癌基因BRAFV600E突变检测的引物和探针

摘要

本发明涉及生物技术领域，旨在提供一种检测癌基因BRAFV600E突变的多条引物和探针。本发明的引物和探针分别包括突变特异性上游引物、突变非特异性上游引物和通用下游引物以及通用探针，如SEQ NO.1～11所示。本发明提供的突变特异性引物和探针的检测灵敏度可以达到500拷贝/ml，灵敏度良好；不含BRAFV600E的样本时，其扩增曲线ct值≥36，特异性强；由于本发明同时设计突变非特异性引物用于检测样本的总模板量，避免假阴性结果，方便质控。

说明书

技术领域

本发明属生物技术领域，特别涉及用于检测癌基因BRAF^V600E突变的多条引物和探 针。

背景技术

BRAF基因是一种癌基因，与ARAF、RAF1(CRAF)基因同属RAF家族，位于7q34， 长约190kb。由其翻译的BRAF蛋白由783个氨基酸组成，有CR1、CR2和CR3三个 保守区。BRAF蛋白为丝苏氨酸蛋白激酶raf/mil家族成员，为Ras-Raf-MEK一ERK 信号通路中上游重要调节因子。BRAF蛋白位于MAPK/ERK途径的入口处，它将细胞 表面的受体和RAS蛋白通过MEK和ERK与核内的转录因子相连接，从而调节细胞的 分化、分裂。该通路被异常激活时，可促进细胞增殖、生长，最终导致肿瘤发生。Braf 基因突变与肿瘤发生具有重要关联，对其展开深入研究具有重要价值。

研究表明，在人类的多种肿瘤中存在不同频率的BRAF癌基因突变，最常见于恶性 黑色素瘤(30-60％)、乳头状甲状腺癌(29-83％)、结直肠癌(6-15％)。序列分析 BRAF突变形式共有40余种，主要集中在两个区域：①位于exonl1上的的突变，约占 10％，常为G463、G465、G468等的点突变；②位于exonl5上的激活区突变约占90％， 多为位于1799核苷酸上T突变(即V600E突变)，导致谷氨酸取代缬氨酸。BRAF^V600E突变使BRAF蛋白持续激活导致MAPK激酶信号通路的磷酸激酶活性改变从而影响肿 瘤的进展。因此，及时检测BRAF突变发生情况，对早期筛选肿瘤病人以及对肿瘤个性 化治疗、预后将具有重要的指导意义。常用的BRAF突变检测方法主要有直接测序、限 制性片段长度多态性(RFLP)、单链构象多态性(SSCP)等，但均存在一定的局限性。等位 基因特异扩增实时定量PCR法具有克服序列多态性、高灵敏度的优点，目前在BRAF 突变检测上的应用日益广泛。在等位基因特异扩增实时定量PCR检测方法中，引物和 探针的设计尤为重要，决定了突变检测结果的有效性。

发明内容

本发明要解决的技术问题是，克服现有技术的不足，提供用于检测癌基因BRAF^V600E突变的多条引物和探针。

基于上述目的，本发明采用以下技术方案：

提供一种用于检测癌基因BRAF^V600E突变的引物，包括通用下游引物BRAFR和只 扩增突变型模板的突变特异性上游引物BRAFFE；所述的突变特异性上游引物BRAFFE 是下述序列中的任意一条：

SEQ NO.1：5′-GTGATTTTGGTCTAGCTACTGA-3′；

SEQ NO.2：5′-GTGATTTTGGTCTAGCTACTTA-3′；

SEQ NO.3：5′-AAAAATAGGTGATTTTGGTCTAGCTACATA-3′；

SEQ NO.4：5′-GGTGATTTTGGTCTAGCTACAAA-3′；

SEQ NO.5：5′-ATAGGTGATTTTGGTCTAGCTACTTA-3′；

所述通用下游引物BRAFR是下述序列中的任意一条：

SEQ NO.6：5′-GGCCAAAAATTTAATCAGTGGA-3′；

SEQ NO.7：5′-TAGTTGAGACCTTCAATGACTTTCTAGTAA-3′。

本发明还提供了一种用于检测癌基因BRAF^V600E突变的引物，包括通用下游引物 BRAFR和能同时等效地扩增野生型和突变型模板的突变非特异性上游引物BRAFFV； 所述的突变非特异性上游引物BRAFFV是下述序列中的任意一条：

