用于检测猪瘟病毒、猪圆环病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒的基因芯片及检测方法

摘要

本发明提供了一种猪瘟病毒、猪圆环病毒2型和猪繁殖与呼吸综合征病毒欧洲型与美洲型基因芯片检测方法，基因芯片采用如下表所示的探针序列：

说明书

技术领域

本发明涉及生物基因技术和计算机数据分析领域，尤其涉及一种用于检测猪瘟病毒(Classical Swine Fever Virus，CSFV)、猪圆环病毒2型(Porcine Circovirus type 2，PCV-2)和猪繁殖与呼吸综合征病毒欧洲型与美洲型(Porcine Reproductive and RespiratorySyndrome Virus Europe type and America type，PRRSE，PRRSVA)基因芯片及芯片的制备方法，以及采用该基因芯片进行检测或诊断病毒的方法。 

背景技术

随着规模化猪场的增加，猪疫病的种类也在增加，旧的疫病没有消灭，新的疫病不断出现，并且随着病毒株的变异使猪的疫病日益呈现复杂化和严重化趋势。猪瘟(ClassicalSwine Fever，CSF)、猪圆环病毒病2型(Porcine Circovirus type 2，PCV-2)和猪繁殖与呼吸综合征(Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome，PRRS)是目前威胁我国猪的主要传染性疾病。对于危害全球养猪业发展的猪主要疫病，快速准确诊断是控制该病重要前提。常规的病毒分离诊断方法虽然准确，但费时费力，并且需要专门的技术人员进行操作。基于分子生物学的诊断方法要以RT-PCR和荧光PCR为主。RT-PCR比荧光RT-PCR方法灵敏度低、耗时长；荧光RT-PCR方法具有高灵敏度的特点，但检测成本高，并且不能同时检测几种疾病。 

近年来，猪瘟病毒(Classical Swine Fever Virus，CSFV)、猪圆环病毒2型(PorcineCircovirus Virus type 2，PCV2)和猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine Reproductive andRespiratory Syndrome Virus，PRRSV)已成为危害世界规模化养猪业的重要猪病症候群。这些病原均可导致猪的繁殖障碍，且常成混合感染，不易区分，给临床鉴别诊断造成较大困难。在这种情况下，如何快速、灵敏、准确地对多种疫病同时做出诊断以及早制定和采取相应防制措施是现代动物疫病检疫新的发展方向。基因芯片技术是近年来兴起的一种早期快速检测的方法，通过高通量平行检测病原体的多个基因，可大大提高检测的灵敏度和精确度，克服了PCR扩增以单个基因为靶标进行检测而易出现假阳性及假阴性的缺点，同时通过计算机软件分析杂交结果，降低了结果判断的主观因素，因而能够快速、准确、高通量地对多种疾病进行早期的快速诊断与排查。但是，目前未有成熟的基因芯片检测技术 应用于猪瘟、猪圆环病毒病和猪繁殖与呼吸综合征(亚型)的检测。 

发明内容

针对现有技术存在检测费时费力和成本高，且只能对单一病种进行检测之不足，本发明的目的是提供一种猪瘟、猪圆环病毒病和猪繁殖与呼吸综合征病毒基因芯片，以及该芯片的制备方法； 

进一步，本发明还提供采用该基因芯片对猪瘟、猪圆环病毒病和猪繁殖与呼吸综合征三种病同时进行检测的方法。 

本发明采用的技术方案如下：一种用于检测猪瘟、猪圆环病毒病和猪繁殖与呼吸综合征的基因芯片，其特征在于：采用如下表所示的探针序列： 

所述基因芯片的制备方法，包括如下步骤： 

根据GenBank中已发表的PCV-2、PRRSVE、PRRSVA、CSFV的序列，应用DNAStar的MEGALIGN程序找出各个病毒的保守区；寡核苷酸潜在的二聚体和特异性用NCBI即美国生物技术信息中心网站，http://www.ncbi.nlm.nih.gov的BLAST程序结合PrimerPremier5.0、Oligo6.0进行鉴定；根据探针、引物设计的相关原则及利用上述软件设计扩增目的片段的引物序列和探针序列，其序列和特性见下表1、表2；合成时在每个探针的5’加上1个氨基和15个T；正链引物用CY-3荧光标记；引物用双蒸水稀释为100μmol/L，-20℃保存备用； 

