一种在毕赤酵母表达系统生产德国小蠊过敏原Blagarg蛋白的方法

摘要

本发明公开了一种在毕赤酵母表达系统生产德国小蠊过敏原Blagarg蛋白的方法：从德国小蠊组织提取总RNA，反转录为cDNA，通过PCR方法获得德国小蠊过敏原Blagarg编码基因；将该编码基因克隆到pGAPaA质粒中，转化酵母表达菌株GS115以表达；采用亲和层析方法进行纯化，从而到德国小蠊过敏原Blagarg蛋白。本发明方法通过毕赤酵母表达系统生产德国小蠊过敏原Blagarg蛋白，并采用一种亲和层析的方法，解决Blagarg过敏原生产的问题。

说明书

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种在毕赤酵母表达系统生产德国小蠊过 敏原Blagarg蛋白的方法。

背景技术

过敏性疾病是人类重大疾病之一。其发病率目前估计约占世界人口的30～40％，而 且正以每年大于1％的速度增加，以儿童患者的发病率上升最为明显。在过去几十年， 过敏性疾病的发生率在全球有显著和迅速的增加，西方国家比发展中国家多，城市比农 村地区多。目前治疗过敏性疾病的方法主要体现在减轻症状。患者经常服用一些抗组胺 类以及类固醇药物以缓解症状，然后这些药物并不能抑制IgE抗体的产生并经常带来副 作用。近年来特异性免疫治疗(脱敏治疗)在过敏性疾病中的作用得到了肯定，被认为是 当前过敏性疾病唯一的对因治疗方法。该疗法是在确定患者的过敏原后，对患者给予由 低到高剂量的过敏原治疗。通过反复给药诱导其对此过敏原的耐受性，当再次接触此类 过敏原时就不产生或减轻过敏反应。

然而，用于治疗的过敏原提取物是从天然来源分离得到的蛋白质和非蛋白质成分的 粗混合物，过敏原提取物或者含有大量与过敏原无关的成分，或者几乎不含有造成患者 高敏感性的过敏原。所有对一种特定的过敏反应提取物敏感的患者接受含全部提取物成 分相同的复杂混合物的治疗，有可能导致副作用的产生。同样对过敏诊断而言，这种使 用整个过敏反应提取物来进行皮肤测试和血清检测妨碍了导致患者敏感的特殊过敏原 的检测。针对这些缺点，许多研究人员采用生物化学分离和纯化技术的方法得到单独的 过敏原。然而，尽管这个方法对于过敏原的鉴定可能有效，但却不足以制备工业规模上 的过敏原。因为这个过程极其耗费人力，并且从昂贵的自然资源中纯化出过敏原产量通 常情况下都很低。基于这些原因，用于合成过敏原蛋白质的重组DNA技术引起了人们 的注意。利用可生长在大发酵罐的微生物表达系统可以大规模获得重组过敏原。因此， 这些技术使得重组过敏原以一致纯度大量生产。除此以外，使用重组DNA技术可以表 达抗原表位片断或修饰的过敏原以方便应用于过敏性疾病的诊断或处理。

早在上世纪60年代，就有蟑螂引起哮喘的报道。但直到近年来，蟑螂在哮喘发病 中的作用才逐渐受到人们的关注。资料显示，美国哮喘患者中蟑螂过敏的发生率达到 27.5～42％，欧洲为3.9～24.5％，非洲为30～44.6％，在我国，北京、上海等大城市中 儿童哮喘患者的蟑螂过敏率也高达27.8～43.8％。哮喘发病率的不断升高，在很大程度 上与蟑螂污染加剧有关，蟑螂已经成为仅次于尘螨的第二大室内过敏源。目前常见的美 洲大蠊和德国小蠊过敏原已经被鉴定出来。德国小蠊为我国长江中下游地区主要的过敏 源。近年来研究表明德国小蠊提取物1)可直接诱导支气管上皮细胞中基质金属蛋白酶 -9和IL-8的表达和释放，导致支气管哮喘的发生；2)可诱导嗜酸性粒细胞活化，使其释放 细胞毒性炎症介质，引起组织过敏反应，介导气道炎症；3)可增加人气道上皮细胞中TNF -α诱导的IL-8表达。然而德国小蠊提取物成分复杂，包含多种蛋白成分和非蛋白成 分，进一步研究发现德国小蠊提取物中的丝氨酸蛋白酶成分引起上述参与上述哮喘症状 的产生。而且这些丝氨酸蛋白酶成分是通过蛋白酶激活受体介导的。然而目前德国小蠊 中这些蛋白酶成分还没有被鉴定出来。面前美洲大蠊中的蛋白酶成分已经鉴定出来，为 一种激肽释放酶。美洲大蠊中激肽释放酶过敏原蛋白已经在大肠杆菌和昆虫细胞表达系 统中得到表达。研究表明它是美洲大蠊过敏病人中的主要过敏原蛋白。然后在大肠杆菌 中的表达的激肽释放酶过敏原蛋白因为不能完全实现蛋白质的正确折叠，活性非常差， 不能用于临床诊断和治疗的要求。昆虫细胞表达系统能实现蛋白的正确折叠和糖基化修 饰，与天然蛋白相似。然后昆虫表达系统成本巨大，不适合大规模发酵生产，限制它在 临床上的进一步应用。在本专利中我们根据genbank登录的德国小蠊激肽释放酶的基因 序列设计引物，从德国小蠊中克隆出一个激肽释放酶基因，通过大肠杆菌和酵母表达系 统表达并纯化出该蛋白，应用于德国小蠊过敏病人，鉴定出该激肽释放酶为德国小蠊中 主要过敏原蛋白。

