中国对虾ES15微卫星标记的检测方法

摘要

一种中国对虾ES15微卫星标记的检测方法，首先提取中国对虾基因组DNA；再利用中国对虾cDNA文库中的含有微卫星核心序列，在其序列两端设计特异性引物；并对中国对虾不同地理群或中国对虾群内个体的基因组DNA进行PCR扩增，将获得的PCR产物在变性聚丙稀酰胺凝胶电泳分离，获得中国对虾在ES15核心序列区呈现高度遗传变异的多态性图谱；对图谱的条带进行分析，可得到中国对虾每个个体在ES15位点的基因型。本发明可快捷的获得中国对虾ES15基因座位的遗传变异图谱，方法简便，可直观地检测出中国对虾每个个体的基因型；本发明主要应用于中国对虾群体遗传标记、系谱认证和遗传图谱的构建等。

说明书

技术领域：

本发明属于中国对虾DNA分子遗传标记技术，是一种中国对虾在ES15位点遗传多态性的微卫星标记检测方法。

背景技术：

本发明做出之前，国内外有类似的研究报道，国内中国科学院海洋研究所徐鹏等(水产学报，2001a；海洋与湖沼，2001b；水产学报，2003)发表的《用PCR法快速筛选中国对虾含微卫星的重组阳性克隆》、《中国对虾微卫星DNA的筛选》和《从中国对虾ESTs中筛选微卫星标记的研究》等论文，曾报道了中国对虾部分基因组文库的构建、含微卫星序列的筛选等内容，并依据Weber(美国，马什菲尔德医学研究基金会，1990)提出的标准对微卫星核心序列进行了评价，但他的这些研究结果仅限于研究微卫星序列的获得，没有进一步应用开发。刘萍等(中国水产科学研究院黄海水产研究所，海洋与湖沼，2004)开发了8个SSR位点，并完成了中国对虾3个自然群体的遗传多样性分析。孙昭宁等(中国水产科学研究院黄海水产研究所，中国水产科学，2005)用6个微卫星标记对中国对虾5个家系进行了系谱鉴别和遗传多样性研究。董世瑞等(中国水产科学研究院黄海水产研究所，海洋学报，2006)用2对微卫星鉴定了中国对虾混合养殖的2个家系的个体交配所繁殖的6个家系的亲缘关系。孟宪红等(中国水产科学研究院黄海水产研究所，海洋水产研究，2006)从33对微卫星引物中筛选到11对引物具有多态性。法国海洋开发研究院(IFREMER)1999年已经从蓝对虾种群中找到10个微卫星标记，从斑节对虾中找到3个微卫星标记，这些标记在识别混养的不同家系时发挥了作用。目前，在国内外尚未见有中国对虾微卫星多态性图谱的构建、特异性遗传标记等方面应用的报道。

发明内容：

本发明其目的是提出一种中国对虾DNA分子遗传标记检测方法，主要利用建立的中国对虾cDNA文库中的含有微卫星核心序列，在其两端设计特异性引物进行PCR检测，从而快速地检测中国对虾每个个体在此微卫星区的遗传变异，获得该引物对中国对虾多态性图谱，通过图谱直观地检测出每个个体的基因型。

本发明是按照以下操作技术方案完成的：

首先提取中国对虾基因组DNA并稀释备用；再利用中国对虾cDNA文库中的含有微卫星核心序列，在其序列两端设计特异性引物；然后使用该引物对中国对虾不同地理群或中国对虾群内个体的基因组DNA进行PCR扩增，对PCR产物进行检测；利用产物出现的条带进行分析，确定每个个体的基因型，并获得中国对虾的遗传多态性图谱。

提取中国对虾基因组DNA，将其稀释为50ng/μl，每个PCR反应中加入2μl，反应总体积为20μl。ES15微卫星核心序列的特异性引物序列分别为：正链5’-GTT TAT GCT ACT TTG GGA CT-3’，负链5’-CTC CTC CTC CTT CTC CTC-3’，使用该引物时的退火温度为50℃。

