一种以木薯淀粉原料生产微生物油脂的补料分批发酵工艺

摘要

本发明涉及微生物油脂的生产，具体的说是一种以木薯淀粉原料生产微生物油脂的补料分批发酵工艺，属生物化工技术领域。在菌体对数生长期向发酵培养基中同时补加碳源和氮源，当菌体处于稳定期时向发酵培养基中补加碳源。本发明的优点在于延长了菌体的生长期使其生物量显著提高，在菌体处于稳定期时只提供碳源使其大量合成油脂，提高了微生物油脂的含量和产量；本发明所设计的补料工艺可使发酵过程中发酵培养基的pH保持稳定，减少了用于调节pH的酸碱的用量，节约了生产成本，且补料方式简单易行，便于操作。

说明书

技术领域

本发明属于生物化工技术领域。利用一种以木薯淀粉原料生产微生物油脂的补料分批发酵工艺，通过两步补料提高发酵生产微生物油脂的含量和产量。

技术背景

微生物油脂(microbial oil)又称单细胞油脂(single cell oil，SCO)，是由酵母、霉菌、细菌和藻类等微生物在一定条件下利用碳水化合物、碳氢化合物和普通油脂为碳源、氮源、辅以无机盐生产的油脂和另一些有商业价值脂质。微生物生产油脂不仅具有油脂含量高、生产周期短等优点；而且可用细胞融合、细胞诱变等方法，使微生物产生高营养油脂或某些特定脂肪酸组成油脂，如EPA、DHA、类可可脂等。

随着现代生物技术的发展，已获得很多具有高产油能力或富含稀有脂肪酸的产油微生物资源，提高了微生物产油的效率。日本、德国、美国等国目前已有商品菌油面市。在欧洲、中东、南亚和澳洲等地已允许将某些微生物油脂添加到婴儿食品中。人口的增长使油脂需求量与自然资源严重短缺的矛盾日益加剧，另外环境污染日趋严重，被迫寻求开发新型清洁能源。微生物油脂不仅可以缓解植物油脂紧缺的局面而且可以生产功能性油脂。另外，大部分微生物油脂的脂肪酸组成和一般植物油相近，以C₁₆和C₁₈系脂肪酸如油酸、棕桐酸、亚油酸和硬脂酸为主，因此微生物油脂可以代替植物油用来制取生物柴油，缓解全球能源危机，是生物柴油产业和生物经济的重要研究方向。因此，开辟微生物油脂这一新的油脂资源，具有深远的意义。

自从国家规定生物能源生产须以非粮原料为主以来，寻找优质、产量大，价格低廉的原料就成为了发展微生物油脂工业的首要任务。木薯被誉为“淀粉之王”，其具有适应性强，生长快、产量大，可种植于山野荒地，不与粮食争地等优点，非常适合于我国栽种。目前利用木薯发酵生产酒精已有大量报道，但以木薯淀粉为原料发酵生产微生物油脂的相关研究报道甚少。木薯价格低廉，产量大，加工容易，且木薯淀粉经双酶法水解糖化为还原糖的转化率高，是发酵生产微生物油脂的良好培养基原料。发展以木薯淀粉为原料生产微生物油脂的发酵工艺，不但可以降低微生物油脂的生产成本，而且可以增加种植木薯的农民的收入，带动地区的经济发展，具有巨大的经济效益和良好的社会效益。

目前，国内外的研究者主要采用分批式发酵的方法生产微生物油脂，但是由于技术和经济的原因，微生物油脂的规模化产业化报道很少，其生产成本仍高于市场能够接受的水平。因此，开发新的微生物油脂生产工艺，提高发酵获得的产油细胞生物量及油脂含量，从而降低生产成本十分必要。本发明以来源丰富、价格低廉的木薯淀粉为原料生产微生物油脂，设计了补料分批发酵工艺，通过两步补料提高发酵生产微生物油脂的含量和产量。本发明所述的以木薯淀粉原料生产微生物油脂的补料分批发酵工艺，降低了微生物油脂的生产成本，提高了微生物油脂的产量，对微生物油脂工业的发展具有重要的意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种以木薯淀粉原料生产微生物油脂的补料分批发酵工艺，提高发酵获得的产油细胞生物量和油脂的含量，从而降低生产成本。

