HER2-结合肽的氧 化铁粒子的制备)
根据实施例17和18，制备具有2000的环氧乙烷接头分子量的 HBP-EO-NP-200。进行如在实施例17和18中的相同的过程，除了使 用的含有氧化铁粒子的粒子是nanomag(注册商标)-D(生产自 Micromod Partikeltechnologie GmbH；平均粒径：200nm，PEG接头 分子量：2000)，含有200nm氧化铁粒子的马来酰亚胺-表面修饰的 粒子(下文中，缩写为NP-EO2k-马来酰亚胺-200)之外。获得的固定 了HER2-结合肽的含有氧化铁粒子的粒子分别缩写为 HBP1-EO2k-NP-200，HBP2-EO2k-NP-200，HBP3-EO2k-NP-200和 HBP4-EO2k-NP-200。固定于含有氧化铁粒子的粒子的HBP量(HBP/ 含有氧化铁粒子的粒子)分别是2.5×105，4.9×104，1.2×104和2.0×103(2.0×103以投料的肽的摩尔量表示)。它们的平均水动力直径(累积 量值)分别是248nm，207nm，250nm和211nm。它们在PBS中的ζ 电位分别是-2.6mV，-2.8mV，-2.8mV和-3.1mV。
根据实施例8，由对N87细胞的各粒子的饱和结合曲线制成斯卡 恰特作图，及测定对于细胞的粒子的表观平衡解离常数(Kd)。结果， 对于N87细胞的HBP1-EO2k-NP-200，HBP2-EO2k-NP-200， HBP3-EO2k-NP-200，及HBP4-EO2k-NP-200的平衡解离常数(Kd) 分别是0.07nM，0.09nM，0.08nM和0.11nM。
【实施例21】
(HBP-EO-NP-200的小鼠药代动力学评估)
评价HBP-EO-NP-200的在患癌的小鼠中的药代动力学。根据实 施例9制备RI-标记的粒子，静脉内施用于患癌的小鼠模型，并通过 摘除检查其药代动力学。给小鼠的粒子剂量是0.22mg铁/小鼠。施用 的粒子数是3.2×1010粒子/小鼠。
在施用之后24小时的药代动力学结果示于图9。图9是显示在各 组织中的蓄积(对剂量和组织重量标准化的值)的图。肿瘤(N87细 胞)蓄积是1.5％ID/g。
【实施例22】
(具有改变分子量的环氧乙烷接头的固定了人工抗体的200nm 氧化铁粒子的制备)
根据实施例12，将人工抗体scFv结合于具有2000或5000的分 子量的具有环氧乙烷接头的含有200nm氧化铁粒子的各粒子。进行如 在实施例12中的相同的过程，除了使用的含有氧化铁粒子的粒子是： nanomag(注册商标)-D(生产自Micromod Partikeltechnologie GmbH； 平均粒径：200nm，PEG接头分子量：2000)，含有200nm氧化铁粒 子的马来酰亚胺-表面修饰的粒子(下文中，缩写为NP-EO2k-马来酰 亚胺-200)；及nanomag(注册商标)-D(生产自Micromod Partikeltechnologie GmbH；平均粒径：200nm，PEG接头分子量： 5000)，另一含有200nm氧化铁粒子的马来酰亚胺-表面修饰的粒子 (下文中，缩写为NP-EO5k-马来酰亚胺-200)之外。由此获得的固定 了scFv的含有氧化铁粒子的粒子分别缩写为scFv-EO2k-NP-200和 scFv-EO5k-NP-200。scFv-EO2k-NP-200和scFv-EO5k-NP-200的平均 水动力直径(数平均分布)通过动态光散射分别测定为175.6nm和 180.9nm。固定于含有氧化铁粒子的粒子的scFv的量(scFv/粒子)分 别是1490和1380。而且，这些粒子在PBS中分别具有-3.9mV和-4.0mV 的ζ电位。
scFv-EO2k-NP-200和scFv-EO5k-NP-200在710nm处分别具有 1.3×1010(M-1×cm-1)和1.1×1010(M-1×cm-1)的摩尔吸收系数(ε)， 且在710nm处分别具有260.0和168.0的光声信号(V/J/nM)。
根据实施例8，由对于N87细胞的各粒子的饱和结合曲线制成斯 卡恰特作图，及测定对于细胞的粒子的表观平衡解离常数(Kd)。结 果，对于N87细胞的scFv-EO2k-NP-200和scFv-EO5k-NP-200的平 衡解离常数(Kd)分别为0.22nM和0.04nM。
