一种产生啮齿类动物弥漫性轴索损伤的装置

摘要

本发明公开了一种能使啮齿类动物产生具有弥漫性轴索损伤的装置，包括底座、机架和安装在机架上的汽缸，汽缸的一端设有力臂；一大鼠头夹与齿轮固定于一中心轴上并安装在底座上；第一金属杆分别连接力臂和机架，第二金属杆一端连接力臂，另一端与滑动部分相接；中心轴上设有齿轮，且与固定在底座上的齿条啮合连接，中心轴通过两轴承与滑动部分相连接，滑动部分连接于固定在底座上的直线导轨上。该装置能同时产生瞬间超大角加速度和线加速度，模拟弥漫性轴索损伤的实际发生机制。通过该装置得到的啮齿类动物弥漫性轴索损伤模型，损伤的轴索在脑内呈弥漫性分布，且分布在不同组织结构的交界处，如灰白质交界处、胼胝体、内囊、脑干等。

说明书

技术领域

本发明涉及创伤神经外科、应用物理和应用力学领域。更具体地说，涉及一种产生弥漫性轴索损伤模型的装置。

背景技术

弥漫性轴索损伤患者死亡率极高，存活者多遗有严重神经功能障碍甚至呈长期植物状态生存，给家庭和社会带来严重经济和精神负担。目前弥漫性轴索损伤的临床诊疗尚无显著进展，现有治疗措施仍不能显著改善患者预后。稳定、可靠的动物模型有助于探索轴索损伤发生机制、提高弥漫性轴索损伤临床诊疗水平。相应地，人们也迫切需要一个能复制动物弥漫性轴索损伤的实验装置。

弥漫性轴索损伤为脑组织遭受线性或旋转性加/减速力作用，不同组织结构脑组织之间产生的剪应力导致，产生的受损轴索在脑内呈弥漫性分布。在真实临床损伤情形中，弥漫性轴索损伤由同时瞬间角加速和线加速力共同导致，且中等程度的角加速和线加速力常导致严重重型颅脑损伤，目前认为这一致伤方式最符合弥漫性轴索损伤临床发生机制。现有实验装置仅能产生上述致伤方式的某一方面，产生的病理改变也主要分布于脑干或表现为对冲伤，这与弥漫性轴索损伤的临床特征尚有较大差距。

头部发生瞬间线性或旋转性加/减速运动时，在脑组织内会产生一种剪切力，此剪切力可以撕裂神经元轴索，从而产生弥漫性轴索损伤。一般认为旋转性加/减速运动较线性加/减速运动更易导致弥漫性轴索损伤。目前复制弥漫性轴索损伤的模型主要有冲击负荷装置(Marmarou A，Foda MA，vanden Brink W，Campbell J，Kita H，Demetriadou K.A new model of diffuse braininjury in rats.Part I：Pathophysiology and biomechanics.J Neurosurg.1994Feb；80(2)：291-300.)和瞬间暴力致旋转装置(Fijalkowski RJ，Stemper BD，PintarFA，Yoganandan N，Crowe MJ，Gennarelli TA.New rat model for diffuse braininjury using coronal plane angular acceleration.J Neurotrauma.2007Aug；24(8)：1387-98.)，分别用于获得瞬间线性和旋转性加减速运动。

如图1所示，冲击负荷装置是将一铁盘用牙胶固定于大鼠穹窿部，将一重488g的铁盘从2m处自由落体，垂直撞击在铁盘上。此装置可以使大鼠头部在直线方向上运动一段距离，且可以产生900G的线性加速度。此装置可以使大鼠颅脑产生弥漫性轴索损伤，但其所致损伤主要分布于脑干或表现为对冲伤。

如图2所示，瞬间暴力致旋转装置是将老鼠头夹和冲击力臂(呈L形，短端连于中心轴上，长臂呈水平位，冲击力打击在长臂游离端)连于中心轴上，坠落重物撞击在冲击力臂的另一端，冲击力臂带动中心轴和头夹做旋转运动。此装置使得大鼠头部以脊柱轴心做旋转运动，且可以产生3.5×10⁵rad/sec²瞬间角加速度。此装置可以使大鼠颅脑产生弥漫性轴索损伤，但产生的病理改变也主要是分布于脑干。

