一种同时进行硫酸盐还原和反硝化的厌氧细菌的分离方法

摘要

一种同时进行硫酸盐还原和反硝化的厌氧细菌的分离方法，它涉及一种厌氧细菌的分离方法。本发明解决了现有分离同时进行硫酸盐还原和反硝化的厌氧细菌的方法分离周期较长、不易获得纯菌株的问题。方法：一、提取DNA、PCR扩增；二、分离培养、纯化培养和富集培养；三、PCR扩增；四、分离培养、纯化培养和富集培养；五、PCR扩增；六、分离培养、纯化培养和富集培养即得到同时进行硫酸盐还原和反硝化的厌氧细菌。本发明的分离方法，与现有厌氧同时硫酸盐还原和反硝化细菌的分离方法相比，周期缩短了40%~50%，工作量小，周期短；本发明的分离方法得了目的菌株的纯菌株，且对硝酸盐和亚硝酸的降解效果好。

说明书

技术领域

本发明涉及一种厌氧细菌的分离方法。

背景技术

可同时进行硫酸盐还原和反硝化的厌氧细菌主要用于含有硫酸盐和硝酸盐污水的处理，该功能菌株快速分离和鉴定对于污水处理工艺的改进以及污水处理的效能提高具有重要的意义，同时该菌株在微生物降解机理研究方面具有重要的科研价值。目前，现有可同时进行硫酸盐还原和反硝化的厌氧细菌的分离方法对厌氧环境要求严格，厌氧条件控制困难，分离过程中工作量大，分离周期较长，同时现有的分离方法不易获得纯菌株，还存在即使获得了菌株，却不是目的功能菌株，而且非目的菌株对硫酸盐、硝酸盐和亚硝酸的降解效果不好。可同时进行硫酸盐还原和反硝化的厌氧细菌分离困难，导致许多的基础理论的研究无法进行，且随着环境的日益恶化，特别是工业废水硫酸盐和硝酸盐污染的加剧，可同时进行硫酸盐还原和反硝化的厌氧细菌的分离和相关的研究凸显出重要性。

发明内容

本发明的目的是为了解决现有分离同时进行硫酸盐还原和反硝化的厌氧细菌的方法分离周期较长、不易获得纯菌株的问题，而提供了一种同时进行硫酸盐还原和反硝化的厌氧细菌的分离方法。

本发明同时进行硫酸盐还原和反硝化的厌氧细菌的分离方法按照以下步骤进行：一、对环境样本采用DNA抽提试剂盒提取样品中环境微生物的总DNA，然后针对硫酸盐还原的亚硫酸还原酶基因和反硝化的特异基因nis K基因的序列，采用两套特异性引物，进行PCR扩增得到同时硫酸盐还原和反硝化的厌氧细菌；二、步骤一中扩增出的能同时进行硫酸盐还原和反硝化的厌氧细菌进行分离培养、纯化培养和富集培养，即得到同时硫酸盐还原和反硝化的厌氧细菌的菌液A；三、菌液A采用两套特异性引物对菌液中细菌的 DNA进行PCR扩增，然后进行电泳检测，将同时能够扩增出亚硫酸还原酶基因和nis K基因条带的菌液确定为同时硫酸盐还原和反硝化的厌氧细菌Ⅰ；四、细菌Ⅰ经过分离培养、纯化培养和富集培养得到同时硫酸盐还原和反硝化的厌氧细菌的菌液B；五、菌液B采用两套特异性引物对菌液中细菌的 DNA进行PCR扩增，然后进行电泳检测，将同时能够扩增出亚硫酸还原酶基因和nis K基因条带的菌液确定为同时硫酸盐还原和反硝化的厌氧细菌Ⅱ；六、细菌Ⅱ经过分离培养、纯化培养和富集培养得到纯菌株即为同时用于硫酸盐还原和反硝化的厌氧细菌；其中步骤一、步骤三和步骤五中进行PCR扩增的两套特异性引物均为：第一套硫酸盐还原的亚硫酸还原酶基因的上游引物为5'- AC[C/G]CACTGGAAGCACG -3'，下游引物为5'-TGCCGAGGAGAACGATGTC-3'，第一套引物对应的PCR扩增程序为：94℃预热5min、94℃变性30s、56℃复性45s、72℃延伸90s、循环30次和72℃延伸10min，PCR扩增的反应体系由2μL的10×PCR Buffer、2μL的dNTPs(0.3mmol/L)、1μL的浓度为0.1μmol/L的上游引物、1μL的浓度为0.1μmol/L的下游引物、0.3μL的浓度为0.3U/μL的rTaq E和2μL的浓度为2μg/L 的DNA样品组成；第二套反硝化的特异基因nis K基因上游引物为5'- TCACACCCCGAGCCGCGCGT-3'，下游引物为5'- AGKCGTTGAACTTKCCGGTCGG -3'，第二套引物对应的PCR扩增程序为：94℃预热5min、94℃变性30s、55℃复性45s、72℃延伸90s、循环30次和72℃延伸10min， PCR扩增的反应体系由2μL的10×PCR Buffer、2μL的浓度为0.3mmol/L的dNTPs、1μL的浓度为0.1μmol/L的上游引物、1μL的浓度为0.1μmol/L的下游引物、0.3μL的浓度为0.3U/μL的rTaq E、2μL的浓度为2μg/L 的DNA样品和20μL的dH₂O组成。

