猪脂肪细胞受盐酸克伦特洛刺激引发表达下调的EST序列

摘要

本发明提供了猪脂肪细胞受盐酸克伦特洛刺激引发表达下调的EST序列，其具有SEQ ID No.1所示的核苷酸序列。利用该序列设计引物，通过定量PCR扩增得到饲喂普通饲料的正常猪体内rpfat_15529基因的表达水平，再通过定量PCR技术检测样品猪体内该基因的表达情况，从而确定样品猪中是否残留有CLB-HCL。另外，本发明对于前期饲喂CLB-HCL的猪中CLB-HCL的检测具有显著的效果。

说明书

技术领域

本发明属于食品检验领域，具体地说，涉及利用猪脂肪细胞受盐酸克伦特洛刺激引发表达下调的EST序列检测猪肉中残留的盐酸克伦特洛。

背景技术

药物盐酸克伦特洛(Clenbuterol-HCL，CLB-HCL)，俗称“瘦肉精”，是一种β-肾上腺素受体激动剂(beta-Adrenergic agonists)，不仅可以提高畜禽的生长速度，降低料肉比，还可以显著减少脂肪蓄积，提高胴体瘦肉率。但是CLB-HCL在动物体内存在广泛的积累性残留，对食用者的安全造成潜在的危害，急性中毒事件屡有发生。到目前为止，没有任何国家允许CLB-HCL作为生长促进剂用于食品动物的生产之中，欧盟、美国FDA及我国政府都制定了严格的残留标准。但是由于CLB-HCL对动物生长的促进作用和降低胴体脂肪积蓄是异常显著的，出于经济效益的考虑，少数养殖户在饲养肉猪的时候，过分依赖CLB-HCL，结果导致问题猪肉上市危害群众健康。

目前主要利用抗体杂交技术检测猪肉中CLB-HCL的残留，但能够检测到的一般都是问题比较严重的猪肉，而对于前期饲喂CLB-HCL的猪却很难检测出CLB-HCL的痕迹。通过对饲喂CLB-HCL的猪和普通饲料饲养的猪的研究表明，饲喂CLB-HCL可引起猪体内一些关键基因的表达变化。

表达序列标签(expressed sequence tags，ESTs)是指从不同组织来源的cDNA序列，这一概念首次由Adams等于1991年提出。近年来由此形成的技术路线被广泛应用于基因识别、绘制基因表达图谱、寻找新基因等研究领域，并且取得了显著成效。在通过mRNA差异显示、代表性差异分析等方法获得未知基因的cDNA部分序列后，研究者都迫切希望克隆到其全长cDNA序列，以便对该基因的功能进行研究。

发明内容

本发明的目的是提供一种受到盐酸克伦特洛(Clenbuterol-HCL，CLB-HCL)刺激引发表达下调的表达序列标签(expressed sequence tags，ESTs)(rpfat_15529)。该序列可以用于检测猪脂肪细胞是否受到盐酸克伦特洛的刺激，从而检测猪肉中是否存在残留的盐酸克伦特洛。

为了实现本发明目的，本发明提供猪脂肪细胞受盐酸克伦特洛刺激引发表达下调的EST序列，其具有Seq ID No.1所示的核苷酸序列。

本发明还提供检测上述序列的引物，其包括上游引物5’-CTTAACATTATTCTCAGAGCTGCG-3’和下游引物5’-GTGGTAGAGAGCTGGATCACTAAG-3’。

本发明进一步提供上述EST序列在检测猪肉中残留的盐酸克伦特洛中的应用。具体方法包括：

1)从普通饲料饲养的正常猪的组织中提取总RNA，利用RT-PCR技术合成cDNA；

2)设计引物，包括上游引物5’-CTTAACATTATTCTCAGAGCTGCG-3’和下游引物5’-GTGGTAGAGAGCTGGATCACTAAG-3’，通过荧光实时定量PCR技术得到正常猪的扩增曲线；