在氨基化片基上点制的60-mer寡核苷酸探针，质量等级为PAGE级；寡核苷酸探针用无菌水溶解后，再与2×上样缓冲液，按1∶1混合，使点样终浓度调整为25μmol/L，通过晶芯 个人点样仪将探针片段有序地点制成6行×5列的阵列，每条探 针横向重复点3个点；点制好的基因芯片通过37℃水浴放置18h以上后经洗涤、封闭、干燥后置干燥器中室温保存；所述上样缓冲液为pH 7.4含0.5％SDS(十二烷基磺酸钠)的200μmol/L PBS(磷酸缓冲盐溶液)； 

表1基因芯片引物序列： 

表2基因芯片探针序列： 

本发明所述基因芯片检测猪瘟、猪圆环病毒病和猪繁殖与呼吸综合征的方法，包括如下步骤： 

(1)标准病毒基因的扩增： 

按照分子生物学实验技术提取标准猪瘟病毒、猪圆环病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒的DNA或RNA，对RNA进行反转录后进行多重PCR体系的构建及优化，对优化好的体系进行带标记引物的PCR扩增，体系如下： 

PCR体系I：包括PCV-2、PRRSVA、CSFV的三种模板DNA或者cDNA各1μL；10×PCRBuffer2.5μL；浓度25mmol/L的MgCl₂2μL；浓度为10mmol/L四种dNTPs0.8μL；Taq DNA聚合酶0.4μL；5端代CY-3标记的10μmol/L四种引物各1μL，加入无菌水至25μL体系； 

PCR体系II：包括PRRSVA、PRRSVE的cDNA各1μL；10×PCR Buffer2.5μL；浓度25mmol/L的MgCl₂2μL；浓度为10mmol/L四种dNTPs0.8μL；Taq DNA聚合酶0.4μL；5端代CY-3标记的10μmol/L两种引物各1μL，加入无菌水至25μL体系； 

PCR反应程序：用PCR仪在94℃温度环境下变性6min；循环步骤为94℃变性30s，54℃/58℃退火30s，72℃延伸1min，进行35个循环；最后72℃延伸10min，PCR产物用1.5％琼脂糖凝胶电泳； 

(2)基因芯片杂交： 

配制15μL的杂交体系：5μL的带标记的PCR产物(即扩增后的标准病毒基因)和10μL芯片杂交液(含25％甲酰胺、10×SSC、0.2％SDS，将两者混合均匀后放入PCR仪进行高温变性；变性条件为：95℃变性5min后，立即置于冰浴上快速冷却3min(使待变性的PCR产物快速降温，避免复性即可，得到单链DNA.)；将15μL杂交体系小心地加入到所述基因芯片的小孔里，组装上杂交盒，放入40～42℃的水浴锅进行杂交2～4h。 

(3)对杂交好的芯片清洗及扫描结果分析： 

对杂交好的芯片要进行洗片；将洗好的芯片置于50ml离心管中在台式冷冻离心机离心2min以甩干，再利用晶芯 微阵列芯片共聚焦激光扫描仪进行扫描并对结果进行分析； 

(4)对被检病毒基因的检测： 

用设计的引物对被检病毒基因进行扩增、基因芯片杂交和对杂交好的芯片清洗及扫描结果分析，即将标有荧光染料的扩增产物与芯片上寡核苷酸探针杂交，扫描、分析芯片上荧光信号；其具体操作方法同步骤(1)、(2)和(3)；并与标准病毒基因扫描结果进行比对，获得检测结果。 

相比现有技术，本发明具有如下优点： 

本发明根据集约化养猪业常见的3种猪疫病病毒特异性基因的保守序列，设计了能扩增出100-500bp靶标的特异引物，通过电泳验证了PCR产物的特异性。按照寡核苷酸探针设计原则，以普通PCR产物序列为依据，运用DNAStar、Oligo6.0等分析软件，筛选出长 度、GC含量和Tm值均相接近的特异性检测用探针，以保证每种检测探针的高度特异性及各条探针在杂交过程中反应条件的一致性。在实际应用中，寡核苷酸芯片由于探针片段短、空间位阻等原因，固定比较困难，本发明设计的所有探针在5’端均合成一个连接氨基，并设计有一段15bp长度的多聚T连接臂，结果表明其具有较高的固定效率。 

本发明建立的带标记引物的多重PCR扩增技术能够一次性扩增出多种与对应探针互补的荧光标记DNA，保证固液相中核酸杂交的高度特异性和灵敏性。此外，采用此种标记分法，可以大大缩短检测时间，降低芯片检测的成本，更适合推广到临床应用中。同时，临床检测结果表明本发明建立的方法检测结果与常规PCR检测方法检测结果具有很好的一致性，可用于临床病例的快速诊断和流行病学调查，进一步规范后还可研制成检测试剂盒，从而为临床上猪疾病的检测试剂盒的推广应用奠定基础。 