SEQ NO.8：5′-AGTAAAAATAGGTGATTTTGGTCTAG-3′；

SEQ NO.9：5′-AAAAATAGGTGATTTTGGTCTAGCTACA-3′；

所述通用下游引物BRAFR是下述序列中的任意一条：

SEQ NO.6：5′-GGCCAAAAATTTAATCAGTGGA-3′；

SEQ NO.7：5′-TAGTTGAGACCTTCAATGACTTTCTAGTAA-3′。

本发明还提供了一种用于检测癌基因BRAF^V600E突变的探针，所使用的探针为通用 LNA探针，探针两端分别标记荧光报告基团和荧光淬灭基团的寡核苷酸，所述通用LNA 探针的序列为：

SEQ NO.10：5′-FAM-GGT[+C]CCA[+T]CAG[+T]TTG[+A]ACA-BHQ 1-3′。

本发明还提供了一种用于检测癌基因BRAF^V600E突变的探针，所使用的探针为通用 TaqMan探针，探针两端分别标记荧光报告基团和荧光淬灭基团的寡核苷酸，所述的通 用TaqMan探针的序列为：

SEQ NO.11：5′-FAM-ACAACTGTTCAAACTGATGGGACC-BHQ 1-3′。

本发明的具体原理是：采用等位基因特异性扩增实时定量PCR方法(AS-PCR)判 断肿瘤标本中是否存在癌基因BRAF^V600E突变以及突变所占比例。

所使用的引物包括一对突变特异性上游引物(只扩增突变型模板)和通用下游引物； 一对突变非特异性上游引物(可同时等效地扩增野生型和突变型模板)和通用下游引物。 所使用的探针为通用LNA探针或者TaqMan探针，探针两端分别标记荧光报告基团(R) 和荧光淬灭基团(Q)的寡核苷酸。在探针完整时，报告基团发出的荧光被淬灭基团吸 收，在PCR扩增过程中，DNA聚合酶的5’端外切酶活性将特异结合在靶核苷酸片断上 的荧光探针酶切降解，使报告基团的荧光信号可以被检测，荧光信号量的变化与扩增产 物量成正比，从而可以通过荧光强弱来判断待测样本中靶核苷酸序列的存在。探针部分 碱基锁核酸化以增加探针对靶序列的识别能力和亲和力。

本发明的有益效果在于：

(1)本发明提供的突变特异性引物和探针的检测灵敏度可以达到500拷贝/ml，说 明其灵敏度良好。

(2)本发明提供的突变特异性引物和探针检测不含BRAF^V600E的样本时，其扩增 曲线ct值≥36，说明其特异性强。

(3)由于本发明同时设计突变非特异性引物用于检测样本的总模板量，避免假阴 性结果，方便质控。

附图说明

图1为BRAF^V600E突变检测用引物和探针实施案例1检测未突变样本扩增图；

图2为BRAF^V600E突变检测用引物和探针实施案例1检测突变样本扩增图。

具体实施方式

1.引物和探针的设计：根据BRAF基因T1799A序列改变，分别在突变特异性上 游引物的3’端引入一个或者多个碱基的突变使其特异性扩增突变型等位基因。在突变 位点之外数碱基设计突变非特异性上游引物，用以同时扩增野生型和突变型等位基因。 设计并筛选多对引物和探针，引物长度一般为20碱基左右。优化引物探针序列组合， 使其达到最佳的特异性和灵敏度。选择如待检样本中没有BRAFV600E，用特异性引物 扩增显示ct值≥36的引物探针序列组合，具体实施案例如下：