本发明中的步骤二和步骤四中的分离培养方法均为：待分离的厌氧细菌接种于液态培养基中，采用亨盖特厌氧滚管技术进行分离培养，然后对分离培养得到的菌株进行检验，筛选出同时硫酸盐还原和反硝化的厌氧细菌，其中，培养温度为35~38℃，培养时间为7~12天；其中液态培养基由4g Na₂SO₄、2.0g KNO₃、2.0g NaNO₃、1g MgSO₄·7H₂O、0.5g K₂HPO₄、5g酒石酸钾钠、1.0g KH₂PO₄、0.2g CaCl₂·2H₂O和1750mL蒸馏水组成，pH为7.5；亨盖特厌氧滚管技术中所使用的固体培养基由4g Na₂SO₄、2.0g KNO₃、2.0g NaNO₃、1g MgSO₄·7H₂O、0.5g K₂HPO₄、5g酒石酸钾钠、1.0g KH₂PO₄、0.2g CaCl₂·2H₂O、12g琼脂和1750mL蒸馏水组成，pH为7.5；步骤二和步骤四中的纯化培养的方法均为：分离培养得到的细菌接种于固体培养基中在35~38℃条件下培养5~14天得到单菌落；其中固体培养基由4g Na₂SO₄、2.0g KNO₃、2.0g NaNO₃、1g MgSO₄·7H₂O、0.5g K₂HPO₄、5g酒石酸钾钠、1.0g KH₂PO₄、0.2g CaCl₂·2H₂O、12  g琼脂和1750mL蒸馏水组成，pH为7.5；步骤二和步骤四中的富集培养的方法均为：纯化培养得到的细菌接种于液体培养基中，在35~38℃条件下富集培养7~14天得到菌液，然后同时采用特异性引物对菌液中细菌的 DNA进行PCR扩增，将同时能够扩增出的条带的菌液确定为同时硫酸盐还原和反硝化的厌氧细菌；其中液态培养基由4g Na₂SO₄、2.0g KNO₃、2.0g NaNO₃、1g MgSO₄·7H₂O、0.5g K₂HPO₄、5g酒石酸钾钠、1.0g KH₂PO₄、0.2g CaCl₂·2H₂O和1750mL蒸馏水组成，pH为7.5。

本发明的分离方法，与现有厌氧同时硫酸盐还原和反硝化细菌的分离方法相比，周期缩短了40%~50%，工作量小，周期短；通过两组特异性引物的PCR扩增，能有针对性的快速的分离，避免了非厌氧同时硫酸盐还原和反硝化细菌对检测的干扰，使得整个实验结果误差小，准确可靠，本发明的分离方法得了目的菌株的纯菌株，且对硝酸盐和亚硝酸的降解效果好。