本发明采用现代生物技术，选择毕赤酵母表达系统，其表达产物的生物学特性与 天然产物相似，具有可糖基化、磷酸化、酰胺化和蛋白切割等后加工修饰功能，而且具 有很高的克隆容量，表达产量高，培养简单，适合大规模生产等优点，从德国小蠊中克 隆出激肽释放酶基因，构建表达载体转化到表达量高，易于纯化以及容易适应大规模工 业化发酵生产的毕赤酵母中，应用德国小蠊过敏的诊断和特异性免疫治疗中。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种在毕赤酵母表达系统中生产德国小蠊过敏 原Blagarg蛋白的方法。

未解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：

一种在毕赤酵母表达系统中生产德国小蠊过敏原Blagarg蛋白的方法，包括如下步 骤：

(1)从德国小蠊组织提取总RNA，反转录为cDNA，通过PCR方法获得德国小蠊 过敏原Blagarg编码基因；

(2)将该编码基因克隆到pGAPaA载体中，转化毕赤酵母菌株GS115以表达Blagarg 蛋白；

(3)采用亲和层析方法对Blagarg蛋白进行纯化，从而到德国小蠊过敏原Blagarg 蛋白。

步骤(1)中，所述的Blagarg编码基因如SEQ ID No：1所示。

步骤(1)中，所述的Blagarg编码基因，其所编码的氨基酸序列如SEQ ID No：2所示。 与基因数据库(Genbank)中收录的德国大蠊精氨酸酯酶序列有3个位点氨基酸差异， 分别是第26位为Lys而不是数据库的Arg。第284位为His而不是数据库的Arg。第341 位为Glu而不是数据库的Gly。与我们先前表达的美洲大蠊精氨酸酯酶过敏原Per a9 有6个位点的差异，分别为第45位为Thr，而不是Ser。第75位为Gly，而不是Ala。第 197位为His，而不是Ala。第257位为Val，而不是Ile。第258位为Pro，而不是Ser。 第294位为Lys，而不是Ala。

步骤(2)中，所述的毕赤酵母表达载体为pGAPaA。

步骤(2)中，所述的毕赤酵母表达菌株为GS115。

步骤(3)中，所述的亲和层析方法为Nickel亲和层析法。含有Blagarg编码基因的表 达菌株在10毫升YPD培养基中30摄氏度震荡(250转/分)培养18小时，加入600毫 升YPD中，30摄氏度震荡(250转/分)培养5天。收集上清，在20mM Tris-HCl缓 冲液(pH 8.0)中透析。上Nickel亲和柱，用20mM Tris-HCl洗去非特异性结合蛋白，该 Tris-HCl含有500mM NaCl和20mM咪唑，之后改用20mM Tris-HCl洗脱，该Tris-HCl 含有500mM NaCl、250mM咪唑，洗脱下的蛋白即为Blagarg蛋白。

有益效果：尽管genbank登记有德国小蠊精氨酸酯酶序列，但是没有任何德国小蠊 精氨酸酯酶蛋白的生产和活性的表达。本发明通过不同表达系统生产德国小蠊精氨酸酯 酶蛋白，并鉴定出它为过敏原蛋白。并发现毕赤酵母表达的蛋白具有更高的特异性Ig E 结合活性，并适应用于德国小蠊过敏的诊断和脱敏治疗的应用。

本发明方法通过毕赤酵母生产德国小蠊过敏原Blagarg蛋白，从而避免在大肠杆菌 表达系统中活性不好的问题，和昆虫细胞中表达工艺复杂，不能大规模发酵生产和成本 很高的缺点，并提供一种亲和层析的方法，解决天然Blagarg过敏原纯化工艺复杂的问 题。

附图说明

图1为重组Blagarg诱导表达及其纯化的SDS-PAGE图谱。其中M：蛋白分子量 标准；S：酵母诱导表达后上清。F：上Nickel柱后穿透峰；E：用20mM Tris-HCl(含 有500mM NaCl，250mM咪唑，pH8.0)洗脱下的蛋白。

