血红素加氧酶-1的表达、纯化方法与抗原表位

摘要

本发明公开了血红素加氧酶-1的表达、纯化方法与抗原表位。通过本发明可以获得高产量的可溶性血红素加氧酶-1，为大量制备具有生物活性的血红素加氧酶-1奠定了基础，可望解决生物工程和药物研发领域等血红素加氧酶-1难以高效表达的难题。此外，本发明还为HO-1结构和功能应用研究提供了具有中和活性的抗体，筛选到的3条抗原表位为以后临床诊断、治疗及预后奠定了一定基础。因此，本发明具有十分广泛的应用前景，有望成为生物工程研究和药物研发的重要技术手段。

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域中蛋白的表达、纯化方法及其抗原表位序列，特别是涉及一种血红素加氧酶-1编码蛋白的表达、纯化方法与抗原表位序列。

背景技术

血红素加氧酶-1(heme oxygenase-1，HO-1)与多种疾病相关。关于HO-1的结构与功能的研究，对众多疾病的发病机理研究和治疗都有重要意义。血红素加氧酶-1(heme oxygenase-1，HO-1)是唯一的可诱导型血红素加氧酶，是降解血红素为等摩尔一氧化碳(CO)、胆绿素和Fe²⁺的限速酶(Tenhunen R，Marver H，SchmidR.The enzymatic conversion of heme to bilirubin by microsomal heme oxygenase.Proc Natl Acad Sci USA.1968；61(2)：748-55；Maines MD，Trakshel GM，KuttyRK.Characterization of two constitutive forms of rat liver microsomal hemeoxygenase，Only one molecular species of the enzyme is inducible.J BiolChem.1986；261：411-9.)。很多因素，如：血红素、炎症、发热、重金属、激素、紫外线、缺氧和一氧化氮(NO)等，都可以诱导HO-1表达(莫俊，龚兴国.血红素加氧酶的研究进展.生物技术通报.1998；15(2)：18-23.；Alyssa Goldberg，Parolini M，Chin BY.Toll-like receptor 4 suppression leads to isletallograft survival，.FASEB J.2007；21：2840-8.；Ollinger R，Wang H，YamashitaK.Therapeutic applications of bilirubin and biliverdin in transplantation.Antioxid Redox Signal.2007；9(12)：2175-85.)。Abraham等研究表明HO-1表达量和活性的提高可以缓和糖尿病的有害症状(Abraham N，Tsenovoy P，McClung J，Drummond G.Heme oxygenase：a target gene for anti-diabetic and obesity.Curr Pharm Des 2008；14(5)：412-21.)。在脉管系统中，HO-1能抵抗动脉粥样硬化(Chung H，Pae H，Cha Y.Role of heme oxygenase-1 in vascular disease..Curr Pharm Des.2008；14(5)：422-8.)。在神经退行性疾病和脑感染中，HO-1表达升高与氧化应激加剧和炎症有关(A C，AI R.Heme oxygenase-1 as a therapeutictarget in neurodegenerative diseases and brain infections..Curr Pharm Des2008；14(5)：429-42.)。此外，HO-1在人及动物的各种实体瘤中高表达。Shi等调查了HO-1与鼻咽癌的关系，揭示HO-1可以用来揭示病人对放疗反应的敏感性，有可能通过抑制HO-1活性治疗鼻咽癌(L S，J F.Implication of heme oxygenase-1in the sensitivity of nasopharyngeal carcinomas to radiotherapy.J Exp ClinCaneer Res.2008 Jun 26；27(1)：13.)。HO-1还在器官移植中发挥减轻缺血再灌注损伤的作用，从而减轻急性排斥反应(NO C，MP S.Heme oxygenase-1(HO-1)，a protective gene that prevents chronic graft dysfunction Free Radic BiolMed.2005；38(2)：426-35.)，其降解产物胆绿素能够显著延长移植物的生存时间(Wang H，Lee SS，Dell’Agnello C，al.e.Bilirubin Can Induce Toleranceto Islet Allografts.Endocrinology.2006；147(2)：762-8.；Yamashita K，McDaidJ，R.Biliverdin，a natural product of heme catabolism，inducestolerance to cardiac allografts.The FASEB Journal.2004；20.)。研究表明，在缺血-再灌注损伤、器官移植、肿瘤、免疫与感染性疾病等很多疾病中，HO-1通过其产物胆红素/胆绿素、CO和Fe²⁺发挥其抗炎、抗凋亡、抗增殖及抗氧化功能(Ollinger R，Wang H，Yamashita K.Therapeutic applications of bilirubinand biliverdin in transplantation.Antioxid Redox Signal.2007；9(12)：2175-85.)。