附图说明

图1为具体实施方式五中的厌氧细菌的二维扫描电镜图；

图2为具体实施方式五中的厌氧细菌的三维扫描电镜图；

图3为具体实施方式五中的系统发育树；

图4为具体实施方式五中的厌氧细菌对NO₃^-和NO₂^-的降解效果图，图中 表示NO₂^-的浓度，表示NO₃^-的浓度，表示NO₃^-的降解率；

图5为具体实施方式五中的厌氧细菌对SO₄^2-的降解效果图，表示SO₄^2-的浓度，表示SO₄^2-的去除率；

图6为具体实施方式五的分离方法的工艺流程图。

具体实施方式

具体实施方式一：本实施方式同时进行硫酸盐还原和反硝化的厌氧细菌的分离方法按照以下步骤进行：一、对环境样本采用DNA抽提试剂盒提取样品中环境微生物的总DNA，然后针对硫酸盐还原的亚硫酸还原酶基因和反硝化的特异基因nis K基因的序列，采用两套特异性引物，进行PCR扩增得到同时硫酸盐还原和反硝化的厌氧细菌；二、步骤一中扩增出的能同时进行硫酸盐还原和反硝化的厌氧细菌进行分离培养、纯化培养和富集培养，即得到同时硫酸盐还原和反硝化的厌氧细菌的菌液A；三、菌液A采用两套特异性引物对菌液中细菌的 DNA进行PCR扩增，然后进行电泳检测，将同时能够扩增出亚硫酸还原酶基因和nis K基因条带的菌液确定为同时硫酸盐还原和反硝化的厌氧细菌Ⅰ；四、细菌Ⅰ经过分离培养、纯化培养和富集培养得到同时硫酸盐还原和反硝化的厌氧细菌的菌液B；五、菌液B采用两套特异性引物对菌液中细菌的 DNA进行PCR扩增，然后进行电泳检测，将同时能够扩增出亚硫酸还原酶基因和nis K基因条带的菌液确定为同时硫酸盐还原和反硝化的厌氧细菌Ⅱ；六、细菌Ⅱ经过分离培养、纯化培养和富集培养得到纯菌株即为同时用于硫酸盐还原和反硝化的厌氧细菌；其中步骤一、步骤三和步骤五中的进行PCR扩增的两套特异性引物均为：第一套硫酸盐还原的亚硫酸还原酶基因的上游引物为5'- AC[C/G]CACTGGAAGCACG-3'，下游引物为5'-TGCCGAGGAGAACGATGTC-3'，第一套引物对应的PCR扩增程序为：94℃预热5min、94℃变性30s、56℃复性45s、72℃延伸90s、循环30次和72℃延伸10min，PCR扩增的反应体系由2μL的10×PCR Buffer、2μL的dNTPs(0.3mmol/L)、1μL的浓度为0.1μmol/L的上游引物、1μL的浓度为0.1μmol/L的下游引物、0.3μL的浓度为0.3U/μL的rTaq E和2μL的浓度为2μg/L 的DNA样品组成；第二套反硝化的特异基因nis K基因上游引物为5'-TCACACCCCGAGCCGCGCGT-3'，下游引物为5'-AGKCGTTGAACTTKCCGGTCGG-3'，第二套引物对应的PCR扩增程序为：94℃预热5min、94℃变性30s、55℃复性45s、72℃延伸90s、循环30次和72℃延伸10min， PCR扩增的反应体系由2μL的10×PCR Buffer、2μL的浓度为0.3mmol/L的dNTPs、1μL的浓度为0.1μmol/L的上游引物、1μL的浓度为0.1μmol/L的下游引物、0.3μL的浓度为0.3U/μL的rTaq E、2μL的浓度为2μg/L 的DNA样品和20μL的dH₂O组成。