图2为纯化后的蛋白(Blagarg)与德国小蠊过敏病人血清和非过敏病人混合血清 免疫印迹(Western blot)鉴定图。其中1为Blagarg德国小蠊过敏病人血清免疫印迹鉴 定图。其中2为Blagarg与非过敏病人混合血清印迹鉴定图。

具体实施方式

根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实 施例所描述的具体的物料配比、工艺条件及其结果仅用于说明本发明，而不应当也不会 限制权利要求书中所详细描述的本发明。

实施例1：德国小蠊总RNA的提取。

取人工饲养的冻存德国小蠊(来自江苏省疾病控制中心)，液氮研磨，按照100mg/mL Trizol试剂加入Trizol试剂。提取德国小蠊总RNA。

实施例2：PCR扩增出德国小蠊过敏原Blagarg的基因并克隆。

将提取出来的总RNA反转录为cDNA。根据genbank登记德国小蠊过敏原Blagarg 基因序列设计引物5’-ATGGTGGATGCCGCAGTTCT-3’和 5’-CAGGGAGCTCTCAATCTTGAT-3’，用PCR方法(94℃预变性10分钟后，94℃30 秒，50℃45秒，72℃1分钟共35个循环)扩增出Blagarg基因，并克隆到pMD18-T载 体中，转化到大肠杆菌JM109感受态细胞中。涂板过夜培养。筛选阳性菌，抽提质粒 PCR和测序鉴定。得到德国小蠊过敏原Blagarg基因，其核苷酸序列如SEQ ID No：1 所示。

实施例3：德国小蠊过敏原Blagarg表达质粒的构建。

将得到的Blagarg基因通过XhoI和Not I酶切位点克隆到质粒pGAPaA中，转化感 受态JM109。筛选出阳性克隆。

实施例4：酵母菌诱导表达和纯化

含有Blagarg编码基因的表达菌株(阳性克隆)在10毫升酵母膏胨葡萄糖琼脂培养 基(YPD)中30摄氏度震荡(250转/分)培养18小时，加入600毫升YPD中，30 摄氏度震荡(250转/分)培养5天。收集上清，在20mM Tris-HCl缓冲液(pH 8.0)中透 析。上Nickel亲和柱，用20mM Tris-HCl洗去非特异性结合蛋白，该Tris-HCl含有500 mM NaCl和20mM咪唑，之后改用20mM Tris-HCl洗脱，该Tris-HCl含有500mM NaCl、250mM咪唑，洗脱下的蛋白即为Blagarg蛋白(图1)。

实施例5：Blagarg蛋白过敏原活性鉴定

德国小蠊过敏病人血清来自于江苏省人民医院过敏门诊，德国小蠊过敏病人通过临 床诊断，过敏原皮肤点刺实验和过敏原血清学实验室检测确定。非过敏病人为临床诊断， 过敏原皮肤点刺实验和过敏原血清学实验室检测均没有发现德国小蠊过敏的病人。分离 到的Blagarg蛋白通过SDS-PAGE电泳后，转移到PVDF膜上。与德国小蠊过敏病人(血 清学实验诊断为德国小蠊过敏III级)和6个德国小蠊过敏阴性混合血清混合血清孵育 90分钟。PBS洗膜后，再与抗人IgE(辣根过氧化物酶偶联)孵育显色。德国小蠊过敏 混合血清有染色带出现。非过敏病人无信号(图2)。这说明德国小蠊Blagarg蛋白能与 德国小蠊过敏病人特异性IgE结合，而与非过敏病人IgE结合，从而鉴定出德国小蠊 Blagarg蛋白为过敏原蛋白。

实施例6：不同表达系统表达出的Blagarg蛋白的特异性IgE结合活性的比较

采用直接ELISA方法分别测定毕赤酵母和大肠杆菌生产的Blagarg蛋白的特异性 IgE结合活性。将2种蛋白稀释成lug/mi，高亲和板每孔加入每种蛋白50ul，37度保温 1小时，洗涤3遍。用1％小牛血清蛋白溶液封闭2h后，洗涤3遍。加入稀释10倍后 的6个德国小蠊过敏病人混合血清和6个非德国小蠊过敏病人混合血清50ul，保温1h， 洗涤3遍。每孔加1∶150000的偶联辣根过氧化物酶的羊抗人IgE 50ul，37度保温40分 钟，洗板5遍。加入50ul四甲基联苯胺(TMB)和过氧化氢。闭光反应5分钟，加入50ul1M 硫酸终止反应。在450nm处测定OD值。德国小蠊过敏阳性混合血清和德国小蠊过敏阴 性混合血清450nm处测定OD值得差值可表示为各种蛋白的特异性IgE结合活性。结果 显示毕赤酵母表达的Blagarg蛋白为大肠杆菌表达的Blagarg蛋白的1.4倍。说明毕赤酵 母表达的Blagarg特异性IgE结合活性优于大肠杆菌生产的Blagarg蛋白，比较合适用于 德国小蠊过敏的诊断和脱敏治疗的应用。