HO-1是血红素代谢途径的限速酶，具有抗氧化、抗炎、抗细胞凋亡和抗平滑肌增生等作用(ZW X，WW Z，JS M，ZL Z.The role of heme oxygenase-1 in Tcell-mediated immunity：the all encompassing enzyme.Curr Pharm Des.2008；14(5)：454-64.)。研究表明，HO-1在多种疾病中都发挥着重要作用，如：肿瘤、肠炎、脓毒血症、氧惊厥、神经元退行性病变、缺血性脑损伤、动脉粥样硬化、哮喘、高血压等(Fukuda K，Richmon J，Sato M.Induction of heme oxygenase-1(HO-1)in glia after traumatic brain injury.Brain Res.1996；732(1-2)：68-75.；代阳丹，欧阳钦.血红素加氧酶-1在炎症性肠病中的研究进展.胃肠病学.2007；12(2)：114-6.)。因此，制备HO-1功能性抗体以及其能中和HO-1活性的抗原表位将会对HO-1相关疾病的研究、治疗及预后会有很大的帮助。

发明内容

本发明的提供了一种成本低廉且纯度较高的血红素加氧酶-1的表达、纯化方法。

本发明所提供的血红素加氧酶-1的表达、纯化方法，是将血红素加氧酶-1基因插入表达载体中，再将构建的重组表达载体导入大肠杆菌，经表达、纯化得到高活性的血红素加氧酶-1(ΔrHO-1)。

所述血红素加氧酶-1基因具有序列表中SEQ ID NO：1的核苷酸序列。

以pMW172a原核表达质粒为出发载体，构建的携带有血红素加氧酶-1基因的重组表达载体为pMW172/ΔrHO-1。

所述大肠杆菌具体可为E.coli BL21(DE3)、E.coli JM109、E.coli HB101或E.coli Top10等，优选为E.coli BL21(DE3)。

所述表达条件优选为：在37℃、(200±5)r/min下培养16小时。

所述血红素加氧酶-1的纯化方法，可包括以下步骤：

1)超声破碎菌体，离心；

2)取上清，进行35％-55％盐析；

3)用Sephacryl S-200进行分子筛层析纯化，得到经纯化的血红素加氧酶-1。

用所述血红素加氧酶-1(ΔrHO-1)制备的抗ΔrHO-1多克隆抗体也属于本发明的保护范围。

本发明的另一个目的是提供血红素加氧酶-1的抗原表位。

本发明所提供的血红素加氧酶-1的抗原表位，是下述氨基酸残基序列之一：

1)序列表中的SEQ ID NO：2；

2)序列表中的SEQ ID NO：3；

3)序列表中的SEQ ID NO：4；

4)将序列表中SEQ ID NO：2-4的氨基酸残基序列经过一至十个氨基酸残基的取代、缺失或添加并可用于制备具有中和血红素加氧酶-1活性作用的多克隆抗体的肽段。

序列表中的SEQ ID NO：2由12个氨基酸残基组成，序列表中的SEQ ID NO：3由12个氨基酸残基组成，序列表中的SEQ ID NO：4由12个氨基酸残基组成。

编码所述血红素加氧酶-1抗原表位的基因，是下述核苷酸序列之一：

1)序列表中SEQ ID NO：5的DNA序列；

2)序列表中SEQ ID NO：6的DNA序列；

3)序列表中SEQ ID NO：7的DNA序列；

4)与序列表中SEQ ID NO：5-7限定的核苷酸序列具有90％以上同源性且可用于制备具有中和血红素加氧酶-1活性作用的多克隆抗体的核苷酸序列；

5)在高严谨条件下可与序列表中的SEQ ID NO：5-7限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。

