法律状态公告日
法律状态信息
法律状态
2019-05-31
未缴年费专利权终止 IPC(主分类):C12N15/53 授权公告日:20140319 终止日期:20180618 申请日:20010618
专利权的终止
2014-03-19
授权
授权
2011-11-16
实质审查的生效 IPC(主分类):C12N15/53 申请日:20010618
实质审查的生效
2011-09-07
公开
公开
本申请是申请日为2001年6月18日、申请号为200610082474.0、发明名称为“改变植物形态学、生物化学和生理学的方法”的发明专利申请的分案申请。
发明领域
本发明一般涉及改变植物形态学、生物化学和生理学性质或特征的方法，例如一种或多种发育过程和/或环境适应过程，包括而不限于改变起始或刺激或增强根的生长、和/或不定根形成、和/或侧根形成、和/或根的向地性、和/或枝条生长、和/或顶端优势、和/或分枝、和/或衰老时间、和/或开花时间、和/或花朵形成、和/或种子发育、和/或种子产量，所述方法包含在植物中，在可调节的启动子序列(例如细胞特异性启动子、组织特异性启动子或器官特异性启动子序列)控制之下表达细胞分裂素降解控制蛋白质，特别是细胞分裂素氧化酶。本发明所改变的特征优选为细胞分裂素介导和/或生长素介导的特征。本发明延伸到用于施行本发明方法的遗传构建体，以及随之产生的转基因植物，与同基因相应物相比，该植物具有改变的形态学和/或生物化学和/或生理学性质。
发明背景
根是高等植物的重要器官。其主要功能是将植物固定在土壤中，并摄取水分和养分(N-营养、矿物质等)。因此，根的生长对地面上器官的生长和产量具有直接或间接的影响，特别是在养分受限的条件下。根也与产生植物次生产物有关，例如防御化合物和植物激素。
在许多重要作物中，根也是储存器官。在欧洲，糖用甜菜是最重要的产糖植物(2亿6千万吨/年；占世界产量的38％)。树薯(木薯)、薯蓣和甘薯(batate)是重要的淀粉生产者(每种大约1亿5千万吨/年)。其淀粉含量可高达马铃薯的两倍。在许多植物(例如胡萝卜、萝卜)、草本植物(例如姜、kukuma)和药用植物(例如人参)中，根也是用于消耗的器官。此外，在根中发现的一些次生植物产物具有化学和制药工业的经济价值。例如薯蓣，其包含用于合成类固醇激素的基本分子。另一个例子是紫草素，由紫草(Lithospermum erythrorhizon)发根培养的根制备。紫草素用于抗炎症、抗肿瘤以及伤口愈合特性。
此外，改善作物根的生长还会增强与杂草植物的竞争性，并提高水的可及性和摄取而改善在干旱地区的生长。
改善根的生长也与生态目的有关，例如生物除污以及预防/阻止土壤侵蚀。
根的构造是尚有大量利用传统繁殖未探索过的领域，因为难以在田间评价这种性状。由于生物技术不依赖于大规模的田间筛选，因而可对改善该性状具有重要影响。生物技术方法还需要对决定植物具体特征的分子元件的基本了解。如今，这些知识还只是零碎的，因此生物技术至今不能实现在此领域的突破。
完善确定的的根生长的调节剂是植物生长素。对生长的植物施加吲哚-3-乙酸(IAA)可促进侧根发育及侧根伸长(Torrey，Am J Bot 37：257-264，1950；Blakely等人，Bot Gaz 143：341-352，1982；Muday和Haworth，Plant Physiol Biochem 32：193-203，1994)。处于IAA浓度范围下的根开始增加许多侧根(Kerk等人，Plant Physiol，122：925-932，2000)。此外，响应特定浓度的外源植物生长素而生成侧根的根随后置于较高浓度的IAA中，在现有的根之间形成许多额外的侧根(Kerk等人，Plant Physiol，122：925-932，2000)。相反，在包含植物生长素转运抑制剂(包括NPA)的琼脂上生长的根的侧根数目下降(Muday和Haworth，Plant Physiol Biochem 32：193-203，1994)。
已经分离了包含内源性IAA水平升高的鼠耳芥属(Arabidopsis)突变体(Boerjan等人，Plant Cell 7：1405-141，1995；Celenza等人，Gene Dev 9：2131-2142，1995；King等人，Plant Cell 7：2023-2037，1995；Lehman等人，Cell 85：183-194，1996)。目前已知它们是位于染色体2上单座位的等位基因。这些突变体的幼苗具有过量的不定根和侧根，与上述施加外源植物生长素的效果相一致。
植物生长素对形成不定根和侧根的刺激效应提示在转基因植物中过量产生植物生长素是促进生根的有效策略。然而，这样是否会产生具有改善特性的商用产品尚有疑问。除了对形成不定根和侧根的刺激效应以外，植物生长素的过量生成引发其它效应，例如叶子数目减少、叶子形态异常(狭窄、卷曲的叶子)、花序发育不全、顶端优势增强、茎上形成不定根，从农学观点来看，其中大部分不合需要(Klee等人，Genes Devel 1：86-96，1987；Kares等人，Plant Mol Biol 15：225-236，1990)。因此，有赖提高植物生长素合成的方法的主要问题在于容留问题，即将植物生长素的效应局限于根。不可能利用组织特异性启动子克服这种容留问题：植物生长素在植物中转运，因而其作用不局限于合成位点。另一问题在于，植物生长素是否总是提高根的总生物量。对于琼脂中生长的植物，已经注意到逐步提高浓度刺激侧根形成，但同时抑制这些根的长出(Kerk等人，Plant Physiol，122：925-932，2000)。通过本专利权利要求的实施方案，可解决上述有关容留植物生长素效应以及维持根的长出的问题。
发明概述
本发明涉及遗传构建体，其包含编码鼠耳芥(Arbidopsis thaliana)的具有细胞分裂素氧化酶活性的蛋白质的基因。该基因在调节启动子的控制下表达。该启动子可由内源性组织特异性或环境特异性因子调节，或者另外地，可应用特定的化学制剂进行诱导。
本发明还涉及包含该遗传构建体的细胞或者植物。
本发明还涉及在根或根的某些组织或细胞类型特异性的启动子控制下表达细胞分裂素氧化酶基因来改变根的构造以及生物量的方法。
发明详述
为了绕过上述关于提高植物生长素生物合成的问题，决定遵循另一方法。我们推论，与提高植物生长素水平相比，下调植物生长素的生物拮抗剂可能对根的生长引起类似以至更大的影响。激素的作用以及相互作用极其复杂，但我们假定细胞分裂素能够对根的生长起到植物生长素拮抗剂的作用。植物组织培养的激素研究已经显示，植物生长素与细胞分裂素的比值比其中每种激素的绝对水平对于器官发生更为重要，这实际上表明这些激素起拮抗剂作用，至少在某些生物进程中如此。此外，外源施用细胞分裂素抑制侧根形成。有趣的是，细胞分裂素处理对根的伸长还有负面影响，这提示细胞分裂素控制根的分支以及根的长出。
总之，目前的文献资料表明，提高细胞分裂素的水平负面影响根的生长，但对该过程的机制并不了解。植物中细胞分裂素合成的位置处于根尖以及枝条的幼稚组织。细胞分裂素的内生浓度在nM范围内。然而，由于难于量化，需要提取的相当大的组织数量，以及并不知道实际的局部浓度。也不知道细胞分裂素的亚细胞区域化。一般认为自由的碱基和核糖核苷定位于细胞质和细胞核，而糖苷定位于液泡。还存在化学结构略微差异的不同细胞分裂素。因此，不知道外源细胞分裂素的效应是否应归于细胞分裂素的总浓度的提高，还是更应归于其它形式的植物产生的细胞分裂素(结构、细胞或亚细胞定位不同)竞争受体、转位分子、运输器、修饰酶......
为了检验根中细胞分裂素水平实际上超出最适于根生长水平的假设，从鼠耳芥中克隆了编码细胞分裂素氧化酶(即细胞分裂素代谢酶)的新基因(记为AtCKX)，然后在强的组成型启动子下于转基因烟草和鼠耳芥属中表达。显示AtCKX mRNA表达以及细胞分裂素氧化酶活性提高的转化子还显示根的形成和生长增强。也观察到对枝条生长的负效应。后者与这些植物中细胞分裂素氧化酶基因的组成型表达一致，说明细胞分裂素氧化酶基因的局限性表达对一般植物生长特性的重要性。利用细胞-、组织-或器官-特异性启动子能够实现细胞分裂素氧化酶活性的保留，因为如以上解释，细胞分裂素的降解过程限于表达CKX蛋白质的组织或细胞，这与依赖激素合成的过程不同。
观察到的细胞分裂素氧化酶表达对枝条生长的负效应表明细胞分裂素氧化酶是设计或筛选生长促进化学剂的令人关注的靶标。这种化学剂应抑制细胞分裂素氧化酶活性，最好不被转运到根，并应在土壤中快速降解，以便施用这些化学剂不会抑制根的生长。细胞分裂素还延迟叶的衰老，这意味着正效应包括光合组织的生长和维持。另外，细胞分裂素延迟衰老、增强叶子的绿化(叶绿素含量)并减弱枝条的顶端优势的结果表明基于抑制植物地上部分中CKX活性的策略(例如反义、核糖酶以及共抑制技术)能够导致延迟衰老、增强叶子绿化并增加分枝。
类似地，观察到的细胞分裂素氧化酶表达对根生长的正效应表明细胞分裂素氧化酶是设计或筛选除草剂的令人关注的靶标。这种除草剂应抑制细胞分裂素氧化酶活性，最好不被转运到枝条，以及应在能穿过土壤给予根的溶剂中可溶并相对稳定。
细胞分裂素氧化酶过量表达对植物发育和构造的这些效应迄今未知，因而本发明及其实施方案是意想不到的。
观察到的对枝条生长的负效应表明操纵细胞分裂素氧化酶还可用于获得矮化表型。矮化表型对经济作物例如谷类和果木特别有用。
本发明的优选实施方案涉及细胞分裂素氧化酶表达对植物生长和构造(特别是根的生长和构造)的正效应。鼠耳芥属中细胞分裂素氧化酶基因家族包含至少六个成员(见如下实施例)，本发明人已经表明，其中一些基因在转基因植物中实现的效应存在量的差异。鉴于有证据表明许多绿色植物(Hare和van Staden，Physiol Plant 91：128-136，1994；Jones和Schreiber，Plant Growth Reg 23：123-134，1997)以及其它生物(Armstrong，in Cytokinins：Chemistry，Activity and Function.Eds Mok and Mok，CRC Press，ppl39-154，1994)中存在细胞分裂素氧化酶活性，可以预料，能够从其它生物中分离所述鼠耳芥属细胞分裂素氧化酶的功能性同系物。因此，在本发明中发挥功能的细胞分裂素氧化酶的序列不必与此处所述相同。通常本发明可特别用于谷类作物和单子叶作物，也可以利用来自诸如小麦或玉米的细胞分裂素氧化酶基因(Morris等人，1999；Rinaldi和Comandini，1999)。可以想到具有细胞分裂素氧化酶活性或者任何其它细胞分裂素代谢活性的其它基因(参见等人，Biochemistry and Molecular Biology of Plant Hormones，Hooykaas，Hall and Libbenga(Eds.)，Elsevier Science，pp141-160，1997)也可以用于本发明目的。类似地，编码可增加内源性细胞分裂素代谢活性的蛋白质的基因也可以用于本发明目的。原则上，还可以通过干扰在细胞分裂素下游行使功能的基因(例如参与细胞分裂素信号转导途径的受体或者蛋白质)来获得类似表型。
为了本发明目的，应当理解术语″根的生长″包含单子叶和双子叶植物中组成根系的不同部分在其不同发育阶段中生长的所有方面。应当理解，增强根的生长能够起因于增强其一个或多个部分的生长，包括初生根、侧根、不定根等，其均属于本发明范围之内。
根据第一个实施方案，本发明涉及刺激根生长和/或增强侧根和/或不定根形成和/或改变根的向地性的方法，其包含在植物或植物部分中表达植物细胞分裂素氧化酶或者表达可降低活性细胞分裂素水平的另一蛋白质。
在本发明上下文中，应当理解术语″表达″和/或″过量表达″可互换使用，两者均涉及″增强和/或异位表达″植物细胞分裂素氧化酶或者可减低植物中活性细胞分裂素水平的其它任何蛋白质。应当清楚，此处意在增强植物细胞分裂素氧化酶表达，以及″从头(de novo)″表达植物细胞分裂素氧化酶或者所述其它蛋白质。另外，所述其它蛋白质增强植物细胞分裂素氧化酶的细胞分裂素代谢活性。
还应理解在本发明上下文中，表述″侧根和/或不定根″意味着″侧根和不定根″，也意味着″侧根或不定根″。可以增强侧根形成或者不定根形成，以及两种类型的非初生根形成，但并不一定。
根据另外的实施方案，本发明涉及刺激根生长和/或增强侧根或不定根形成和/或改变根的向地性和/或增加产量和/或增强早期活力和/或改变根/枝比率和/或提高倒伏抗性和/或增加耐旱性和/或促进外植体体外繁殖的方法，其包含在植物或植物部分中表达植物细胞分裂素氧化酶或者表达可降低活性细胞分裂素水平的另一蛋白质。
根据优选实施方案，本发明涉及通过在植物或植物部分(优选根部)过量表达细胞分裂素氧化酶(优选本发明的细胞分裂素氧化酶)或者可降低活性细胞分裂素水平的另一蛋白质来刺激根生长使根块(root mass)增大的方法。
由过量表达促生长序列而提高根部生物量产生对产量具有直接效应，对根细胞或转基因根细胞或所述转基因根细胞的细胞培养物所生成化合物的产生具有间接效应。根培养物中生成的一个引人关注的化合物的例子是紫草素，能够利用所述方法方便地增加其产量。
根据更具体的实施方案，本发明涉及刺激根生长或增强侧根和不定根形成或改变根的向地性的方法，其包含表达编码植物细胞分裂素氧化酶的核酸，其选自：
(a)包含任何SEQ ID NO 27、1、3、5、7、9、11、25、26、28-31、33或34，或其互补序列所示的DNA序列的核酸，
(b)包含对应于任何SEQ ID NO 27、1、3、5、7、9、11、25、26、28-31，33或34，或其互补序列的RNA序列的核酸，
(c)与任何SEQ ID NO 27、1、3、5、7、9、11、25、26、28-31、33或34，或其互补序列特异性杂交的核酸，
(d)编码包含任何SEQ ID NO 2、4、6、8、10、12、32或35，或其互补序列所示的氨基酸序列的蛋白质的核酸，
(e)任何(a)-(d)定义的核酸，其特征在于所述核酸是DNA、基因组DNA、cDNA、合成DNA或RNA(其中T替换为U)，
(f)通过遗传密码可简并为任何SEQ ID NO 27、1、3、5、7、9、11、25、26、28-31、33或34中所示的核酸的核酸，或者简并为任何(a)-(e)中定义的核酸的核酸，
(g)由于生物之间密码子使用的差异，不同于编码任何SEQ ID NO 2、4、6、8、10、12、32或35中所示的蛋白质的核酸的核酸，或者不同于任何(a)-(e)中定义的核酸的核酸，
(h)编码SEQ ID NO 2、4、6、8、10、12或35中所示蛋白质的核酸，或者(a)-(e)中定义的核酸，其由于等位基因之间的差异而不同，
(i)编码任何SEQ ID NO 2、4、6、8、10、12或35中所示的蛋白质的核酸，
(j)任何(a)-(i)中定义的核酸的、具有细胞分裂素氧化酶生物活性的功能性片段，以及
(k)编码植物细胞分裂素氧化酶的核酸，
或者包含在植物或植物部分中表达编码(优选在根中)可降低活性细胞分裂素水平的蛋白质的核酸。
本发明中，已经分离了编码新的鼠耳芥细胞分裂素氧化酶的核酸，本发明人首次另人惊奇地表明，细胞分裂素氧化酶在转基因植物或转基因植物部分中的表达引起上述根相关性特征。细胞分裂素氧化酶的表达优选于根中进行，优选位于根特异性启动子的控制之下。SEQ ID NO 36提供了这种根特异性启动子的一个例子。
应当清楚，虽然本发明在实施例部分通过几种新的AtCKX基因和蛋白质得到支持，本发明构思还涉及利用从其它植物中(优选在所述其它植物的根中)分离并表达的其它细胞分裂素氧化酶，以在植物中获得与实施例部分所述类似的效应。
因此，本发明更一般涉及利用编码植物细胞分裂素氧化酶的核酸或者编码可降低活性细胞分裂素水平的蛋白质的核酸在植物或植物部分中来刺激根的生长或增强侧根或不定根形成或改变根的向地性。优选使用的细胞分裂素氧化酶由以上定义的编码细胞分裂素氧化酶的核酸编码，以及由以下定义的本发明的新核酸编码。
本发明涉及分离的编码具有细胞分裂素氧化酶活性的新植物蛋白质的核酸，其选自：
(a)包含任何SEQ ID NO 29、3、5、9、26、27、31、33或34、或其互补序列所示的DNA序列的核酸，
(b)包含对应于任何SEQ ID NO 29、3、5、9、26、27、31、33或34、或其互补序列的RNA序列的核酸，
(c)与任何SEQ ID NO 29、3、5、9、26、27、31、33或34，或其互补序列所示的核酸特异性杂交的核酸，
(d)编码编码具有包含SEQ ID NO 32所示的多肽的氨基酸序列、并且与SEQ ID NO 4所示的氨基酸序列至少70％、优选至少75％、80％或85％、更优选至少90％或95％、最优选至少99％相似性的蛋白质的核酸，
(e)编码具有与SEQ ID NO 6所示的氨基酸序列至少35％、优选37％、40％、45％、47％或50％、更优选55％、60％、65％、70％、75％或80％、最优选85％、90％或95％相似性的氨基酸序列的蛋白质的核酸，
(f)编码具有与SEQ ID NO 10或35所示的氨基酸序列至少35％、优选37％、40％、45％、47％或50％、更优选55％、60％、65％、70％、75％或80％、最优选85％、90％或95％相似性的氨基酸序列的蛋白质的核酸，
(g)编码包含任何SEQ ID NO 4、6、10、32或35中所示的氨基酸序列的蛋白质的核酸，
(h)通过遗传密码可简并为任何SEQ ID NO 29、3、5、9、26、27、33或34中所示核酸的核酸，或者简并为任何(a)-(g)中定义的核酸的核酸，
(i)由于生物之间密码子使用的差异，不同于编码任何SEQ ID NO4、6、10或35中所示蛋白质的核酸的核酸，或者不同于任何(a)-(g)中定义的核酸的核酸，
(j)编码SEQ ID NO 4、6、10或35中所示的蛋白质的核酸，或者(a)-(g)中定义的核酸，其由于等位基因之间的差异而不同，
(k)编码任何SEQ ID NO 29、3、5、9、26、27、31、33或34中所示的核酸编码的细胞分裂素氧化酶的免疫活性片段的核酸，或者任何(a)-(j)中定义的核酸的免疫活性片段的编码核酸，
(l)编码任何SEQ ID NO 29、3、5、9、26、27、31、33或34中所示核酸编码的细胞分裂素氧化酶的功能性片段的核酸，或者任何(a)-(j)中定义的核酸的功能性片段的编码核酸，其中所述片段具有细胞分裂素氧化酶的生物活性，以及
(m)编码SEQ ID NO 4、6、10或35中定义的蛋白质的核酸，
只要所述核酸不是按下列Genbank登录号保藏的核酸：AC005917、AB024035和AC023754
本发明还涉及本发明分离的核酸，它们是DNA、cDNA、基因组DNA或合成的DNA、或RNA(其中T替换为U)。
本发明还涉及与本发明的核酸特异性杂交或特异性扩增的至少15个核苷酸长度的核酸分子。
根据另一实施方案，本发明还涉及包含本发明核酸的载体。在优选实施方案中，所述载体是表达载体，其中该核酸与使该序列在原核和/或真核宿主细胞中表达的一种或多种控制序列有效连接。
应当理解，为了在单子叶植物中表达本发明的细胞分裂素氧化酶基因，应该使用对应于cDNA序列的核酸序列以避免单子叶植物中内含子的错误剪接。在单子叶植物中表达的优选cDNA序列具有SEQ ID NO25-30和34所示的核酸序列。
本发明还涉及包含本发明的任何核酸分子或载体的宿主细胞。所述宿主细胞选自细菌、昆虫、真菌、植物或动物细胞。