本实施方式步骤一中的样品采自厌氧ABR反应器中的活性污泥，该反应器用于处理含有硫酸盐和硝酸盐的污水。

本实施中的引物均从市场上购买得到。

本实施方式步骤一中DNA的提取方法按照试剂盒的说明书进行操作。

具体实施方式二：本实施方式与具体实施方式一不同的是：步骤二和步骤四中的分离培养方法均为：待分离的厌氧细菌接种于液态培养基中，采用亨盖特厌氧滚管技术进行分离培养，然后对分离培养得到的菌株进行检验，筛选出同时硫酸盐还原和反硝化的厌氧细菌，其中，培养温度为35~38℃，培养时间为7~12天；液态培养基由4g Na₂SO₄、2.0g KNO₃、2.0g NaNO₃、1g MgSO₄·7H₂O、0.5g K₂HPO₄、5g酒石酸钾钠、1.0g KH₂PO₄、0.2g CaCl₂·2H₂O和1750mL蒸馏水组成，pH为7.5；亨盖特厌氧滚管技术中所使用的固体培养基由4g Na₂SO₄、2.0g KNO₃、2.0g NaNO₃、1g MgSO₄·7H₂O、0.5g K₂HPO₄、5g酒石酸钾钠、1.0g KH₂PO₄、0.2g CaCl₂·2H₂O、12  g琼脂和1750mL蒸馏水组成，pH为7.5。其它步骤及参数与具体实施方式一相同。

本实施方式分离得到的菌进行检验（镜鉴或革兰氏染色）可按照《伯杰氏细菌鉴定手册》第八版中记载的方法进行。

本实施方式所使用的液态培养基的配制方法为：将4g Na₂SO₄、2.0g KNO₃、2.0g NaNO₃、1g MgSO₄·7H₂O、0.5g K₂HPO₄、5g酒石酸钾钠、1.0g KH₂PO₄、0.2g CaCl₂·2H₂O和1750mL蒸馏水混合，煮沸，同时通入体积纯度为99.99%的氮气以驱除氧气，然后向培养基中加入0.5g的L-半胱氨酸，利用L-半胱氨酸还原作用去除氧，降低氧化还原电位(低于-100mV)，获得厌氧条件，即得到液体培养基。

具体实施方式三：本实施方式与具体实施方式一至二不同的是：步骤二和步骤四中的纯化培养的方法均为：分离培养得到的细菌接种于固体培养基中在35~38℃条件下培养5~14天得到单菌落；其中固体培养基由4g Na₂SO₄、2.0g KNO₃、2.0g NaNO₃、1g MgSO₄·7H₂O、0.5g K₂HPO₄、5g酒石酸钾钠、1.0g KH₂PO₄、0.2g CaCl₂·2H₂O、12  g琼脂和1750mL蒸馏水组成，pH为7.5。其它步骤及参数与具体实施方式一至二相同。

本实施方式纯化得到的菌进行检验（镜鉴或革兰氏染色）可按照《伯杰氏细菌鉴定手册》第八版中记载的方法进行。

本实施方式所使用的固体培养基的配制方法为：将4g Na₂SO₄、2.0g KNO₃、2.0g NaNO₃、1g MgSO₄·7H₂O、0.5g K₂HPO₄、5g酒石酸钾钠、1.0g KH₂PO₄、0.2g CaCl₂·2H₂O、12  g琼脂和1750mL蒸馏水混合放入到电磁锅中，煮沸后加入0.5g L-半胱氨酸和质量浓度为0.2%的刃天青溶液，若有氧气存在，培养基的颜色为粉红色，不断加热煮沸，盖上锅盖，通入质量纯度为99.99%的氮气30~40min，直至培养基由粉红色变成无色，然后厌氧管分装，在121℃的条件下灭菌20min，即得到了固体培养基。

具体实施方式四：本实施方式与具体实施方式一至三不同的是：步骤二和步骤四中的富集培养的方法均为：纯化培养得到的细菌接种于液体培养基中，在35~38℃条件下富集培养7~14天得到菌液，然后同时采用特异性引物对菌液中细菌的 DNA进行PCR扩增，将同时能够扩增出的条带的菌液确定为同时硫酸盐还原和反硝化的厌氧细菌；其中液态培养基由4gNa₂SO₄、2.0g KNO₃、2.0g NaNO₃、1g MgSO₄·7H₂O、0.5g K₂HPO₄、5g酒石酸钾钠、1.0g KH₂PO₄、0.2g CaCl₂·2H₂O和1750mL蒸馏水组成，pH为7.5。其它步骤及参数与具体实施方式一至三相同。