【实施例23】
(scFv-EO2k-NP-200和scFv-EO5k-NP-200的小鼠药代动力学的 评估)
评价scFv-EO2k-NP-200和scFv-EO5k-NP-200的在患癌的小鼠中 的药代动力学。根据实施例9，制备各RI-标记的粒子，静脉内施用于 患癌的小鼠模型，并通过摘除检查其药代动力学。给小鼠的粒子剂量 是0.22mg铁/小鼠。施用的粒子数是3.2×1010粒子/小鼠。
在施用之后24小时的药代动力学结果示于图10。图10是显示在 各组织中的蓄积(对剂量和组织重量标准化的值)的图。 scFv-EO2k-NP-200和scFv-EO5k-NP-200的肿瘤(N87细胞)蓄积分 别是4.0％ID/g和2.2％ID/g。
【实施例24】
(使用皮下施用于小鼠的scFv-EO-NP-200的光声成像)
图11显示用于小动物的生产的光声成像设备的简化图。将各小动 物用来自TI:SA激光源的激光(波长：710nm，脉冲宽度：约10ns，10 HZ重复，束直径：约2mm)适当衰减激光而照射。使用超声变换器 (BD＝1.5mm，FC＝3.5MHZ)检测形成的光声信号，使用放大器放大， 然后合并到示波器(50Ω输入阻抗，2.5GS/S，记录长度10K)。扫描 范围设为3.5cm矩形。
将在实施例12中制备的scFv-EO-NP-200用作光声成像用造影剂 的一例。将scFv-EO-NP-200的100μL的PBS溶液(铁浓度：2.2mg/mL) 皮下注射给各BALB/c Slc-nu/nu小鼠(Japan SLC，Inc.)。然后，将 小鼠在麻醉下固定到PA成像设备，以在小鼠皮肤下使用 scFv-EO-NP-200进行光声成像。结果示于图12。如从图12明白，由 scFv-EO-NP-200(铁：0.2mg)确认强光声信号。
【实施例25】
(对氧化铁粒子的粒径的摩尔吸收系数和光声信号)
通过下列方法测定粒径不同的氧化铁粒子的摩尔吸收系数和光声 信号：
使用的粒径不同的氧化铁粒子是聚合物-包被的5nm氧化铁粒子 (铁原子浓度：1.45mg/ml，氧化铁粒子浓度：10nmol/ml；SHP-05，生 产自Ocean NanoTech)，聚合物-包被的10nm氧化铁粒子(铁原子 浓度：5mg/ml，氧化铁粒子浓度：4.3nmol/ml；SHP-10，生产自Ocean NanoTech)，聚合物-包被的20nm氧化铁粒子(铁原子浓度：5mg/ml， 氧化铁粒子浓度：0.55nmol/ml；SHP-20，生产自Ocean NanoTech)， 及聚合物-包被的50nm氧化铁粒子(铁原子浓度：5mg/ml，氧化铁粒 子浓度：0.034nmol/ml；SHP-50，生产自Ocean NanoTech)。这些粒 径是一级粒径，不是次级粒径。
将各氧化铁粒子分散于水中以获得氧化铁粒子分散体。在710， 750，800和850nm处使用分光光度计(Lambda Bio 40，生产自 PerkinElmer Inc.)测量吸光度。使用的测量容器是具有1cm的宽度 和0.1cm的光路长度的聚(苯乙烯)比色杯。向此容器，添加200μl的氧 化铁粒子分散体及测量其吸光度。由Ocean NanoTech提供的文献测 定氧化铁粒子的铁原子浓度和粒子浓度。
由吸光度，铁原子浓度，及粒子浓度计算摩尔吸收系数/mol铁原 子和摩尔吸收系数/mol氧化铁粒子。
在光声信号测量中，将分散于水的各光声成像用造影剂用脉冲激 光照射。使用压电元件检测来自造影剂的光声信号，及使用高速前置 放大器放大，及然后使用数字示波器获得它们的波形。特定条件如下： 使用的脉冲激光源是钛-蓝宝石激光器(LT-2211-PC，生产自LOTIS LTD.)。条件涉及710，750，800和850nm的波长，约20～50mJ/cm2 的能量密度(依赖于选择的波长)，约20ns的脉冲宽度，及10Hz的 脉冲重复频度。用于含有分散于水的光声成像用造影剂的测量容器是 上述聚(苯乙烯)比色杯。