本发明的另一实施方案涉及由本发明核酸编码的分离的多肽、或其同系物或衍生物、或其免疫活性或功能性片段。本发明优选的多肽包含任何SEQ ID NO 2、4、6、8、10、12、32和35所示氨基酸序列、或其同系物或衍生物、或其免疫活性和/或功能性片段。在另一更优选实施方案中，本发明涉及具有SEQ ID NO 2、4、6、8、10、12或35所示的氨基酸序列的多肽、或其同系物或衍生物、或其免疫活性和/或功能性片段。其优选的功能性片段是缺乏其信号肽的片段。
根据另一实施方案，本发明涉及产生本发明多肽的方法，其包含在使该多肽表达的条件下培养本发明的宿主细胞，并从培养物中回收生成的多肽。
本发明还涉及特异性识别本发明多肽或其特异性表位的抗体。
本发明进一步涉及产生转基因植物、植物细胞或植物组织的方法，其包含在所述植物、植物细胞或植物组织中引入可表达形式的本发明的核酸分子或者本发明的载体。
本发明还涉及产生改变的植物、植物细胞或植物组织的方法，其包含将本发明的多肽直接引入所述植物的细胞、组织或器官中。
根据另一实施方案，本发明涉及实现本发明多肽表达的方法，其包含在植物细胞的基因组中稳定引入与一个或多个控制序列有效连接的本发明的核酸分子或者本发明的载体。本发明进一步涉及上述方法，其另外包含由所述植物细胞再生为植物。本发明还涉及包含本发明核酸序列的转基因植物细胞，该序列与使其在植物细胞中转录和/或表达的调控成分有效联接，或可利用以上阐述的方法获得。
根据另一优选实施方案，本发明涉及此处上述的转基因植物细胞，其中本发明的核酸稳定整合到该植物细胞的基因组中。
本发明另外涉及包含此处所述植物细胞的转基因植物或植物组织，也涉及所述转基因植物可收获的部分，优选地选自种子、叶子、果实、茎培养物、根、块茎、根茎和鳞茎。本发明还涉及来源于任何所述转基因植物或植物部分的后代。
根据另一实施方案，本发明涉及刺激根生长的方法，其包含在植物或植物部分中表达本发明的核酸或者表达可降低活性细胞分裂素水平的另一蛋白质。
植物细胞或组织培养即人工产生的植物细胞或植物组织培养物，其在特定的培养基(液体或固体)中生长，以提供这些植物细胞或组织生长和/或产生某些化合物所必需的各种条件。植物细胞和/或组织培养能用于快速繁殖植物以及产生转基因植物，仅举几个例子。某些外植体或者在所述的某些培养条件下难以形成根，在所述培养的植物细胞或组织中表达细胞分裂素氧化酶基因能够用于增强根形成。植物细胞和/或组织培养还能用于工业生产有价值的化合物。可能生产的化合物有药物、杀虫剂、颜料、化妆品、香料、食品添加剂等。该产品的一个例子是紫草素，由植物紫草(Lithospermum erythrorhizon)的根产生。植物组织培养的例子有毛根培养物，其是人工制备的毛根块。紫草的根难以大量收集，通过制备毛根培养物，能够比常规速度更快地工业上制备终产品紫草素。如此处所公开，表达细胞分裂素氧化酶增强了根的生长和发育，因此能够方便地用于所述植物细胞以及组织培养过程中。因此，本发明的另一实施方案提供了刺激根的生长和发育的方法，其包含在转基因植物细胞或包含该转基因植物细胞的组织培养中表达植物细胞分裂素氧化酶、优选本发明的细胞分裂素氧化酶的编码核酸。
本发明另外涉及增强侧根或不定根形成的方法，其包含在植物或植物部分中表达本发明的核酸或者表达可降低活性细胞分裂素水平的另一蛋白质。
本发明还涉及改变根向地性的方法，其包含在植物或植物部分中改变本发明核酸的表达或者表达可降低活性细胞分裂素水平的另一蛋白质。
本发明还涉及增强早期活力和/或改变根/枝条比率和/或提高倒伏抗性和/或增加耐旱性和/或促进外植体体外繁殖的方法，其包含在植物或植物部分中表达本发明的核酸或者表达可降低活性细胞分裂素水平的另一蛋白质。
本发明进一步涉及增加根的大小或者根分生组织大小的方法，其包含在植物或植物部分、优选根中表达本发明的核酸或者表达可降低活性细胞分裂素水平的另一蛋白质。
根据另一实施方案，本发明涉及增加枝条分生组织大小的方法，其包含优选在枝条中下调本发明核酸的表达。
根据优选的实施方案，本发明涉及延迟叶片老化的方法，其包含在叶片中、优选开始老化的叶片中下调本发明的任何细胞分裂素氧化酶的表达。本发明还涉及改变叶片老化的方法，其包含在开始老化的叶片中表达一种细胞分裂素氧化酶。
本发明还涉及增加叶片厚度的方法，其包含在植物或植物部分、优选叶片中表达本发明的核酸或者表达可降低活性细胞分裂素水平的另一蛋白质。
本发明还涉及降低导管大小的方法，其包含在植物或植物部分、优选导管中表达本发明的核酸或者表达可降低活性细胞分裂素水平的另一蛋白质。
本发明另外涉及增加导管大小的方法，其包含下调本发明核酸在植物或植物部分中的表达。
根据另一实施方案，本发明涉及提高幼苗直立性(standability)的方法，其包含表达本发明的核酸，或者包含表达可降低幼苗中活性细胞分裂素水平的另一蛋白质。
此外，本发明涉及上述任何方法，所述方法导致产量增加。
本发明另外涉及本发明的任何方法，其中所述核酸的表达处于强的组成型启动子控制之下。在优选的实施方案中，本发明涉及本发明的任何方法，其中所述核酸的表达处于优选在根中表达的启动子控制之下。表5包括了根特异性启动子的不完全清单。用于本发明方法的优选启动子为根clavata同源性(root clavata homolog)启动子，具有SEQ ID NO 36所示的序列。
根据另一实施方案，本发明涉及改变细胞命运和/或改变植物发育和/或改变植物形态学和/或改变植物生物化学和/或改变植物生理学和/或改变细胞周期前进速度的方法，其包含改变本发明核酸在植物特定的细胞、组织或器官中的表达。
本发明还涉及获得增强生长、和/或提高产量和/或改变植物细胞、组织和/或器官老化、和/或增加植物侧生器官形成频率的方法，其包含异位表达本发明的核酸。
本发明还涉及在不利的生长条件和/或压力下促进和延长细胞中细胞分裂活性的方法，其包含异位表达本发明的核酸序列。
根据另一实施方案，本发明涉及识别并获得与本发明多肽相互作用的蛋白质的方法，其包含利用本发明多肽的筛选试验。
在更优选实施方案中，本发明涉及识别并获得与本发明多肽相互作用的蛋白质的方法，其包含双杂交筛选试验，其中利用本发明多肽为诱饵(bait)及cDNA文库为捕获物(prey)。
本发明进一步涉及调节本发明多肽与通过上述方法获得的互相作用蛋白质之间相互作用的方法。
在另外的实施方案中，本发明涉及识别并获得与本发明多肽相互作用的化合物的方法，其包含步骤：
a)提供双杂交系统，其中本发明多肽以及通过上述方法获得的互相作用蛋白质，
b)所述化合物与a)中定义的表达的多肽形成的复合物相互作用，以及，
c)对所述化合物与所述多肽或a)中定义的表达多肽形成的复合物的相互作用进行(实时)测量。
本发明进一步涉及识别与本发明多肽特异性结合的化合物、或化合物的混合物的方法，包含：
a)在适于复合物形成的条件下，将本发明多肽与所述化合物或化合物的混合物结合，以及，
b)检测复合物形成，其中复合物存在可识别特异性结合所述多肽的化合物或混合物。
本发明还涉及上述方法，其中所述化合物或混合物抑制本发明所述多肽的活性，并能用于合理设计化学剂。
根据另一实施方案，本发明涉及上述方法识别的化合物或混合物作为植物生长调节剂或除草剂的用途。
本发明还涉及植物生长调节剂或除草剂组合物的生产方法，其包含上述化合物筛选法步骤，以及将该步骤获得的化合物配制成适当形式以应用到农业或植物细胞或组织培养中。
本发明还涉及增加分枝的方法，其包含在植物或植物部分中、优选茎或腋芽中表达本发明的核酸。
本发明还涉及提高倒伏抗性的方法，其包含在植物或植物部分中、优选茎或腋芽中表达本发明的核酸。
本发明还涉及设计或筛选促生长的化学剂或除草剂的方法，其包含利用本发明的核酸或本发明的载体。
根据另一实施方案，本发明涉及将本发明的核酸分子、本发明的载体、或本发明的多肽用于提高产量。
本发明还涉及将本发明的核酸分子、本发明的载体、或本发明的多肽用于刺激根生长。
本发明还涉及将本发明的核酸分子、本发明的载体、或本发明的多肽用于增强侧根或不定根形成。
本发明还涉及将本发明的核酸分子、本发明的载体、或本发明的多肽用于改变根的向地性。
本发明另外涉及将本发明的核酸分子、本发明的载体、或本发明的多肽用于增强早期活力和/或改变根/枝条比率和/或提高倒伏抗性和/或增强耐旱性和/或促进外植体的体外繁殖。
本发明还涉及将本发明的核酸分子本发明的重组载体或本发明的多肽用于改变植物发育和/或改变植物形态学和/或改变植物生物化学和/或改变植物生理学。
根据另一实施方案，本发明涉及诊断组合物，其至少包含本发明的核酸分子、本发明的载体、本发明的多肽或本发明的抗体。
本发明另一实施方案涉及在与接穗嫁接过程中利用转基因根状茎(其根的生长和发育由于表达细胞分裂素氧化酶而增强)来产生农业或园艺特性得到改善的植物或树。接穗可能是转基因或非转基因的。此实施方案的具体特征是由根系赋予的特定性状，包括增强植物/树木在土壤中的固定和/或提高水的摄取而导致例如耐旱性增强、和/或提高从土壤中摄取养分和/或增强植物的有机物转运、和/或增加物质分泌到土壤中(例如植物含铁细胞)、和/或改善呼吸作用和/或提高抗病性和/或增加产量。利用AtCKX转化的根状茎进行嫁接的好处，除增强根系之外，还如此处所公开，在于延迟接枝上叶片的老化(参见图12A)。此特定实施方案优选的植物或树木包括利用自身根生长不良、且嫁接栽培的植物或树木，例如具有商业利益的各种葡萄、柑橘、杏、扁桃、李子、桃、苹果、梨、樱桃、胡桃、无花果、榛子和枇杷。
如上所述，在某些生物过程中植物生长素和细胞分裂素作为拮抗剂。例如，细胞分裂素/植物生长素的比率调节根和枝条的产生，高浓度的植物生长素引起生根，高浓度的细胞分裂素引起枝条生长。如本发明所公开，在烟草和鼠耳芥属中表达细胞分裂素氧化酶引起根的发育增强，与植物生长素效应增强相一致。果实发育中也涉及植物生长素。植物生长素处理雌花部导致某些植物品种发育单性果实。通过增强雌性生殖器官中植物生长素的生物合成，几种园艺作物植物已经遗传工程改造为单性果实发育(WO0105985)。因此，根据另一实施方案，本发明涉及诱导植物单性性状的方法，该方法包含在植物或植物部分中、优选在雌性生殖器官例如胎座、胚珠及其衍生组织中下调一种或多种细胞分裂素氧化酶、或者可降低活性细胞分裂素水平的另一蛋白质的表达。金鱼草(Antirrhinum majus)DefH9启动子区或其同系物之一(其在胎座和胚珠提供特异性高效表达)能够用于此目的。
定义及实施方案详述
本领域技术人员应当明白，除明确描述以外，此处所述本发明可能变更和修改。应当理解此处所述本发明包括所有这些变更和修改。本发明还包括本说明书中涉及或表明的所有这类步骤、特征、组合物和化合物，单个或全体，以及任一或更多所述步骤或特征的任意或所有组合。本发明适用于任何植物，特别是单子叶植物和双子叶植物，包括饲料或豆科饲料、观赏植物、粮食作物、树木、或灌木，选自：金合欢属(Acacia spp.)，槭树属(Acer spp.)，猕猴桃属(Actinidia spp.)，七叶树属(Aesculus spp.)，新西兰贝壳杉(Agathis australis)，Albizia amara，Alsophila tricolor，须芒草属(Andropogon spp.)，落花生属(Arachis spp.)，槟榔(Areca catechu)，Astelia fragrans，Astragalus cider，Baikiaea plurijuga，桦木属(Betula spp.)，芸苔属(Brassica spp.)，木榄(Bruguiera gymnorrhiza)，Burkea africana，紫铆(Butea frondosa)，Cadaba farinosa，朱缨花属(Calliandra spp，)，大叶茶(Camellia sinensis)，美人蕉(Canna indica)，辣椒属(Capsicum spp.)，决明属(Cassia spp.)，Centroema pubescens，木瓜属(Chaenomeles spp.)，肉桂(Cinnamomum cassia)，小果咖啡(Coffea arabica)，Colophospermum mopane，变异小冠花(Coronillia varia)，Cotoneaster serotina，山楂属(Crataegus spp.)，香瓜属(Cucumis spp.)，柏木属(Cupressus spp.)，Cyathea dealbata，榅桲(Cydonia oblonga)，日本柳杉(Cryptomeria japonica)，香茅属(Cymbopogon spp.)，Cynthea dealbata，榅桲(Cydonia oblonga)，Dalbergia monetaria，大叶骨碎补(Davallia divaricata)，角丝鼓藻属(Desmodium spp.)，粗糙蚌壳蕨(Dicksonia squarosa)，Diheteropogon amplectens，Dioclea spp，镰扁豆属(Dolichos spp.)，Dorycnium rectum，Echinochloa pyramidalis，Ehrartia spp.，子(Eleusine coracana)，Eragrestis spp.，刺桐属(Erythrina spp.)，桉属(Eucalyptus spp.)，Euclea schimperi，Eulaliavillosa，荞麦属(Fagopyrum spp.)，费约果(Feijoa sellowiana)，草莓属(Fragaria spp.)，千斤拔属(Flemingia spp)，Freycinetia banksii，Geranium thunbergii，银杏(Ginkgo biloba)，Glycine javanica，Gliricidia spp，陆地棉(Gossypium hirsutum)，银桦属(Grevillea spp.)，Guibourtia coleosperma，岩黄芪属(Hedysarum spp.)，牛鞭草(Hemarthia altissima)，扭黄茅(Heteropogon contortus)，大麦(Hordeum vulgare)，Hyparrhenia rufa，小连翘(Hypericum erectum)，Hyperthelia dissoluta，Indigo incarnata，鸢尾属(Iris spp.)，Leptarrhena pyrolifolia，胡枝子属(Lespediza spp.)，Lettuca spp.，Leucaena leucocephala，Loudetia simplex，Lotonus bainesii，百脉根属(Lotus spp.)，Macrotyloma axillare，苹果属(Malus spp.)，Manihot esculenta，紫苜蓿(Medicago sativa)，水杉(Metasequoia glyptostroboides)，大蕉(Musa sapientum)，烟草属(Nicotiana spp.)，驴食豆属(Onobrychis spp.)，Ornithopus spp.，稻属(Oryza spp.)，Peltophorum africanum，狼尾草属(Pennisetum spp.)，Persea gratissima，碧冬茄属(Petunia spp.)，菜豆属(Phaseolus spp.)，槟榔竹(Phoenix canariensis)，Phormium cookianum，石楠属(Photinia spp.)，白云杉(Picea glauca)，松属(Pinus spp.)，豌豆(Pisum sativum)，新西兰罗汉松(Podocarpus totara)，Pogonarthria fleckii，Pogonarthria squarrosa，杨属(Populus spp.)，牧豆树(Prosopis cineraria)，花旗松(Pseudotsuga menziesii)，Pterolobium stellatum，西洋梨(Pyrus communis)，栎属(Quercus spp.)，Rhaphiolepsis umbellata，美味棒花棕(Rhopalostylis sapida)，Rhus natalensis，欧洲醋栗(Ribes grossularia)，茶藨子属(Ribes spp.)，洋槐(Robinia pseudoacacia)，蔷薇属(Rosa spp.)，悬钩子属(Rubus spp.)，柳属(Salix spp.)，Schyzachyrium sanguineum，金松(Sciadopitys verticillata)，北美红杉(Sequoia sempervirens)，巨杉(Sequoiadendron giganteum)，两色蜀黍(Sorghum bicolor)，菠菜属(Spinacia spp.)，Sporobolus fimbriatus，Stiburus alopecuroides，Stylosanthos humilis，葫芦茶属(Tadehagi spp)，落羽杉(Taxodium distichum)，阿拉伯黄背草(Themeda triandra)，车轴草属(Trifolium spp.)，小麦属(Triticum spp.)，异叶铁杉(Tsuga heterophylla)，越桔属(Vaccinium spp.)，野豌豆属(Vicia spp.)，葡萄(Vitis vinifera)，锥穗沃森花(Watsonia pyramidata)，马蹄莲(Zantedeschia aethiopica)，玉蜀黍(Zea mays)，苋属(amaranth)，朝鲜蓟、芦笋、茎椰菜、抱子甘蓝、甘蓝、油菜、胡萝卜、花椰菜、芹菜、羽衣甘蓝、绿叶菜、亚麻、散叶甘蓝、小扁豆、含油种子油菜、秋葵、洋葱、马铃薯、稻、大豆、稻草、糖用甜菜、糖甘蔗、向日葵、番茄、南瓜和茶等，或上述任何特定名称植物的种子，或任何上述物种的组织、细胞或器官培养物。
贯穿本说明书，除非上下文需要，否则单词″包含″应当理解为表示包含所述整体或步骤、或整体或步骤群，而不排除任何其它的整体或步骤、或整体或步骤群。
此处所用术语″来源于″应当用来表明来源于指定种类的特定整体或整体群，但并不一定直接从该指定来源获得。
此处所用术语″蛋白质″、″肽″或″寡肽″是指任意长度的多聚体形式的氨基酸。所述术语还包括已知的氨基酸修饰，例如二硫键形成、半胱氨酰化、氧化、谷胱甘肽酰化、甲基化、乙酰化、法尼基化、生物素化、硬脂酰化、甲酰化、硫辛酸加成、磷酸化、硫酸化、泛素化、肉豆蔻酰化、棕榈酰化、香叶基香叶基化(geranylgeranylation)、环化(例如形成焦谷氨酸)、氧化、脱酰胺化、脱水化、糖基化(例如戊糖、氨基己醣、N-乙酰氨基己醣、脱氧己糖、己糖、唾液酸等.)和酰基化，以及非天然存在的氨基酸残基，L-氨基酸残基和D-氨基酸残基。
本发明蛋白质的″同系物″是肽、寡肽、多肽、蛋白质和酶，就其是同系物而言，其包含相对于所述蛋白质的氨基酸替换、缺失和/或添加，而不改变其一种或多种功能特性，特别是不降低其产物的活性。例如，所述蛋白质的同系物会包含所述蛋白质的生物活性的氨基酸序列变体。所述蛋白质中的氨基酸能够替换为其它具有类似特性(例如疏水性、亲水性、疏水性矩(hydrophobic moment)、抗原性、倾向性形成或破坏α-螺旋结构或β-片层结构等)的氨基酸，以产生上述同系物。表1给出氨基酸的物理和化学性质概述。本发明蛋白质的替换变体为其中所述蛋白质氨基酸序列中至少一个残基已经去除，并在其位置插入一个不同的残基。氨基酸替换一般为单个残基，但可能取决于该多肽处的功能限制而成簇；插入通常为大约1-10个氨基酸残基数目，而缺失介于大约1-20个残基。优选地，氨基酸替换将包含保守氨基酸的替换，例如上文所述。
