法律状态公告日
法律状态信息
法律状态
2013-03-20
授权
授权
2012-05-23
实质审查的生效 IPC(主分类):C12Q1/68 申请日:20100926
实质审查的生效
2012-04-11
公开
公开
技术领域
本发明涉及一种辅助诊断非浸润性膀胱癌和浸润性膀胱癌的试剂。
背景技术
膀胱癌是严重威胁人类健康的一种恶性肿瘤,在美国和欧洲地区,膀胱癌在男性恶性肿 瘤中所占比例分别是10%和5%,男性的发病率为女性的3~4倍,平均发病年龄为65~70岁。 在中国,膀胱癌的发病率同样位居男性恶性肿瘤的前列。根据组织病理学及临床表现,膀胱 尿路上皮癌大致分为两类:非浸润性膀胱尿路上皮癌和浸润性膀胱尿路上皮癌。超过70%的 膀胱尿路上皮癌病变局限于上皮及粘膜固有层,包括原位癌和非浸润性肿瘤;这类病人术后 经常出现复发,其中5~30%会进展为肌肉浸润性病变。剩余不足30%的病人属于浸润性膀胱 尿路上皮癌,此类病人预后不良且病情进展迅速,5年生存率小于50%。
目前,对于这两种类型膀胱癌所采用的治疗方案不同,对非浸润性膀胱癌患者多采取经 膀胱镜下电切肿瘤,而浸润性膀胱癌患者则采取膀胱切除术治疗。因此,术前准确区分膀胱 癌为非浸润性或浸润性对于制定合理的手术术式至关重要。在实际工作中,临床医生主要根 据膀胱镜下所见肿瘤大小、有蒂或无蒂来粗略判断肿瘤类型。但是,当肿瘤较大或肿瘤蒂不 明显时,区分非浸润性和浸润性癌就十分困难,只能依靠术后的组织病理学方法进行诊断。 因此,是否能找出有效的分子标志物来辅助术前鉴别诊断浸润性和非浸润性膀胱癌,是一个 有待回答的重要临床问题。
基因芯片技术广泛应用于药物研发、临床筛查等多个领域,包括肿瘤的分子分型,具有 快速、灵敏、高通量等优点。微阵列比较基因组杂交技术(array Comparative Genomic Hybri dization,array CGH)是基因芯片的一种,能够快速、全面地筛查肿瘤基因组结构功 能的变化.如果能够通过基因芯片技术从非浸润性和浸润性膀胱癌的差异DNA片段/区域中筛 选出一组具有鉴别意义的分子标志,对于辅助膀胱癌的正确诊断意义重大。
发明内容
本发明的目的是提供一种辅助诊断非浸润性膀胱癌和浸润性膀胱癌的试剂。
本发明提供的辅助诊断非浸润性膀胱癌和浸润性膀胱癌的试剂,由序列表的序列1至序 列表的序列96所示的96条DNA组成。
本发明还保护含序列表的序列1至序列表的序列96所示的96条DNA的DNA芯片。
所述试剂可用于制备辅助诊断非浸润性膀胱癌和浸润性膀胱癌的试剂盒。
本发明还保护一种辅助诊断非浸润性膀胱癌和浸润性膀胱癌的试剂盒,包括所述的试剂。
本发明提供的辅助诊断非浸润性膀胱癌和浸润性膀胱癌的试剂包括用于检测5个染色体 区段的96种DNA探针。应用96种DNA探针的杂交信号,可以得到5个染色体片段的信号处 理数据,根据5个染色体区段的信号处理数据,按照一定判断标准,可以辅助诊断非浸润性 膀胱癌和浸润性膀胱癌,具有较高的准确率,且相对临床病理诊断法,操作更为简单,具有 较强的实用性和临床应用价值。
附图说明
图1为65例患者的根据染色体片段数据辅助诊断非浸润性膀胱癌和浸润性膀胱癌的流程 和结果示意图;柱形图中“1”表示非浸润性膀胱癌,“2”表示浸润性膀胱癌。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明,但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法, 如无特殊说明,均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料,如无特殊说明,均为自常规 生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验,均设置三次重复实验,结果取平均值。
实施例1、辅助诊断非浸润性膀胱癌和浸润性膀胱癌的试剂的制备
辅助诊断非浸润性膀胱癌和浸润性膀胱癌的试剂由96条DNA探针组成;96条DNA探针 的核苷酸序列如表1所示,针对不同的染色体片段。表1中,序列1至序列5为针对 1p36.13(chr1:16218_16270)的探针,序列6至序列10为针对1q32.1(chr1:201426_201543) 的探针,序列11和序列12为针对5q11.2(chr5:54469_54489)的探针,序列13至序列91为 针对9q21.31-q21.33(chr9:82707_89606)的探针;序列92至序列96为针对 9q33.2(chr9:122723_122836)的探针。表1中的序列1至序列96与序列表中的序列1至序列 96一一对应。
表1探针序列
实施例2、实施例1的试剂在辅助诊断非浸润性膀胱癌和浸润性膀胱癌中的应用
在知情同意的前提下,用实施例1的试剂分别对65例膀胱癌患者进行检测。
一、采用金标准进行诊断
65例膀胱癌患者先采用临床病理(金标准)方法进行诊断。诊断结果为:非浸润性膀胱 癌患者29例,浸润性膀胱癌患者36例。各个病例的诊断结果见表8。
二、采用本发明的试剂进行诊断
