辅助鉴定具有不同体重性状的鸡群体的方法

摘要

本发明公开了辅助鉴定具有不同体重性状的鸡群体的方法。本发明提供了序列表的序列3所示DNA和序列表的序列4所示DNA组成的引物对。所述引物对可应用于辅助鉴定具有不同体重性状的鸡群体。本发明提供的方法包括如下步骤：分别以每只待测鸡的基因组DNA为模板，用序列表的序列3所示DNA和序列表的序列4所示DNA组成的引物对进行PCR扩增，用限制性内切酶HhaI酶切PCR产物；如果得到两条DNA片段，待测鸡的基因型为BB；如果得到三条DNA片段，待测鸡的基因型为AB；BB基因型鸡群体的平均体重在统计学上低于AB基因型的鸡群体的平均体重。本发明发现鸡的SCTGF基因中的SNP(单核苷酸多态性)与体重具有显著相关的特性，可以作为鸡的遗传标记，使用分子生物学手段，进行辅助育种。

说明书

技术领域

本发明涉及辅助鉴定具有不同体重性状的鸡群体的方法。

背景技术

SNP(single nucleotide polymorphism单核苷酸多态性)主要是指在基因组水平上，由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列的多态性，包括转换、颠换、插入或缺失。在基因组中分布密集的SNP，因其携带巨大的遗传信息量，被认为是应用前景最好的遗传标记物，人类SNP标记的检测已经成为基因诊断的重要手段。SNP标记的遗传图谱的研究，对分子辅助育种有巨大的促进作用，农业动物中很多重要性状的基因已经定位。

SNP的检测常采用一些已有的成熟技术，如DNA测序(Sanger测序法和焦磷酸测序法)、单链构象多态性(SSCP)、限制性酶切片段长度多态性(RFLP)、等位基因特异的寡聚核苷酸杂交(ASO)、寡聚核苷酸特异的连接、DNA芯片以及Taqman探针等技术手段。

1991年Bradham等(Bradham DM，Igarashi A，Potter RL，et al.Connectivetissue growth factor：a cysteine-rich mitogen secreted by human vascularendothelial cells is related to the SRC-induced immediate early gene productCEF-10[J].J Cell Biol，1991，114(6)：1285.)首次发现了人类结缔组织生长因子(connective tissue growth factor，CTGF)。CTGF主要由皮肤成纤维细胞、肾小球系膜细胞、肝星状细胞、肺成纤维细胞、血管平滑肌细胞等间质细胞合成分泌。CTGF是CCN(CTGF、Cef10/cyr61和Nov的缩写)家族中的成员。该家族目前包括鸡胚成纤维细胞经诱导产生的Cef10、3T3细胞经诱导产生的Cyr61、3T3细胞受血清刺激后产生的Fisp-12、成年鸡肾细胞中表达的Nov、非洲爪蟾成纤维细胞产生的Xnov和人类CTGF。它们均属于即刻早期基因(immediate early gene)，直接参与生长因子对细胞生长分化的调控。它们的共同结构特点是具有很高的序列同源性和序列结构的类似性(Bork P.The modular architecture of a new family of growth regula2torsrelated to connective tissue growth factor[J].FEBS Lett，1993，327(2)：125.)。

CTGF在生物体中发挥着重要的作用，参与了多个代谢途径，主要在以下方面发挥着作用(刘剑毅，李世荣纪淑兴结缔组织生长因子及其生物学作用ChineseJournal of Practical Aesthetic and Plastic Surgery，2004.Vol.15No.1)：

(1)加速DNA合成、促进细胞增殖：1991年Bradham等首先发现人类CTGF对3T3细胞具有促有丝分裂作用。

(2)调节细胞外基质基因的表达：CTGF能够刺激成纤维细胞增殖、细胞外基质产生、肉芽组织形成和纤维化。

(3)介导细胞黏附：Chen等(Chen CC，Chen N，Lau L F.The angiogenic factorsCyr61and connective tissue growth factor induce adhesive signaling in primaryhuman skin fibroblasts[J].J Biol Chem，2001，276(13)：10443.)研究发现CTGF能够介导成纤维细胞的黏附，其过程必须要有整合素和硫酸乙酰肝素糖蛋白的参与。