用于检测光声信号的压电元件是具有1.27cm 的元件直径和1MHz的中心频度的非-收敛-型超声变换器(V303，生 产自Panametrics-NDT)。将测量容器和压电元件以2.5cm的间隔距 离浸到填充水的玻璃容器中。用于放大光声信号的高速前置放大器是 具有+30dB的放大度的超声前置放大器(模型5682，生产自 OLYMPUS CORP.)。将放大的信号输入到数字示波器(DPO4104，生 产自Tektronix)。将聚(苯乙烯)比色杯用脉冲激光从玻璃容器之外照 射。使用光电二极管检测由其散射的部分光，及作为引发信号输入到 数字示波器。数字示波器设置为32次-平均显示模式以获得32次激光 脉冲辐射的平均光声信号。图15显示典型光声信号的波形。如图中箭 标所示，由波形测定光声信号强度(V)。获得的光声信号强度除以 照射的脉冲激光的能量(J)，及将获得的值定义为用于标准化的光声 信号(VJ-1)及以下用作评估单位。
由铁原子浓度和粒子浓度分别计算用于标准化的光声信号/mol铁 原子和用于标准化的光声信号/mol氧化铁粒子。
图16A～16D显示粒径不同的氧化铁粒子的摩尔吸收系数和光声 信号。图16A显示在710nm处的摩尔吸收系数/mol各氧化铁粒子中 含有的铁原子。图16B显示在710nm处的摩尔吸收系数/mol氧化铁 粒子。摩尔吸收系数/mol铁原子呈现随着氧化铁粒子的粒径增加而增 加的趋势。也在其他波长观察到该摩尔吸收系数/mol铁原子的增加。 由于此效应，摩尔吸收系数/mol氧化铁粒子随着氧化铁粒子的粒径的 增加而显著增加。
图16C显示在710nm处用于标准化的光声信号/mol各氧化铁粒 子中含有的铁原子。图16D显示在710nm处的用于标准化的光声信 号/mol氧化铁粒子。用于标准化的光声信号/mol铁原子随着氧化铁粒 子的粒径增加而增加。同样，也在其他波长观察到该用于标准化的光 声信号/mol铁原子的增加。由于此效应，用于标准化的光声信号/mol 氧化铁粒子随着氧化铁粒子的粒径增加而显著增加。
具有更大粒径的氧化铁粒子吸收更大量的光，和由此发射更强光 声信号。特别在15nm或更大氧化铁粒子中观察吸收的光量及光声信 号的增加。
【实施例26】
(光声成像用造影剂1(NP1)的制备)
包括聚氧乙烯山梨糖醇酐脂肪酸酯，疏水聚合物，及氧化铁粒子 的光声成像用造影剂通过下列方法制备：
将油酸-包被的50nm氧化铁粒子(13.8mg，约50nm；SOR-50，生 产自Ocean NanoTech)和聚(乳酸-共-乙醇酸)(9.2mg，M.W.20000，乳 酸∶乙醇酸＝1∶1；PLGA5020，生产自Wako Pure Chemical Industries， Ltd.)添加到氯仿(1ml)。将混合物在超声波浴中照射10分钟以制 备氯仿溶液。
接下来，将氯仿溶液添加到含有溶解于其中的Tween 20(60mg； 生产自Kishida Chemical Co.，Ltd.)的水溶液(12ml)以制备混合的 溶液。
然后，将混合的溶液用超声破裂机(UD-200，生产自TOMY SEIKO CO.，LTD.)处理4分钟以制备O/W-型乳剂。
接下来，将氯仿从乳剂的分散体在100hPa的减压下于40℃蒸发 1小时或更长以获得光声成像用造影剂1的水分散体。将光声成像用 造影剂1通过离心纯化。下文中，此获得的光声成像用造影剂1也缩 写为NP1。
【实施例27】
(光声成像用造影剂2(NP2)的制备)
通过下列方法制备包括磷脂，聚氧乙烯山梨糖醇酐脂肪酸酯，疏 水聚合物，及氧化铁粒子的光声成像用造影剂：
将油酸-包被的50nm氧化铁粒子(13.8mg；SOR-50，生产自 Ocean NanoTech)和聚(乳酸-共-乙醇酸)(9.2mg)添加到氯仿(1ml)。 将混合物在超声波浴中照射10分钟以制备氯仿溶液。
接下来，将氯仿溶液添加到含有溶解于其中的Tween 20(60mg) 和磷脂(7.3mg；DSPE-PEG-MAL，N-[(3-马来酰亚胺-1-丙酰)氨基丙 基聚乙二醇-羰基]二硬脂酰磷脂酰-乙醇胺，生产自NOF CORP.)的 水溶液(12ml)以制备混合的溶液。
然后，将混合的溶液用超声破裂机处理4分钟以制备O/W-型乳 剂。