现有装置的固有缺陷严重制约了研究进展，主要体现在：

1.在临床实际损伤情形中，头颅常同时产生瞬间线加速度和角加速度运动。目前实验装置仅能产生瞬间角加速度或线加速度，因而仍未能复制出弥漫性轴索损伤的真实发生情形。

2.弥漫性轴索损伤的临床病理特征为，损伤的轴索在脑内呈弥漫性分布，特别是不同组织结构的交界处，如灰白质交界处、胼胝体等部位。现有的实验装置产生的损伤主要分布于脑干或表现为对冲伤。因而，这些装置复制的动物模型可以为伤后轴索变化提供可靠资料，但用来研究伤后动物神经生理、行为等变化时存在很大局限性。

3.啮齿类动物遗传背景清楚，价格便宜，便于饲养和管理，因而成为理想的动物实验载体。目前研究认为产生弥漫性轴索损伤所需加速度随受试动物头颅质量减小而增大，(其中角加速度随头颅质量减小呈指数式增长)因而目前模型较难使用大鼠等啮齿类动物获得弥漫性轴索损伤模型。

4.目前认为，中等程度的角加速和线加速运动在临床上最常发生，也常导致重型颅脑损伤。理论上，此种复合的致伤方式可能较单纯的线/角加速运动更易于复制出理想的啮齿类动物弥漫性轴索损伤模型。然而，现有实验装置尚不能提供同时角加速和线加速运动，也不能用来验证此致伤方式是否可以复制出理想的弥漫性轴索模型。

同时产生瞬间超大角加速和线加速度的实验装置模仿了弥漫性轴索损伤的真实发生机制，该装置也复制出了具有临床病理生理特征的龋齿类动物弥漫性轴索损伤模型，且此实验装置尚未见报道。

发明内容

本发明的第一个目的在于提供一种可以同时产生超大角加速度和线加速度的实验装置，该装置能使啮齿类动物产生具有弥漫性轴索损伤临床特征的病理生理改变。

本发明的第二个目的在于提供一种啮齿类动物弥漫性轴索损伤模型，损伤的轴索在脑内呈弥漫性分布，且分布在不同组织结构的交界处，如灰白质交界处、胼胝体、内囊、脑干等部位。

本发明的第三个目的在于提供一种建立啮齿类动物弥漫性轴索损伤模型的方法。

为实现上述目的，本发明公开以下技术方案：一种能使啮齿类动物产生具有弥漫性轴索损伤的装置，包括底座、机架和安装在机架上的汽缸，其特征在于：汽缸的一端设有力臂；一大鼠头夹与齿轮固定于一中心轴上并安装在底座上；第一金属杆分别连接力臂和机架，第二金属杆一端连接力臂，另一端与滑动部分相接；中心轴上设有齿轮，且与固定在底座上的齿条啮合连接，中心轴通过两轴承与滑动部分相连接，滑动部分连接于固定在底座上的直线导轨上。

使用该实验装置对大鼠进行致伤实验，在大鼠头颅中心(与中心轴中心呈一直线)处和距离1cm处各安装一反射靶点。使用美国FASTEC&IMAGING公司生产的HiSpec高速摄像机(分辨率384Pixel×120Pixel，拍摄速度10000帧/秒)拍摄实验装置运动过程，采用美国Xcitex公司提供的Proanalyst运动分析软件对靶点运动过程进行跟踪，测算装置线加速度和角加速度参数特征。结果显示在供气压力为1.0MPa时实验装置可产生线加速度-740.5±62.3m/sec2和角加速度-94.3±8.9krad/sec2，且同时达到最大值。

观察伤后大鼠生命体征和神经功能变化，结果显示伤后大鼠出现短暂呼吸抑制(5-20s)，角膜反射消失时间35.4±10.2min，刺痛后肢反射消失时间67.6±20.3min，翻身反射恢复时间120.8±31.2min，受伤大鼠行动(1W)和认知功能(2W)较对未损伤显著降低(P＜0.01)。

取伤后24h、48h及72h大鼠进行病理学检测(包括HE染色，免疫组化标记beta-APP和投射电镜)，结果显示伤后易损区脑组织结构紊乱，血流淤滞，神经元周围空泡形成；灰-白质交界、胼胝体、内囊、脑干等多部位出现轴索损伤；神经轴索损伤、髓鞘破坏。

本发明具有以下有益效果：

比较现有技术，本发明可以同时产生瞬间线加速度和角加速度，角加速度和线加速度同时达到最大值，且在角加速度和线加速度均小于单纯使用角加速度或线加速度所需参数的条件下产生了具有弥漫性轴索损伤临床病理特征的大鼠动物模型。