表1.天然存在的氨基酸的特性
本发明蛋白质插入的氨基酸序列变体为其中在所述蛋白质的预定位点引入一个或多个氨基酸残基。插入可包含氨基端和/或羧基端融合，以及单个或多个氨基酸的内部序列插入。氨基酸序列内部插入通常小于氨基端或羧基端融合，其数目大约为1-10个残基。氨基端或羧基端融合蛋白质或肽的例子包括双杂交系统、噬菌体外壳蛋白、(组氨酸)6-标签、谷胱甘肽S-转移酶、蛋白质A、麦芽糖-结合蛋白质、二氢叶酸还原酶、Tag 100表位(EETARFQPGYRS)、c-myc表位(EQKLISEEDL)、-表位(DYKDDDK)、lacZ、CMP(钙调蛋白-结合肽)、HA表位(YPYDVPDYA)、蛋白质C表位(EDQVDPRLIDGK)以及VSV表位(YTDIEMNRLGK)中使用的转录活化子的结合结构域或活化结构域。
本发明蛋白质的缺失变体特征在于从所述蛋白质的氨基酸序列中去除一个或多个氨基酸。
本发明蛋白质的氨基酸变体可以容易地利用本领域公知的肽合成方法(例如固相肽合成等)、或者通过重组DNA操作进行制造。产生变体蛋白质(表示为替换、插入或缺失变体)的DNA序列操作为本领域所公知。例如，在已知序列DNA的预定位点产生替换突变的方法为本领域技术人员所公知，诸如利用M13诱变、T7-Gen体外诱变试剂盒(USB，Cleveland，OH)、QuickChange Site Directed诱变试剂盒(Stratagene，San Diego，CA)、PCR-介导的定点诱变或者其它定点诱变方法。
在本发明中，利用本领域已知的计算机程序(诸如DNAstar/MegAlign程序)结合Clustal方法，计算DNA序列和/或蛋白质之间的″同一性″和/或″相似性″百分率。本发明蛋白质的″衍生物″为肽、寡肽、多肽、蛋白质以及酶，其包含所述多肽至少大约5个连续的氨基酸残基，但保持所述蛋白质的生物活性。″衍生物″可以进一步包含另外的天然存在的、改变的糖基化、酰化或者与天然存在形式的所述多肽的氨基酸序列相比为非天然存在的氨基酸残基。另外或者再有，与所述多肽的天然存在形式的氨基酸序列相比，衍生物可以包含一个或多个非氨基酸取代，例如报告分子或者其它配基，与氨基酸序列共价或非共价结合，例如其结合一个报告分子以便于检测。
具有″免疫活性″意味着分子或其特定片段(例如特异性表位或半抗原)通过结合抗体而被识别。利用例如Geysen等人(1996)描述的肽扫描技术可确定特异性表位(Geysen，H.M.，Rodda，S.J.和Mason，T.J.(1986).A priori delineation of a peptide which mimics a discontinuous antigenic determinant.Mol.Immunol.23，709-715.)。
术语″序列的片段″或″序列的一部分″意思是所涉及的原始序列的截短序列。截短序列(核酸或蛋白质序列)长度可以变化很大；最小长度序列为足以提供至少与所涉及的原始序列具有类似的功能和/或活性的序列(例如″功能片段″)，而最大长度并不关键。在某些应用中，最大长度通常基本上不大于提供所期望的原始序列的活性和/或功能所需要的长度。典型地，截短的氨基酸序列介于大约5-60个氨基酸长度。然而更典型地，序列最大为大约50个氨基酸长度，优选最大为大约60个氨基酸。通常希望选择至少约10、12或15个氨基酸、直至最大约20或25个氨基酸的序列。
功能片段还可以包括那些包含对本发明蛋白质特异性的表位的片段。优选的功能片段长度至少为，例如5、10、25、100、150或200个氨基酸。
因而应当理解，功能片段也可以是、或者不是免疫活性片段。
在本发明上下文中包含上文明确的细胞分裂素氧化酶的同系物、衍生物、和/或免疫活性和/或功能片段。本发明预期使用的、特别优选的细胞分裂素氧化酶蛋白质的同系物、衍生物和/或免疫活性和/或功能片段来源于植物，更具体而言来源于鼠耳芥，再具体而言，所述细胞分裂素氧化酶是鼠耳芥(At)CKX、或者能够任其中被表达。本发明显然包括AtCKX蛋白质的功能同系物或衍生物和/或免疫活性片段的应用，并不受限于利用编码所述AtCKX蛋白质的核苷酸序列的应用。
可以在生物系统例如细胞培养中产生任何所述蛋白质、多肽、肽及其片段。另外，可以化学方法制备任何所述蛋白质、多肽、肽及其片段，例如通过固相肽合成。所述蛋白质或其片段可以是融合蛋白质的一部分，例如双杂交试验中就是这样，其能够鉴定与本发明细胞分裂素氧化酶相互作用的蛋白质。
该蛋白质或其片段另外用于例如调节本发明细胞分裂素氧化酶与利用本发明方法获得的蛋白质配偶体之间的相互作用。化学合成肽特别用于例如作为抗原来源以生产抗血清和/或抗体。″抗体″包括单克隆、多克隆、合成或重链camel抗体以及抗体片段，例如Fab、Fv或scFv片段。可以利用例如Liddle和Cryer(1991)所述技术制备单克隆抗体，其包含小鼠骨髓瘤细胞与来源于免疫动物的脾细胞融合。此外，可以利用例如Harlow和Lane(1988)所述方法获得分子或其片段的抗体或其片段。至于针对小肽(例如本发明蛋白质的片段)的抗体，通常在免疫动物以前，将该肽与载体蛋白质偶联。这样的蛋白质载体包括匙孔血蓝蛋白(KLH)、牛血清白蛋白(BSA)、卵清蛋白以及破伤风类毒素。载体蛋白质增强动物的免疫反应，并为T细胞受体结合部位提供表位。术语″抗体″进一步包括其衍生物，例如标记的抗体。抗体标记物包括碱性磷酸酶、PKH2、PKH26、PKH67、荧光素(FITC)、Hoechst 33258、R-藻红蛋白(PE)、罗丹明(TRITC)、Quantum Red、Texas Red、Cy3、生物素、琼脂糖、过氧化物酶以及金球(gold spheres)。依赖蛋白质抗体的分子生物学工具包括蛋白质凝胶印迹分析、筛选表达文库进行基因鉴定、蛋白质定量方法(包括ELISA和RIA)、蛋白质的免疫亲和纯化、蛋白质的免测沉淀(例如参见实施例6)以及免疫定位。抗体、特别是肽抗体的其它用途包括研究蛋白水解加工(Loffler等人，1994，Woulfe等人，1994)、确定蛋白质活性部位(Lerner 1982)、研究前体和翻译后加工(Baron和Baltimore 1982，Lerner等人，1981，Semier等人，1982)、鉴定蛋白质-蛋白质相互作用涉及的蛋白质结构域(Murakami等人，1992)以及研究基因表达中外显子的使用(Tamura等人，1991)。
本发明包括特异性识别上文明确的细胞分裂素氧化酶或同系物、衍生物或其片段的抗体。该细胞分裂素氧化酶优选植物细胞分裂素氧化酶，更具体而言，是鼠耳芥细胞分裂素氧化酶(AtCKX)之一。
此处所用术语″基因″、″多核苷酸″、″核酸″、″核酸序列″、″核苷酸序列″或″核酸分子″是指多聚体形式的任意长度核苷酸，或为核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸或两者的组合。所述术语另外包括双链及单链DNA和RNA。所述术语还包括已知的核苷酸修饰，例如甲基化、环化和‘戴帽’以及一个或多个天然存在的核苷酸替换为类似物，例如次黄苷。核苷酸修饰包括加成吖啶、胺、生物素、瀑布蓝(cascade blue)、胆固醇、Dabcyl、地高辛配基、二硝基苯基、Edans、6-FAM、荧光素、3′-甘油基、HEX、IRD-700、IRD-800、JOE、磷酸补骨脂素、罗丹明、ROX、硫醇(SH)、隔离物、TAMRA、TET、SE、MarinaPacificOregonRhodamineRhodamineRhodol和Texas多核苷酸主链修饰包括膦酸甲酯、2′-OMe-膦酸甲酯RNA、硫代磷酸酯、RNA、2′-OMeRNA。碱基修饰包括2-氨基-dA、2-氨基嘌呤、3′-(ddA)、3′dA(蛹虫草菌素)、7-脱氮-dA、8-Br-dA、8-oxo-dA、N6-Me-dA、无碱基位点(dSpacer)、生物素dT、2′-OMe-SMe-C、2′-OMe-丙炔基-C、3′-(5-Me-dC)、3′-(ddC)、5-Br-dC、5-I-dC、5-Me-dC、5-F-dC、羧基-dT、可转换dA、可转换dC、可转换dG、可转换dT、可转换dU、7-脱氮-dG、8-Br-dG、8-oxo-dG、06-Me-dG、S6-DNP-dG、4-甲基-吲哚、5-硝基吲哚、2′-OMe-次黄苷、2′-dI、06-苯基-dI、4-甲基-吲哚、2′-脱氧水粉蕈素、5-硝基吲哚、2-氨基嘌呤、dP(嘌呤类似物)、dK(嘧啶类似物)、3-硝基吡咯、2-硫代-dT、4-硫代-dT、生物素-dT、羧基-dT、04-Me-dT、04-三唑dT、2′-OMe-丙炔基-U、5-Br-dU、2′-dU、5-F-dU、5-I-dU、04-三唑dU。所述术语还包含肽核酸(PNA)，一种DNA类似物，其中主链是假肽(pseudopeptide)，其由N-(2-氨乙基)-甘氨酸单元而非糖组成。PNA类似DNA的特性，结合核酸互补链。PNA的中性主链导致比通常获得的结合更牢、特异性更强。此外，PNA独特的化学、物理和生物学特性已经用于产生强大的生物分子工具、反义和反基因因子、分子探针以及生物传感器。本发明还方便地提供了至少约15个本发明核酸的连续核苷酸的核酸序列，并优选15-50个核苷酸。这些序列可以方便地用作探针，特异性与上文定义的本发明序列杂交，或者用作引物，特异性扩增或复制上文定义的本发明序列，等等。可按照本领域公知的技术(例如重组或合成方法)产生这样的核酸序列。它们也可用于诊断试剂盒等以检测本发明核酸的存在。该检测一般包括探针在杂交条件下与样品接触，检测探针与样品中任意核酸之间形成的任何双链或三链。
可利用重组或合成方法方便地产生本发明的核酸序列，例如利用PCR克隆原理，其中一般包括制备一对引物，其可能为欲克隆基因区域的约15-50个核苷酸，将引物与细胞的mRNA、cDNA或基因组DNA接触，在使所要求区域扩增的条件下进行聚合酶链反应，分离扩增区域或片段，并回收扩增的DNA。此处所述的这种技术一般为本领域所公知，例如Sambrook等人所述(Molecular Cloning：a Laboratory Manual，1989)。
″编码序列″或″开放阅读框架″或″ORF″定义为在适当的控制序列或调节序列的控制下，即所述编码序列或ORF以表达形式存在时，能够转录为mRNA和/或翻译为多肽的核苷酸序列。所述ORF编码序列以5′翻译起始密码子和3′翻译终止密码子为界。编码序列或ORF可包括但不限于RNA、mRNA、cDNA、重组核苷酸序列、合成制备的核苷酸序列或基因组DNA。所述编码序列或ORF可被插入的核酸序列破坏。
基本上编码相同蛋白质但分离自不同来源的基因和编码序列可以由基本上不同的核酸序列组成。相反，基本不同的核酸序列可以用来表达基本相同的蛋白质。所述核酸序列是由，例如给定基因存在不同的等位基因、遗传密码的简并性或密码子使用上的差异而造成。因而，如表2所示，氨基酸例如甲硫氨酸和色氨酸由单个密码子编码，而其它氨基酸例如精氨酸、亮氨酸和丝氨酸，各由多达6个不同的密码子翻译而成。根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)(一种细菌)、鼠耳芥(A.thaliana)、紫苜蓿(M.sativa)(两种双子叶植物)和稻(Oryza sativa)(一种单子叶植物)偏性密码子使用的差异如表3所示。选一个例子，密码子GGC(甘氨酸)在根癌土壤杆菌中为最常用密码子(36.2‰)，在稻中为第二常用密码子，而在鼠耳芥和紫苜蓿中的使用频率则低得多(分别为9‰和8.4‰)。编码甘氨酸的四种可能的密码子中(参见表2)，根癌土壤杆菌和稻最偏性使用所述GGC密码子。然而，鼠耳芥使用GGA(和GGU)密码子，而紫苜蓿为GGU(和GGA)密码子。
本发明确定的DNA序列可被插入序列破坏。″插入序列″是指破坏包含所述发明DNA序列的编码序列、或者破坏包含所述发明DNA序列的DNA序列的可表达形式的任何核酸序列。去除插入序列可恢复所述编码序列或所述可表达形式。插入序列的例子包括内含子以及可移动的DNA序列，例如转座子。″可移动的DNA序列″是指能够由于重组事件而移动的任何DNA序列。
表2.遗传密码的简并性
表3.不同生物中指定密码子的使用
按每千个密码子的频率给出(http://www.kazusa.or.ip/codon)
″杂交″是基本上同源的互补核苷酸序列互相退火的过程。杂交过程能够完全在溶液中发生，即互补核酸双方都处于溶液中。依赖此过程的分子生物学方法包括PCR、消减杂交以及DNA序列测定。将一条互补核酸固定到基质(例如磁珠、Sepharose珠或其它任何树脂)上，也能发生杂交过程。依赖此过程的分子生物学方法包括分离poly(A+)mRNA。此外，将一条互补核酸固定到固相支持物，例如硝化纤维或尼龙膜、或通过例如光蚀刻技术(photolitography)固定到硅质玻璃支持物(后者即核酸阵列或微阵列或核酸芯片)，能够发生杂交过程。依赖此过程的分子生物学方法包括RNA和DNA凝胶印迹分析、集落杂交、噬斑杂交以及微阵列杂交。为了使杂交发生，一般核酸分子通过热或化学(例如用NaOH)变性，双链解链为两条单链和/或去除单链核酸的发夹或其它二级结构。杂交的严谨性受例如温度、盐浓度和杂交缓冲液成分等条件的影响。高严谨性杂交条件包括高温、和/或低盐浓度(盐包括NaCl和Na3-柠檬酸)、和/或杂交缓冲液中包含甲酰胺、和/或降低杂交缓冲液中化合物例如SDS(去污剂)的浓度、和/或排除杂交缓冲液中化合物例如硫酸葡聚糖或聚乙二醇(促进分子聚集)。常规杂交条件为Sambrook等人所述(1989)，但技术人员应当理解，根据已知的或预期的同源性功能和/或核酸序列的长度可以设计许多不同的杂交条件。特别优选严谨性足够低的杂交条件，以分离与上述本发明DNA序列异源的核酸。促成所述异源性的因素包括等位性、遗传密码简并性以及上述偏性密码子使用的差异。
显然，本发明包含前述本发明编码细胞分裂素氧化酶、其同系物、衍生物或免疫活性和/或功能片段的DNA序列在任何杂交方法中的应用。此外，本发明也涉及与所述发明的DNA序列杂交的DNA序列。该细胞分裂素氧化酶优选植物细胞分裂素氧化酶，更具体而言，是鼠耳芥(At)CKX。
为在(优选植物来源的)细胞、组织或器官中实现蛋白质表达，该蛋白质可以通过例如显微注射或冲击方法直接引入所述细胞中，或者另外地，可以将编码该蛋白质的分离的核酸分子以可表达形式引入所述细胞、组织或器官中。
本发明DNA序列优选包含编码上述细胞分裂素氧化酶蛋白质、或其同系物或衍生物、或其免疫活性和/或功能片段的编码序列或开放阅读框架(ORF)。本发明优选的蛋白质包含所述细胞分裂素氧化酶的氨基酸序列。所述细胞分裂素氧化酶优选植物细胞分裂素氧化酶，更具体而言，是鼠耳芥(At)CKX。
″载体″或″载体序列″是指可以通过转化引入生物体并可在该生物体中稳定维持的DNA序列。例如，有可能在大肠杆菌(Escherichia coli)、根癌土壤杆菌(A.tumefaciens)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)或裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)的培养物中维持载体。其它载体，例如噬菌粒(phagemid)和粘粒载体可以在细菌和/或病毒中维持并繁殖。载体序列一般包含一套限制酶识别的唯一位点、多克隆位点(MCS)，其中可以插入一个或多个非载体序列。
因此，″非载体序列″是指整合到载体所含MCS的一个或多个位点中的DNA序列。
″表达载体″构成载体的亚类，其由于包含适当的调节或控制序列，将插入的非载体序列形成可表达形式，从而使所述非载体序列编码的蛋白质表达。表达载体为本领域已知，可使蛋白质在包括细菌(例如大肠杆菌)、真菌(例如啤酒酵母、裂殖酵母、巴斯德毕赤氏酵母)、昆虫细胞(例如杆状病毒表达载体)、动物细胞(例如COS或CHO细胞)以及植物细胞(例如基于马铃薯X病毒的表达载体)的生物体中表达。在本发明显然包含上述任何细胞分裂素氧化酶、同系物、衍生物、和/或免疫活性和/或功能片段。所述细胞分裂素氧化酶优选植物细胞分裂素氧化酶，更具体而言，是鼠耳芥(At)CKX。
作为生物系统中以表达载体介导蛋白质生产的替代方案，可以应用蛋白质的化学合成。可以在液相或固相中制造合成肽。然而肽固相合成(Merrifield 1963)是最常见的方式，包括连续加成氨基酸以形成线性肽链。固相肽合成包括由三个步骤组成的循环：(i)将生长中肽链的羧基端氨基酸固定到固相支持物或树脂上；(ii)链装配过程，由将要加成到生长中肽链上的氨基酸的活化、偶联以及去保护组成；以及(iii)断裂，包括从树脂上去除完成的肽链，并从氨基酸侧链上去除保护基团。常见的肽固相合成方法包括，将Fmoc/tBu(9-芴甲氧羰基/t-叔丁基)和Boc(t-叔丁氧羰基)用作氨基酸的氨基端保护基团。氨基酸侧链保护基团包括甲基(Me)、甲酰基(CHO)、乙基(Et)、乙酰基(Ac)、t-叔丁基(t-Bu)、甲氧苯基、苄基(Bzl)、三氟乙酰基(Tfa)、N-羟基丁二酰亚胺(ONSu，OSu)、苯甲酰基(Bz)、4-甲苄基(Meb)、硫茴香基(thioanizyl)、硫甲苯基(thiocresyl)、苄氧甲基(Bom)、4-硝基苯基(ONp)、苄氧羰基(Z)、2-硝基苯甲酰基(NBz)、2-硝基苯硫苯基(Nps)、4-甲苯磺酰基(Tosyl，Tos)、五氟苯基(Pfp)、二苯甲基(Dpm)、2-氯苄氧基羰基(CI-Z)、2，4，5-三氯苯基、2-溴苄氧基羰基(Br-Z)、三苯甲基(Trityl，Trt)以及2，5，7，8-五甲基-苯并二氢吡喃-6-磺酰(Pmc)。链装配过程中，去除Fmoc或Boc引起结合生长中链的氨基酸残基的氨基端活化。新进氨基酸的羧基端通过转变为高反应性的酯(例如通过HBTU)而活化。利用现有技术(例如PerSeptive Biosystems 9050合成仪，Applied Biosystems Model 431A Peptide Synthesizer)，可以制备多达50个残基的线性肽。许多指导原则可以用来生产适于生物系统使用的肽，包括(i)限制使用不利的氨基酸，例如cys、met、trp(在肽合成期间容易氧化和/或降解)或arg；(ii)最少使用疏水氨基酸(可降低肽的可溶性)；以及(iii)防止氨基端的谷氨酸(可环化为焦谷氨酸)。
″可表达形式″是指分离的核酸分子或者组成型、或者经胞内或胞外信号(例如环境刺激或压力(有丝分裂原、缺氧、低氧、温度、盐、光、脱水等)、或者化合物例如IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)、或者例如抗生素(四环素、氨苄青霉素、利福平、卡那霉素)、激素(例如赤霉素、植物生长素、细胞分裂素、糖皮质激素、brassinosteroid、乙烯、脱落酸等)、激素类似物(吲哚乙酸(IAA)、2，4-D等)、金属(锌、铜、铁等)、或者地塞米松等)诱导后，处于适合转录为mRNA和/或翻译以产生蛋白质的形式。如本领域技术人员所知，表达功能蛋白质可能还需要一种或多种翻译后修饰，例如糖基化、磷酸化、去磷酸化、或者一种或多种蛋白质-蛋白质的相互作用等。所有这类过程都包括在术语″可表达形式″的范畴之内。