PRRSV、CSFV和PCV-2是引发猪繁殖障碍的主要病原，建立其基因芯片快速检测体系，对开发猪繁殖障碍疾病快速检测试剂盒具有重要意义。本发明将我国重大的主要猪繁殖障碍传染病病毒基因集成在一个芯片上进行检测或诊断，包括突变株和主要亚型，通过权威机构科技查新，技术上有重大创新。 

本发明已获得重庆市科技攻关项目“No.2009CC05”经费资助。 

本发明检测方法时间短、效率高、准确的达到同时检测3种病毒的目的，以期为猪病临床样品的早期、快速、准确的诊断以及猪病防制提供科学依据。 

附图说明

图1是CSFV、CPV-2和PRRSV基因芯片探针排布(Fig.1Diagram of the positions and probes of microarray for CSFV、CPV-2和PRRSV)；在图1中，A1-A6、E1-E6、D4-D6、：positive control(阳性对照)；D1-D3：negative control(阴性对照)；B1-B3：probe for PRRSVA(PRRSVA的探针)；B4-B6：probe forPRRSVE(PRRSVE的探针)；C1-C3：probe for PCV-2(PCV-2的探针)；C4-C6：probe for CSFV(CSFV的探针)。 

图2A是PCR扩增不同病毒组合电泳结果(Fig.2A mPCR for Different combinations of PRRSV PCV-2CSFV)；在图2A中，M：DNA分子质量标准DL2000(DL2000 DNA Marker)；1：PCV-2的PCR产物(mPCR for PCV-2)；2：CSFV的PCR产物(mPCR for CSFVr)；3：PRRSV的PCR产物(mPCR for PRRSV)；4：PCV-2、CSFV的PCR产物(mPCR for PCV-2、CSFV)；5：PRRSV、CSFV的PCR产物(mPCR for PRRSV、CSFV)；6：PCV-2、PRRSV的PCR产物(mPCR for CSFV and PCV-2)；7：PRRSV、CSFV、PCV-2的PCR产物(mPCRfor PRRSV、PCV-2 and CSFV)；8-12：阴性对照(Negetive control)。 

图2B是多重PCR扩增不同病毒组合电泳结果(Fig.2BmPCR for Different combinations of PRRSV PCV-2CSFV)；在图2B中，M：DNA分子质量标准DL2000(DL2000 DNAMarker)；1：PRRSV欧洲型的PCR产物(mPCR for PRRSVE)；2：即PRRSV美洲型的PCR产物(mPCR for PRRSVA)；3：PRRSV欧洲型、美洲型的PCR产物(mPCR for PRRSVAand PRRSVE)；4-8：阴性对照(Negetive control)。 

图3是多种病原的典型芯片杂交结果(Fig.3 Typical hybridization results of 4 pathogen)；在图3中，A：基因芯片检测PCV-2；B：基因芯片检测CSFV；C：基因芯片检测PRRSVA；D：基因芯片检测PRRSVE；E：基因芯片检测PRRSVA、CSFV、PCV-2；F：基因芯片检测PRRSVA、PRRSVE。 

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明的技术方案作进一步的说明。 

一种猪瘟、猪圆环病毒病和猪繁殖与呼吸综合征病毒保守基因芯片的制备方法，其特征在于，包括如下步骤： 

1材料与方法： 

11病毒和细胞： 

PCV2、PRRSV和PK-15细胞(猪肾细胞)、Marc-145细胞(猴肾细胞)均由南京农业大学提供，CSFV标准毒株重庆理工大学生物制药实验室保存，ST细胞(猪睾丸细胞)由重庆出入境检验检疫局提供。PCV-2标准毒株接种PK-15细胞，CSFV标准毒株接种ST细胞，PRRSV标准毒接种Marc-145细胞。PCV-2接种细胞连续盲传3代后收毒，CSFV接种ST细胞盲传3代后收毒，PRRSV接种细胞后出现80％以上的细胞病变(CPE)时收毒。 

1.2主要试剂及仪器： 

TRIzol试剂购自Invitrigen公司；TaqTM DNA聚合酶、RNase Inhibitor、dNTP、DL2000DNAMarker、反转录试剂盒均购自大连宝生物工程有限公司；DNA提取试剂盒购TIANGEN公司；氯仿、异丙醇、无水乙醇等为国产分析纯试剂。AppliedBiosystems 2720Thermal Cycler型PCR仪为ABI公司产品，凝胶电泳图像分析系统为SynGen公司产品。芯片基片(博奥生物有限公司)；晶芯 个人点样仪(博奥生物有限公司)、PCR仪(MJ公司)、晶芯 10K-A微阵列芯片扫描仪(博奥生物有限公司)。 