该实验装置可以使大鼠等啮齿类动物的头颅同时产生瞬间超大角加速度和线加速运动，这一方式最符合弥漫性轴索损伤的临床发生机制，经上述装置处理过的动物模型即为啮齿类动物弥漫性轴索损伤模型。

附图说明

下面结合说明书附图，对本发明进一步详细说明。

图1是现有技术中冲击负荷装置的示意图。

图2是现有技术中瞬间暴力致旋转装置的示意图。

图3是本发明装置的立体图

图4是本发明装置的正视图

图5是本发明装置的俯视图

图6是本发明装置的左视图即局部剖视图

图7是大鼠头颅线加速度(A)和角加速度(B)时间变化曲线

图8(a，b，c，d，e，f，g，h)是本发明动物模型的病理结果图，HE染色显示损区脑组织结构紊乱，血流淤滞，神经元周围空泡形成。

图9(a，b，c，d，e，f)是本发明动物模型的另一病理结果，免疫组化标记beta-APP结果显示灰-白质交界、胼胝体、内囊、脑干等多部位出现轴索损伤。

图10(a，b)是投射电镜观察组织内轴突、髓鞘超微结构变化。

具体实施方式

实施例：产生啮齿类动物弥漫性轴索损伤(diffuse axonal injury，DAI)的装置

1、一种可以同时产生超大角加速度和线加速度的实验装置

图中：1，底座2，汽缸3，齿轮4，齿条5，第一金属杆6，第二金属杆7，大鼠头夹8，中心轴9，直线导轨10，机架11，力臂12，轴承13，轴承14，滑块15，滑动部分。

参照图3，图4和图5，本发明包括一底座1，底座1上垂直安装一机架10，机架10上安装一汽缸2，汽缸2上设有进气口21和出气口22，汽缸2的一端设有力臂11，一大鼠头夹7与齿轮3固定于一中心轴8上并安装在底座2上。第一金属杆5分别连接力臂11和机架10，第二金属杆6分别连接力臂11，并通过和滑块14与滑动部分15相接，力臂11与滑块14呈轴承式啮合连接。

中心轴8上设有齿轮3，且与固定在底座1上的齿条4啮合连接，中心轴8通过两轴承12、13与滑动部分15相连接，滑动部分15连接于固定在底座1上的直线导轨9上。

运动方式时：气缸2打开之前，气缸2活塞位于气缸2上端，气缸力臂11也处于上端；连接力臂11呈曲屈状态；滑块15与大鼠头夹7位于直线导轨9左端，头夹7呈水平位(即通过轴心的固定轴呈水平位)。

运行情况：气泵(图未示)充气结束后打开气阀放气，气缸力臂11在高压气体推动下向下运动，第一金属杆5和第二金属杆6在气缸力臂推动下由屈曲(静态时呈120度夹角)变伸直，同时连接力臂11推动滑块14向右侧运动；在滑块14的推动下，中心轴8同时向右侧运动，而通过齿轮3齿条4的啮合作用，中心轴8做旋转运动。

运动结束时：气缸活塞位于气缸2底端，气缸力臂11也处于下端；第一金属杆5和第二金属杆6呈伸直状态；滑块14与大鼠头夹7位于直线导轨9右侧端，大鼠头夹7呈垂直位(即通过轴心的固定轴呈垂直位)。手动控制放气后，气缸力臂11推动第一金属杆5和第二金属杆6迅速伸直，第一金属杆5和第二金属杆6推动滑动部分15做直线运动，通过齿轮3齿条4的啮合作用，大鼠头夹7同时做旋转运动。

2、大鼠致伤实验

80只Sprague Dawley(SD)大鼠(250～300g)随机分为分入致伤组(n＝60)(病理检测n＝30；生理参数，近、远期神经功能各10只)、假伤组(n＝10)和正常对照组(n＝10)。麻醉后，使用上述实验装置对致伤组大鼠进行致伤，观察记录大鼠受伤前后意识、生命体征、神经功能等变化，观察评价远期神经功能损害情况。假伤组大鼠仅进行麻醉，仅固定于致伤装置上但不进行损伤。

3、实验装置线加速度和角加速度测量

使用该实验装置对大鼠进行致伤实验，在大鼠头颅中心(与中心轴中心呈一直线)处和距离1cm处各安装一反射靶点。使用美国FASTEC&IMAGING公司生产的HiSpec高速摄像机(分辨率384Pixel×120Pixel，拍摄速度10000帧/秒)拍摄实验装置运动过程，采用美国Xcitex公司提供的Proanalyst运动分析软件对靶点运动过程进行跟踪并对结果行1000Hz低通道滤波处理，测算装置线加速度和角加速度参数特征。图7为大鼠头颅线加速度(A)和角加速度(B)时间变化曲线，结果显示在供气压力为1.0MPa时实验装置可产生线加速度-740.5±62.3m/sec²和角加速度-94.3±8.9krad/sec²，且两者同时达到最大值。

