一种水体沉积物中雌激素及壬基酚、辛基酚、双酚A的共检测方法

摘要

基于加速溶剂萃取(ASE)-液液萃取(LLE)-液相色谱/串联质谱联用(LC/MS/MS)技术的水体沉积物中雌激素及其壬基酚、辛基酚、双酚A共检测方法，以丙酮为萃取剂进行加速溶剂萃取提取沉积物中的雌激素及其壬基酚、辛基酚、双酚A。用1mol/L氢氧化钠溶液，溶解萃取液氮吹后的残渣，离心收集上清液并在PH＝2的条件下，用乙酸乙酯进行液液萃取。利用美国Applied Biosystem公司的3200QTRAP型液相色谱/串联质谱仪和Agilent 1100高效液相色谱系统及美国Agilent公司的自动进样器进行浓度检测。回收率为59-94％，检测限0.04ng/g。

说明书

技术领域

本发明涉及一种采用快速溶剂萃取-液液萃取-液相色谱/串联质谱联用(ASE-LLE-LC/MS/MS)对水体沉积物中有机污染物进行检测技术领域，特别是涉及沉积物中痕量雌激素及其壬基酚、辛基酚、双酚A的共检测方法。

背景技术

由人与动物卵巢分泌的天然雌激素雌酮(Estrone，E1)、17β-雌二醇(17β-Estradiol，E2)和雌三醇(Estriol，E3)，以及作为口服避孕药主要成分的合成雌激素17α-乙炔基雌二醇(17α-Ethinyl Estradiol，EE2)，会随着粪尿排放进入污水处理系统或农田土壤中。雌激素的排放是不可避免的，近十年来雌激素作为典型的内分泌干扰物受到广泛关注。欧美等国对多家污水处理厂雌激素浓度及去除效率的调查结果显示，在污水处理厂出水及受纳水体中残留着ng/L浓度水平的雌激素，表明污水处理厂不能有效去除进水中的雌激素。畜禽养殖业排放的雌激素会通过堆肥施用或地表径流进入土壤及水体中。有关鱼类生殖异常现象的研究结果表明，污水处理厂受纳水体中所含ng/L浓度水平的雌激素是导致鱼类雌性化生殖异常现象的主要原因物质。

烷基酚类化合物是一类具有内分泌干扰性的亲脂性有机化合物，主要用于洗涤剂、润滑剂、化妆品、油漆等的生产和制造，如壬基酚(Nonylphenol，NP)、辛基酚(Octylphenol，OP)等。在环境中，烷基酚主要源于非离子表面活性剂烷基酚聚氧乙烯醚生产过程的排放。壬基酚聚氧乙烯醚和辛基酚聚氧乙烯醚是两种十分重要的非离子型表面活性剂，在自然环境及污水处理过程中经微生物的作用转化为壬基酚和辛基酚，再经污水排放等过程进入水体、大气和土壤中。双酚A(Bisphenol A，BPA)是生产聚碳酸酯和环氧树脂等的重要原料。该物质广泛用于食具和餐具的制造，电子器件包覆物、金属饮料罐保护层、食品包装材料、牙齿填充剂、餐巾纸和纸杯的生产等。例如，纸杯和餐巾纸等用品中双酚A含量为34～360ng/g，再生纸制成的包装盒中双酚A的含量为190～26000ng/g。上述物质对生物体具有类雌激素活性干扰效应且存在广泛，因而引起国内外学者的关注。

污水处理厂出水和农田径流是雌激素等内分泌干扰物进入河流、湖泊水体的两个主要途径。近年来，许多学者展开了对自然水体中雌激素以及壬基酚、辛基酚、双酚A浓度污染状况的调查研究，发现多数河流和湖泊等水体中均有ng/L水平上述物质的存在。然而，目前国内外关注水相中雌激素的研究比较多，对于水体沉积物中雌激素含量的调查研究相对较少。由于雌激素的疏水特性，水体中雌激素倾向在沉积物中存在，环境条件的变化会引起沉积物中雌激素的释放，造成水体雌激素浓度升高。因此，对水体沉积物中雌激素含量的调查研究，对其生态风险评价具有重要的意义。沉积物中雌激素的含量不仅受水体污染源强度的影响，而且和沉积物的有机质含量、粒径大小等因素紧密相关，不同雌激素的含量相差也很大，其分析难度大于水相中的雌激素。因次，如何通过有效的样品前处理技术和仪器分析技术，建立一种回收率高、重现性好、精确度及精密度高、同时测定水体沉积物中痕量存在的雌激素以及壬基酚、辛基酚、双酚A的共检测方法，成为研究的关键。

近年来，雌激素的仪器检测技术有了很大的提高，如气相色谱-质谱联用(GC/MS)、气相色谱-串联质谱联用(GC/MS/MS)、液相色谱-质谱联用(LC/MS)等，具有较高的灵敏度和精确度。但由于沉积物样品基质复杂，若样品前处理过程中杂质去除不好，可直接干扰仪器的测定结果，甚至损坏仪器。因此，如何高效地从沉积物样品中提取雌激素并进行净化，成了沉积物中痕量雌激素分析的一个瓶颈。