所述高严谨条件为在0.1×SSPE(或0.1×SSC)，0.1％SDS的溶液中，在65℃下与NC膜或PVDF膜杂交并洗涤。

序列表中的SEQ ID NO：5由36个碱基组成，编码序列表中SEQ ID NO：2氨基酸残基序列的蛋白质；序列表中的SEQ ID NO：6由36个碱基组成，编码序列表中SEQ ID NO：3氨基酸残基序列的蛋白质；序列表中的SEQ ID NO：7由36个碱基组成，编码序列表中SEQ ID NO：4氨基酸残基序列的蛋白质。

含有本发明血红素加氧酶-1抗原表位编码基因的重组表达载体、转基因细胞系及重组菌均属于本发明的保护范围。

用本发明血红素加氧酶-1抗原表位制备的多克隆抗体也属于本发明的保护范围。

所述多克隆抗体均用常规方法制备。

本发明提供了血红素加氧酶-1的表达、纯化方法。通过本发明可以获得高产量的可溶性血红素加氧酶-1，为大量制备具有生物活性的血红素加氧酶-1奠定了基础，可望解决生物工程和药物研发领域等血红素加氧酶-1难以高效表达的难题。此外，本发明还为HO-1结构和功能应用研究提供了具有中和活性的抗体，筛选到的3条抗原表位为以后临床诊断、治疗及预后奠定了一定基础。因此，本发明具有十分广泛的应用前景，有望成为生物工程研究和药物研发的重要技术手段。

下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。

附图说明

图1为表达并经纯化的血红素加氧酶-1的SDS-PAGE电泳检测结果(各步纯化纯度检测)

图2为抗ΔrHO-1多克隆抗体效价的ELISA法测定结果

图3为抗ΔrHO-1多克隆抗体特异性的Western-Blot检测结果

图4为抗ΔrHO-1多克隆抗体的中和活性检测结果

图5为噬菌体展示肽库技术筛选血红素加氧酶-1抗原表位的结果

图6为三条合成多肽与抗rHO-1多抗的ELISA结果

图7为抗A1和A13肽段及其天然肽的多克隆抗体纯化后的ELISA结果

图8为抗A1和A13肽段及其天然肽的多克隆抗体特异性的Western-Blot检测结果

图9为抗A1和A13肽段及其天然肽的多克隆抗体中和HO-1结合活性检测结果

图10为抗A1和A13肽段及其天然肽的多克隆抗体中和HO-1催化活性检测结果

具体实施方式

下述实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如sambrook等人所编《分子克隆实验指南》中所述的条件，或按照制造厂商建议的条件。

实施例1、血红素加氧酶-1的高效、可溶性表达及纯化

用本发明的方法进行血红素加氧酶-1的高效、可溶性表达，具体方法包括以下步骤：

一、血红素加氧酶-1的原核表达载体pMW172/ΔrHO-1的构建

首先通过化学合成的方法合成含有酶切位点为NdeI(上游)和HindIII(下游)的血红素加氧酶-1编码序列(序列表中SEQ ID NO：1)，然后采用限制性内切酶NdeI和HindIII双酶切该基因片段和空载体pMW172a(含有噬菌体T7启动子的表达载体，参考文献：王秀宏，滕悦秋，王志刚，血红素加氧酶在大肠杆菌中稳定表达的氨基酸范围的研究，医学分子生物学杂志，2004，1(4)：212-215.)，分别回收目的片段后，经T4 DNA连接酶连接外源DNA片段和空载体，转化入大肠杆菌感受态细胞BL21(DE3)。按照常规方法提取质粒DNA并进行NdeI和HindIII双酶切鉴定，最后送英骏公司直接测序，确证含有血红素加氧酶-1基因的原核表达载体pMW172/ΔrHO-1构建成功。