在优选植物来源的特定细胞、组织或器官中实现一种蛋白质的表达，优选地通过在所述细胞、组织或器官中引入并表达编码所述蛋白质的分离的核酸分子，例如cDNA分子、基因组基因、合成的寡核苷酸分子、mRNA分子或者开放阅读框架，其中所述核酸分子有效地连接适当的调节或控制序列，包括启动子(优选植物可表达的启动子)以及终止子序列。
此处涉及的″启动子″将利用其广义，包括来源于传统真核基因组基因的转录调节序列，包括准确起始转录所需的TATA盒、有或没有CCAAT盒以及响应发育和/或外界刺激、或者以组织特异性方式改变基因表达的另外的调节或控制成分(即上游活化序列、增强子和沉默子)。
术语″启动子″还包括传统原核基因的转录调节序列，在这种情况下可能包括-35盒序列和/或-10盒转录调节序列。
术语″启动子″还用于描述引起细胞、组织或器官中核酸分子表达活化或增强的合成的或者融合的分子、或衍生物。
启动子可以包含另外的一种或多种特异性调节成分的拷贝，以进一步增强与其有效相连的核酸分子的表达和/或改变其空间上和/或时间上的表达。这种调节成分可置于异源启动子序列邻近以应答例如铜、糖皮质激素、地塞米松、四环素、赤霉素、cAMP、脱落酸、植物生长素、创伤、乙烯、茉莉酮酸酯或水杨酸而驱动核酸分子的表达，或者使核酸分子在特定细胞、组织或器官例如分生组织、叶、根、胚、花、种子或果实中表达。
在本发明范围内，启动子优选植物可表达的启动子序列。本发明并不排除也在或仅在非植物细胞中(例如细菌、酵母细胞、昆虫细胞和动物细胞)有功能的启动子。″植物可表达″是指至少能够诱导、赋予、活化或者增强植物细胞、组织或器官优选单子叶或双子叶植物细胞、组织或器官中表达的启动子序列，包括其中加入或包含的任何另外的调节成分。
此处所用关于启动子序列的术语″植物可操作″以及″可在植物中操作″，应当认为等同于植物可表达的启动子序列。
作为双病毒植物表达系统的一部分，可调节启动子也为技术人员所知(Yadav 1999-W09922003；Yadav 2000-W00017365)。
在目前范围内，″可调节启动子序列″是能够使结构基因于特定条件下在植物特定细胞、组织或器官、或者细胞、组织或器官群中表达、但在所有条件下一般不使其表达遍及整个植物的启动子。因此，可调节启动子序列可能是使与其有效连接的基因在植物内特定位点、或者于特定条件组合下(例如通过化合物或其它激发子(elicitor)诱导基因表达)使其在整个植物中表达的启动子序列。
用于实现本发明的可调节启动子，优选或组成型或诱导以后在植物内特定位点引起表达、但无论如何不在整个植物中引起表达。在此种启动子的范畴内，包括细胞特异性启动子序列、组织特异性启动子序列、器官特异性启动子序列、细胞周期特异性基因启动子序列、可诱导启动子序列以及已经改造为可在任一时刻于植物特定部分引起表达的组成型启动子序列，例如将所述组成型启动子整合入可转座的遗传因子(Ac，Ds，Spm，En或其它转座子)内部。
类似地，应当认为术语″组织特异性″表示主要在(优选植物来源的)特定组织或组织类型中表达，虽然不一定仅仅位于所述组织或组织类型。
类似地，应当认为术语″器官特异性″表示主要在(优选植物来源的)特定器官中表达，虽然不一定仅仅位于所述器官。
类似地，应当认为术语″细胞周期特异性″表示主要周期性表达于(优选植物来源的)细胞周期一个或多个不一定连续的阶段，虽然不一定仅仅位于周期细胞中。
本领域技术人员应当知道，″可诱导型启动子″是应答发育、化学、环境或物理刺激而增强或诱导转录活性的启动子。类似地，技术人员应当理解，″组成型启动子″是在生物体(优选植物)的大部分、而不一定所有部分中，于其生长和发育的大部分、而不一定所有阶段中具有转录活性的启动子。
本领域技术人员能轻易地从公开或易于利用的资源中选择适当的启动子序列用于调节细胞分裂素氧化酶蛋白质的适度表达，无需过分实验。
将核酸分子置于启动子序列的调节控制之下或者与启动子序列有效连接，是指放置所述核酸分子使其表达受启动子序列控制。启动子通常、但不一定位于所调节核酸分子的上游、或5′端，并在转录开始位点的2kb之内。在异源启动子/结构基因组合的构建中，一般优选将启动子置于与基因转录开始位点隔一段距离，大约等同于天然状态中启动子与其控制的基因(即，该启动子来源于的基因)之间的距离。如本领域已知，可以适应距离上的一些变化，而不损失启动子的功能。类似地，调节序列成分相对于处于其控制下的异源基因的优选位置由天然状态中该成分的位置确定(即，其来源于的基因)。此外，如本领域已知，还可以存在一些距离上的变化。
适于本发明基因构建体使用的启动子的例子包括表4所列等。仅为例证目的提供表4所列启动子，本发明不受其提供的列表限制。本领域技术人员应容易提供另外的可用于实现本发明的启动子。
至于组成型启动子或者在整个植物中诱导表达的启动子，其优选通过加入来源于一个或多个表4所列组织特异性启动子的核苷酸序列、或者来源于一个或多个上述组织特异性可诱导启动子的核苷酸序列，从而改变该序列，以赋予了组织特异性。例如，如先前所述，通过加入玉米Adh1启动子序列可改变CaMV 35S启动子带来厌氧调节的根特异性表达(Ellis等人，1987)。另一个例子描述了通过将CaMV35S启动子与玉米富含甘氨酸蛋白质GRP3基因的成分融合，带来根特异性或根丰富性的基因表达(Feix和Wulff 2000-W00015662)。本领域技术人员可以通过常规实验获得这种修饰。
术语″终止子″是指转录单位末端的DNA序列，提供转录终止信号。终止子是包含多聚腺苷酸信号的3′非翻译DNA序列，其促进在原始转录物的3′端添加多聚腺苷酸序列。在来自病毒、酵母、霉菌、细菌、昆虫、鸟类、哺乳动物和植物的细胞中的活性终止子已知并在文献中进行了描述。它们可分离自细菌、真菌、病毒、动物和/或植物。
表4.用于实现本发明的代表性的植物可表达启动子
表4(续).用于实现本发明的代表性的植物可表达启动子
表4(续).用于实现本发明的代表性的植物可表达启动子
表4(续).用于实现本发明的代表性的植物可表达启动子
特别适用于本发明基因构建体的终止子的例子包括根癌土壤杆菌胭脂碱合酶(NOS)基因终止子、根癌土壤杆菌章鱼肉碱合酶(OCS)基因终止子序列、花椰菜花叶病毒(CaMV)35S基因终止子序列、稻(Oryza sativa)ADP-葡萄糖焦磷酸化酶终止子序列(t3′Bt2)、玉蜀黍(Zea mays)玉米醇溶蛋白基因终止子序列、rbcs-1A基因终止子以及rbcs-3A基因终止子序列等。
优选的本发明启动子序列包括根特异性启动子，例如而不限于表5所列以及实施例中所述。
表5.用于实现本发明的代表性的根特异性启动子
本领域技术人员应当知晓可能适用于实现本发明的另外的启动子序列和终止子序列。这种序列可以轻易使用，无需任何过分的实验。
在本发明范围内，基因或蛋白质的″异位表达″或″异位过量表达″赋予所述基因或蛋白质在自然条件下一般不存在的表达模式和/或表达水平，更具体而言，是指增强表达和/或增强表达水平。能够以许多方式获得异位表达，包括编码所述蛋白质的编码序列与分离的同源或异源启动子有效连接以形成嵌合基因和/或所述编码序列与其自身的分离的启动子(即天然驱动所述蛋白质表达的未分离启动子)有效连接以产生重组基因重复或基因倍增效应。″异位共表达″是指异位表达或异位过表达两个或多个基因或蛋白质。相同的或更优选不同的启动子用于引起所述基因或蛋白质的异位表达。
本发明范围内使用的启动子序列优选地与编码上述细胞分裂素氧化酶蛋白质或同系物、衍生物、或其免疫活性和/或功能片段的编码序列或开放阅读框架(ORF)有效连接。
此处所用″下调表达″是指降低基因表达的水平和/或活性基因产物的水平和/或基因产物活性的水平。通过例如在相对启动子序列的正义方向(如果引起共抑制)或者在反义方向添加编码序列或其部分，并进一步通过例如插入诱变(例如T-DNA插入或转座子插入)或者通过例如Angell和Baulcombe(1998-W09836083)、Lowe等人(1989-W09853083)、Lederer等人(1999-W09915682)或Wang等人(1999-W09953050)所述基因沉默策略来降低表达。针对沉默基因表达的遗传构建体在其相对于启动子序列的正义和/或反义方向上可包含所述基因(或其一个或多个部分)的核苷酸序列。下调基因表达的另一方法包含利用核酶。
通过将所述基因产物、同系物、衍生物和/或其免疫活性片段给予或接触细胞、组织、器官或生物体，可以实现调节、包括降低活性基因产物或者基因产物活性的水平。能够下调活性基因产物水平和/或基因产物活性的技术的另一个例子是免疫调节，其包含将所述基因产物的抗体给予或接触细胞、组织、器官或生物体、或在其中表达，将调节其中所述基因产物和/或基因产物活性的水平。这种抗体包含″plantibodies″、单链抗体、IgG抗体和重链camel抗体及其片段。
通过将所述基因产物或其活性的激动剂给予或接触细胞、组织、器官或生物体可以进一步实现调节、包括降低活性基因产物或者基因产物活性的水平。这种激动剂包括上述本发明鉴定的蛋白质(例如包含激酶和蛋白酶类)和化合物。
在本发明范围内关注下调上述细胞分裂素氧化酶基因的表达。所述细胞分裂素氧化酶基因优选植物细胞分裂素氧化酶基因，更具体而言是AtCKX。本发明进一步包含下调细胞分裂素氧化酶蛋白质或细胞分裂素氧化酶活性的水平，所述细胞分裂素氧化酶蛋白质上文已经明确。所述细胞分裂素氧化酶蛋白质优选植物细胞分裂素氧化酶，更具体而言是AtCKX。
″改变细胞命运和/或植物发育和/或植物形态学和/或生物化学和/或生理学″是指通过实行此处所述本发明的一个或多个步骤改变植物的一种或多种发育和/或形态学和/或生物化学和/或生理学特性。
″细胞命运″是指在植物发育或细胞过程中、特别是在细胞周期中或因细胞周期过程而产生的特定细胞的细胞类型或细胞特性。
应当认为此处所用″植物发育″或术语″植物发育特性″或类似术语是在决定祖细胞将发育成的植物细胞、特别是特异性组织或器官类型的发育命运中所涉及的植物的任何细胞过程。与植物发育有关的细胞过程应为本领域技术人员所知。该过程涉及，例如形态发生、光形态发生、枝条发育、根发育、营养体发育、生殖发育、茎伸长、开花以及决定细胞命运中涉及的调节机制、特别是涉及细胞周期的过程或调节过程。
本领域技术人员应当理解，此处所用″植物形态学″或术语″植物形态特性″或类似术语是指植物的外观，包括任何一个或多个结构特性或其结构特性的组合。这种结构特性包括植物的任何细胞、组织或器官、或者细胞、组织或器官群(包括根、茎、叶、枝、叶柄、毛状体、花、花瓣、柱头、花柱、雄蕊、花粉、胚珠、种子、胚、胚乳、种皮、糊粉、纤维、果实、形成层、木材、心材、薄壁组织、通气组织、筛管分子、韧皮部或维管组织等)的形状大小、数目、位置、颜色、质地、排列及成型。
本领域技术人员应当理解，此处所用″植物生物化学″或术语″植物生物化学特性″或类似术语是指植物的代谢和催化过程，包括初级和次级代谢及其产物，包括任何小分子、大分子或化合物，例如而不限于植物产生的淀粉、糖、蛋白质、肽、酶、激素、生长因子、核酸分子、纤维素、半纤维素、愈创葡聚糖、植物凝集素、纤维、色素如花青苷、维生素、矿物、微量营养物或常量营养物。
应当理解此处所用″植物生理学″或术语″植物生理学特性″或类似术语是指植物的功能性过程，包括发育过程例如生长、增殖和分化、性发育、有性繁殖、结种(seed set)、种子发育、灌浆、无性繁殖、细胞分裂、休眠、萌芽、光适应、光合作用、展叶、纤维产生、次生生长或木材生产等；植物对外界施加因素例如金属、化学物、激素、生长因子、环境和环境压力因素(例如缺氧、低氧、高温、低温、脱水、光、昼长(daylength)、水淹、盐、重金属等)的反应，包括植物对所述外界施加因素的适应性反应。
将重组DNA引入植物组织或细胞的方法包括但不限于，利用CaCl2及其变体转化，特别是Hanahan(1983)所述方法，原生质体直接摄取DNA(Krens等人，1982；Paszkowski等人，1984)，PEG介导原生质体摄取(Armstrong等人，1990)微粒轰击，电穿孔(Fromm等人，1985)，DNA显微注射(Crossway等人，1986)，微粒轰击组织外植体或细胞(Christou等人，1988；Sanford，1988)，核酸真空渗入组织，或者对植物而言，An等人(1985)、Dodds等人(1985)、Herrera-Estrella等人(1983a，1983b，1985)所述的T-DNA介导从土壤杆菌转移到植物组织。本领域公知单子叶植物的转化方法，其包括土壤杆菌介导的转化(Cheng等人，1997-W09748814；Hansen 1998-W09854961；Hiei等人，1994-W09400977；Hiei等人，1998-W09817813；Rikiishi等人，1999-W09904618；Saito等人，1995-W09506722)、微粒轰击(Adams等人，1999-US5969213；Bowen等人，1998-US5736369；Chang等人，1994-W09413822；Lundquist等人，1999-US5874265/US5990390；Vasil和Vasil，1995-US5405765.Walker等人，1999-US5955362)、DNA摄取(Eyal等人，1993-W09318168)、土壤杆菌细胞的显微注射(von Holt，1994-DE4309203)以及超声处理(Finer等人，1997-US5693512)。
细胞的微粒轰击是将微粒推进到细胞中产生转化细胞。任何适当的弹性细胞转化方法和仪器可用于实现本发明。代表性的仪器和方法由Stomp等人(U.S.Patent No.5,122，466)以及Sanford和Wolf(U.S.Patent No.4，945,050)公开。利用弹性转化过程时，基因构建体可掺入能在被转化细胞中复制的质粒。该系统适用的微粒的例子包括1-5um的金球。通过任何适用技术例如沉淀可将DNA构建体沉积在微粒上面。
按照本领域公知的方法，全植物可从转化或转染细胞再生。无论通过器官发生或胚胎发生能够随后进行克隆繁殖的植物组织可用本发明的基因构建体转化并从中再生全植物。特定组织的选择变化取决于所转化的特定物种可用的并且是最适合的克隆繁殖体系。代表性的组织对象包括叶片、花粉、胚、子叶、下胚轴、大配子体、愈伤组织、原生分生组织(例如顶端分生组织、腋芽和根分生组织)以及诱生分生组织(例如子叶分生组织和胚轴分生组织)。
此处所用术语″器官发生″是指由分生组织中心顺序发育为枝条和根的过程。
此处所用术语″胚胎发生″是指由体细胞或配子按协同方式(而非顺序地)共同发育为枝条和根的过程。
优选地，按本发明方法产生的植物通过任何公认的技术方法例如微粒轰击、显微注射、土壤杆菌介导转化(包括植物内in planta)转化)、原生质体融合或电穿孔等进行遗传序列转染或转化、或者引入蛋白质。所述植物最优选通过土壤杆菌介导的转化产生。
植物、酵母、霉菌或丝状真菌的土壤杆菌介导转化或″agrolistic″转是基于将转化载体序列的一部分(称为T-DNA)转移到细胞核并整合所述T-DNA到所述真核生物的基因组中。
″土壤杆菌属″是指Agrobacteriaceae的一个成员，更优选土壤杆菌或根瘤菌属(Rhizobacterium)，最优选根癌土壤杆菌。
″T-DNA″或转移DNA是指侧翼为T-DNA边界的转化载体的一部分，土壤杆菌vir基因活化后，于T-DNA边界处切断，以单链DNA转移到真核细胞的细胞核中。
此处所用″T-DNA边界″、″T-DNA边界区″或″边界区″是指或右侧的T-DNA边界(RB)或左侧的T-DNA边界(LB)。这种边界包含核心序列，其侧翼为边界内区域(为边界侧翼的T-DNA的一部分)和/或边界外区域(为边界侧翼的载体主链的一部分)。章鱼肉碱型载体和胭脂碱型载体的核心序列分别包含22bp、25bp。在右边界区和左边界区中，核心序列形成不完全的重复。边界核心序列为至少由VirD1和VirD2组成的土壤杆菌切割复合物的识别和加工所必需。T-DNA侧翼的核心序列足以促进所述T-DNA的转移。然而，利用携带侧翼只有该核心序列的所述T-DNA的转化载体的转化效率低。已知边界内和外区域调节T-DNA的转移效率(Wang等人，1987)。已经鉴定一种增强T-DNA转移的成分，其位于右边界外区域，称为overdrive(超趋动)(Peralta等人，1986，van Haaren等人，1987)。
″T-DNA转化载体″或″T-DNA载体″是指包含侧翼为右和左T-DNA边界(至少分别由右和左边界核心序列组成)的T-DNA序列的任何载体，其用来转化任何真核细胞。
″T-DNA载体主链序列″是指含T-DNA载体位于T-DNA边界以外、更具体而言位于边界核心不完全重复的切割位点以外的全部DNA。
本发明包括优化的T-DNA载体，以使真核细胞基因组中整合的载体主链最少或没有。″优化T-DNA载体″是指T-DNA载体设计为减少或消除转移到真核细胞基因组的载体主链序列。这种T-DNA载体为熟悉技术人员所知，包括Hanson等人(1999)和Stuiver等人(1999-W09901563)所述。
本发明显然包括在任何T-DNA载体包括双转化载体、超级双转化载体、共整合转化载体、Ri来源的转化载体以及用于agrolistic转化的携带T-DNA的载体中的上述编码细胞分裂素氧化酶、同系物、衍生物或其免疫活性和/或功能片段的DNA序列。所述细胞分裂素氧化酶优选植物细胞分裂素氧化酶，更具体而言，是鼠耳芥(At)CKX。
″双转化载体″是指T-DNA转化载体，其包含：
(a)包含至少一个目的基因和/或至少一个在待转化真核细胞中有活性的选择标志的T-DNA区域；以及
(b)包含至少在大肠杆菌(E.coli)和土壤杆菌中有活性的复制起点、以及在大肠杆菌和土壤杆菌中供选择的标志的载体主链区域。
双转化载体的T-DNA边界可来源于章鱼肉碱型或胭脂碱型Ti质粒或双方。双载体的T-DNA和辅助质粒一起只能转移到真核细胞中。
″辅助质粒″是指在土壤杆菌中稳定维持、并至少携带为使T-DNA转移所必需的一套vir基因的质粒。该套vir基因可来源于章鱼肉碱型或胭脂碱型Ti质粒或双方。
″超级双转化载体″是指在载体主链区域内另外带有根癌土壤杆菌超级毒性株A281的Ti质粒pTiBo542的vir区的双转化载体(EP0604662，EP0687730)。超级双转化载体与辅助质粒一起使用。
″共整合转化载体″是指T-DNA转化载体，其至少包含：
(a)包含至少一个目的基因和/或至少一个在植物中有活性的选择标志的T-DNA区域；以及
(b)包含至少在大肠杆菌和土壤杆菌中有活性的复制起点、在大肠杆菌和土壤杆菌中供选择的标志、以及为使T-DNA转移所必需的一套vir基因的载体主链区域。
所述T-DNA载体的T-DNA边界和该套vir基因可来源于章鱼肉碱型或胭脂碱型Ti质粒或双方。
″Ri来源的植物转化载体″是指其中T-DNA边界来源于Ti质粒的双转化载体，所述双转化载体与携带一套必要的vir基因的″辅助″Ri质粒一起使用。
此处所用术语″选择标志基因″或″选择标志″或″供选择的标志″包括赋予细胞表型的任何基因，其中其表达以促进鉴定和/或选择经本发明基因构建体或其衍生物转染或转化的细胞。此处合适的选择标志基因包括氨苄青霉素抗性(Ampr)、四环素抗性基因(Tcr)、细菌卡那霉素抗性基因(Kanr)、瞵丝菌素抗性基因、新霉素磷酸转移酶基因(nptII)、潮霉素抗性基因、β-葡糖醛酸酶(GUS)基因、氯霉素乙酰转移酶(CAT)基因、绿色荧光蛋白质(gfp)基因(Haseloff等人，1997)以及萤光素酶基因等。