具体实施方式五：本实施方式同时进行硫酸盐还原和反硝化的厌氧细菌的分离方法按照以下步骤进行：一、对环境样本采用DNA抽提试剂盒提取样品中环境微生物的总DNA，然后针对硫酸盐还原的亚硫酸还原酶基因（DSR基因）和反硝化的特异基因nis K基因的序列，采用两套特异性引物，进行PCR扩增得到同时硫酸盐还原和反硝化的厌氧细菌；二、步骤一中扩增出的能同时进行硫酸盐还原和反硝化的厌氧细菌进行分离培养、纯化培养和富集培养，即得到同时硫酸盐还原和反硝化的厌氧细菌的菌液A；三、菌液A采用两套特异性引物对菌液中细菌的 DNA进行PCR扩增，然后进行电泳检测，将同时能够扩增出亚硫酸还原酶基因和nis K基因条带的菌液确定为同时硫酸盐还原和反硝化的厌氧细菌Ⅰ；四、细菌Ⅰ经过分离培养、纯化培养和富集培养得到同时硫酸盐还原和反硝化的厌氧细菌的菌液B；五、菌液B采用两套特异性引物对菌液中细菌的 DNA进行PCR扩增，然后进行电泳检测，将同时能够扩增出亚硫酸还原酶基因和nis K基因条带的菌液确定为同时硫酸盐还原和反硝化的厌氧细菌Ⅱ；六、细菌Ⅱ经过分离培养、纯化培养和富集培养得到纯菌株即为同时用于硫酸盐还原和反硝化的厌氧细菌；其中步骤一、步骤三和步骤五中的进行PCR扩增的两套特异性引物均为：第一套硫酸盐还原的亚硫酸还原酶基因的上游引物为5'- AC[C/G]CACTGGAAGCACG-3'，下游引物为5'-TGCCGAGGAGAACGATGTC-3'，第一套引物对应的PCR扩增程序为：94℃预热5min、94℃变性30s、56℃复性45s、72℃延伸90s、循环30次和72℃延伸10min，PCR扩增的反应体系由2μL的10×PCR Buffer、2μL的dNTPs(0.3mmol/L)、1μL的浓度为0.1μmol/L的上游引物、1μL的浓度为0.1μmol/L的下游引物、0.3μL的浓度为0.3U/μL的rTaq E和2μL的浓度为2μg/L 的DNA样品组成；第二套反硝化的特异基因nis K基因上游引物为5'-TCACACCCCGAGCCGCGCGT-3'，下游引物为5'-AGKCGTTGAACTTKCCGGTCGG-3'，第二套引物对应的PCR扩增程序为：94℃预热5min、94℃变性30s、55℃复性45s、72℃延伸90s、循环30次和72℃延伸10min， PCR扩增的反应体系由2μL的10×PCR Buffer、2μL的dNTPs(0.3mmol/L)、1μL的浓度为0.1μmol/L的上游引物、1μL的浓度为0.1μmol/L的下游引物、0.3μL的浓度为0.3U/μL的rTaq E、2μL的浓度为2μg/L 的DNA样品和20μL的dH₂O组成。

本实施方式步骤一中对环境样本采用DNA抽提试剂盒提取样品中环境微生物的总DNA经PCR扩增后，若DSR基因的序列和特异基因nis K基因的序列不同时存在，则将该样品被淘汰掉。