(4)刺激细胞迁移：Bradham等发现，CTGF可以刺激体外培养的3T3细胞的迁移。Fan等(Fan WH，Pech M，Karnovsky MJ.Connective tissue growth factor(CTGF)stimulates vascular smooth muscle cell growth and migra2tion in vitro[J].Eur J Cell Biol，2000，79(12)：915.)发现，如果CTGF表达过度，血管平滑肌细胞的生长率和迁移率都将有显著增加。

(5)促进新生血管形成：Babic等(Babic AM，Chen CC，Lau L F.Fisp12/ mouseconnective tissue growth factor mediates endothelial cell adhesion andmigration through integri

(6)促进软骨发生和骨骼发育：CTGF可促进软骨细胞和成骨细胞的增殖分化，Nakanishi等(Nakanishi T，Kimura Y，Tamura T，et al.Cloning of a mRNApreferentially expressed in chondrocytes by differential display-PCR from ahuman chondrocytic cell line that is identical with con2nective tissue growthfactor(CTGF)mRNA[J].Biochem Biophys Res Commun，1997，234(1)：206.)发现CTGFmRNA的过表达可促进软骨细胞株HCS-2/8细胞增殖，并促进软骨聚集蛋白多醣分泌和X型胶原蛋白表达，而X型胶原是肥大带软骨细胞的表型特征。

(7)促进细胞存活、免于凋亡：Babic等发现将内皮细胞置于不含生长因子的层黏连蛋白培养基内(即在诱导凋亡的情况下)，加入小鼠的CTGF可以促进内皮细胞的存活，免于凋亡。

作为生长性状的体重指标一直是畜牧业生产中重要的经济性状之一，也是肉鸡品种选育中的重要指标。与1957年相比，2001年的肉鸡当代品系的屠体产量提高了6倍，其中85％-90％要归功于遗传学效应，只有10％-15％是由于饲料营养水平的改良造成的。家禽遗传标记辅助育种研究在不断深入，大量的性状已经在遗传水平上确定了候选区域。

我国有丰富的地方鸡品种资源，如何对其评估、保护和选育是迫切需要解决的问题。

发明内容

本发明的目的是提供辅助鉴定具有不同体重性状的鸡群体的方法。

本发明提供了序列表的序列3所示DNA和序列表的序列4所示DNA组成的引物对。

所述引物对可应用于辅助鉴定具有不同体重性状的鸡群体。

所述引物对还可应用于制备辅助鉴定具有不同体重性状的鸡群体的试剂盒。

本发明同时保护含有所述引物对的辅助鉴定具有不同体重性状的鸡群体的试剂盒。

本发明提供的辅助鉴定具有不同体重性状的鸡群体的方法，包括如下步骤：分别以每只待测鸡的基因组DNA为模板，用序列表的序列3所示DNA和序列表的序列4所示DNA组成的引物对进行PCR扩增，用限制性内切酶HhaI酶切PCR产物；如果得到两条DNA片段，待测鸡的基因型为BB；如果得到三条DNA片段，待测鸡的基因型为AB；BB基因型鸡群体的平均体重在统计学上低于AB基因型的鸡群体的平均体重。

所述两条DNA片段具体为45bp的DNA片段和191bp的DNA片段；所述三条DNA片段具体为236bp的DNA片段、45bp的DNA片段和191bp的DNA片段。

本发明提供的一种辅助鉴定具有不同体重性状的鸡群体的方法，包括如下步骤：分别检测每只待测鸡的基因组DNA中是否具有序列表的序列1所示DNA片段和序列表的序列2所示DNA片段；如果待测鸡为序列1所示DNA片段的纯合体，其基因型为BB；如果待测鸡为序列1和2所示DNA片段的杂合体，其基因型为AB；BB基因型鸡群体的平均体重在统计学上低于AB基因型的鸡群体的平均体重。

以上任一所述的方法中，还包括选择待测鸡的步骤；所述待测鸡为如下两个群体的鸡：一个群体中每只待测鸡基因组中均同时具有序列表的序列1所示DNA片段和序列表的序列2所示DNA片段；另一个群体中每只待测鸡基因组中均具有序列表的序列2所示DNA片段且不具有序列1所示DNA片段。