此处″agrolistics″、″agrolistic转化″或″agrolistic转移″是指联合土壤杆菌介导的转化以及biolistic DNA转运的特性的转化方法。同样，含T-DNA的目的质粒与可使植物中产生VirD1和VirD2、有或无VirE2的DNA/RNA共转运(Hansen和Chilton 1996；Hansen等人，1997；Hansen和Chilton 1997-W09712046)。
″外源DNA″是指通过重组技术引入宿主基因组的任何DNA序列。所述外源DNA包括例如T-DNA序列或其一部分，诸如包含选择标志的可表达形式的T-DNA序列。外源DNA另外包括上述插入DNA序列。″重组事件″是指位点特异性重组事件、或由转座子″跳跃″引起的重组事件。
″重组酶″是指位点特异性重组酶或转座酶。
″重组位点″是指位点特异性重组位点或转座子边界序列。
″位点特异性重组事件″是指通过一般由三个成分组成的系统催化的事件：一对DNA序列(位点特异性重组序列或位点)以及一个特异性酶(位点特异性重组酶)。位点特异性重组酶仅仅在两个位点特异性重组序列之间、取决该位点特异性重组序列的方向催化重组反应。如果位点特异性重组序列彼此反方向定位(即反向重复)，在位点特异性重组酶存在下，两个位点特异性重组位点之间的插入序列将倒转。如果位点特异性重组序列彼此相同方向定位(即同向重复)，那么在位点特异性重组酶作用下，将删除任何插入序列。因此，如果位点特异性重组序列以同向重复存在于整合真核基因组中的外源DNA序列的两端，通过该位点特异性重组序列与相应的位点特异性重组酶的相互作用，所述序列的这种整合可随后倒转。可以利用许多不同的位点特异性重组酶系统，包括而不限于噬菌体P1的Cre/lox系统、酵母的FLP/FRT系统、噬菌体Mu的Gin重组酶、大肠杆菌的Pin重组酶、志贺菌(Shigella)的PinB、PinD和PinF以及pSR1质粒的R/RS系统。重组酶一般为整合酶、解离酶或反转酶(flippase)。双特异性重组酶还可与对应于该双特异性重组酶的直接或间接重复的两个不同的位点特异性重组位点联合使用(WO 99/25840)。两个优选的位点特异性重组酶系统是噬菌体P1Cre/lox以及酵母FLP/FRT系统。在这些系统中，重组酶(Cre或FLP)特异性地与其各自的位点特异性重组序列(分别为lox或FRT)相互作用以倒转或切除插入序列。这两个系统的位点特异性重组序列相对较短(lox为34bp，FRT为47bp)。这些系统中某些已经高效用于植物例如烟草(Dale等人，1990)以及鼠耳芥属(Osborne等人，1995)。位点特异性重组系统在植物分子生物学中具有许多应用，包括控制同源重组(例如US5527695)、定点插入、基因叠加等(W099/25821)以及分解复杂的T-DNA整合模式或切除选择标志(W099/23202)的方法。
虽然位点特异性重组序列必须连接所切除或倒转的DNA末端，但编码位点特异性重组酶的基因可位于别处。例如，重组酶基因可以已经存在于真核生物DNA中，或者可以通过其后引入的DNA片段(或通过杂交、或通过异花授粉直接引入细胞)提供。另外，基本纯化的重组酶蛋白质可以通过例如显微注射或粒子轰击直接引入真核细胞。位点特异性重组酶编码区一般应有效连接调节序列，使能够在真核细胞中表达位点特异性重组酶。
″转座子跳跃引起的重组事件″或″转座酶介导的重组″是指通过由三个成分组成的系统催化的重组事件：一对DNA序列(转座子边界序列)以及一个特异性酶(转座酶)。转座酶只在倒转重复排列的两个转座子边界序列之间催化重组反应。可以使用许多不同的转座子/转座酶系统，包括而不限于Ds/Ac系统、Spm系统以及Mu系统。这些系统起源于玉米，但已经表明至少Ds/Ac和Spm系统也在其它植物中起作用(Fedoroff等人，1993，Schlappi等人，1993，Van Sluys等人，1987)。优选Ds-和Spm-型转座子，其分别有11bp-和13bp-边界序列。
虽然转座子边界序列必须连接所切除DNA的末端，但编码转座酶的基因可位于别处。例如，重组酶基因可以已经存在于真核生物DNA中，或者可以通过其后引入DNA片段(或通过杂交、或通过异花授粉直接引入细胞)提供。另外，基本纯化的转座酶蛋白质可以通过例如显微注射或粒子轰击直接引入真核细胞。
作为本发明的一部分，转座子边界序列归入外源DNA序列，其位于所述DNA序列外，并将所述DNA序列转变为能够在转座酶作用下移动的转座子样成分。
由于转座子经常重整合到宿主基因组的另一座位，可能必须隔离允许转座酶起作用的宿主子代以分离例如只包含转座子足印(footprint)的转化宿主以及仍包含外源DNA的转化宿主。
在实施本发明中，优选地诱导遗传成分动员，例如通过在细胞中表达重组酶蛋白质，接触该遗传成分的整合位点并促进其中的重组事件，完全切除该遗传成分或在原始整合位点留下″足印″(一般为约20个核苷酸长度或更大)。可以通过标准的核酸杂交和/或扩增技术检测可移动遗传成分或包含该成分的基因构建体的存在来鉴定按照本发明方法产生的宿主和宿主部分。另外，对于已经切除其中可移动遗传成分的转化宿主细胞、组织和宿主，利用这种技术有可能检测切除事件后在宿主基因组中留下的足印。此处所用术语″足印″应当认为是指此处所述可移动遗传成分或包含该成分的基因构建体的任何衍生物，其通过从先前经所述基因构建体转化的细胞的基因组中切除、缺失或其它方法去除可移动遗传成分而产生。足印一般包含重组座位或用于促进切除的转座子的至少一个拷贝。然而，足印可包含另外的来源于基因构建体的序列，例如来源于左边界序列、右边界序列、复制起点、重组酶或转座酶编码序列(如果使用过)的核苷酸序列，或者其它来自载体的核苷酸序列。因此，根据重组座位或者所用基因构建体的转座子的核苷酸序列(例如与lox位点或frt位点对应或互补的核苷酸序列)可以识别足印。
术语″细胞周期″是指与细胞生长和分裂相关、特别是与调节DNA复制和有丝分裂相关的周期性的生化和结构事件。细胞周期包括称为G0、Gap1(G1)、DNA合成(S)、Gap2(G2)和有丝分裂(M)的阶段。通常这四个阶段顺序发生，然而细胞周期也包括变化的周期，其中缺少一个或多个阶段，引起细胞周期改变，例如核内有丝分裂、多核化(acytokinesis)、多倍性、多线性和核内再复制。
术语″细胞周期进展″是指通过细胞周期不同阶段的过程。因此术语″细胞周期进展速度″是指通过所述细胞周期阶段的速度或者完成所述细胞周期阶段所需的时间跨度。
″双杂交试验″是指以下述观察为基础的试验，即许多真核转录因子包含两个结构域，一个DNA结合结构域(DB)和一个活化结构域(AD)，其如果物理上分离(即共价键破裂)则不能实现目的基因表达。能够物理上相互作用的两个蛋白质(其一与DB融合，另一与AD融合)将重新联合转录因子的DB和AD结构域，导致目的基因表达。在酵母双杂交试验中，目的基因通常是报告基因，例如β-半乳糖苷酶基因。因而可通过测量报告基因产物的活性来定量酵母双杂交试验中蛋白质配偶体之间的相互作用(Bartel和Fields 1997)。另外，可以使用哺乳动物双杂交系统，其包括例如编码嵌合绿色荧光蛋白质的报告基因(Shioda等人，2000)。
此外，利用适当的计算机程序可以进行本发明蛋白质结构基序的折叠模拟和计算机重新设计(Olszewski，Proteins 25(1996)，286-299；Hoffman，Comput.Appl.Biosci.1(1995)，675679)。蛋白质折叠的计算机模建可用于肽和蛋白质详细模型的构象和能量分析(Monge，J.Mol.Biol.247(1995)，995-1012；Renouf，Adv.Exp.Med.Biol.376(1995)，37-45)。特别地，适当的程序通过计算机辅助搜索互补肽序列可用于鉴定细胞分裂素氧化酶、其配基或其它相互作用蛋白质的相互作用的位点(Fassina，Immunomethods 5(1994)，114-120)。现有技术例如Berry，Biochem.Soc.Trans.22(1994)，1033-1036；Wodak，Ann，N.Y.Acac.Sci.501(1987)，1-13；Pabo，Biochemistry 25(1986)，5987-5991中描述了更多供设计蛋白质和肽的合适计算机系统。从上述计算机分析获得的结果可用于例如制备本发明蛋白质或其片段的拟肽(peptidomimetics)。蛋白质天然氨基酸序列的这种拟肽类似物可非常有效地摹拟亲代蛋白质(Benkirane，J.Biol.Chem.271(1996)，33218-33224)。例如，将易于获得的非手性Ω-氨基酸残基掺入本发明蛋白质或其片段导致氨基键替换为脂肪链的聚亚甲基单元，从而提供了构建拟肽的方便策略(Banerjee，Biopolymers 39(1996)，769-777)。现有技术描述了其它系统中小型肽类激素超级活性的拟肽类似物(Zhang，Biochem.Biophys.Res.Commun.224(1996)，327-331)。通过连续的胺的烷基化合成拟肽组合文库并测试产生的化合物(例如其结合、激酶抑制和/或免疫特性)也可以鉴别本发明蛋白质合适的拟肽。现有技术描述了产生和使用拟肽组合文库的方法，例如Ostresh，Methods in Enzymology 267(1996)，220-234以及Dorner，Bioorg.Med.Chem.4(1996)，709-715。
此外，本发明蛋白质的三维和/或晶体结构可用于设计本发明蛋白质生物活性的拟肽抑制剂(Rose，Biochemistry 35(1996)，12933-12944；Ruterber，Bioorg.Med.Chem.4(1996)，1545-1558)。
本发明方法将要获得或鉴别的化合物可以是能够结合本发明任何核酸、肽或蛋白质的化合物。将要鉴别的其它感兴趣的化合物是以通过该化合物的作用增强或减低所述基因或蛋白质表达的方式调节本发明基因或蛋白质表达的化合物。另外，化合物可以通过增强或减低本发明任何蛋白质的活性而发挥作用。此处优选蛋白质为新的细胞分裂素氧化酶。
所述化合物或许多化合物可能包含于样本中，例如植物、动物或微生物的细胞提取物。此外，所述化合物可能为本领域已知，但至今不知道其能够抑制或活化细胞分裂素氧化酶相互作用蛋白质。反应混合物可能是细胞或组织培养物的无细胞提取物，或者包含细胞或组织培养物。适于本发明方法的安排为本领域技术人员所知，并例如一般在Alberts等人，Molecular Biology of the Cell，第三版(1994)，特别是第17章中所述。例如，许多化合物可添加到反应混合物、培养基或注入细胞中。
如果本发明方法鉴定出样本包含一种或许多化合物，那么有可能从鉴定为包含能够作为激动剂的化合物的原始样本中分离该化合物，或者例如，如果它由许多不同的化合物组成，则可以进一步细分原始样本，以便降低每种样本中各种物质的数目，并重复细分原始样本的方法。取决于样品的复杂性，上述步骤可以执行若干次，优选地，直至根据本发明方法鉴定的样品只包含少数或仅仅一种物质。所述样品优选包含具有类似化学和/或物理特性的物质，最优选所述物质是相同的。优选地，根据上述方法鉴定的化合物或其衍生物进一步配制成适合植物育种、或植物细胞和组织培养应用的形式。
术语″早期活力″是指植物在早期发育期间快速生长的能力，并涉及在萌芽后成功建立发育良好的根系以及发育良好的光合作用器官。
术语″倒伏抗性″或″直立性″是指植物将自身固定到土壤中的能力。对于具有直立或半直立生长习性的植物，该术语也指在不利的(环境)条件下维持直立位的能力。该性状与根系的大小、深度和形态学有关。
此处所用术语″嫁接″是指将两个不同植物的部分接在一起，以便其结合一起，而且汁液可以流动，从而形成单一的可以生长和发育的新植物。因此嫁接由两部分组成：(i)下部为此处所述根状茎，基本上由根系和一部分茎组成，以及(ii)上部为接穗或移植物，其产生植物的地上部分。
此处所用tblastn是指对比工具，其是BLAST(Basic Local Alignment Search Tool)程序家族的一部分(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)。BLAST目标在于鉴定最佳局部对比区域，即对比两个核酸或蛋白质序列的某些部分，检测仅共享孤立的相似性区域的序列间关系(Altschul等人，1990)。本发明中，BLAST 2.0程序套件的tblastn用于比较玉米细胞分裂素氧化酶蛋白质序列与按全部阅读框架动态翻译的核苷酸序列数据库(Altschul等人，Nucleic Acids Res.25：3389-3402(1997))。
提供下列实施例和附图用于阐明本发明而决非限制。本申请中包括的所有参考文献的内容引入以供参考。
附图简述
图1.植物细胞分裂素氧化酶基因的示意图
显示从玉米(ZmCKX1，登录号AF044603，Biochem.Biophys.Res.Com.255：328-333，1999)和鼠耳芥属(AtCKX1-AtCKX4)中分离的不同细胞分裂素氧化酶基因的结构。外显子命名为‘E’，由阴影框表示。内含子由空白框表示。还标明了基因大小(kb，于各结构上方)、基因登录号(名称下方)以及表示0.5kb的标尺。
图2.植物细胞分裂素氧化酶氨基酸序列的比对。
比对了分别来自玉米(ZmCKX1)和鼠耳芥属(AtCKX1-AtCKX4)细胞分裂素氧化酶的氨基酸序列。相同的氨基酸残基由黑色框标记，相似氨基酸残基为灰色框。氨基酸相似群：(M，I，L，V)，(F，W，Y)，(G，A)，(S，T)，(R，K，H)，(E，D)，(N，Q)，
图3.表达ALCKX1的烟草和鼠耳芥属植物的Northern印迹分析。
(A)组成型表达的烟草植物(泳道1-8)较之野生型SNN烟草(泳道9)的Northern印迹分析
(B)组成型表达的克隆诱导12h后，比较叶子中四环素诱导的基因表达。泳道2-9，四个不同AtCKX1-W38TetR克隆的叶子(+、-为有或没有四环素处理)；泳道1，组成型表达的35S::AtCKX1克隆。
(C)鼠耳芥属植物组成型表达的AtCKX1基因的Northern印迹分析。泳道2-4为三个不同的组成型表达的35S::AtCKX1克隆，与野生型鼠耳芥属植物(泳道1)比较。
图4：35S::AtCKX1转基因的鼠耳芥属植物的生长特性。
(A)两个野生型幼苗(左)与两个35S::AtCKX1表达幼苗(右)比较。注意转基因幼苗中不定根形成增强以及根分支增强。于萌芽14天后照相。植物体外在培养皿中MS培养基上垂直生长。
(B)类似A，但是根用甲苯胺蓝染色。
(C)萌芽三周后，35S::AtCKX1转基因幼苗的培养皿的平面图。
(D)液体培养中生长的35S::AtCKX1转基因植物。野生型幼苗的根在此条件下生长不良(未显示)。
(E)表达35S::AtCKX1基因的转化子(T0)(右方三个植物)，左边所示野生型植物。
(F)土壤中生长的T1植物的表型。野生型植物(左)与两个35S::AtCKX1转基因植物比较。
图5：AtCKX2过表达的鼠耳芥属植物的表型。
表达35S::AtCKX2的T1代鼠耳芥属植物(右方两个植物)与野生型(左方植物)比较。
图6.表达AtCKX2的烟草和鼠耳芥属植物的Northern印迹分析。
(A)组成型表达的烟草植物(泳道1-7)较之野生型SNN烟草(泳道8)的Northern印迹分析。
(B)鼠耳芥属植物组成型表达的AtCKX2基因的Northern印迹分析。泳道2-8为七个不同的35S::AtCKX2组成型表达克隆与野生型鼠耳芥属植物(泳道1)比较。
图7.表达AtCKX1和AtCKX2烟草植物的枝条表型。
(A)六周龄植物的平面图。
(B)开花期的烟草植物。
(C)茎伸长的动力学。箭头标记花的开始。此阶段植物龄期(萌芽后天数)和叶片数如箭头上部所示。短线表示标准差(SD)；n＝12。
(D萌芽后第68天和100天之间形成叶片数(n＝12)以及这些叶片的最终表面积(野生型100％为3646±144cm2；n＝3)。
(E)比较叶子大小和老化。叶子来自于从上数节点号4、9、12、16和20(从左至右)。
图8.表达AtCKX转基因烟草植物的根的表型。
(A)萌芽17天后幼苗。
(B)土壤中生长植物在开花期的根系。
(C)萌芽后第10天的根长、侧根(LR)和不定根(AR)数目。
(D)外源细胞分裂素抑制根生长抑制的剂量-反应曲线。短线表示±SD；n＝30。
图9：表达35S::AtCKX1烟草植物中腋生枝分生组织的生长。
图10：过表达AtCKX1的烟草植物与野生型(WT)烟草的枝条分生组织、叶和根分生组织的组织学。
(A)营养枝顶端分生组织纵向正中切面。P，叶原基。
(B)次级叶脉的维管组织。X，木质部；PH，韧皮束。
(C)充分发育的叶子的横向切面。
(D)上叶表皮的扫描电子显微术。
(E)根尖用DAPI染色。RM，根分生组织。
(F)萌芽10天后，根分生组织的纵向正中切面。RC，根冠；PM，原分生组织。
(G)尖端10mm处的横向根部切面。E，表皮；C1-C4，皮层细胞层；X，木质部；PH，韧皮部。短线为100pm。
图11：表达AtCKX3和AtCKX4的烟草植物的Northern印迹分析。
(A)组成型表达AtCKX3的烟草植物的Northern印迹分析。泳道名称表示各转基因植物的编号，WT为野生型SNN烟草。上部印迹用AtCKX3特异性探针检测，下部印迹用25S rRNA特异性探针，并作为RNA载样量的对照。
(B)组成型表达AtCKX4的烟草植物的Northern印迹分析。泳道名称表示各转基因植物的编号，WT为野生型SNN烟草。上部印迹用AtCKX4特异性探针检测，下部印迹用25S rRNA特异性探针，并作为RNA载样量的对照。
图12：AtCKX2转基因烟草植物和野生型植物的交互嫁接。
(A)左方两个植物：对照(嫁接在WT根状茎上的WT接穗)。
右方两个植物：嫁接在AtCKX2-38转基因根状茎上的WT接穗。
(B)左侧：对照(嫁接在WT根状茎上的WT接穗)。
右侧：嫁接在WT根状茎上的AtCKX2-38植物的接穗。
(C)根区放大。
左侧：对照(嫁接在WT根状茎上的WT接穗)。
右侧：嫁接在AtCKX2-38转基因根状茎上的WT接穗。
(D)不定根形成。
左侧：对照(嫁接在WT根状茎上的WT接穗)。
右侧：嫁接在AtCKX2-36转基因根状茎上的WT接穗。
实施例
实施例1.本发明序列简述
实施例2.鉴定候选的鼠耳芥细胞分裂素氧化酶编码基因
从鼠耳芥中鉴定了与玉米细胞分裂素氧化酶基因具有序列相似性的6个不同基因(Morris等人，Biochem Biophys Res Comm 255：328-333，1999；Houda-Herin等人，Plant J 17：615-626；WO 99/06571)。利用玉米蛋白质序列，使用tblastn程序从基因组公共数据库中筛选6个翻译框架的核苷酸序列发现这些基因。这些序列命名为鼠耳芥细胞分裂素氧化酶样基因或AtCKX。其任意编号为AtCKX1-AtCKX6。如下列表概述了这些基因的有关信息。预测的ORF边界和蛋白质序列是指示性的，以大致说明鼠耳芥属和玉米细胞分裂素氧化酶之间、以及不同的鼠耳芥属细胞分裂素氧化酶之间蛋白质序列的差异。所示ORF边界和蛋白质序列不应视为这些AtCKX基因作用方式的结论性证据。DNAstar的MegAlign程序用于DNA和蛋白质序列比较。该程序使用Clustal比对方法。对于蛋白质和cDNA序列的多重比对，空位罚分和空位长度罚分均设为10。蛋白质的成对比对参数如下：Ktuple为1；空位罚分为3；窗口为5；对角线存为5。cDNA的成对比对参数如下：Ktuple为2；空位罚分为5；窗口为4；对角线存为4。蛋白质比对的相似群为：(M，I，L，V)，(F，W，Y)，(G，A)，(S，T)，(R，K，H)，(E，D)，(N，Q)。鼠耳芥属cDNA和蛋白质序列中标明的值代表各种组合发现的最低和最高值。