本实施方式步骤一中的样品采自厌氧ABR反应器，该反应器能够实现硫酸盐还原和反硝化两种功能。

本实施中的引物均从市场上购买得到。

本实施方式步骤一中DNA抽提试剂盒试剂盒按说明书操作。

本实施方式步骤二和步骤四中的分离培养方法均为：待分离的厌氧细菌接种于液态培养基中，采用亨盖特厌氧滚管技术进行分离培养，然后对分离培养得到的菌株进行检验，筛选出同时硫酸盐还原和反硝化的厌氧细菌，其中，培养温度为36℃，培养时间为10天；液态培养基由4g Na₂SO₄、2.0g KNO₃、2.0g NaNO₃、1g MgSO₄·7H₂O、0.5g K₂HPO₄、5g酒石酸钾钠、1.0g KH₂PO₄、0.2g CaCl₂·2H₂O和1750mL蒸馏水组成，pH为7.5；亨盖特厌氧滚管技术中所使用的固体培养基由4g Na₂SO₄、2.0g KNO₃、2.0g NaNO₃、1g MgSO₄·7H₂O、0.5g K₂HPO₄、5g酒石酸钾钠、1.0g KH₂PO₄、0.2g CaCl₂·2H₂O、12  g琼脂和1750mL蒸馏水组成，pH为7.5，其中，本实施方式分离得到的菌进行检验（镜鉴或革兰氏染色）可按照《伯杰氏细菌鉴定手册》第八版中记载的方法进行，所使用的液态培养基的配制方法为：将4g Na₂SO₄、2.0g KNO₃、2.0g NaNO₃、1g MgSO₄·7H₂O、0.5g K₂HPO₄、5g酒石酸钾钠、1.0g KH₂PO₄、0.2g CaCl₂·2H₂O和1750mL蒸馏水混合，煮沸，同时通入体积纯度为99.99%的氮气以驱除氧气，然后向培养基中加入0.5g的L-半胱氨酸，利用L-半胱氨酸还原作用去除氧，降低氧化还原电位(低于-100mV)，获得厌氧条件，即得到液体培养基。

本实施方式步骤二和步骤四中的纯化培养的方法均为：分离培养得到的细菌接种于固体培养基中在37℃条件下培养12天得到单菌落；其中固体培养基由4g Na₂SO₄、2.0g KNO₃、2.0g NaNO₃、1g MgSO₄·7H₂O、0.5g K₂HPO₄、5g酒石酸钾钠、1.0g KH₂PO₄、0.2g CaCl₂·2H₂O、12  g琼脂和1750mL蒸馏水组成，pH为7.5；纯化得到的菌进行检验（镜鉴或革兰氏染色）可按照《伯杰氏细菌鉴定手册》第八版中记载的方法进行；所使用的固体培养基的配制方法为：将4g Na₂SO₄、2.0g KNO₃、2.0g NaNO₃、1g MgSO₄·7H₂O、0.5g K₂HPO₄、5g酒石酸钾钠、1.0g KH₂PO₄、0.2g CaCl₂·2H₂O、12  g琼脂和1750mL蒸馏水混合放入到电磁锅中，煮沸后加入0.5g L-半胱氨酸和质量浓度为0.2%的刃天青溶液，若有氧气存在，培养基的颜色为粉红色，不断加热煮沸，盖上锅盖，通入质量纯度为99.99%的氮气35min，直至培养基由粉红色变成无色，然后厌氧管分装，在121℃的条件下灭菌20min，即得到了固体培养基。

本实施方式步骤二和步骤四中的富集培养的方法均为：纯化培养得到的细菌接种于液体培养基中，在37℃条件下富集培养12天得到菌液，然后同时采用特异性引物对菌液中细菌的 DNA进行PCR扩增，将同时能够扩增出的条带的菌液确定为同时硫酸盐还原和反硝化的厌氧细菌；其中液态培养基由4gNa₂SO₄、2.0g KNO₃、2.0g NaNO₃、1g MgSO₄·7H₂O、0.5g K₂HPO₄、5g酒石酸钾钠、1.0g KH₂PO₄、0.2g CaCl₂·2H₂O和1750mL蒸馏水组成，pH为7.5。