本发明所述的以木薯淀粉原料生产微生物油脂的补料分批发酵工艺是在菌体对数生长期以C/N为15-40同时向发酵培养基中补加碳源和氮源，延长了菌体的生长期使其生物量显著提高；当菌体处于稳定期时向发酵培养基中补加碳源，使其大量合成油脂，最终提高了微生物油脂的含量和产量。具体工艺步骤如下：

(1)将保存在固体培养基上的皮状丝孢酵母、发酵性丝孢酵母、粘红酵母、橙黄红酵母、斯达凯依酵母、被孢霉、拉曼被孢霉、少根根霉等可生产微生物油脂的菌种接入种子培养基中培养36-48h，以3％-10％的接种量接入发酵培养基；摇瓶培养的温度为25-30℃，摇床转速为180-220r/min；发酵罐培养pH保持在5.5-6.5，通气量0.5-1.5vvm，搅拌速度200-600r/min。

(2)发酵培养至菌体处于对数生长期、还原糖浓度低于15g/L时进行补料，向发酵培养基中补加200-400g/L的木薯淀粉水解糖化液碳源，使还原糖浓度维持在30-60g/L，并以C/N为15-40同时向发酵培养基中补加酵母提取物氮源；发酵培养至菌体处于减速期，停止补加氮源，继续向发酵培养基中补加200-400g/L的木薯淀粉水解糖化液碳源，使还原糖浓度维持在30-60g/L。

(3)发酵60-100h结束，3000-5000r/min离心菌体，水洗1-2次，50-100℃烘干至恒重，以索氏抽提法、超临界CO₂萃取法、酸热法和有机溶剂法等方法提取微生物油脂并进行称量和成分测定。

本发明所述的发酵菌种为皮状丝孢酵母、发酵性丝孢酵母、粘红酵母、橙黄红酵母、斯达凯依酵母、被孢霉、拉曼被孢霉、少根根霉等可生产微生物油脂的菌种，优先选用本实验室经诱变选育而得的皮状丝孢酵母B3，保藏编号为CCTCC NO.M 2010076。

本发明的有益成果：采用本发明的以木薯淀粉原料生产微生物油脂的补料分批发酵工艺，较分批式培养可显著提高生物量和微生物细胞油脂含量，油脂产量显著提高。木薯淀粉价格低廉，降低了成本，且本工艺补料方式简单易行，便于操作。

另外，采用本发明所设计的培养基和补料方式可使发酵过程中发酵培养基的pH值保持在一个稳定的范围。本发明通过实验设计获得的在发酵前期保持较低的葡萄糖浓度，以C/N为15-40的比例进行补料，可使发酵过程中发酵培养基的pH至保持在5.5-6.5。这不仅有利于菌体的生长，而且省去了向发酵培养基中补加酸和碱的费用，降低了生产成本。

具体实施方式

实例1

(1)菌种：皮状丝孢酵母B3(Trichosporon cutaneum，由本实验室筛选得到，菌种保藏号CCTCC NO.M 2010076)

(2)培养基

a.固体培养基

葡萄糖：70g/L；酵母提取物：1g/L；NH₄NO₃：0.5g/L；KH₂PO₄：0.75g/L；CaCl₂·2H₂O：0.4g/L；MgSO₄·7H₂O：0.4g/L；琼脂：20g/L；pH自然。

b.种子培养基

葡萄糖：70g/L；酵母提取物：1g/L；NH₄NO₃：0.5g/L；KH₂PO₄：0.75g/L；CaCl₂·2H₂O：0.4g/L；MgSO₄·7H₂O：0.4g/L；pH＝6.0。

c.发酵培养基

木薯淀粉水解糖化液(其用量以其含还原性糖计)：30g/L；酵母提取物：2.0g/L；NH₄NO₃：0.5g/L；KH₂PO₄：0.75g/L；CaCl₂·2H₂O：0.4g/L；MgSO₄·7H₂O：0.4g/L；pH＝6.0。