发明内容

本发明的目的是针对沉积物样品基质复杂，沉积物中雌激素痕量存在，前处理技术难度大等问题，拟开发一种回收率高、灵敏度高、准确、快速的分析技术，实现对沉积物样品中雌激素及壬基酚、辛基酚、双酚A的定量测定。

本发明的技术方案如下：

一种检测水体沉积物样品中痕量雌激素及壬基酚、辛基酚、双酚A的方法，其特征在于该方法包括如下步骤：

(1)沉积物样品预处理

将采集的沉积物样品进行冷冻干燥，以丙酮为萃取剂，用快速溶剂萃取提取沉积物中的雌激素及壬基酚、辛基酚、双酚A；然后采用旋转蒸发仪浓缩至1ml左右，用氮气吹干；用碱液超声溶解残渣，离心并将上清液调节PH＝2左右，用乙酸乙酯萃取水溶液中的雌激素及壬基酚、辛基酚、双酚A，并将萃取液在氮气下吹干，以乙腈∶水＝1∶1(v∶v)定容后漩涡混合，冷藏等待浓度测定。

(2)利用液相色谱-串联质谱分析雌激素及壬基酚、辛基酚、双酚A浓度液相色谱-串联质谱联用选择的条件：3200QTRAP型液相色谱/串联质谱仪，配有电喷雾离子化源(ESI)以及Analyst 1.4.1数据处理软件，美国AppliedBiosystem公司；Agilent 1100高效液相色谱系统，包括四元输液泵，自动进样器，美国Agilent公司。

色谱柱：Nova-Pak C18(3.9mm×150mm×4μm)，Waters公司。离子源：电喷雾离子化源(ESI)，负离子方式检测；离子喷射电压：-4500V；温度：450℃；源内气体1(GS1，N₂)压力：45psi；气体2(GS2，N₂)压力：45psi；气帘气体(N₂)压力：20psi；扫描方式为多重反应监测(MRM)；碰撞气(N₂)压力：Medium。采用甲醇和氨水(pH＝10)为流动相，梯度洗脱条件详见表1。

表1流动相梯度条件

(3)标准曲线的绘制，以外标法进行定量测定

所述的外标法标准曲线的绘制：利用分析天平准确称量4种雌激素及壬基酚、辛基酚、双酚A，溶于色谱纯乙腈内，配置成系列浓度的标准溶液，采用液相色谱-串联质谱联用进行分析，分别以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标进行回归，得到7条标准曲线，用于测定样品中分析物的量。

(4)样品及回收率的测定

采集待测沉积物样品，按步骤1对土壤样品进行预处理，再按步骤2进行液相色谱-串联质谱联用检测，并与步骤3得到的标准曲线比较，通过换算最终得到待测沉积物样品中雌激素及壬基酚、辛基酚、双酚A的含量。

采用同样的土壤样品，按10ng/g的添加量加入标准溶液，进行上述预处理并测定雌激素含量，按照下式进行回收率计算：

$R=\frac{C-C_0}{10}\times 100\%---\left(1\right)$

R-回收率，％；

C-添加标准溶液沉积物样品的雌激素含量，ng/g；

C₀-未添加标准溶液沉积物样品的雌激素含量，ng/g。

本发明所述的快速溶剂萃取方法选择的温度为60℃，压力为1500pis，静态提取2次，各8min。

本发明所述的碱液为1mol/L的NaOH溶液，调节PH的盐酸浓度为4mol/l，液液萃取溶剂为乙酸乙酯。

本发明的有益效果是采用快速溶剂萃取进行提取，萃取效果好，操作简单，萃取速度快，安全可靠；采用碱液超声-酸性条件下液液萃取净化方法，净化效果好，成本低；采用液相色谱-串联质谱联用进行检测，检测限低，具有较高的灵敏度和精确度。本发明提供一种检测限低、重现性好、灵敏度高、回收率较好、操作简单易行的分析方法，能够快速分析沉积物中雌激素及壬基酚、辛基酚、双酚A的含量。本方法的回收率与最低检测限，如表2所示。

表2本方法的回收率和最低检测限

附图说明

图1为5μg/L标准品溶液的色谱图，色谱图依次为：图1a为雌酮、图1b为17β雌二醇、图1c为雌三醇、图1d为17α-乙炔基雌二醇、图1e为壬基酚、图1f为辛基酚、图1g为双酚A；

图2为雌激素及壬基酚、辛基酚、双酚A的标准曲线；

图3为实际河流沉积物某样品中雌激素及壬基酚、辛基酚、双酚A的色谱图；色谱图依次为：图3a为雌酮、图3b为17β-雌二醇、图3c为雌三醇、图3d为17α乙炔基雌二醇、图3e为壬基酚、图3f为辛基酚、图3g为双酚A。