接下来，将氯仿从乳剂的分散体在100hPa的减压下于40℃蒸发 1小时或更长以获得光声成像用造影剂2的水分散体。将光声成像用 造影剂2通过离心纯化。下文中，此获得的光声成像用造影剂2也缩 写为NP2。
(NP1和NP2的物理性质评估)
使用DLS测定NP1和NP2的粒径。将NP1和NP2独立地分散 于水，及使用动态光散射分析仪(DLS；ELS-Z，生产自OTSUKA ELECTRONICS CO.，LTD.)测量它们的平均粒径。结果示于图17A 和18A。NP1和NP2的平均粒径(重量-平均)分别是205和176nm。
使用透射电子显微镜(TEM；H800，生产自Hitachi，Ltd.)观察 NP1和NP2。图17B和18B分别是光声成像用造影剂的TEM照片。 可观察到含有多个氧化铁粒子的光声成像用造影剂。
使用发射分光计(ICP；CIROS CCD，生产自SPECTRO Analytical Instruments GmbH)测定NP1和NP2中含有的氧化铁粒 子的量。将各光声成像用造影剂溶于浓硝酸。使用ICP测定Fe量， 及计算氧化铁粒子的重量。将光声成像用造影剂的水分散体冷冻干燥， 然后测量其重量以测定全体光声成像用造影剂的重量。对于NP1和 NP2，由氧化铁粒子的重量和光声成像用造影剂的重量，将光声成像 用造影剂中的氧化铁粒子含量分别计算为58和63(wt)％。可获得具有 高氧化铁粒子含量的光声成像用造影剂。
评价获得的NP1和NP2的光吸收性质通过测定光声成像用造影 剂的摩尔吸收系数/mol粒子。使用分光光度计测量分散于水的NP1 和NP2的光吸收。由通过这些方法获得的物理性质的值计算光声成像 用造影剂的粒子浓度。在710，750，800和850nm的波长的光声成像 用造影剂的摩尔吸收系数/mol粒子总结于下表4。NP1，NP2，及 Resovist(注册商标)的在710nm的波长的摩尔吸收系数分别是 2.1×1010，9.9×109和1.6×106(M-1cm-1(每摩尔粒子))。获得相比作 为已知的光声成像用造影剂的Resovist(注册商标)具有更优良的光 吸收的光声成像用造影剂。
表4
表4.在各波长的光声成像用造影剂的摩尔吸收系数/mol粒子
表5显示每NP1和NP2的粒子的用于标准化的光声信号。在 710nm波长处用于标准化的光声信号/mol的NP1，NP2，及Resovist (注册商标)的粒子分别是3.5×1011，2.0×1011和6.0×107(VJ-1M-1(每 摩尔粒子))。获得相比作为已知的光声成像用造影剂的Resovist(注 册商标)发射更强声学信号的光声成像用造影剂。
[表5]
表5.在各波长的光声成像用造影剂的用于标准化的光声信号/mol 粒子
(NP2上磷脂的定量)
使用末端马来酰亚胺基的活性测定导入NP2表面的磷脂的量。将 NP2和L-半胱氨酸混合及温育过夜，以使NP2上的马来酰亚胺基与 L-半胱氨酸上的硫氢基通过共价结合反应。将NP2通过离心沉淀，及 将上清液收集，以收集未反应的L-半胱氨酸。将未反应的L-半胱氨酸 与5，5’-二硫代双(2-硝基苯甲酸)混合，并通过测量在420nm处的吸光 度来定量。1个NP2粒子上的磷脂量是5.6×105分子/粒子。
【实施例28】
(单链抗体hu4D5-8scFv的制备)
基于HER2-结合IgG可变区的基因序列(hu4D5-8)，制备编码 单链抗体(scFv)的基因hu4D5-8scFv。首先，制备包括经编码肽 (GGGGS)3的cDNA连接的hu4D5-8的VL和VH基因的cDNA。分 别将NcoI-及NotI限制性位点导入其5’和3’端。核苷酸序列示于下。