(3)培养方式

甘油管保藏的菌种转接至固体平板培养基，28℃活化48h。种子培养使用250ml三角瓶，装液量为100ml，培养温度为28℃，摇床转速200r/min。种子培养36h以5％的接种量接入发酵培养基，发酵培养使用2L发酵罐，装液量1.3L，通气量1vvm，初始搅拌速率200r/min，根据溶氧的变化提高搅拌速率，使溶氧保持在10％-30％。当发酵培养基中的还原糖的浓度低于10g/L时，补加200g/L的木薯淀粉糖化液(其用量以其含还原性糖计)使发酵培养基中的还原糖的浓度提高至30g/L，使发酵培养基中的还原糖的浓度维持在10-30g/L，同时以C/N＝15向发酵培养基中补加酵母提取物。在发酵进行到52h时停止向发酵培养基中补加氮源，继续通过补加200g/L的木薯淀粉糖化液(其用量以其含还原性糖计)使发酵培养基中的还原糖的浓度维持在10-30g/L，在发酵进行到68h时停止向发酵培养基中补加碳源。以不补料的分批式培养为对照。二者均在发酵培养基中的还原糖浓度低于5g/L时放罐。

(4)发酵结果

补料分批式发酵培养共进行76h，菌体生物量为67.06g/L，油脂含量为45.34％，油脂产量为30.41g/L。对照菌体生物量为10.85g/L，油脂含量为26.20％，油脂产量为2.84g/L。采用补料培养较对照的分批式培养菌体生物量、油脂含量和产量分别提高了518.06％、73.05％，970.77％。

实例2

(1)菌种：皮状丝孢酵母B3(Trichosporon cutaneum B3，由本实验室筛选得到，菌种保藏号CCTCC NO.M 2010076)

(2)培养基

a.固体培养基

同实例1。

b.种子培养基

同实例1。

c.发酵培养基

木薯淀粉水解糖化液(其用量以其含还原性糖计)：45g/L；酵母提取物：2.25g/L；NH₄NO₃：0.5g/L；KH₂PO₄：1.5g/L；CaCl₂·2H₂O：0.4g/L；MgSO₄·7H₂O：0.4g/L；pH＝6.0。

(3)培养方式

甘油管保藏的菌种转接至固体平板培养基，28℃活化48h。种子培养使用250ml三角瓶，装液量为100ml，培养温度为28℃，摇床转速200r/min。种子培养36h以5％的接种量接入发酵培养基，发酵培养使用2L发酵罐，装液量1.3L，通气量1vvm，初始搅拌速率200r/min，根据溶氧的变化提高搅拌速率，使溶氧保持在10％-30％。当发酵培养基中的还原糖的浓度低于20g/L时，补加200g/L的木薯淀粉糖化液(其用量以其含还原性糖计)使发酵培养基中的还原糖的浓度提高至45g/L，使发酵培养基中的还原糖的浓度维持在20-45g/L，同时以C/N＝20向发酵培养基中补加酵母提取物。在发酵进行到60h时停止向发酵培养基中补加氮源，继续通过补加200g/L的木薯淀粉糖化液(其用量以其含还原性糖计)使发酵培养基中的还原糖的浓度维持在20-45g/L。在发酵进行到76h时停止向发酵培养基中补加碳源。以不补料的分批式培养为对照。二者均在发酵培养基中的还原糖浓度低于5g/L时放罐。

(4)发酵结果

发酵共进行84h，补料分批式培养的菌体生物量为105.96g/L，油脂含量为42.53％，油脂产量为45.06g/L。对照菌体生物量为16.15g/L，油脂含量为30.62％，油脂产量为4.95g/L。采用补料培养较对照的分批式培养菌体生物量、油脂含量和产量分别提高了556.10％、47.16％，810.30％。

实例3

(1)菌种：皮状丝孢酵母B3(Trichosporon cutaneum B3，由本实验室筛选得到，菌种保藏号CCTCC NO.M 2010076)