3)从样品猪的组织中提取总RNA，利用RT-PCR技术合成cDNA；

4)使用与步骤2)相同的引物进行荧光实时定量PCR，将得到的扩增曲线与步骤2)中得到正常猪的扩增曲线做对照，根据基因表达情况检测样品猪中是否有盐酸克伦特洛残留。

本发明首次提供了猪脂肪细胞受盐酸克伦特洛刺激引发表达下调的EST序列，利用该序列设计引物，通过定量PCR扩增得到正常猪体内rpfat_15529基因的表达水平，再通过定量PCR技术检测样品猪体内该基因的表达情况，从而确定样品猪中是否残留有CLB-HCL。另外，本发明对于前期饲喂CLB-HCL的猪中CLB-HCL的检测具有显著的效果。

附图说明

图1为本发明实验组与对照组猪肉中rpfat_15529基因的表达差异(定量PCR结果)。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

实施例

一.总RNA的提取

1、取新鲜或-70℃冻存的猪肉样品，每30～50mg猪肉样品加入1mlTRIzon，匀浆仪进行匀浆处理。样品体积一般不要超过TRIzon体积的10％。

2.将上述样品在15～30℃放置5分钟，使得核酸蛋白复合物完全分离。

3.4℃，12,000rpm离心10分钟，取上清。

4.向上清中加入氯仿，每使用1ml TRIzon加入0.2ml氯仿，盖好管盖，剧烈振荡15秒，室温放置3分钟。

5.4℃，12,000rpm离心10～15分钟，此时溶液分三层：黄色的有机相，中间层和上层无色的水相，RNA主要存在水相中，把水相(约500μl)转移到一个新的无Rnase的离心管中。

6.向得到的水相溶液中加入等体积的异丙醇，混匀，室温放置20～30分钟。

7.4℃，12,000rpm离心10分钟，弃上清。

8.用75v/v％乙醇(无RNase)洗涤沉淀。每使用1ml TRIzon用1ml 75v/v％乙醇对沉淀进行洗涤。

9.4℃，5,000rpm离心3分钟。用枪头小心吸出上层液体，保留沉淀。

10.室温放置2～3分钟，晾干，加入30～100μl 无RNase的水，充分溶解RNA后，置于-70℃保存。

二.cDNA第一链的合成

1.在PCR管中依次加入

Oligo(dT)18                2μl

10mM dNTP                  2μl

RNA                        4μl(约3μg)

DEPC水                     16μl

2.于70℃变性5min，迅速置于冰上，静置1min。

3.向上述PCR管中依次加入

Superscript II             2μl

5×第一链合成缓冲液        8μl

RNasin                     2μl

0.1M DTT                   4μl

4.混匀后，稍微离心。

5.42℃，反应50min。

6.72℃，反应15min。

7.产物直接用于PCR反应或者置于-20℃保存。

三.引物合成

通过生物软件设计引物，包括上游引物5’-CTTAACATTATTCTCAGAGCTGCG-3’和下游引物5’-GTGGTAGAGAGCTGGATCACTAAG-3’。

四.利用定量PCR技术检测rpfat_15529的表达情况

参照美国ABI公司定量PCR Mix试剂盒说明书操作。

1.标准曲线的制定

以GAPDH作为内标基因绘制标准曲线。

2.按照下列反应体系在96孔板上加样

SYBR Green Mix               7.5μl

上游引物(10μM)              0.3μl

下游引物(10μM)              0.3μl

cDNA                         1.0μl

ddH₂O                        5.9μl

3.采用ABI7900HT荧光实时定量PCR仪，按下列条件进行反应：55℃ 5min；95℃ 10min；95℃ 15s，60℃ 1min，40个循环。

4.最后在ABI7900HT荧光实时定量PCR仪上95℃ 15s，60℃ 15s，再次95℃ 15s作熔解曲线，每个样品、阴性对照(以水为模板)及标准曲线各做3个重复。

5.对实验结果进行统计分析，如果实验样品猪(饲喂CLB-HCL)和对照样品猪(普通饲料饲喂)中该基因的表达量下调达2倍以上，则表明该猪饲喂了CLB-HCL。

结果分析：对72头实验组猪(普通饲料中添加25ppm CLB-HCL，1月龄猪，连续饲喂3个月)和18头对照组猪(普通饲料饲喂，1月龄猪，连续饲喂3个月)的研究结果表明，rpfat_15529在实验组猪中的表达明显下调。平均下调倍数为2.4倍。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。