5’-CCATGGATATCCAGATGACCCAGTCCCCGAGCTCCCT GTCCGCCTCTGTGGGCGATAGGGTCACCATCACCTGCCGTG CCAGTCAGGATGTGAATACTGCTGTAGCCTGGTATCAACAGA AACCAGGAAAAGCTCCGAAACTACTGATTTACTCGGCATCCT TCCTCTACTCTGGAGTCCCTTCTCGCTTCTCTGGATCCAGAT CTGGGACGGATTTCACTCTGACCATCAGCAGTCTGCAGCCGG AAGACTTCGCAACTTATTACTGTCAGCAACATTATACTACTC CTCCCACGTTCGGACAGGGTACCAAGGTGGAGATCAAAGGC GGTGGTGGCAGCGGTGGCGGTGGCAGCGGCGGTGGCGGTA GCGAGGTTCAGCTGGTGGAGTCTGGCGGTGGCCTGGTGCAG CCAGGGGGCTCACTCCGTTTGTCCTGTGCAGCTTCTGGCTTC AACATTAAAGACACCTATATACACTGGGTGCGTCAGGCCCCG GGTAAGGGCCTGGAATGGGTTGCAAGGATTTATCCTACGAAT GGTTATACTAGATATGCCGATAGC GTCAAGGGCCGTTTCACT ATAAGCGCAGACACATCCAAAAACACAGCCTACCTGCAGATG AACAGCCTGCGTGCTGAGGACACTGCCGTCTATTATTGTTCT AGATGGGGAGGGGACGGCTTCTATGCTATGGACTACTGGGG TCAAGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCGGCGGCCGC-3’(SEQ ID NO：1)
(限制位点加了下划线。)
将基因片段hu4D5-8scFv插入质粒pET-22b(+)(Novagen，Inc.) 的T7/lac启动子的下游。特别是，将cDNA与用限制酶NcoI-及NotI 消化的pET-22b(+)(Novagen，Inc.)连接。
将大肠埃希氏菌(Escherichia coli)BL21(DE3)用此表达质粒转 化以获得用于表达的细菌株。将获得的细菌株在4ml的LB-Amp培养 基中预培养过夜。然后，将其全量添加到250ml的2xYT培养基和以 120rpm于28℃振摇培养8小时。然后，以1mM的终浓度添加IPTG (异丙基-β-D(-)-硫代吡喃半乳糖苷)之后，将细菌株于28℃过夜培养。 将培养的大肠埃希氏菌(Escherichia coli)以8000×g于4℃离心30 分钟，及收集培养溶液的上清液。向获得的培养溶液，添加60重量％ 的硫酸铵，并通过盐析沉淀蛋白。使溶液于4℃静置过夜而经历盐析， 然后以8000×g于4℃离心30分钟以收集沉淀物。将获得的沉淀物溶 于20mM Tris·HCl/500mM NaCl缓冲液及对1L的相同的缓冲液透析。 将由此透析的蛋白溶液加入装载了His·Bind(注册商标)树脂 (Novagen，Inc.)的柱并通过金属螯合物亲和层析经Ni离子纯化。在 还原SDS-PAGE中确认纯化的hu4D5-8scFv而呈现单条带且具有约 28kDa的分子量。制备的抗体的氨基酸序列示于下。下文中， hu4D5-8scFv也缩写为scFv。
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAVAWYQQKPG KAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYY CQQHYTTPPTFGQGTKVEIKGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESG GGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWVARI YPTNGYTRYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVY YCSRWGGDGFYAMDYWGQGTLVTVSSAAALEHHHHHHGGC
(SEQ ID NO：2)
(单链抗体hu4D5-8scFv和NP2之间的结合)
将以上“单链抗体hu4D5-8sdCv的制备”中制备的缓冲液用含有 5mM EDTA的磷酸缓冲液取代(2.68mM KCl/137mM NaCl/1.47mM KH2PO4/1mM Na2HPO4/5mM EDTA，pH7.4)。然后，将scFv使用20 倍摩尔量的三(2-羧乙基)膦(TCEP)于25℃还原约2小时。将此由此 还原的scFv于25℃与以上制备的NP2反应3小时。将scFv以NP2 粒子的2000倍摩尔量的量用于反应。通过离心获得固定了scFv的NP2 的沉淀物和未反应的scFv的上清液。通过液相层析定量未反应的 scFv。固定于1个NP2粒子的scFv是1.4×103分子/粒子。