1.3引物设计、探针设计： 

根据GenBank中已发表的PCV-2、PRRSV欧洲型(PRRSVE)、PRRSV美洲型(PRRSVA)、CSFV的序列，应用DNAStar的MEGALIGN程序找出各个病毒的保守区。寡核苷酸潜在的二聚体和特异性用NCBI(美国国生物技术信息中心网站，http://www.ncbi.nlm.nih.gov)的BLAST程序结合PrimerPremier5.0、Oligo6.0进行鉴定。根据探针、引物设计的相关原则及利用上述软件设计的引物和探针序列和特性见表1、表2。为了使探针分子在芯片上伸展开来，利于靶标探针的杂交，合成时在每个探针的5’加上1 个氨基和15个T。引物和探针由上海invitrigen(英骏)生物技术有限公司合成，正链引物用CY-3荧光标记。引物用双蒸水稀释为100μmol/L，-20℃保存备用。 

表1扩增目的片段的引物： 

表2探针序列： 

1.4芯片的制备： 

在氨基化片基上点制的60-mer(mer，monomeric unit的缩写，即单体单元)寡核苷酸探针由上海invitrigen生物有限公司合成，质量等级为PAGE级。寡核苷酸探针用无菌水溶解后，再与2×上样缓冲液1∶1混合，使点样终浓度调整为25μmol/L，通过晶芯 个人点样仪将探针片段有序地点制成6行×5列的阵列，每条探针 横向重复点3个点(即A1、A2、A3三个点的位置表示同一种探针，其它依次类推。)；阵列设计方案见图1。点制好的芯片通过37℃水浴放置18h以上后经洗涤、封闭、干燥后置干燥器中室温保存。 

1.5带标记多重PCR产物的制备和验证： 

按照分子生物学实验技术提取标准毒的DNA及RNA，对RNA进行反转录后进行多重PCR体系的构建及优化，对优化好的体系进行带标记引物的PCR扩增，体系如下： 

PCR体系I：包括PCV-2、PRRSV美洲型、CSFV的三种模板DNA或者cDNA各1μL；10×PCR Buffer2.5μL；浓度25mmol/L的MgCl₂2μL；浓度为10mmol/L四种dNTPs0.8μL；Taq DNA聚合酶0.4μL；5端代CY-3标记的10μmol/L四种引物各1μL，加入无菌水至25μL体系。 

PCR体系II：包括PRRSV美洲型、PRRSV欧洲型cDNA各1μL；10×PCR Buffer2.5μL；浓度25mmol/L的MgCl₂2μL；浓度为10mmol/L四种dNTPs0.8μL；Taq DNA聚合酶0.4μL；5端代CY-3标记的10μmol/L两种引物各1μL，加入无菌水至25μL体系。 

PCR反应程序：用PCR仪在94℃温度环境下变性6min；循环步骤为94℃变性30s，54℃/58℃退火30s，72℃延伸1min，进行35个循环；最后72℃延伸10min，PCR产物用1.5％琼脂糖凝胶电泳。 

1.6芯片杂交、清洗及扫描结果分析： 

配制15μL的杂交体系：为5μL的带标记的PCR产物和10μL杂交液，将两者混合均匀后放入PCR仪进行高温变性。变性条件为：95℃变性5min后，立即置于冰上冷却3min，此步的速度一定要快，以避免缓慢降温导致变性后的产物复性而影响杂交效率。将15μL杂交液小心的加入到盖片的小孔里，组装上杂交盒，放入一定温度的水浴锅进行杂交2h或更长时间。对杂交好的芯片要进行洗片，洗片是为了除去芯片上未杂交上的成分降低背景值。将洗好的芯片置于50ml离心管中在台式冷冻离心机离心2min以甩干。洗涤和甩干过程注意避光操作，甩干后的芯片利用晶芯 微阵列芯片共聚焦激光扫描仪进行扫描并对结果进行分析。 

1.7临床检测： 

收集来自四川省达州及重庆的60份病猪临床疑似病料，包括心、肝、脾、肺、肾。所有样品组织匀浆后反复冻融三次，并进行8000r/min离心10min，取上清进行DNA、RNA的提取，用于PCR临床样品的检测及基因芯片检测。 