二、血红素加氧酶-1的高效、可溶性表达

将步骤一构建正确的原核表达载体pMW172/ΔrHO-1转化入大肠杆菌BL21(DE3)并涂布至LB平皿待长出克隆，挑取一个克隆接种到100mL LB培养基中，37℃、(200±5)r/min培养8h，OD值达到0.5。取30mL培养菌液加于300mL LB培养基中，37℃、(200±5)r/min摇菌16小时。

三、血红素加氧酶-1的纯化

用本发明的方法对表达的血红素加氧酶-1进行纯化，具体方法包括以下步骤：

1)用超声波粉碎仪(宁波分析仪器厂)超声破碎菌体，18000rpm离心15min；

2)取上清，进行35％-55％盐析，具体方法为：向上部离心上清中加入饱和硫酸铵溶液，使其饱和度为35％，4℃、盐析3h；4℃、10,000g离心10min收集上清与沉淀，上清加入饱和硫酸铵溶液，使其饱和度为55％，4℃、盐析3h；4℃、10,000g离心10min收集上清与沉淀，沉淀溶于等体积1×PBS中；

3)进行Sephacryl S-200(美国GE公司)分子筛层析纯化(层析系统(AKTA FPLC层析仪，Amersham Pharmacia biotech公司))，具体方法为：将Sephacryl S-200HR预装柱静态平衡4个柱体积，然后用2个柱体积的1×PBS洗脱凝胶柱，确定流出液在280nm处吸光度平稳后开始上样。将300mL培养液经超速离心和分级盐析所得蛋白沉淀用5mL 1×PBS溶解，0.22μm滤器过滤样品后上样2mL。记录流出液蛋白吸光度曲线，部分收集流出液，利用12％SDS-PAGE检测层析结果。

对上述步骤1)-3)产物进行12％SDS-PAGE电泳检测，结果如图1所示(M：蛋白分子量标准品(美国GE公司)1：超声后上清纯度66.5％；2：盐析后蛋白纯度76％；3：层析后蛋白纯度95％)，35％-55％盐析最大限度地保留了重组血红素加氧酶-1(ΔrHO-1)，除去了杂蛋白，S-200柱层析进一步通过分子量差异将杂蛋白分离。

Bio-Rad凝胶成像分析软件分析此泳道中血红素加氧酶-1的纯度，结果显示获得纯度为95％的活性蛋白-血红素加氧酶-1(ΔrHO-1，重组大鼠血红素加氧酶-1)。计算收得率为34.5％，纯化倍数为1.61倍(见表1)。

表1 ΔRHO-1纯化总表

实施例2、抗ΔrHO-1多克隆抗体的制备及检测

一、抗ΔrHO-1多克隆抗体的制备

实施例1制备的ΔrHO-1经背部皮下多点(不少于8点)注射免疫纯种成年雄性新西兰兔，每隔2周免疫1次，共免疫3次。用完全弗氏佐剂乳化的2mg蛋白对兔子进行初次免疫，用不完全弗氏佐剂乳化2mg蛋白对兔子进行后两次免疫。用股动脉插管的方法对麻醉的兔子进行采血，3000rpm离心15min分离血清；将血清分装后，于-80℃保存。用CNBr活化的Sepharose 4B(购自美国GE公司)偶联了ΔrHO-1的亲和层析柱纯化抗血清，得到纯化后抗ΔrHO-1多克隆抗体。

二、ELISA法测定效价

测定制备的抗ΔrHO-1多克隆抗体效价，方法为：从第二次免疫开始，每次免疫后7天采兔耳缘静脉血，分离血清作为一抗，用纯化的ΔrHO-1作为抗原包被ELISA板，用间接ELISA法测定抗体效价。

结果如图2所示(酶联板用纯化后的ΔrHO-1包被。对照：对照兔血清；兔1、兔2：抗血清)，获得了特异性强且效价达到6.4×10⁶的抗ΔrHO-1多克隆抗体。

三、Western-Blot检测

利用Western-Blot检测制备的抗ΔrHO-1多克隆抗体的特异性，方法为：将10μl纯化抗ΔrHO-1多克隆抗体进行常规12％SDS-PAGE电泳后转于PVDF膜上。奶粉包被后，用1∶5000稀释的抗HO-1多克隆抗体作为一抗，1∶5000稀释的HRP标记羊抗兔IgG作为二抗孵育。加入ECL发光液后对X光片曝光后，进行显影和定影。