以上任一所述的方法中，所述待测鸡具体可为CAU资源家系的鸡，更具体可为CAU资源家系的F2代个体。所述待测鸡具体可为AB或BB基因型的鸡。

以上任一所述的方法中，所述体重性状具体可为初生体重、1周龄体重、3周龄体重、4周龄体重、5周龄体重、6周龄体重或7周龄体重。

所述的方法，所述引物对或所述的试剂盒可应用于鸡的育种。

以待测鸡的基因组DNA为模板，用序列表的序列3所示DNA和序列表的序列4所示DNA组成的引物对进行PCR扩增，得到的PCR产物即为序列表的序列1或序列表的序列2所示的DNA片段。序列1和序列2所示DNA片段仅存在一个核苷酸的差异，序列1所示DNA片段自5’端第191位核苷酸为C，序列2所示DNA片段自5’端第191位核苷酸为T。本发明发现该SNP(鸡的类CTGF基因)与体重具有显著相关的特性，可以作为鸡的遗传标记。

本发明提供的方法和产品可进行辅助育种，快速准确的辅助筛选，具有早期筛选、节省时间、成本低廉、准确性高的优点。

附图说明

图1为PCR产物电泳图谱；M：100bp Marker；1-12泳道：CAU资源家系的12个不同个体；ck：空白对照。

图2为PCR产物酶切后电泳图谱；M：100bp Marker；ck：空白对照。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。下述实施例中的％，如无特殊说明，均为质量百分含量。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

CAU资源家系：由中国农业大学李宁教授课题组1998年建立的用于研究定位影响鸡重要经济性状QTL、寻找克隆主效基因的实验群体，亲本为法国明星肉鸡和泰和丝羽乌骨鸡；来源为中国农业大学实验牧场；CAU资源家系参考文献：Deng，X.M.，Li，J.Y.，Li，N.，and Wu，C.X.(2001).[Genetic analysis of important growth traitbased on F-2resource population in chicken].Yi Chuan Xue Bao 28，801-807.；中国农业大学保证向公众提供。

实施例1、SNP与体重相关性的发现

通过比较基因组学分析，在鸡的23号染色体上找到了人的CTGF类似物(similarto connective tissue growth factor，LOC419598)，与和鸡的基因组测序结果BLAT，发现SCTGF位于鸡的23号染色体(Chr23：2887664-2896948)，由4个外显子组成，转录本长度为966bp，编码322个氨基酸。

生长性状是目前关于鸡的QTL研究最多的内容之一。在CAU资源家系中测定了F2代个体1到12周龄的体重，根据扫描结果定位了一系列影响鸡生长的QTL。其中最值得关注的是在鸡的23号染色体标记ADL0262附近定位了一个影响鸡出生重和早期生长(1到7周龄)体重的QTL，根据鸡的测序信息，分析这一区域的基因可以找到一些基因作为影响鸡早期生长体重的候选基因进行深入研究，结缔组织生长因子(connectivetissue growth factor，CTGF)(NC_006110)就是首先的候选基因。

一、基因型分析

实验材料：215个CAU资源家系的F2代个体。

1、基因组DNA的提取

鸡12周龄时翅静脉采血，抗凝处理后裂解，经蛋白酶K消化后，用酚仿抽提，TE溶解-20℃保存。

2、PCR扩增

以步骤1提取的基因组DNA为模板，用引物对CTGFex3H进行PCR扩增。

CTGFex3H：正向引物：5’-AAATCGAACCATCGGGATTA-3’；

反向引物：5’-GGTCTGCACCAAGCAGTTCT-3’。

PCR反应体系(15μl)：模板2μl(40ng基因组DNA)，扩增缓冲液(10×buffer)1.5μl，dNTP 1.2μl，正向引物0.8pm/ul，反向引物0.8pm/ul，DNA聚合酶(TaqE)0.3μl，加水补至15μl。

PCR反应条件：94℃、5min；94℃、30sec，60℃、30sec，72℃、90sec，40循环；72℃、7min。

PCR产物进行2％琼脂糖凝胶(见图1)，回收236bp的DNA片段。

3、酶切

PCR扩增产物用HhaI进行酶切(37℃5h)。酶切体系(20μl)：PCR产物10μl，10倍缓冲液2μl，2U HhaI(TaKaRa公司)，用水补至20μl。