A.基因名称：AtCKX1(鼠耳芥细胞分裂素氧化酶样蛋白质1，SEQ ID NO1)
数据库定位(登录号、bac定位)：AC002510，255个完整序列的鼠耳芥染色体II 225区。序列来自克隆T32G6。
在数据库中预测的ORF：
15517..16183，16415..16542，16631..16891，16995..17257，17344..17752
AtCKX1 cDNA序列如SEQ ID NO 25所列
预测的蛋白质序列：SEQ ID NO 2
同源性
与玉蜀黍(Z.mays)cDNA的同一性％：
31,5％(Dn astar/MegAlign-Clustal方法)
与玉蜀黍蛋白质的相似性％：
32,2％(Dnastar/MegAlign-Clustal方法)
与其它鼠耳芥属cDNA的同一性％(范围)：
38,2％(AtCKX2)-54,1％(AtCKX6)(Dnastar/MegAlign-Clustal方法)
与其它鼠耳芥属蛋白质的相似性％(范围)：
37,1％(AtCKX2)-58,1％(AtCKX6)(Dnastar/MegAlign-Clustal方法)
B.基因名称：AtCKX2(鼠耳芥细胞分裂素氧化酶样蛋白质2，SEQ ID NO3)
数据库定位(登录号、bac定位)：AC005917，255个完整序列的鼠耳芥染色体II 113区。序列来自克隆F27F23、F3P11。
在数据库中预测的ORF：
互补，40721..41012，41054..41364，41513..41770，42535..42662，43153..43711
请注意：本发明人利用基因预测程序NetPlantGene(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetGene2/)鉴定的cDNA序列不同于数据库中注释的序列。根据新的cDNA序列，修正了在数据库中预测的ORF：互补，40721..41012，41095..41364，41513..41770，42535..42662，43153..43711
该cDNA序列编码的蛋白质序列如SEQ ID NO 4所列。利用一步RT-PCR试剂盒(Qiagen，Hilden，Germany)，从AtKX2转基因植物组织的总RNA中RT-PCR克隆AtCKX2的cDNA，并利用ABI PRISM Big Dye Terminator循环测序反应试剂盒(Perkin Elmer Applied Biosystems Division)测序。这证实本发明人鉴定和预测的cDNA序列是正确的。新的AtCKX2 cDNA序列如SEQ ID NO 26所列。对应于AtCKX2 cDNA 1171-1254核苷酸的84-bp片段列于SEQ ID NO 31。该84-bp cDNA序列对应的肽序列如SEQ ID NO 32所列。
同源性
与玉蜀黍cDNA的同一性％：
38,4％(Dnastar/MegAlign-Clustal方法)
与玉蜀黍蛋白质的相似性％：
37,5％(Dnastar/MegAlign-Clustal方法)
与其它鼠耳芥属cDNA的同一性％(范围)：
34,9％(AtCKX6)-64,5％(AtCKX4)(Dnastar/MegAlign-Clustal方法)
与其它鼠耳芥属蛋白质的相似性％(范围)：
36,5％(AtCKX6)-66,1％(AtCKX4)(Dnastar/MegAlign-Clustal方法)
C.基因名称：AtCKX3(鼠耳芥细胞分裂素氧化酶样蛋白质3，SEQ ID NO 5)
数据库定位(登录号、bac定位)：AB024035，鼠耳芥基因组DNA、染色体5、P1克隆：MHM17，全序列。
数据库中没有预测到ORF。
本发明人利用若干基因预测程序鉴定该基因，包括GRAIL(ftp://arthur.epm.ornI.gov/pub/xgrail)，Genscan(http://CCR-081.mit.edu/GENSCAN.html)和NetPlantGene(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetGene2/)：
互补，29415..29718，29813..30081，30183..30443，30529..30656，32107..32716
本发明人鉴定的新的AtCKX3 cDNA序列如SEQ ID NO 27所列
根据自身ORF预测的蛋白质序列：SEQ ID NO 6
同源性
与玉蜀黍cDNA的同一性％：
38,7％(Dnastar/MegAlign-Clustal方法)
与玉蜀黍蛋白质的相似性％：
39,2％(Dnastar/MegAlign-Clustal方法)
与其它鼠耳芥属cDNA的同一性％(范围)：
38,8％(AtCKX6)-51,0％(AtCKX2)(Dnastar/MegAlign-Clustal方法)
与其它鼠耳芥属蛋白质的相似性％(范围)：
39,9％(AtCKX6)-46,7％(AtCKX2)(Dnastar/MegAlign-Clustal方法)
D.基因名称：AtCKX4(鼠耳芥细胞分裂素氧化酶样蛋白质4，SEQ ID NO 7)
数据库定位(登录号、bac定位)：
1)AL079344，鼠耳芥DNA染色体4，BAC克隆T16L4(ESSA计划)
2)AL161575，鼠耳芥DNA染色体4，重叠群(contig)片段号71。
在数据库中预测的ORF：
1)76187..76814，77189..77316，77823..78080，78318..78586，78677..78968
2)101002..101629，102004..102131，102638..102895，103133..103401，103492..103783
AtCKX4 cDNA序列如SEQ ID NO 28所列
预测的蛋白质序列：SEQ ID NO 8
同源性
与玉蜀黍cDNA的同一性％：
41,0％(Dnastar/MegAlign-Clustal方法)
与玉蜀黍蛋白质的相似性％：
41,0％(Dnastar/MegAlign-Clustal方法)
与其它鼠耳芥属cDNA的同一性％(范围)：
35,2％(AtCKX6)-64,5％(AtCKX2)(Dnastar/MegAlign-Clustal方法)
与其它鼠耳芥属蛋白质的相似性％(范围)：
35,1％(AtCKX6)-66,1％(AtCKX2)(Dnastar/MegAlign-Clustal方法)
E.基因名称：AtCKX5(鼠耳芥细胞分裂素氧化酶样蛋白质5，SEQ ID NO 9)
数据库定位(登录号、bac定位)：AC023754，F1B16，全序列，染色体1
数据库中没有预测到ORF。
本发明人利用若干基因预测程序鉴定该基因，包括GRAIL(ftp://arthur.epm.ornI.cov/Pub/xgrail)，Genscan(http://CCR-081.mit.edu/GENSCAN.html)和NetPlantGene(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetGene2/)。
43756..44347，44435..44562，44700..44966，45493..45755，46200..46560
本发明人鉴定并预测的新的AtCKX5cDNA序列如SEQ ID NO 29所列。该cDNA预测的蛋白质序列如SEQ ID NO 10所列。第二个可能的ATG起始密码子位于基因组序列更上游的9个核苷酸。尚不清楚这两个起始密码子中，哪个编码该蛋白质的第一个氨基酸。因此，起始于该上游起始密码子的第二个可能的AtCKX5 cDNA也列于本发明的SEQ ID NO 34。相应的基因组序列如SEQ ID NO 33所列，编码的蛋白质为SEQ ID NO 35。
同源性
与玉蜀黍cDNA的同一性％：
39,1％(Dnastar/MegAlign-Clustal方法)
与玉蜀黍蛋白质的相似性％：
36,6％(Dnastar/MegAlign-Clustal方法)
与其它鼠耳芥属cDNA的同一性％(范围)：
40,1％(AtCKX2)-44,0％(AtCKX3)(Dnastar/MegAlign-Clustal方法)
与其它鼠耳芥属蛋白质的相似性％(范围)：：
41,6％(AtCKX4)-46,4％(AtCKX6)(Dnastar/MegAlign-Clustal方法)
F.基因名称：AtCKX6(鼠耳芥细胞分裂素氧化酶样蛋白质6，SEQ ID NO 11)
数据库定位(登录号、bac定位)：AL163818，鼠耳芥DNA染色体3，P1克隆MAA21(ESSA计划)。
在数据库中预测的ORF：
46630..47215，47343..47470，47591..47806，47899..48161，48244..48565
AtCKX6cDNA序列如SEQ ID NO 30所列
预测的蛋白质序列：SEQ ID NO 12
同源性
与玉蜀黍cDNA的同一性％：：
37,3％(Dnastar/MegAlign-Clustal方法)
与玉蜀黍蛋白质的相似性％：：
36,1％(Dnastar/MegAlign-Clustal方法)
与其它鼠耳芥属cDNA的同一性％(范围)：
34,9％(AtCKX2)-54,1％(AtCKX1)(Dnastar/MegAlign-Clustal方法)
与其它鼠耳芥属蛋白质的相似性％(范围)：
35,1％(AtCKX4)-58,1％(AtCKX1)(Dnastar/MegAlign-Clustal方法)
基因AtCKX3和AtCKX5在数据库中没有注释为推定的细胞分裂素氧化酶，并且未给出这些基因的ORF。此外，预测的AtCKX2 ORF(以及随之的蛋白质结构)不同于我们自己的预测，我们的预测由AtCKX2cDNA测序证实。
鼠耳芥属AtCKX基因1-4与玉米CKX基因的基因结构比较如图1所示。
预测的鼠耳芥属AtCKX基因编码的蛋白质与玉米蛋白质之间显示32％和41％的序列相似性，而它们彼此之间显示35％和66％的序列相似性。由于序列保守性降低，事先并不清楚鼠耳芥属AtCKX基因是否编码具有细胞分裂素氧化酶活性的蛋白质。鼠耳芥属AtCKX预测蛋白质1-4与玉米CKX基因的比对如图2所示。
实施例3.过量表达AtCKX1的转基因植物显示增强的细胞分裂素氧化酶活性以及植物形态学改变
1.克隆过程描述
下列引物用于从鼠耳芥(Arabidopsis thaliana，accession Columbia)中PCR扩增AtCKX1基因(小写字母为用于克隆的非同源序列)：
5′引物序列：cggtcgacATGGGATTGACCTCATCCTTACG(SEQ ID NO：13)
3′引物序列：gcgtcgacTTATACAGTTCTAGGTTTCGGCAGTAT(SEQ ID NO：14)
这些引物扩增的2235-bp PCR片段插入pUC19的Sal I位点。插入序列测序并证实PCR扩增产物不含任何突变。该载体的Sall/Sall片段亚克隆到双载体pBinHyg-Tx的改变的CaMV 35S启动子(携带三个四环素操纵子序列)下游的Sall位点(Gatz等人，1992)。利用标准转化规程，通过土壤杆菌介导的转化将产生的构建体引入烟草和鼠耳芥。
2.转基因系的分子分析
鉴定了高水平合成AtCKX1转录物的若干转基因系(图3)。表达AtCKX1转录物的转基因系也显示增强的细胞分裂素氧化酶活性(由所述的基于[2-3H]iP转变为腺嘌呤的细胞分裂素氧化酶活性标准试验测定(Motyka等，1996))。
这由表6中2个烟草系和2个鼠耳芥属系举例说明。此结果证明，AtCKX1基因编码具有细胞分裂素氧化酶活性的蛋白质。
表6.AtCKX1转基因植物组织的细胞分裂素氧化酶活性
3.转基因系的表型描述
3.1在烟草中：
该植物具有矮化表型，顶端优势下降(图7A、B和C)以及根产生增强(图8)。
五种表型：
1)强-2个克隆
2)中-3个克隆
3)弱-4个克隆
4)高大植物(同WT)、大花序-5个克隆
5)类似于WT，9个克隆
高度(见图7B和C)
-WT：介于100-150cm
-弱：大约75cm
-中：大约40-45cm(主茎大约25cm，但侧枝生长过度。
-强：大约10cm
转基因的AtCKX1-48和AtCKX1-50显示强的表型。以下为同WT植物相比测量茎的伸长：
实验：植物在温室土壤中生长。数据采自每系至少十株植物。
叶子(参见图7D和E)
AtCKX1转基因表达子的叶子形状为披针形(长而窄)：成熟叶的宽-长比值从野生型植物1∶2减少到AtCKX1转基因的1∶3(图7E)。叶数和叶面比WT减少(参见图7D)。也注意到叶老化进展的显著差异。在WT烟草中，叶老化开始于最基部的叶子，引起叶色素的均匀减少(图7E)。相反，强表达AtCKX1植物的老化叶子的叶脉保持绿色，而脉间区域变黄，表明叶的衰老变化。老叶的质地更坚硬。
根
该基因高表达的体外生长植物能够形成更多较粗(较强壮)的根，并沿着茎形成气生根，因而容易与WT区分，
如图8C所示，AtCKX1-50过量表达幼苗的初生根较长，侧根和不定根的数目较多(参见实施例9)。
外源细胞分裂素抑制根生长的剂量-反应曲线表明转基因幼苗的根对细胞分裂素的抗性高于WT的根(图8D)。AtCKX1转基因植物对iPR的抗性较之AtCKX2不明显，这与后者中iP型细胞分裂素的变化较小相一致(见表10)。
土壤中生长的成熟植物尽管地上部分的生长大大减少，但观察到根生物量大量增加(土壤中生长4-5个月的植物参见图8B)。
节间距离
●中间表型：花序下方第五节间约为2.5cm长，第九节间约为0.5cm长，而WT植物的第五和第九节间分别为5cm和2cm长。
●强表型：植物AtCKX1-50于萌芽后131天测量下数第二十节间长度为1.3±0.4mm，WT为39.2±3.8mm
顶端优势和分枝
在营养生长期间形成更多侧枝表明与WT植物相比顶端优势降低(参见图9)。中间型AtCKX1表达子主茎侧枝过度生长，高度达到40-45cm。甚至出现次生枝。然而，芽并没有完全从顶端优势脱落，即侧枝没有真正继续发育。顶端优势降低可能归因于枝条顶端分生组织较小而导致植物生长素产生减少(参见实施例10)。
繁殖发育
AtCKX1转基因植物的开花起始延迟，花的数目和每粒蒴果的种子产量减少。转基因植物花的大小没有变化，各粒种子的重量与野生型植物种子的重量相当。以下概述了两个典型的AtCKX1转基因植物的数据：
A.开花起始
实验：数据采自每系至少十株植物。第一朵花完全伸展定义为开花起始。DAG＝萌芽后天数。
B.每株植物的种子蒴果数目
实验：至少从5株不同植物确定种子蒴果数目。请注意这些植物冬季在温室条件下生长。这对花形成的数目有负面影响，特别是在转基因克隆中。然而，其花形成数目减少的概况是正确的。n.d.，未确定
C.种子产量/蒴果(mg)
实验：种子产量至少由12个种子蒴果确定。种子蒴果的大小变化很大，因此标准偏差大。n.d.，未确定
D.100粒种子的重量(mg)
实验：种子生物量由来自至少5个不同种子蒴果的100粒种子的重量确定。n.d.，未确定
3.2鼠耳芥属中
-萌芽起始与WT相同
-总根系增大，旁根和不定根数目增加(参见图4A-D)
-地面器官的生长减弱，产生矮化表型(参见图4E和F)，叶生物量减少。叶和花的形成推迟。
-与WT相比，生命周期较长，种子产量下降
下列形态学数据说明这些表型：
根发育
A.根系总长度
B.初生根长度
C.侧根(LR)长度
D.不定根长度
E.侧根(LR)数目
F.不定根(AR)数目
实验：植物于MS培养基中体外萌芽8天后进行测量。每系至少计数17株植物。
枝条发育
A.叶面
实验：测量在萌芽30天后形成的主要莲座叶的叶面面积。每个克隆分析3株植物。
繁殖发育
开花起始
实验：植物在温室条件下生长。每个克隆分析至少13株植物。DAG＝萌芽后天数
结论：AtCKX1转基因的鼠耳芥属植物的分析很大程度上证实了从烟草中获得的结果，表明减少细胞分裂素含量所致后果的普遍特性。总根系增大(AtCKX1转基因植物的总根长增加大约110-140％)，枝条发育更慢(开花延迟)以及叶生物量减少。转基因植物的种子产量也降低(数据未显示)。
实施例4.过量表达AtCKX2的转基因植物显示增强的细胞分裂素氧化酶活性以及植物形态学改变
1.克隆过程描述
下列引物用于从鼠耳芥(Arabidopsis thaliana，accession Columbia)中PCR扩增AtCKX2基因(小写字母为用于克隆的非同源序列)：
5′引物序列：gcggtaccAGAGAGAGAAACATAAACAAATGGC(SEQ ID NO：15)
3′引物序列：gcggtaccCAATTTTACTTCCACCAAAATGC(SEQ ID NO：16)
这些引物扩增的3104-bp PCR片段插入pUC19的KpnI位点。插入序列测序以检查PCR方法未引入与发表序列的差异。该载体的KpnI/KpnI片段亚克隆到双载体pBinHyg-Tx的改变的CaMV 35S启动子(携带三个四环素操纵子序列)下游的KpnI位点(Gatz等人，1992)。利用标准转化规程，通过土壤杆菌介导的转化将产生的构建体引入烟草和鼠耳芥。
2.转基因系的分子分析
鉴定了高水平合成AtCKX2转录物的若干转基因系(图6)。表达AtCKX2转录物的转基因系也显示增强的细胞分裂素氧化酶活性。这由表7中2个烟草系和3个鼠耳芥属系举例说明。此结果证明AtCKX2基因编码具有细胞分裂素氧化酶活性的蛋白质。
表7.AtCKX2转基因植物组织的细胞分裂素氧化酶活性
3.转基因系的表型描述
3.1在烟草中(参见图7-10)：
三种表型：
1)强-15个克隆(类似于AtCKX1的中间表型)
2)弱-6个克隆
3)其它-类似于WT植物，7个克隆
植物地上部分
有关植株高度、节间距离、分枝、叶子形成及变黄的观察结果类似于AtCKX1转基因植物，一般具有某些微小的数量差异，AtCKX1转基因植物比AtCKX2转基因的矮化特性更严重(图7A和B比较了AtCKX1植物与AtCKX2植物)。以下强表型克隆AtCKX2-38和AtCKX2-40的茎伸长和节间距离的测量说明了这一点：
茎伸长
实验：植物在温室土壤中生长。数据采自每系至少十株植物。
节间距离
实验：萌芽131天后测量从下数第二十节间的长度。
根
基因高表达的体外生长植物能够形成更多较粗(较强壮)的根，并沿着茎形成气生根，因而容易与WT植物区分。
如图8C所示，AtCKX2-38过量表达幼苗的初生根较长，侧根和不定根的数目较多(参见实施例9)。
外源细胞分裂素抑制根生长的剂量-反应曲线表明转基因幼苗的根对细胞分裂素的抗性高于WT的根(图8D)。AtCKX1-28转基因植物对iPR的抗性比AtCKX2-38不明显，这与后者中iP型细胞分裂素的变化较小相一致(参见表10)。
对于土壤中生长的植物，观察到AtCKX2转基因植物T0系的根生物量的鲜重和干重比WT增加，如下表所示：
实验：六个WT植物和六个独立的T0系35S::AtCKX2克隆在土壤中生长。开花后，用水洗涤根系，尽可能除去土壤，测量鲜重和干重。