2结果： 

2.1带标记引物的多重PCR产物的验证： 

用设计的引物分别对PCV-2、PRRSV美洲型、PRRSV欧洲型、CSFV进行带标记引物PCR扩增，扩增产物经1.5％经琼脂糖凝胶电泳鉴定，如图2A和图2B所示，可以看到4种病毒的扩增产物与预期目的片段的大小一致，且特异性和灵敏性较高，说明设计的4对引物特异性很高。扩增的产物可以用于后续杂交试验。 

2.2四种猪疫病病毒样本与芯片杂交： 

4种病毒的荧光标记样本及阳性质控标记样本分别与60mer寡核苷酸芯片杂交及两组标记多重PCR产物分别与芯片杂交(杂交结果见图3)，在阳性质控位置和每种病毒对应的探针位置均出现较强的阳性杂交信号，而阴性质控、空白对照及其他病毒探针位置均未出现荧光信号。同时背景信号值、定位信号值、特异信号值都比较稳定，特异性较强，检测结果准确可靠。 

2.3芯片杂交的临床样品检测： 

将处理好的临床样品同时基因芯片检测及PCR检测，并将检测结果进行比较。临床病料检测结果显示，芯片检出率高于PCR方法，两种检测方法的结果复合率大于88％。结果见表3。 

表3临床病料检测结果 

试验结果表明，芯片上各样本对应探针位点呈现阳性荧光信号，而阴性对照和空白对照则不能检测到荧光信号。并分别用基因芯片检测方法和PCR/RT-PCR方法检测60份临床病料，两者符合率高达92％，表明该检测方法可以用于临床病料的检测，具有较大的应用价值，可广泛应用于临床检验。 

本发明的基因芯片能快速准确诊断猪瘟、猪圆环病毒病和猪繁殖与呼吸综合征。其主要的技术经济指标如下：(1)检测灵敏度：＜1ng/L；(2)检测时间：3h；(3)特异性100％。能够用于临床样本和畜产品的检测。 

本发明利用基因芯片高通量、高特异性和高灵敏度的特点，将其用于检测上述3种猪常见的病毒性疾病，缩短检测时间，达到同时检测3种病毒的目的，以期对临床样品进行早期、快速、准确的诊断，为猪病的防制提供科学依据。 

本发明采用的基因芯片技术具有微型化和高度自动化的优点，可以减少试剂用量和减小反应液体积，降低实验费用，高度自动化则可以降低制造芯片的成本和保证芯片的制造质量。 

最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员能够理解和实施，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。 

序列表： 

序列1PRRSVA引物序列〔5，-3，〕，(目的基因14898-15189，长221bp)： 

PRRSV1：AACCAGTCCAGAGGCAAGG。 

PRRSV2：GGCAAACTAAACTCCACAGTGT。 

序列2CSFV引物序列〔5，-3，〕，(目的基因3910-4096，长186bp)： 

CSFV1：CCTGAGAACGGCTAAGATGAC。 

CSFV2：TCCAACTCACCTATTCCCTTCA。 

序列3PCV-2引物序列〔5，-3，〕，(目的基因34-406，长372bp)： 

PCV-21：AGCACCTCAGCAGCAACAT。 

PCV-22：GGTCACTCCGTTGTCCTTGA。 

序列4PRRSVE引物序列〔5，-3，〕，(目的基因13100-13576，长476bp)： 

PRRSV1：ATGCTTTTCAGGACAGGTCA。 

PRRSV2：GCTCAGTTGATTTCTTCACCTC。 

序列5PRRSVA探针序列〔5，-3，〕(探针位置14910-14962，长62)： 

TTTTTTTTTTTTTTTGTCGCTAGAGGGAAATGGGGCTTCTCCGGGTTTTTCTTCCTATTTTT。 

序列6CSFV探针序列〔5，-3，〕(探针位置3990-4055，长67)： 

TTTTTTTTTTTTTTTAACAGCGTTGCTAACCTGGACCTACATTAGTGACTATTATAGATACAAGACT。 

序列7PCV-2探针序列〔5，-3，〕(探针位置90-156，长66)： 

TTTTTTTTTTTTTTTAAAGCGAAAGGAACGGATCAGCAGAATAAAGAATATTGCAGTAAAGAAGGC。 

序列8PRRSVE探针序列〔5，-3，〕(探针位置13200-13250，长62)： 

TTTTTTTTTTTTTTTTTGGGAACCAGAACCTCCTTGCCTTTGACCAGATACCTATTATAC GT。