实施案例1：

(1)突变特异性上游引物BRAFFE-1序列为：

5′-GTGATTTTGGTCTAGCTACTGA-3′。

(2)突变非特异性上游引物BRAFFV-1序列为：

5-AGTAAAAATAGGTGATTTTGGTCTAG-3′。

(3)通用下游引物BRAFR-1序列为：

5′-GGCCAAAAATTTAATCAGTGGA-3′。

(4)锁核酸探针序列：

5′-FAM-GGT[+C]CCA[+T]CAG[+T]TTG[+A]ACA-BHQ 1-3′。

实施案例2：

(1)突变特异性上游引物BRAFFE-1序列为：

5′-GTGATTTTGGTCTAGCTACTTA-3′。

(2)突变非特异性上游引物BRAFFV-1序列为：

5-AGTAAAAATAGGTGATTTTGGTCTAG-3′。

(3)通用下游引物BRAFR-1序列为：

5′-GGCCAAAAATTTAATCAGTGGA-3′。

(4)锁核酸探针序列：

5′-FAM-GGT[+C]CCA[+T]CAG[+T]TTG[+A]ACA-BHQ1-3′。

实施案例3：

(1)突变特异性上游引物BRAFFE-1序列为：

5′-AAAAATAGGTGATTTTGGTCTAGCTACATA-3′。

(2)突变非特异性上游引物BRAFFV-1序列为：

5′-AAAAATAGGTGATTTTGGTCTAGCTACA-3′。

(3)通用下游引物BRAFR-1序列为：

5′-TAGTTGAGACCTTCAATGACTTTCTAGTAA-3′。

(4)TaqMan探针序列：

5′-FAM-ACAACTGTTCAAACTGATGGGACC-BHQ1-3′。

实施案例4：

(1)突变特异性上游引物BRAFFE-1序列为：

5′-GGTGATTTTGGTCTAGCTACAAA-3′。

(2)突变非特异性上游引物BRAFFV-1序列为：

5′-AGTAAAAATAGGTGATTTTGGTCTAG-3′。

(3)通用下游引物BRAFR-1序列为：

5′-GGCCAAAAATTTAATCAGTGGA-3′。

(4)TaqMan探针序列：

5′-FAM-ACAACTGTTCAAACTGATGGGACC-BHQ1-3′。

实施案例5：

(1)突变特异性上游引物BRAFFE-1序列为：

5′-ATAGGTGATTTTGGTCTAGCTACTTA-3′。

(2)突变非特异性上游引物BRAFFV-1序列为：

5′-AGTAAAAATAGGTGATTTTGGTCTAG-3′。

(3)通用下游引物BRAFR-1序列为：

5′-TAGTTGAGACCTTCAATGACTTTCTAGTAA-3′。

(4)TaqMan探针序列：

5′-FAM-ACAACTGTTCAAACTGATGGGACC-BHQ1-3′。

实施案例6：

(1)突变特异性上游引物BRAFFE-1序列为：

5′-GTGATTTTGGTCTAGCTACTTA-3′。

(2)突变非特异性上游引物BRAFFV-1序列为：

5′-AAAAATAGGTGATTTTGGTCTAGCTACA-3′。

(3)通用下游引物BRAFR-1序列为：

5′-TAGTTGAGACCTTCAATGACTTTCTAGTAA-3′。

(4)TaqMan探针序列：

5′-FAM-ACAACTGTTCAAACTGATGGGACC-BHQ1-3′。

2.反应体系的优化：利用实体瘤术后冰冻组织或者石蜡组织作为检测标本，用DNA 抽提试剂盒(QIAamp DNA Mini Kit，Catalog no.51306)进行提取，DNA溶液分装后贮 存于-20℃。

2.1引物浓度的优化：在反应体系中其它条件相同的情况下，将引物浓度分别从 0.1μmol/L至1.6μmol/L作倍比连续稀释，通过对试验结果的分析比较定最佳引物浓度是 0.3μmol/L。

2.2探针浓度的优化：在反应体系中其它条件相同的情况下，将探针浓度分别从， 确0.05μmol/L至0.5μmol/L作倍比连续稀释，通过对试验结果的分析比较，确定最佳探 针浓度是0.1μmol/L。

2.3退火温度的优化：在反应体系中其它条件相同的情况下，进行梯度PCR(56° 至64°退火温度)，通过对试验结果的分析比较，确定最佳退火温度是62°。

利用上述引物和探针进行反应体系的建立，最后确定采用的BRAF^V600E AS-PCR反 应体系为25μl。按照两步法荧光定量PCR试剂盒说明进行反应液的配置。

3.仪器检测通道的选择

选择的荧光检测通道应与探针所标记的报告荧光基团一致，具体按照仪器使用说明 书进行设置。

4.PCR反应条件如下

95℃1min；95℃15s，62℃1min，40个循环，在62℃1min阶段收集荧光。

5.检测结果分析

如果待检样本中含有BRAF^V600E，用特异性引物扩增时则显示阳性扩增曲线，其检 测灵敏度可以达到500拷贝/ml；如果待检样本中没有BRAF^V600E，用特异性引物扩增时 则显示阴性扩增曲线，即ct值≥36，提示上述引物对和探针具有良好的特异性和灵敏度。 用非特异性引物扩增曲线检测样本的总模板量，总模板量≤10⁴拷贝/ml的样本视为不合 格样本(丢弃或浓缩后再分析)，总模板量≥10⁶拷贝/ml的样本适当稀释后重新分析。