本实施方式的分离方法与现有分离方法相比，周期缩短了60%，且获得了目的菌株的纯菌株，分离速度快。

本实施方式获得的纯菌株采用《伯杰氏细菌鉴定手册》第八版中记载的方法，进行生理生化鉴定、脂肪酸分析和16s rDNA系统发育分析。

本实施方式分离得到的厌氧细菌（SN10）进行生理鉴定，如图1和图2所示，SN10菌株为短杆菌，菌体形态为短杆状，菌体大小为宽0.40~1.0μm，长1.5~2.5μm；革兰氏染色为阴性，接触酶阳性，淀粉水解阳性，油脂水解阳性，甲基红阴性，乙酰甲基醇阴性，产吲哚阳性，柠檬酸盐利用阳性，石蕊牛奶可还原、凝固；硝酸盐还原阳性，明胶液化阴性，产硫化氢阳性，产氨试验阳性，尿素水解阳性，最适生长温度为20～40℃，初始生长pH值为7.5；需氧性为厌氧；葡萄糖氧化发酵为产酸；葡萄糖发酵阴性，果糖发酵阴性，乳糖发酵阴性，蔗糖发酵阴性，乙醇发酵阴性；平板菌落形态为圆形、表面隆起，颜色为白色。

本实施方式分离得到的厌氧细菌（SN10）的脂肪酸主要分布在C12:0~C19-CYC-FAME，主要脂肪酸为C14:0-FAME，C16:0-FAME和C18:1c-FAME,C18:0-FAME，C19-CYC-FAME，含量分别为7.56%，48.23%，9.15%，8.67%，6.98%占到脂肪酸总数的80.59%。

本实施方式分离得到的厌氧细菌（SN10），经测序后获得16S rDNA 序列，GenBank登录号为DQ450463，系统发育树16个菌株的平均遗传距离为0.045，系统树发育树如图3所示，系统进化表明，SN10菌株的16S rDNA序列与Paenibacillus sp.(EU124565)的相似性为97%，结合菌株的形态学和生理学特性，初步鉴定为Paenibacillus sp. SN10。

本实施方式分离得到的厌氧细菌（SN10）对NO₃^-和NO₂^-的降解效果如图4所示，从图中可以看出NO₃^-浓度变化范围是从初始的5830.92mg/L，降低到86.41mg/L，去除率在第7d的时候达到了98.52%，而整个降解过程中有NO₂^-的产生，菌株的中间代谢产物有NO₂^-，而NO₂^-浓度期间变化不大，整个过程中最高为686.07mg/L，SN10菌株具有很强的反硝化功能。如图5所示，本实施方式分离得到的厌氧细菌（SN10）对SO₄^2-的降解效果如图5所示，从图5可以看出， SO₄^2-的浓度变化范围从682.83mg/L到23.94mg/L，对于SO₄^2-的去除率最高达到96.49%，SN10菌株具有较强的硫酸盐还原能力。本实施方式分离得到的厌氧细菌（SN10）同时具有硫酸盐还原功能和反硝化功能，菌株可能先利用硫酸根而后利用硝酸根，该菌株是一株非常具有应用价值的菌株，特别是在地下水修复以及相应的厌氧环境中，具有较高的开发潜力。 

序 列 表                            

<110> 哈尔滨工业大学

<120>一种同时进行硫酸盐还原和反硝化的厌氧细菌的分离方法

<160> 4

<210> 1

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列

<220> 

<221> misc_feature 

<222> (3) 

<223> m =a或c

<220>

<223> 第一套进行PCR扩增的硫酸盐还原的亚硫酸还原酶基因的上游引物的序列

<400> 1

acmcactgga agcacg 16

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 第一套进行PCR扩增的硫酸盐还原的亚硫酸还原酶基因的下游引物的序列

<400> 2

tgccgaggag aacgatgtc 19

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 第二套进行PCR扩增的反硝化的特异基因nis K基因的上游引物的序列

<400> 3

tcacaccccg agccgcgcgt 20

<210> 4

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220> 

<221> misc_feature 

<222> (3，14) 

<223> k=g或t

<220>

<223>第二套进行PCR扩增的反硝化的特异基因nis K基因的下游引物的序列

<400> 5

agkcgttgaa cttkccggtc gg 22