4、DAI大鼠生理参数及其神经功能评价

a)急性期生理参数测量

(1)生命体征：伤后大鼠出现呼吸节律紊乱，表现为短暂的呼吸暂停后(3～20sec)呼吸由深慢到浅快，苏醒后基本恢复正常节律；伤后心率由伤前308±28次/分骤降至246±46次/分，后逐渐恢复至正常水平；伤后平均血压由103±18mmHg，骤升到128±39mmHg，35分钟后基本恢复正常。

(2)急性期神经功能损伤评价(24h内，每分钟测定一次直至恢复正常)：①角膜反射-致伤至角膜反射恢复的时间间隔；②后肢-爪反射-致伤至后肢-爪反射恢复的时间间隔；③翻正反射一致伤至翻正反射恢复的时间间隔。

结果：角膜反射消失时间35.4±10.2min，刺痛后肢反射消失时间67.6±20.3min，翻身反射恢复时间120.8±31.2min。

b)远期神经功能评价(2w内)

神经功能评分方法：每一项为1-5分(1分为肌力或功能完全丧失；2分为严重损害；3分为中度损伤；4分为轻度损害；5分为正常)：提尾时，右(1)、左(2)前肢反射；双前肢接地提尾时，右(3)、左(4)后肢反射；抵抗来自左(5)、右(6)侧推力的能力；在左(7)、右(8)侧倾斜面或垂直面(9)站立的能力。倾斜面站立能力评分取决于平面倾斜角度(5分＝45°；4分＝42.5°；3分＝40°；2分＝37.5°；1分＝＜37.5°)。将7，8，9项平均得分与1-6项得分相加即为神经功能综合评分。11、12、13、14天时各测定一次，取平均值。在此基础上，评价其与人类DAI后认知功能、神经功能损害的相似性。正常大鼠为35分，伤后为大鼠为24±7分，与对照组具有明显统计学差异。

结论：伤后大鼠出现短暂呼吸、心率、血压变化和近、远期神经功能评分结果说明，此装置成功复制了啮齿类动物弥漫性轴索损伤模型。

5、大鼠DAI模型病理学验证

于伤后1、12、24、48、72h及2w各取损伤组大鼠4只、假伤组4只、对照组4只进行病理学检测。

(1)HE染色：观察组织大体结构、局灶性出血和局部空泡形成情况(图8)。

a.HE染色显示额叶内神经束致密、排列规则

b.HE染色显示额叶内神经束疏松、紊乱

c.HE染色显示正常胼胝体体部神经束排列规则

d.HE染色显示损伤胼胝体体部神经束屈曲、紊乱

e.HE染色显示正常桥桥脑内神经束排列规则、致密

f.HE染色显示桥伤后桥脑内神经束排列紊乱、疏松

g.HE染色显示伤后额叶内血管淤滞

h.HE染色显示伤后顶叶(胼胝体下)血管淤滞

(2)免疫组化标记Beta-APP染色：观察轴索断裂、崩解、肿胀以及轴索球形成情况(图9)。

a.免疫组化标记beta-APP显示正常枕叶内未见显色

b.免疫组化标记beta-APP显示伤后枕叶内受损轴索显色

c.免疫组化标记beta-APP显示正常中脑内未见显色

d.免疫组化标记beta-APP显示伤后中脑内受损轴索显色

e.免疫组化标记beta-APP显示正常桥脑内未见显色

f.免疫组化标记beta-APP显示伤后桥脑内受损轴索显色

(3)投射电镜观察组织内轴突、髓鞘超微结构变化(图10)

a.投射电镜显示正常胼胝体内神经轴索和髓鞘结构完整

b.投射电镜显示正常胼胝体内神经轴索破坏和髓鞘结构紊乱

结论：HE染色显示伤后大鼠灰白质交界处、胼胝体、脑干等部位神经束疏松、排列紊乱，神经元周围空泡行成，血流瘀滞；免疫组化学标记beta-APP显示大脑白质、中脑、桥脑等部位出现轴浆运输淤滞，显示为棕褐色，而正常轴索不显色；透射电镜观察组织超微结构，显示神经元轴索损伤，髓鞘分离，呈“花环样”改变。