Western-Blot实验结果如图3所示(1：BL21空菌超声上清；2：表达了ΔrHO-1的BL21菌超声上清；3：层析纯化后的ΔrHO-1；4：对照293-Ft细胞；5：过表达野生型人血红素加氧酶-1(hHO-1)的293-Ft细胞)，证实抗ΔrHO-1多克隆抗体能够特异性识别原核表达及真核过表达的HO-1。

四、中和活性检测

在HO-1测活体系中(采用细胞色素P450还原酶提供电子的体外反应体系，通过避光反应1h后464nm和530nm处吸光度的差值测HO-1的比活性。反应体系为：血红素1mM，细胞色素P450还原酶(CPR)(由鼠肝中提取，加少许即可)，NADPH45.5mg/mL，胆绿素还原酶(BRE)(由鼠肝中提取，一般过量加)，去铁铵0.8mg/mL，缓冲液为100mmol/L PBS。加入不同稀释度(抗ΔrHO-1兔血清分别稀释1、10²、10⁴、10⁶、10⁸、10¹⁰、10¹²倍)的抗血清1μl，其中对照血清与未稀释抗血清量相同，检测ΔrHO-1比活性值，比较不加抗体与加入抗体的比活性，检测抗体对ΔrHO-1催化活性的中和特性。

ΔrHO-1抗血清的中和活性检测结果如图4所示(1：无关兔血清；2-4：抗ΔrHO-1兔血清分别稀释1、10⁶、10¹²倍；5：阳性对照；6：阴性对照，即阳性对照中不加NADPH。数据表示为：平均值±标准差(n＝4)。**P＜0.01，与阳性对照比较；*P＜0.05，与阳性对照比较；##P＜0.01，与对照抗体比较；#P＜0.05，与对照抗体比较。)，可见，获得的抗ΔrHO-1多克隆抗体能中和掉72.6％的ΔrHO-1活性。

实施例3、血红素加氧酶-1抗原表位的获得及检测

一、噬菌体展示肽库技术筛选血红素加氧酶-1抗原表位

噬菌体随机12肽库(Ph.D.-12 Phage Peptide Library)试剂盒购自NewEngland Biolabs公司。根据改进的用户使用手册，用微孔板筛选了容量为1×10¹¹的随机肽库，得到了与抗ΔrHO-1抗体(实施例2制备得到)结合的肽段。简单来说，就是包被抗ΔrHO-1的抗体后，用磷酸缓冲液稀释的3％BSA封闭，接下来使1μl的噬菌体肽库同结合在protein A sepharose beads上的正常山羊IgG孵育1h，目的是除去不与抗ΔrHO-1的抗体结合的噬菌体。噬菌体得到放大和滴定，经过几轮淘洗，从筛选到的噬菌体中随机挑选18个单克隆，扩增并提取噬菌体单链DNA进行测序，分析外源展示肽氨基酸序列特征。同时，通过间接ELISA鉴定结合噬菌体的特异性(一抗为抗rHO-1的纯化后的多抗，二抗为HRP标记的抗噬菌体M13单抗)。

通过噬菌体展示肽库技术，筛选到12条肽段，参见图5中序号1、4-7、9、13-18，其中每组最左边柱表示PHAGE，中间柱表示噬菌体与HO-1抗原混合，最右边柱表示空白。测序后，得到了四个肽段组(表2)。