(2)培养基

a.固体培养基

同实例1。

b.种子培养基

同实例1。

c.发酵培养基

木薯淀粉水解糖化液(其用量以其含还原性糖计)：60g/L；酵母提取物：2.0g/L；NH₄NO₃：0.5g/L；KH₂PO₄：1.5g/L；CaCl₂·2H₂O：0.4g/L；MgSO₄·7H₂O：0.4g/L；pH＝6.0。

(3)培养方式

甘油管保藏的菌种转接至固体平板培养基，28℃活化48h。种子培养使用250ml三角瓶，装液量为100ml，培养温度为28℃，摇床转速200r/min。种子培养36h以5％的接种量接入发酵培养基，发酵培养使用2L发酵罐，装液量1.3L，通气量1vvm，初始搅拌速率200r/min，根据溶氧的变化提高搅拌速率，使溶氧保持在10％-30％。当发酵培养基中的还原糖的浓度低于30g/L时，补加200g/L的木薯淀粉糖化液(其用量以其含还原性糖计)使发酵培养基中的还原糖的浓度提高至60g/L，使发酵培养基中的还原糖的浓度维持在30-60g/L，同时以C/N＝30向发酵培养基中补加酵母提取物。在发酵进行到56h时停止向发酵培养基中补加氮源，继续通过补加200g/L的木薯淀粉糖化液(其用量以其含还原性糖计)使发酵培养基中的还原糖的浓度维持在30-60g/L。在发酵进行到72h时停止向发酵培养基中补加碳源。以不补料的分批式培养为对照。二者均在发酵培养基中的还原糖浓度低于5g/L时放罐。

(4)发酵结果

发酵共进行80h，补料分批式培养的菌体生物量为96.54g/L，油脂含量为42.84％，油脂产量为41.36g/L。对照菌体生物量为25.20g/L，油脂含量为24.66％，油脂产量为6.21g/L。采用补料培养较对照的分批式培养菌体生物量、油脂含量和产量分别提高了283.10％、73.72％，566.02％。

实例4

(1)菌种：皮状丝孢酵母B3(Trichosporon cutaneum B3，由本实验室筛选得到，菌种保藏号CCTCC NO.M 2010076)

(2)培养基

a.固体培养基

同实例1。

b.种子培养基

同实例1。

c.发酵培养基

木薯淀粉水解糖化液(其用量以其含还原性糖计)：30g/L；酵母提取物：1.5g/L；NH₄NO₃：0.5g/L；KH₂PO₄：2.0g/L；CaCl₂·2H₂O：0.4g/L；MgSO₄·7H₂O：0.4g/L；pH＝6.0。

(3)培养方式

甘油管保藏的菌种转接至固体平板培养基，28℃活化48h。种子培养使用250ml三角瓶，装液量为100ml，培养温度为28℃，摇床转速200r/min。种子培养36h以5％的接种量接入发酵培养基，发酵培养使用2L发酵罐，装液量1.3L，通气量1vvm，初始搅拌速率200r/min，根据溶氧的变化提高搅拌速率，使溶氧保持在10％-30％。当发酵培养基中的还原糖的浓度低于15g/L时，补加200g/L的木薯淀粉糖化液(其用量以其含还原性糖计)使发酵培养基中的还原糖的浓度提高至30g/L，使发酵培养基中的还原糖的浓度维持在15-30g/L，同时以C/N＝20向发酵培养基中补加酵母提取物。在发酵进行到48h时停止向发酵培养基中补加氮源，继续通过补加200g/L的木薯淀粉糖化液(其用量以其含还原性糖计)使发酵培养基中的还原糖的浓度维持在15-30g/L。在发酵进行到70h时停止向发酵培养基中补加碳源。以不补料的分批式培养为对照。二者均在发酵培养基中的还原糖浓度低于5g/L时放罐。

(4)发酵结果

发酵共进行76h，补料分批式培养的菌体生物量为90.75g/L，油脂含量为52.38％，油脂产量为47.53g/L。对照菌体生物量为11.36g/L，油脂含量为27.01％，油脂产量为3.07g/L。采用补料培养较对照的分批式培养菌体生物量、油脂含量和产量分别提高了698.86％、93.93％，1448.21％。