酶切产物用4％琼脂糖凝胶检测(见图2)。

产生三种带型：

第一种带型：只有一个条带，为236bp；将基因型命名为AA；

第二种带型：有两个条带，分别为45bp和191bp；将基因型命名为BB，45bp片段较小，未能显示，所以图2显示出来一条191bp的条带；

第三种带型：有三个条带，分别为45bp、191bp和236bp；将基因型命名为AB，45bp片段较小，未能显示，所以图2显示出来191bp和236bp的两条条带。

统计结果如表1。

表1CTGF基因PCR-HhaI-RFLP鉴定基因型在F2群体中的分布

从表1结果看，BB型为实验所用群体中的优势基因型，比例达到80％。

二、测序验证

分别将各个样本的PCR产物进行测序。结果表明，所有品种的鸡中：AA基因型均为序列表的序列2所示的DNA的纯合体(2448T的纯合体)；BB基因型均为序列表的序列1所示的DNA的纯合体(2448C的纯合体)；AB基因型均为序列表的序列2所示的DNA和序列表的序列1所示的DNA的杂合体(2448T和2448C的杂合体)。

对照CTGF基因(NC_006110)进行分析：外显子3的2448处的SNP为同义突变，由于该SNP由C突变为T时，会减少一个HhaI酶切位点，因而可以采用PCR-HhaI-RFLP的方法检测2448C-T的变异情况；用CTGFex3H引物PCR扩增可以得到含有外显子3的部分DNA片段(236bp)，236bp的扩增产物经HhaI酶切后，产生三种带型，分别对应不同的基因型：236bp(AA)，45+191bp(BB)和45+191+236bp(AB)。

三、关联分析

采用SAS(8.2版)统计分析软件包的PROC GLM过程进行统计分析根据最小二乘分析模型对供试鸡群的基因型和生长性状进行方差统计分析。

统计分析模型：

Y_ijkl＝U+F_i+S_j+R_k+e_ijkl

Y_ijklm个体的表型性状(体重)观察值；

U为群体的均值；

F_i为第i个家系对表型性状(体重)的效应值；

S_j为性别对表型性状(体重)的效应值；

R_k为不同批次对表型性状(体重)的效应值；

e_ijkl为对应于观察值的随机残差效应。

分析结果见表2。

表2CTGF基因PCR-HhaI-RFLP的多态性与鸡各个周龄体重的方差分析

  AA  AB  BB  w0(初生)  30.03±1.20^ab  31.79±0.54^ab  29.75±0.28^b  w1(1周龄)  73.10±4.51^ab  70.90±2.03^a  64.51±1.05^b  w2(2周龄)  153.72±9.06^a  144.66±4.09^a  135.80±2.12^a  w3(3周龄)  251.97±13.94^ab  241.65±6.29^a  225.16±3.26^b

  w4(4周龄)  382.03±23.32^ab  366.78±10.52^a  341.73±5.45^b  w5(5周龄)  541.24±34.84^ab  536.65±15.71^a  491.53±8.14^b  w6(6周龄)  726.64±45.55^ab  726.77±20.54^a  669.75±10.65^b  w7(7周龄)  942.05±59.83^ab  918.53±26.98^a  851.39±13.99^b  w8(8周龄)  1076.35±69.91^a  1121.48±31.53^a  1053.89±16.34^a  w9(9周龄)  1297.92±76.90^a  1334.59±34.68^a  1253.35±17.98^a  w10(10周龄)  1477.05±85.82^a  1514.59±38.70^a  1436.62±20.06^a  w11(11周龄)  1600.09±90.95^a  1645.78±41.02^a  1587.89±21.26^a  w12(12周龄)  1750.22±91.03^a  1762.45±43.76^a  1715.40±22.68^a

注：均值比较字母相同表示差异不显著，字母不同表示差异显著。

其中在w0和w1中，BB型对AB型达到差异极显著(P＜0.01)，从W3和W7中，BB型对AB型达到差异显著(P＜0.05)。

分析结果表明：在各个发育阶段AB基因型群体的平均体重均大于BB基因型群体的平均体重，BB型为劣势基因型；BB型对AB型在出生重(初生重)和1周龄体重分析中，差异极显著(P＜0.01)，BB型对AB型在从3周龄到7周龄体重分析中，差异显著(P＜0.05)。一般的商品肉鸡上市时间平均为6周。