【实施例29】
(光声成像用造影剂3(NP3)的制备)
通过下列方法制备包括两性聚合物和氧化铁粒子的光声成像用造 影剂：
将聚(马来酸酐-共-苯乙烯)(12.5mg，平均分子量：9500，苯乙烯∶ 马来酸酐＝75∶25(摩尔比)；生产自Polysciences，Inc.)溶于氯仿(3ml)。 将此溶液通过添加MeO-PEG-NH2(45mg，平均分子量：5000； SUNBRIGHT ME-50EA，生产自NOF CORP.)来反应以获得两性聚 合物(导入有PEG链的聚(马来酸酐-共-苯乙烯))。
将油酸-包被的50nm氧化铁粒子(14mg；SOR-50，生产自Ocean NanoTech)和两性聚合物(50mg)添加到氯仿(3ml)。然后，将氯 仿通过蒸发来蒸发。
然后，将水(18ml)加入残留物。将混合物在超声波水浴中处理 1分钟以获得光声成像用造影剂3的水分散体。将光声成像用造影剂3 通过离心纯化。下文中，此获得的光声成像用造影剂3也缩写为NP3。
NP3具有211nm的平均粒径(重量-平均)。而且，NP3确认为 具有1.9×1010(M-1cm-1(每摩尔粒子))/mol粒子的摩尔吸收系数和 4.8×1011(V J-1M-1(每摩尔粒子))/mol粒子的用于标准化的光声信 号。
使用冷冻-TEM观察NP3。结果示于图19。从图19确认NP3含 有多个氧化铁粒子。
【实施例30】
(光声成像用造影剂的粒径和光声信号)
通过以下显示的方法制备粒径不同的光声成像用造影剂。使用的 氧化铁粒子是油酸-包被的50nm氧化铁粒子(SOR-50，生产自Ocean NanoTech)和油酸-包被的5nm氧化铁粒子(SOR-05，生产自Ocean NanoTech)。
将5nm或50nm氧化铁粒子(13.8mg)和聚(乳酸-共-乙醇酸) (9.2mg)添加到氯仿(1ml)。将混合物在超声波浴中照射10分钟 以制备氯仿溶液。接下来，用或不用不同类型的磷脂制备各种含有溶 解于其中的Tween 20(60mg；生产自Kishida Chemical Co.，Ltd.)的 水溶液(12ml)。将氯仿溶液加入各Tween 20的水溶液以制备混合 的溶液。然后，进行如在NP1和NP2制备方法中相同的过程。以相 同的铁原子重量制备含有5nm氧化铁粒子的光声成像用造影剂和含 有50nm氧化铁粒子的光声成像用造影剂。从TEM观察和光声成像 用造影剂中的氧化铁粒子含量，可确认获得的光声成像用造影剂稠密 地含有的多个5nm或50nm氧化铁粒子。
图20A和20B显示含有50nm或5nm氧化铁粒子的光声成像用 造影剂的平均粒径(重量-平均)和光声信号之间的关系。各光声成像 用造影剂的用于标准化的光声信号/mol铁原子和用于标准化的光声信 号/mol粒子作为光声信号分别显示于图20A和20B。含有50nm氧化 铁粒子的光声成像用造影剂确认为随着光声成像用造影剂的粒径的增 加而具有光声信号/mol铁原子的增加。此趋势无关于制备方法，即， 除了氧化铁粒子之外的组分。而且，由于此趋势，在含有50nm氧化 铁粒子的光声成像用造影剂中，光声成像用造影剂的光声信号/mol粒 子也增加。由此，获得了发射强光声信号的光声成像用造影剂。
【符号说明】
1光声成像用造影剂
2氧化铁粒子
3两性化合物
4磷脂
5聚氧乙烯山梨糖醇酐脂肪酸酯
6两性聚合物
7疏水聚合物
8配体分子
9光声成像用造影剂
10第1液体
11第2液体
12乳剂
13水
本申请要求2009年10月5日提交的日本专利申请No. 2009-231994，和2010年6月24日提交的No.2010-144322的权利， 将它们通过引用整体并入本文。
机译： 用于光声成像的造影剂和使用用于光声成像的造影剂的光声成像方法
机译： 用于光声成像的造影剂，或使用该造影剂的光声成像方法
机译： 光声成像造影剂，以及使用其的光声成像方法