对于水培生长的植物，也观察到AtCKX2转基因植物F1代的根生物量的鲜重和干重比WT增加，如下表所示：
实验：萌芽60天后，土壤生长的植物转移到水培体系(Hoagland″s溶液)，再生长60天。水培溶液连续通气，每3天更换新鲜溶液。
总之，水培溶液中生长的转基因植物比野生型植物形成的根生物量多大约65-150％(鲜重)。干重增加10-50％。这种差异可能部分由于转基因植物的细胞体积大。这使细胞壁相应成分减少，其形成大部分的干物质。枝条生物量减少为野生型枝条的20％-70％。鲜重的差异导致枝条/根比值变动，野生型约为8，而转基因克隆约为1。
结论：
不同条件下生长的AtCKX2转基因幼苗和成熟植物与WT对照相比，观察到根的生长和生物量增加，尽管其地上植物部分的生长下降。在不同转基因植物之间观察到数量差异：最强表达克隆观察到根生物量的增加较大。
繁殖发育
AtCKX2转基因植物的开花起始延迟，花的数目和每粒蒴果的种子产量减少。这些效应非常类似于AtCKX1转基因植物的观察结果，但在AtCKX2转基因植物中并不显著，如下表所示。转基因植物花的大小没有变化，各粒种子的重量与野生型植物种子的重量相当。
A.开花起始
实验：数据采自每系至少十株植物。第一花完全伸展定义为开花起始。DAG＝萌芽后天数。
B.每株植物的种子蒴果数目
实验：至少从5株不同植物确定种子蒴果数目。请注意这些植物冬季在温室条件下生长。这对花形成的数目有负面影响，特别是在转基因克隆中。然而，其花形成数目减少的概况是正确的。n.d.，未确定
C.种子产量/蒴果(mg)
实验：种子产量至少由12个种子蒴果确定。种子蒴果的大小变化很大，因此标准偏差大。n.d.，未确定
D.100粒种子的重量(mg)
实验：种子生物量由来自至少5个不同种子蒴果的100粒种子的重量确定。n.d.，未确定
3.2鼠耳芥属中：
由AtCKX2转基因植物获得下列形态学数据：
根发育
A.根系总长度
B.初生根长度
C.侧根长度
D.不定根长度
E.侧根(LR)数目
F.不定根(AR)数目
实验：植物于体外MS培养基中8d.a.g后进行测量。每系至少计数17株植物。
枝条发育
叶面
实验：测量在萌芽30天后形成的主要莲座叶的叶面面积。每个克隆分析3株植物。
繁殖发育
开花起始
实验：植物在温室条件下生长。每个克隆分析至少13株植物。DAG＝萌芽后天数
结论：鼠耳芥属AtCKX2转基因植物叶生物量减少以及类似于AtCKX1转基因植物的矮化表型(比较图5和图4F)。AtCKX2转基因鼠耳芥属的总根系也增大。AtCKX2转基因植物的总根长增加约50％。AtCKX1转基因植物的初生根较长，旁根较多，并形成较多不定根。AtCKX2转基因植物的初生根没有增强生长，但比WT形成更多的旁根和侧根。
小结：
观察到AtCKX2转基因植物的表型与AtCKX1转基因植物非常类似但并不相同，与烟草转基因植物获得的结果也非常类似但并不相同。这证实在这两个植物品种中减少细胞分裂素含量所致后果的普遍特性，因此类似表型在其它植物品种中也可能发生。烟草和鼠耳芥属之间的主要区别在于AtCKX2过量表达植物没有增强初生根的生长(数据未显示)。
实施例5.过量表达AtCKX3转基因植物显示增强的细胞分裂素氧化酶活性以及植物形态学改变
1.克隆过程描述
下列引物用于从鼠耳芥(Arabidopsis thaliana，accession Columbia)中PCR扩增AtCKX3基因(小写字母为用于克隆的非同源序列)：
5′引物序列：gcggtaccTTCATTGATAAGAATCAAGCTATTCA(SEQ ID NO：17)
3′引物序列：gcggtaccCAAAGTGGTGAGAACGACTAACA(SEQ ID NO：18)
PCR扩增产生的3397-bp PCR片段插入pBluescript的KpnI位点。插入序列测序以证实PCR扩增产物与基因比较没有序列变化。该载体的KpnI/KpnI片段亚克隆到双载体pBinHyg-Tx的改变的CaMV 35S启动子(携带三个四环素操纵子序列)下游的KpnI位点(Gatz等人，1992)。利用标准转化规程，通过土壤杆菌介导的转化将产生的构建体引入烟草和鼠耳芥。
2.转基因系的分子分析
鉴定了高水平合成AtCKX3转录物的若干转基因烟草系(图11A)。表达AtCKX3转录物的转基因烟草系也显示增强的细胞分裂素氧化酶活性。这由表8中的3个植物举例说明。此结果证明AtCKX3基因编码具有细胞分裂素氧化酶活性的蛋白质。
表8.AtCKX4转基因植物组织的细胞分裂素氧化酶活性
3.植物表型分析
在烟草和鼠耳芥属中过量表达AtCKX3基因所产生的表型基本上类似于表达AtCKX1和AtCKX2的植物，即增强生根及矮化。然而，在烟草中过量表达AtCKX3基因比AtCKX2产生更强的表型。在这种意义上讲，过量表达AtCKX3与过表达AtCKX1更为相似。
实施例6.过量表达AtCKX4的转基因植物显示增强的细胞分裂素氧化酶活性以及植物形态学改变
1.克隆过程描述
下列引物用于从鼠耳芥(Arabidopsis thaliana，accession Columbia)中PCR扩增AtCKX4基因(小写字母为用于克隆的非同源序列)：
5′引物序列：gcggtaccCCCATTAACCTACCCGTTTG(SEQ ID NO：19)
3′引物序列：gcggtaccAGACGATGAACGTACTTGTCTGTA(SEQ ID NO：20)
PCR扩增产生的2890-bp PCR片段插入pBluescript的KpnI位点。插入序列测序以证实PCR扩增产物与基因比较没有序列变化。该载体的KpnI/KpnI片段亚克隆到双载体pBinHyg-Tx的改变的CaMV 35S启动子(携带三个四环素操纵子序列)下游的KpnI位点(Gatz等人，1992)。利用标准转化规程，通过土壤杆菌介导的转化将产生的构建体引入烟草和鼠耳芥。
2.转基因系的分子分析
高水平合成AtCKX4转录的若干转基因烟草系(图11B)。表达AtCKX4转录物的转基因系也显示增强的细胞分裂素氧化酶活性。这由表9中3个鼠耳芥属系和3个烟草系举例说明。此结果证明AtCKX4基因编码具有细胞分裂素氧化酶活性的蛋白质。
表9.AtCKX4转基因植物组织的细胞分裂素氧化酶活性
总之，数据表明四个细胞分裂素氧化酶以iP为底物的表观Km值介于0.2-9.5μM范围内，这进一步表明AtCKX1-4编码的蛋白质确实是如此处公开的细胞分裂素氧化酶。
3.植物表型分析
在烟草和鼠耳芥属中过量表达AtCKX4基因所产生的表型基本上类似于表达AtCKX1和AtCKX2的植物，即生根增强、顶端优势降低、矮化以及烟草老叶的脉间区域变黄。烟草中另外的表型为披针形叶(改变长-宽比例)。
过量表达AtCKX烟草植物的一般观察结果
总之，表型分析表明在烟草中过量表达AtCKX基因引起植物枝条和根系发育的剧烈变化，包括根系发育增强以及植物地上部分矮化。如此处公开，也观察到其它效应，例如改变叶老化、在茎上形成不定根等。不同的基因，其变化非常相似，但并不相同。在烟草中，AtCKX1和AtCKX3过量表达子及AtCKX2和AtCKX4的相似。前两者一般显示较高表达的性状，特别是在枝条中。因此，可优选特定的细胞分裂素氧化酶基因以获得本发明实施方案中所述表型。
实施例7.AtCKX5基因的克隆
下列引物用于从鼠耳芥(Arabidopsis thaliana，accession Columbia)中PCR扩增AtCKX5基因(小写字母为用于克隆的非同源序列)：
5′引物序列：ggggtaccTTGATGAATCGTGAAATGAC(SEQ ID NO：21)
3′引物序列：ggggtaccCTTTCCTCTTGGTTTTGTCCTGT(SEQ ID NO：22)
5′引物序列包括AtCKX5蛋白质两个潜在的起始密码子，下划线为最5′的起始密码子，斜体表示第二个ATG。PCR扩增产生的2843-bpPCR片段，以平端产物插入pCR-Blunt II-TOPO克隆载体(Invitrogen)。
实施例8.AtCKX6基因克隆
下列引物用于从鼠耳芥(Arabidopsis thaliana，accession Columbia)中PCR扩增AtCKX6基因(小写字母为用于克隆的非同源序列)：
5′引物序列：gctctagaTCAGGAAAAGAACCATGCTTATAG(SEQ ID NO：23)
3′引物序列：gctctagaTCATGAGTATGAGACTGCCTTTTG(SEQ ID NO：24)
PCR扩增产生的1949-bp PCR片段，以平端产物插入pCR-Blunt II-TOPO克隆载体(Invitrogen)。
实施例9.烟草幼苗生长测试表明AtCKX转基因植物的早期活力
过量表达AtCKX1-50和AtCKX2-38转基因植物和WT烟草的种子体外播种在MS培养基中，低温处理后4天带到培养间，6天后萌芽。萌芽10天后观察幼苗生长(参见图8C)，总结如下。每个克隆至少计数20株个体。两次不同实验获得相似数据。
A.根系总长度
B.初生根长度
C.侧根长度
D.不定根长度
E.侧根(LR)数目
F.不定根(AR)数目
AtCKX1和AtCKX2植物的一般观察结果：
萌芽10天以后，与未转化的对照植物相比，AtCKX1和AtCKX2过量表达烟草植物的幼苗的不定根多出60％，侧根多出3倍。初生根的长度增加约70％。加之更多、更长的旁根和次生根，使总根长增加70-100％。这些结果表明过量表达细胞分裂素氧化酶增强了主根和不定根的生长和发育，引起早期活力。
实施例10.AtCKX1过量表达烟草植物形态学变化的组织学分析
显微镜分析不同组织揭示AtCKX转基因植物的形态变化是细胞数目和细胞形成速度方面显著变化的反映(参见图10)。AtCKX1转基因植物的枝条顶端分生组织(SAM)比野生型小，位于侧器形成的中央带和边缘带之间的细胞较少，但细胞大小相同(图10A)。细胞分裂素含量减少导致SAM的细胞数目和大小减少，表明细胞分裂素具有控制SAM增殖的作用。分化样式没有发生明显变化，提示SAM分化带的空间定向很大程度上与细胞数目以及局部细胞分裂素浓度无关。细胞分裂素氧化酶过量表达子叶子的整体组织样式没有变化。但韧皮部和木质部的大小显著减少(图10B)。相反，叶薄壁组织和表皮细胞的平均细胞大小增加4-5倍(图10C、D)。AtCKX1转基因植物以野生型叶3-4％的速度形成新细胞，估计叶子的最终细胞数目介于野生型的5-6％。这表明为了维持细胞分裂周期，叶中绝对需要细胞分裂素。花器的细胞大小和细胞类型均未改变，每粒蒴果的种子产量在野生型及AtCKX转基因植物中相似。AtCKX1转基因植物根分生组织的细胞群体大约增大4倍，中囊轴(columnella)和侧囊轴中细胞数目均增多(图10E、F)。由于各类根细胞的直径增大，最终根部直径增加60％。野生型和转基因植物根的径向样式相同，不同之处在于经常注意到转基因根皮层细胞存在第四层(图10G)。细胞数目增加而细胞长度略微减少表明根生长增强是由于周期细胞数目增加，而非细胞生长增强。细胞分裂素含量降低的情况下，根分生组织细胞必须经历另轮有丝分裂，才能脱离分生组织并开始伸长。因此，脱离分生组织由对细胞分裂素敏感的机制来调节。显然，细胞分裂素对根分生组织具有负调节作用，野生型细胞分裂素浓度受抑制以发育出最大的根系。因此，利用过量表达细胞分裂素氧化酶减少活性细胞分裂素的水平刺激根发育，其导致与WT植物相比，根的大小增加，具有更多的侧根和不定根。
实施例11.AtCKX1和AtCKX2过量表达的烟草植物细胞分裂素含量减少。
在测量的16个不同的细胞分裂素代谢物中，AtCKX2过量表达子中iP型细胞分裂素的变化最大(表10)：表达AtCKX2植物中iP型细胞分裂素含量全面下降比AtCKX1转基因植物更为显著。AtCKX1转基因植物的枝条显示更强的表型。尚未了解与所分析的不同性状相对应的细胞分裂素代谢物。不同形式的细胞分裂素可能在不同的发育过程中发挥不同的作用。注意到Z型细胞分裂素的变化较小，这可能是由于底物的可及性不同，或者蛋白质的底物特异性下降。各个转基因克隆的iP和Z代谢物的总含量介于野生型的31％-63％之间。转基因植物中O-葡糖苷的细胞分裂素储备库也降低(表10)。N-葡糖苷和DHZ型细胞分裂素的浓度很低，在转基因幼苗中没有或者只略微改变(数据未显示)。
表10.AtCKX转基因植物的细胞分裂素含量。按Faiss等人，1997所述进行细胞分裂素的提取、免疫纯化、HPLC分离以及ELISA方法定量。每个克隆分析大约100株两周龄幼苗的三个独立混合样本(每样本2.5g)。浓度为pmol x g鲜重-1。缩写：iP，N6(Δ2异戊烯基)腺嘌呤；PR，N6-(Δ2异戊烯基)腺嘌呤核苷；iPRP，N6(Δ2异戊烯基)腺嘌呤核苷5′-一磷酸；Z，反式-玉米素；ZR，玉米素核苷；ZRP,玉米素核苷5′-一磷酸；ZOG，玉米素O-葡糖苷；ZROG，玉米素核苷O-葡糖苷。
实施例12.嫁接实验表明AtCKX过量表达所致矮化和根发育增强限于转基因组织
为研究细胞分裂素氧化酶过量表达的哪些表型效应限于表达的组织(即为细胞或器官自主性状)进行嫁接实验。在AtCKX2转基因烟草植物和WT烟草之间进行交互嫁接。该实验使用的转基因植物是显示强表型的AtCKX2-38，其特征在于根生长增强以及植物地上部分发育减少。如实施例3-6所述，这是烟草和鼠耳芥属中由细胞分裂素氧化酶过量表达所致的两个重要表型。
嫁接并且嫁接接点位于土壤以上约10cm的时植物大约15cm高。图12所示为嫁接15周后的植物。主要结果是：(i)嫁接在转基因根状茎上的WT接穗的地上表型类似于WT嫁接对照(＝WT根状茎上的WT接穗)。重要的是，这表明在根状茎中过量表达AtCKX2转基因不诱导该植物非转基因的地上部分的矮化(参见图12A)。转基因根状茎维持其根生长增强，表明AtCKX转基因植物的根生长增强是自主性的，并不依赖于AtCKX转基因枝条(图12C)。有趣的是，嫁接在转基因根状茎上的WT接穗看上去健康，并且发育良好。值得注意的是，这些植物的基生叶延迟老化(参见图12A)；(ii)嫁接在WT根状茎上的转基因接穗看上去类似于所来源的转基因植物的地上部分，即枝条矮化表型也是自主性的，并不依赖于根生长的增强(参见图12B)。
嫁接在转基因根状茎上的WT枝条除上述优良表现之外，注意到在WT枝条的基底部形成不定根(图12D，右侧植物)。在AtCKX转基因植物茎上也形成不定根，但WT对照嫁接物的茎上没有(图12D，左侧植物)，因而似乎是非自主性性状。
总之，本发明公开了AtCKX过量表达烟草的根形成增强以及枝条矮化是自主性性状，并可以通过嫁接方法而分离。令人吃惊的是，在AtCKX转基因根状茎上嫁接WT接穗引起的植物生长更具活力，并延迟叶子老化。
除嫁接之外，可以使用组织特异性启动子分离细胞分裂素过表达的自主性表型效应。因此，本发明公开了以组织特异性方式过量表达细胞分裂素氧化酶可用于改变植物例如枝条或根的形态学。
实施例13.转基因植物中在根特异性启动子控制下AtCKX基因的表达导致根产量增加
将AtCKX基因(参见实施例4)克隆于可驱动根特异性表达的鼠耳芥属根clavata同源性启动子(SEQ ID NO 36)控制之下。其它根特异性启动子也可用于本发明目的。代表性的根特异性启动子参见表5。
在根中特异性表达AtCKX基因的转基因植物显示根产生提高，而对该植物地上部分的生长和发育没有负面影响。观察到对叶子老化和植物地上部分生长的正效应。
实施例14.转基因植物中在衰老诱导型启动子控制之下AtCKX基因的抑制导致叶老化延迟以及种子产量增加。
将设计为抑制内源细胞分裂素氧化酶基因表达的、来源于AtCKX基因的嵌合基因构建体克隆于衰老诱导型启动子控制之下。例如，可以使用来源于衰老相关基因(SAG)的启动子，例如SAG 12启动子(Quirino等人，2000)。在老化叶子中特异性抑制内源细胞分裂素氧化酶基因的转基因植物显示叶老化延迟以及种子产量较高，而对该植物的形态学以及生长和发育没有负面影响。
实施例15.在雌性繁殖器官中过量表达AtCKX基因导致单性果实发育
将AtCKX基因的开放阅读框架克隆于使其在雌性繁殖器官中过表达的启动子控制之下，例如金鱼草(Antirrhinum majus)DefH9启动子或其同系物，其在胎座和胚珠中具有高表达特异性。在这些组织中细胞分裂素氧化酶活性提高的转基因植物显示单性果实发育。
参考文献
WO0105985.Method to modulate the expression of genes inducing the parthenocarpic trait in plants.
Alberts，B.，Bray，D.，Lewis，J.，Raff，M.，Roberts，K.，and Watson，J.D.(1994).″Molecular Biology of the Cell.″Garland Publishing Inc.
Altschul，S.F.，Madden，T.L.，A.A.，Zhang，J.，Zhang，Z.，Miller，W.& Lipman，D.J.(1997)″Gapped BLAST and PSI-BLAST：a new generation of protein database search programs.″Nucl.Acids Res.25，3389-3402.
An，G.，Watson，B.D.，Stachel，S.，Gordon，M.P.，and Nester，E.W.(1985).New cloning vehicles for transformation of higher plants.EMBO J.4，277-284.
Armstrong，C.L.，Petersen，W.P.，Buchholz，W.G.，Bowen，B.A.，and Sulc，S.L.(1990).Factors affecting PEG-mediated stable transformation of maize protoplasts.Plant Cell Reports 9，335-339.
Banerjee，A.，Pramanik，A.，Bhattacharjya，S.，and Balaram，P.(1996).Omega amino acids in peptide design：incorporation into helices.Biopolymers 39，769-777.
Baron，M.H.and Baltimore，D.(1982).Antibodies against the chemically synthesized genome-linked protein of poliovirus react with native virus-specific protei ns.Cell 28，395-404.
Bartel，P.L.and Fields，S.(1997).“The Yeast Two-Hybrid System.”Oxford University Press.
Benkirane，N.，Guichard，G.，Briand，J.P.，and Muller，S.(1996).Exploration of requirements for peptidomimetic immune recognition.Antigenic and immunogenic properties of reduced peptide bond pseudopeptide analogues of a histone hexapeptide.J.Biol Chem.271，33218-33224.