1、提取膀胱癌组织的基因组DNA。
2、将提取的基因组DNA进行array CGH芯片杂交
采用的是Agilent公司的芯片技术平台,所用44k array CGH属于高密度芯片,每个芯 片含用43000个探针,能够覆盖全基因组的超过30000个基因,分辨率为35kb;该芯片中含 有表1中所列的96条探针。
3、芯片经过Agi lent芯片扫描仪,以5um分辨率扫描,用Feature Extraction 9.1从 芯片扫描图片中提取各探针的信号值。
4、利用R project(Team,R.D.C.R:A language and environment for statistical computing.R Foundation for Statistical Computing,Vienna,Austria.ISBN 3-900051-07-0,URL http://www.R-project.org(2009).;Fridlyand,J.& Dimitrov,P. aCGH:Classes and functions for Array Comparative Genomic Hybridization data.R package version 1.18.1.(2009).)对探针信号值进行分析,进行均一化(normalization) 和片段化(segmentation)的程序处理。
每个患者96个探针信号值的均一化后数据见表2至表6。
表296个探针信号值的均一化后数据
表396个探针信号值的均一化后数据
表496个探针信号值的均一化后数据
表596个探针信号值的均一化后数据
表696个探针信号值的均一化后数据
序列1至序列5为针对1p36.13(chr1:16218_16270)的探针,即将该5个探针均一化后 的数据进行片段化,得到chr1:16218_16270片段数据;序列6至序列10为针对 1q32.1(chr1:201426_201543)的探针,即将该5个探针均一化后的数据进行片段化,得到 chr1:201426_201543片段数据;序列11和序列12为针对5q11.2(chr5:54469_54489)的探针, 即将该2个探针均一化后的数据进行片段化,得到chr5:54469_54489片段数据;序列13至 序列91为针对9q21.31-q21.33(chr9:82707_89606)的探针,即将该79个探针均一化后的 数据进行片段化,得到chr9:82707_89606片段数据;序列92至序列96为针对 9q33.2(chr9:122723_122836)的探针,即将该5个探针均一化后的数据进行片段化,得到 chr9:122723_122836片段数据。片段化后的数据见表7。
表765个样本的片段化后的数据
5、根据片段化后的数据进行评判,评判标准(参见图1)如下:
首先根据chr9:82707_89606片段数据进行评判,chr9:82707_89606片段数据小于等于 -0.514的患者为候选的非浸润性膀胱癌患者,chr9:82707_89606片段数据大于-0.514的患 者对chr1:16218_16270片段数据进行评判;
chr1:16218_16270片段数据小于等于0.055的患者对chr1:201426_201543片段数据进 行评判,chr1:16218_16270片段数据大于0.055的患者对chr9:122723_122836片段数据进 行评判;
chr1:201426_201543数据小于等于0.056的患者为候选的浸润性膀胱癌患者, chr1:201426_201543数据大于0.056的患者为候选的非浸润性膀胱癌患者;
chr9:122723_122836数据小于等于-0.111的患者为候选的浸润性膀胱癌患者, chr9:122723_122836数据大于-0.111的患者对chr5:54469_54489片段数据进行评判;
chr5:54469_54489数据小于等于-0.287的患者为候选的浸润性膀胱癌患者, chr5:54469_54489数据大于-0.287的患者为候选的非浸润性膀胱癌患者。
以第1号病例为例,按上述方法进行评判。首先,chr9:82707_89606片段的值为-0.079, -0.079>-0.514,因此再观察第二个指标;chr1:16218_16270片段的值为0.019,小于0.055, 因此再观察第三个指标;chr1:201426_201543片段的值为0.056,因此判断该病例类型为“2” 型,即浸润性膀胱癌。根据上述判断标准,65例患者的判断结果见表8。
表865例患者的判断结果
*“1”表示非浸润性膀胱癌,“2”表示浸润性膀胱癌。
#“T”表示分型预测正确,true;“F”表示分型预测错误,false。
共检测65例病人,分型正确率为90.8%(59/65),其中第14号,37号,41号,45号, 49号,64号病人被错误分型。
机译: 评估非肌肉浸润性膀胱癌患者治疗效果的方法
机译: 减少非肌肉浸润性膀胱癌发展为肌肉浸润性癌的方法
机译: Paclitaxel-透明质酸在非肌肉浸润性膀胱癌治疗中的作用