实施例2、SNP的应用

分别对7个品种的鸡(均获自中国农业大学实验牧场)进行SNP测定，7个品种：广西三黄鸡、北京油鸡、罗曼肉鸡、藏鸡、农大褐蛋鸡、丝羽乌骨鸡、明星肉鸡。

1、基因组DNA的提取

鸡12周龄时翅静脉采血，抗凝处理后裂解，经蛋白酶K消化后，用酚仿抽提，TE溶解-20℃保存。

2、各个品种的基因型确定

以步骤1提取的基因组DNA为模板，用引物对CTGFex3H进行PCR扩增。

CTGFex 3H：正向引物：5’-AAATCGAACCATCGGGATTA-3’；

反向引物：5’-GGTCTGCACCAAGCAGTTCT-3’。

PCR反应体系(15μl)：模板2μl(40ng基因组DNA)，扩增缓冲液(10×buffer)1.5μl，dNTP 1.2μl，正向引物0.8pm/ul，反向引物0.8pm/ul，DNA聚合酶(TaqE)0.3μl，加水补至15μl。

PCR反应条件：94℃、5min；94℃、30sec，60℃、30sec，72℃、90sec，40循环；72℃、7min。

PCR产物进行2％琼脂糖凝胶，回收236bp的DNA片段。

PCR扩增产物用HhaI进行酶切(37℃5h)。酶切体系(20μl)：PCR产物10μl，10倍缓冲液2μl，2U HhaI(TaKaRa公司)，用水补至20μl。

酶切产物用4％琼脂糖凝胶检测。

结果见表3。

表3CTGF基因PCR-HhaI-RFLP的多态性在不同纯种鸡中的分布

表4CTGF基因PCR-HhaI-RFLP的多态性在国内与国外鸡种中的分布

  样本总数  AA  AB  BB  国内鸡种  79  1  5  73  国外鸡种  78  20  42  16

卡方检验：x²＝82.82，d_f＝3，P＜0.01。

从表3和表4中看出，七个纯种鸡，同样检测到A和B两个等位基因，分为AA、AB、BB三种基因型，国外鸡品种罗曼肉鸡和明星肉鸡中AB基因型比例较大，而在中国地方鸡种中BB基因型为主体。AB基因型为影响鸡出生重和早期生长体重的优势基因型，而BB型为劣势基因型，所以该位点的基因型分布与国内外鸡种体重及生长的差异相符合。

结果表明，BB纯合个体在体重方面具有劣势。本SNP位点可以作为一个遗传标记，应用于鸡生长性状的分子遗传标记辅助选择，提高肉鸡选种的速度和准确性。

序列表

<110>中国农业大学

<120>辅助鉴定具有不同体重性状的鸡群体的方法

 

<130>CCGNARY102223

 

<160>4

 

<210>1

<211>236

<212>DNA

<213>鸡(Gallus domestiaus)

 

<400>1

aaatcgaacc atcgggatta tatagaatta taaagatcac agaaccatga aatcacagaa     60

tggttgggtt ggaagggaac ttaaagaccc ccagctttgc ctcccaccgg atcaggctgt    120

ccagggccct atggggtatc tgaccttcat gtcttcctcc tggctcagtt ttcagggagg    180

atcccgagcg cgagccggag ctgaacaacc tgcaggagaa ctgcttggtg cagacc        236

 

<210>2

<211>236

<212>DNA

<213>鸡(Gallus domestiaus)

 

<400>2

aaatcgaacc atcgggatta tatagaatta taaagatcac agaaccatga aatcacagaa     60

tggttgggtt ggaagggaac ttaaagaccc ccagctttgc ctcccaccgg atcaggctgt    120

ccagggccct atggggtatc tgaccttcat gtcttcctcc tggctcagtt ttcagggagg    180

atcccgagcg tgagccggag ctgaacaacc tgcaggagaa ctgcttggtg cagacc        236

<210>3

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

 

<220>

 

<223>

 

<400>3

aaatcgaacc atcgggatta                                            20

 

<210>4

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

 

<220>

 

<223>

 

<400>4

ggtctgcacc aagcagttct                                            20