表2 阳性克隆序列

二、序列分析HO-1抗原表位

将单个噬菌斑的扩增液(获得方法为：挑取单个噬菌斑加入20mL对数生长早期的ER2537后，37℃振荡培养5h，于4℃、6000r/min离心10min，吸取上清，加入1/6体积PEG8000/NaCl混匀，4℃静置至少60min或过夜。4℃、6000r/min离心15min，弃去上清，再离心一次，吸尽残液。用1ml TBS混悬溶解沉淀，加入1/6体积PEG 8000/NaCl混匀，于冰上孵育15-60min。于4℃、12,000r/min离心10min，用80-200μl TBS混悬溶解沉淀，室温10000r/min离心1min后，上清移入新的无菌EP管。便得到单个噬菌体的扩增液。)用碘缓冲液(Tris-HCL(pH8.0)10mM，EDTA 1mM，NaI 4M)重悬，乙醇沉淀法制备噬菌体DNA模板。利用购自New England Biolabs公司的噬菌体随机12肽库试剂盒所提供的特异性下游引物M13-96gⅢ引物测定插入DNA序列，分析外源展示肽氨基酸序列特征。

由于A1和A13两组的重复克隆数多，可能为抗原表位，同时，经过肽段序列与hHO-1及ΔrHO-1序列比对后，A1和A13两组序列与HO-1序列的相似度最高，认为A1和A13最可能为HO-1的抗原表位。本发明进而对A1：DYDRYSSALIAA(序列表中序列2，编码该肽段的基因序列为序列表中序列5)及其天然肽：T：AYTRYLGDLSGG(序列表中序列4，编码该肽段的基因序列为序列表中序列7)和A13：GQPKTFLSVSEL(序列表中序列3，编码该肽段的基因序列为序列表中序列6)3条肽段进行多肽的合成(由军事医学科学院基础医学研究所合成)，将合成的多肽经ELISA鉴定，证实3条合成肽都能与抗HO-1多抗结合。

三、多克隆抗体制备及检测

1、多克隆抗体的制备

用与实施例2相同的方法制备抗A1和A13肽段及其天然肽的多克隆抗体。

2、ELISA法测定效价

测定制备的抗A1及其天然肽和A13肽段的多克隆抗体效价，方法与实施例2相同。

结果如图6所示(使用肽高亲和酶联板，用合成多肽进行包被，抗体500倍稀释，测定抗体与肽段的结合性高低。空白：空白孔；对照：对照兔血清；R：抗rHO-1兔血清。数据表示为：平均值±标准差(n＝2)。**P＜0.01，与空白对照比较；##P＜0.01，与对照血清比较。)，肽段抗体纯化后ELISA结果如图7所示，获得了效价达到1×10⁵的抗A1及其天然肽T和A13肽段的多克隆抗体。

3、Western-Blot检测

利用Western-Blot检测制备的抗A1及其天然肽T和A13肽段的多克隆抗体的特异性。

Western-Blot实验结果如图8所示(上图为Western-Blot结果，下图为对应的SDS-PAGE结果。样品为纯化后ΔrHO-1。1、2、3：以抗A1、天然肽、A13多抗为一抗，均以1∶100稀释；4：以抗ΔrHO-1多抗为一抗，以1∶5000稀释，作为阳性对照；5：以普通兔血清为一抗，以1∶5000稀释，作为阴性对照)，证实纯化的肽段抗体能够特异性识别ΔrHO-1。

4、中和HO-1结合活性及中和HO-1催化活性检测

1)测定肽段抗体中和HO-1结合活性，方法为：H₂O₂是一种强氧化剂，能够使血红素加氧酶·血红素发生彻底的氧化分解反应。反应体系为：血红素加氧酶0.4mg/mL，血红素1mM，抗体(过柱纯化后抗体，约为1mg/mL，测定时用不同稀释度)，缓冲液为100mmol/L PBS，于37℃保温10分钟后加入：H₂O₂，立即混匀后扫描200nm-500nm光谱，30秒间隔扫描一次，测量257nm处0-1min的峰值减少，设阳性对照的减少值为一，将各个加入抗体后的减少值与阳性对照的比值做柱形图。

结果如图9所示(1：抗体原液；2、3：抗体分别稀释10²和10⁴倍；4：阳性对照，不加抗体；5：阴性对照，不加H₂O₂。数据表示为：平均值±标准差(n＝4)。**P＜0.01，与阳性对照比较；*P＜0.05，与阳性对照比较。)，获得的抗体分别能中和掉45.4％、46.1％和52.2％的ΔrHO-1结合活性。