Berry，A.and Brenner，S.E.(1994).A prototype computer system for de novo protein design.Biochem.Soc.Trans.22，1033-1036.
Christou，P.，McCabe，D.E.，and Swain，W.F.(1988).Stable transformation of soybean callus by DNA-coated gold particles.Plant Physiol.87，671-674.
Crossway，A.，Oakes，J.V.，Irvine，J.M.，Ward，B.，Knauf，V.C.，and Shewmaker，C.K.(1986).Integration of foreign DNA following microinjection of tobacco mesophyll protoplasts.Mol.Gen.Genet.202，179-185.
Dale，E.C.and Ow，D.W.(1990).Intra-and intermolecular site-specific recombination in plant cells mediated by bacteriophage P1 recombinase.Gene 91，79-85.
Dodds，J.H.(1985).“Plant genetic engineering.”Cambridge University Press.
Doerner，P.，Jorgensen，J.E.，You，R.，Steppuhn，J.，and Lamb，C.(1996).Control of root growth and development by cyclin expression.Nature 380，520-523.
Dorner，B.，Husar，G.M.，Ostresh，J.M.，and Houghten，R.A.(1996).The synthesis of peptidomimetic combinatorial libraries through successive amide alkylations.
Bioorg.Med.Chem.4，709-715.
Ellis，J.G.，Llewellyn，D.J.，Dennis，E.S.，and Peacock，W.J.(1987).Maize Adh-1promoter sequences control anaerobic regulation：addition of upstream promoter elements from constitutive genes is necessary for expression in tobacco.EMBO J.6，11-16.
Faiss，M.，Zalubilová，J.，Strnad，M.，Schmülling，T.(1997).Conditional transgenic expression of the ipt gene indicates a function for cytokinins in paracrine signaling in whole tobacco plants.Plant J.12，401-415.
Fassina，G.and Melli，M.(1994).Identification of interactive sites of proteins and protein receptors by computer-assisted searches for complementary peptide sequences.
Immunomethods.5，114-120.
Fedoroff，N.V.and Smith，D.L.(1993).A versatile system for detecting transposition in Arabidopsis.Plant J.3，273-289.
Hanahan，D.(1983).Studies on transformation of Escherichia coll with plasmids.
J.Mol.Biol 166，557-580.
Hansen，G.and Chilton，M.D.(1996).“Agrolistic”transformation of plant cells：integration of T-strands generated in planta.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 93，14978-14983.
Hansen，G.，Shillito，R.D.，and Chilton，M.D.(1997).T-strand integration in maize protoplasts after codelivery of a T-DNA substrate and virulence genes.
Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A94，11726-11730.
Hanson，B.，Engler，D.，Moy，Y.，Newman，B.，Ralston，E.，and Gutterson，N.(199g).A simple method to enrich an Agrobacterium-transformed population for plants containing only T-DNA sequences.Plant J.19，727-734.
Harlow，E.and Lane，D.(1988).“Antibodies：A Laboratory Manual.”Cold Spring Harbor Laboratory Press.
Herrera-Estrella，L.，De Block，M.，Messens，E.H.J.P.，Van Montagu，M.，and Schell，J.(1983).Chimeric genes as dominant selectable markers in plant cells.EMBO J.2，987-995.
Hoffman，D.L.，Laiter，S.，Singh，R.K.，Vaisman，I.I.，and Tropsha，A.(1995).Rapid protein structure classification using one-dimensional structure profiles on the bioSCANparallel computer.Comput.Appl.Biosci.11，675-679.
Krens，F.A.，Molendijk，L.，Wullems，G.J.，and Schilperoort，R.A.(1982).In vitro transformation of plant protoplasts with Ti-plasmid DNA.Nature 296，72-74.
Lerner，R.A.(1982).Tapping the immunological repertoire to produce antibodies of predetermined specificity.Nature 299，593-596.
Lerner，R.A.，Green，N.，Alexander，H.，Liu，F.T.，Sutcliffe，J.G.，and Shinnick，T.M.(1981).Chemically synthesized peptides predicted from the nucleotide sequence of the hepatitis B virus genome elicit antibodies reactive with the native envelope protein ofDane particles.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A78，3403-3407.
Liddle，J.E.and Cryer，A.(1991).“A Practical Guide to Monoclonal Antibodies.”Wiley New York.
Loffler，J.，Langui，D.，Probst，A.，and Huber，G.(1994).Accumulation of a 50kDa N-terminal fragment of beta-APP695 in Alzheimer’s disease hippocampus and neocortex.
Neurochem.Int.24，281-288.
Monge，A.，Lathrop，E.J.，Gunn，J.R.，Shenkin，P.S.，and Friesner，R.A.(1995).Computer modeling of protein folding：conformational and energetic analysis of reduced and detailed protein models.J.Mol.Biol 247，995-1012.
Morris，R.O.et al.(19g9).Isolation of a gene encoding a glycosylated cytokinin oxidase from maize.Bioechem.Biophys.Res.Commun.255，328-333
Motyka，V.，Faiss，M.，Strnad，M.，Kaminek，M.and Schmuelling，T.(1996).Changes in cytokinin content and cytokinin oxidase activity in response to derepression of ipt gene transcription in transgenic tobacco calli and plants.Plant Physiol.112，1035-1043.
Murakami，T.，Simonds，W.F.，and Spiegel，A.M.(1992).Site-specific antibodies directed against G protein beta and gamma subunits：effects on alpha and beta gamma subunit interaction.Biochemistry 31，2905-2911.
Olszewski，K.A.，Kolinski，A.，and Skolnick，J.(19g6).Folding simulations and computer redesign of protein A three-helix bundle motifs.Proteins 25，286-299.
Osborne，B.I.，Wirtz，U.，and Baker，B.(1995).A system for insertional mutagenesis and chromosomal rearrangement using the Ds transposon and Cre-Iox.Plant J.7，687-701.
Ostresh，J.M.，Blondelle，S.E.，Dorner，B.，and Houghten，R.A.(1996).Generation and use of nonsupport-bound peptide and peptidomimetic combinatorial libraries.Methods Enzymol.267，220-234.
Pabo，C.O.and Suchanek，E.G.(1986).Computer-aided model-building strategies for protein design.Biochemistry 25，5987-5991.
Paszkowski，J.，Shillito，R.D.，Saul，M.，Mandak，V.，and Hohn，T.H.B.P.I.(1984).Direct gene transfer to plants.EMBO J.3，2717-2722.
Peralta，E.G.，Hellmiss，R.，and Ream，W.(1986).Overdrive，a T-DNA transmission enhancer on the A.tumefaciens tumour-inducing plasmid.EMBO J.5，1137-1142.
Quirino，B.F.，Noh，Y.-S.，Himelbau，E.，and Amasino，R.M.(2000).Molecular aspects of leaf senescence.Trends in Plant Science 5，278-282.
Renouf，D.V.and Hounsell，E.F.(1995).Molecular modelling of glycoproteins by homology with non-glycosylated protein domains，computer simulated glycosylation and molecular dynamics.Adv.Exp.Med.Biol 376，37-45.
Rinaldi，A.C.and Comandini，O.(1999).Cytokinin oxidase strikes again.Trends in Plant Sc.4，300.
Rose，R.B.，Craik，C.S.，Douglas，N.L.，and Stroud，R.M.(1996).Three-dimensional structures of HIV-1 and SIV protease product complexes.Biochemistry 35，12933-12944.
Rutenber，E.E.，McPhee，F.，Kaplan，A.P.，Gallion，S.L.，Hogan，J.C.，Jr.，Craik，C.S.，and Stroud，R.M.(1996).A new class of HIV-1 protease inhibitor：the crystallographic structure，inhibition and chemical synthesis of an aminimide peptide isostere.
Bioorg.Med.Chem.4，1545-1558.
Sambrook，J.，Fritsch，E.F.，and Maniatis，T.(1989).“Molecular Cloning：A Laboratory Manual.”Cold Spring Harbor Laboratory Press.
Schlappi，M.，Smith，D.，and Fedoroff，N.(1993).TnpA trans-activates methylated maize Suppressor-mutator transposable elements in transgenic tobacco.Genetics 133，1009-1021.
Shioda，T.，Andriole，S.，Yahata，T.，and lsselbacher，K.J.(2000).A green fluorescent protein-reporter mammalian two-hybrid system with extrachromosomal maintenance of a prey expression plasmid：Application to intera ction screening.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A97，5220-5224.
Tamura，R.N.，Cooper，H.M.，Collo，G.，and Quaranta，V.(1991).Cell type-specific integrin variants with alternative alpha chain cytoplasmic domains.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A88，10183-10187.
Van Haaren，M.J.，Sedee，N.J.，Schilperoort，R.A.，and Hooykaas，P.J.(1987).Overdrive is a T-region transfer enhancer which stimulates T-strand production in Agrobacterium tumefaciens.Nucleic Acids Res.15，8983-8997.
Van Sluys，M.A.，Tempe，J.，and Fedoroff，N.(1987).Studies on the introduction and mobility of the maize Activator element in Arabidopsis thaliana and Daucus carota.EMBO J.6，3881-3889.
Wang，K.，Genetello，C.，Van Montagu，M.，and Zambrys ki，P.C.(1987).Sequence context of the T-DNA border repeat element determines its relative activity during T-DNA transfer to plant cells.Mol.Gen.Genet.210，338-346.
Woulfe，J.，Lafortune，L.，de Nadai，F.，Kitabgi，P.，an d Beaudet，A.(1994).Post-translational processing of the neurotensin/neuromedin N precursor in the central nervous system of the rat-II.Immunohistochemical localization of maturation products.Neuroscience 60，167-181.
Zhang，Y.L.，Dawe，A.L.，Jiang，Y.，Becker，J.M.，and Naider，F.(1996).A superactive peptidomimetic analog of a farnesylated dodecapeptide yeast pheromone.Biochem.Biophys.Res.Commun.224，327-331.
机译： 改变植物细胞分裂素氧化酶表达的植物形态，生物化学和生理学的方法
机译： 改变植物细胞分裂素氧化酶表达的植物形态，生物化学和生理学的方法
机译： 改变植物形态，生物化学和生理学的方法，包括表达植物细胞分裂素氧化酶