具体实施方式

下面结合实例及附图对本发明的技术方案作进一步的描述。

(1)沉积物样品预处理

采集好的沉积物样品先进行冷冻干燥处理。取5g冷冻干燥后的样品，以60ml丙酮进行快速溶剂萃取。所采用的快速溶剂萃取方法选择的温度为60℃，压力为1500pis，静态提取2次，各8min。用旋转蒸发仪将萃取液浓缩到1ml左右，转移至50ml离心管中并在37℃水浴条件下氮气吹干。用15ml的1mol/L NaOH溶液分三次超声溶解残渣，然后离心并转移上清液至50ml离心管中，用4mol/L的盐酸调节其PH＝2，用30ml乙酸乙酯分三次在300r/min震荡条件下液液萃取，萃取时间为15min。萃取液在氮气流下缓慢吹干，加入1ml乙腈/水(v/v)＝1∶1，漩涡混合后，待测。

(2)利用液相色谱-串联质谱联用分析雌激素浓度

液相色谱-串联质谱联用选择的条件：3200QTRAP型液相色谱-串联质谱仪，配有电喷雾离子化源(ESI)以及Analyst 1.4.1数据处理软件，美国AppliedBiosystem公司；Agilent 1100高效液相色谱系统，包括四元输液泵，自动进样器，美国Agilent公司。

色谱柱：Nova-Pak C18(3.9mm×150mm×4μm)，Waters公司。离子源：电喷雾离子化源(ESI)，负离子方式检测；离子喷射电压：-4500V；温度：450℃；源内气体1(GS1，N₂)压力：45psi；气体2(GS2，N₂)压力：45psi；气帘气体(N₂)压力：20psi；扫描方式为多重反应监测(MRM)；碰撞气(N₂)压力：Medium。采用甲醇和氨水(pH＝10)为流动相，梯度洗脱条件详见表1。

液相色谱-串联质谱联用对雌酮、17β-雌二醇、17α-乙炔基雌二醇及壬基酚、辛基酚、双酚A的最低检测限为200ng/L，对雌三醇的最低检测限为500ng/L。(3)标准曲线的绘制，以外标法进行定量测定

所述的外标法标准曲线的绘制：利用分析天平准确称量4种雌激素及壬基酚、辛基酚、双酚A，溶于色谱纯乙腈内，配置成系列浓度的标准溶液，采用液相色谱-串联质谱联用进行分析，分别以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标进行线性回归，得到7条标准曲线，用于测定样品中分析物的量。

(4)样品回收率的测定

采集待测沉积物样品，按步骤1对土壤样品进行预处理，再按步骤2进行液相色谱-串联质谱联用检测，并与上述得到的标准曲线比较，通过换算最终得到待测土壤样品中雌激素及壬基酚、辛基酚、双酚A的含量。

采用同样的沉积物样品进行冷冻干燥，取5g冷冻干燥后的土壤样品按10ng/g的添加量加入标准溶液，进行预处理并测定雌激素及壬基酚、辛基酚、双酚A含量，进行回收率计算。

利用本发明检测某河流沉积物中雌激素及壬基酚、辛基酚、双酚A的实施过程：

采集某河流沉积物，迅速装入不锈钢饭盒并放入带有冰块的保温箱内，带回实验室进行处理分析。取5g冷冻干燥后的样品，以60ml丙酮进行快速溶剂萃取。所采用的快速溶剂萃取方法选择的温度为60℃，压力为1500pis，静态提取2次，各8min。用旋转蒸发仪将萃取液浓缩到1ml左右，转移至50ml离心管中并在37℃水浴条件下氮气吹干。用15ml的1mo1/L NaOH溶液分三次超声溶解残渣，然后离心并转移上清液至50ml离心管中，用4mol/L的盐酸调节其PH＝2，用30ml乙酸乙酯分三次在300r/min震荡条件下液液萃取，萃取时间为15min。萃取液液在氮气流下缓慢吹干，加入1ml乙腈/水(v/v)＝1∶1，漩涡混合后，待测。

利用液相色谱-串联质谱联用测定上述待测样品的雌激素及壬基酚、辛基酚、双酚A浓度。液相色谱-串联质谱联用选择的条件：3200QTRAP型液相色谱-串联质谱仪，配有电喷雾离子化源(ESI)以及Analyst 1.4.1数据处理软件，美国Applied Biosystem公司；Agilent 1100高效液相色谱系统，包括四元输液泵，自动进样器，美国Agilent公司。色谱柱：Nova-Pak C18(3.9mm×150mm×4μm)，Waters公司。离子源：电喷雾离子化源(ESI)，负离子方式检测；离子喷射电压：-4500V；温度：450℃；源内气体1(GS1，N₂)压力：45psi；气体2(GS2，N₂)压力：45psi；气帘气体(N₂)压力：20psi；扫描方式为多重反应监测(MRM)；碰撞气(N₂)压力：Medium。采用甲醇和氨水(pH＝10)为流动相，梯度洗脱条件详见表1。计算结果如表3所示。

表3实际河流沉积物中雌激素及壬基酚、辛基酚、双酚A的含量(ng/g)

注：n.d.表示未检出。