2)测定肽段抗体中和HO-1催化活性，方法与实施例1相同。

结果如图10所示(1：抗体原液；2、3：抗体分别稀释10²和10⁴倍；4：对照抗体；5：阳性对照，不加抗体；6：阴性对照，不加NADPH。数据表示为：平均值±标准差(n＝4)。**P＜0.01，与阳性对照比较；##P＜0.01，与对照抗体比较；#P＜0.05，与对照抗体比较。)，抗A13抗体可中和掉38.7％的ΔrHO-1催化活性。

上述检测结果表明获得了三个肽段作为血红素加氧酶-1抗原表位，其中，抗原表位1(A1)具有序列表中序列2的氨基酸残基序列，编码该肽段的基因具有序列表中序列5的核苷酸序列；抗原表位2(A13)具有序列表中序列3的氨基酸残基序列，编码该肽段的基因具有序列表中序列6的核苷酸序列；抗原表位3(天然肽)具有序列表中序列4的氨基酸残基序列，编码该肽段的基因具有序列表中序列7的核苷酸序列。

序列表

<160>7

 

<210>1

<211>792

<212>DNA

<213>人工序列

 

<220>

<223>

 

<400>1

atggagcgcc cacagctcga cagcatgtcc caggatttgt ccgaggcctt gaaggaggcc   60

accaaggagg tgcacatccg tgcagagaat tctgagttca tgcgcaattt ccagaaaggt  120

caggtttccc gggaaggatt caaactggtt atggctagcc tgtaccacat ctacactgct  180

ctcgaggagg agatagagcg gaacaagcag aacccagtat acgccccgct ctacttccct  240

gaggagctcc accgaagggc tgccctagag caggacatgg ccttctggta tgggccccac  300

tggcaggagg ccatccctta cacaccagcc acacagcact acgtaaagcg tctccacgag  360

gtcggaggaa ctcatcctga gctgctggtg gcccatgcat atacccgcta cctaggtgac  420

ctctcagggg gtcaggtcct gaagaagatt gcgcagaagg ccatggcctt gccaagctct  480

ggggaaggcc tggctttttt caccttcccg agcatcgata accccaccaa gttcaaacag  540

ctgtatcgtg cgcgcatgaa cactctggag atgactccgg aggtcaagca cagggtgaca  600

gaagaggcta agaccgcctt cctgctcaat attgagctgt ttgaggagct gcaggcactg  660

ctgacagagg aacacaaaga ccagagtccc tcacagacag agtttcttcg ccagaggcct  720

gctagcctgg ttcaagatac tacctctgca gagacgcccc gaggaaaatc ccagatcagc  780

actaggctct ag                                                      792

 

<210>2

<211>12

<212>PRT

<213>人工序列

 

<220>

<223>

<400>2

Asp Tyr Asp Arg Tyr Ser Ser Ala Leu Ile Ala Ala

1               5                   10

 

<210>3

<211>12

<212>PRT

<213>人工序列

 

<220>

<223>

 

<400>3

Gly Gln Pro Lys Thr Phe Leu Ser Val Ser Glu Leu

1               5                   10

 

<210>4

<211>12

<212>PRT

<213>人工序列

 

<220>

<223>

 

<400>4

Ala Tyr Thr Arg Tyr Leu Gly Asp Leu Ser Gly Gly

1               5                   10

 

<210>5

<211>36

<212>DNA

<213>人工序列

<220>s：g或c；y：t或c；m：a或c；n：a或g或c或t；h：a或c或t。

<223>

 

<400>5

saytaysaym gntayagyag ygcnytnath gcngcn                             36

 

<210>6

<211>36

<212>DNA

<213>人工序列

 

<220>y：t或c；n：a或g或c或t；r：g或a。

<223>

 

<400>6

ggncarccna aracnttyct nagygtnagy garytn                             36

 

<210>7

<211>36

<212>DNA

<213>人工序列

 

<220>y：t或c；n：a或g或c或t；s：g或c。

<223>

 

<400>7

gcntayactm gntayytngg nsayytntcn ggnggn                             36