PCR扩增的加样参数为：每个PCR反应总体积为20μl，包括100ng中国对虾基因组DNA；10X PCR Buffer，2.0μl；Mg⁺⁺2.0mmol/L；Tag酶1U；dNTP各0.1mmol/L；本发明的引物各0.2μmol/L；加ddH₂O至20μl。使用该引物时设置PCR仪的程序参数为：94℃变性5min；94℃40sec，64℃40sec，72℃40sec，，35个循环；72℃延伸10min，4℃保存。

PCR产物的检测：将PCR产物在8％的变性聚丙烯酰胺凝胶，12W恒功率电泳1-1.5小时进行分离。将胶板通过10％的冰醋酸溶液20min→蒸馏水6min→0.1％的硝酸银溶液20min→3％的碳酸钠溶液显色数分钟，终止反应即可得到中国对虾在ES15基因座位的多态性图谱。

本发明技术具有以下特点：

(1)本发明可快捷的获得中国对虾的ES15遗传标记基因座位的遗传变异图谱，方法简便，所得结果可直观地检测出中国对虾每个个体的基因型，从而区分纯合子和杂合子个体；

(2)本发明主要应用于中国对虾群体间遗传标记、系谱认证和遗传图谱的构建等。PCR引物是本发明的核心，在中国对虾总群检测中呈现多态性。

附图说明：

图1：本发明的ES15引物对中国对虾20个个体的检测图谱，编号1-20是中国对虾的20个个体，M是DL 100标准分子量。

具体实施方式：

下面通过实施例结合附图详细叙述本发明在中国对虾ES 15微卫星核心序列DNA分子遗传标记技术方法。

首先提取中国对虾基因组DNA并稀释备用；再利用中国对虾cDNA文库中的含有微卫星核心序列，在其序列两端设计特异性引物；然后使用该引物对中国对虾不同地理群或中国对虾群内个体的基因组DNA进行PCR扩增，对PCR产物进行检测；利用产物出现的条带进行分析，确定每个个体的基因型，并获得中国对虾的遗传多态性图谱。

1、中国对虾基因组DNA的提取：取对虾肌肉组织100mg，剪碎后放入1.5ml离心管中，加入pH8.0的TE溶液(10mmol/L Tris-Cl，10mmol/L EDTA)475μl，用研磨棒研磨。加入10％SD S溶液25μl，混匀。加入20mg/ml蛋白酶K 4μl，混匀，55℃消化2.5～3h。重蒸酚抽提两次，每次10min，12000转/min离心5min，取上清；酚∶氯仿(1∶1)抽提一次，10min，12000转/min离心5min，取上清；氯仿抽提一次5min，5000g离心5min，取上清。加入1/25体积的5mol/L NaCl溶液，混匀后再加入两倍体积的-20℃的无水乙醇沉淀DNA 15min；挑出的DNA，用70％的乙醇洗涤数十分钟，使DNA干燥，用灭菌水500μl充分溶解后，定量将其稀释成50ng/μl的浓度备用。

2、微卫星引物的设计：在中国对虾cDNA文库中含有微卫星核心序列的基础上，利用微卫星DNA两侧的序列在同一物种相对于核心序列的高度保守性，据此在其两端设计特异性引物，用其扩增出该位点的微卫星片段。由于微卫星核心序列突变率相对较高，造成微卫星DNA核心序列重复次数的增加或减少，即微卫星DNA序列长度的变化，这是检测微卫星多态性的根源。本发明的微卫星区核心序列两端的特异性引物序列为：正链5’-GTT TAT GCT ACT TTG GGACT-3’，负链5’-CTC CTC CTC CTT CTC CTC-3’，使用该引物时的退火温度为50℃。

3、PCR扩增：首先加样，加样量如下：中国对虾基因组DNA(50ng/μl)，2μl；10X PCR Buffer，2.0μl；Mg⁺⁺(25mmo l/L)，2μl；Tag酶(5U/μl)，0.2μl；dNTP(各2.5mmol/L)，2μl；本发明的引物(各10mmol/μl)，2μl；加灭菌水至20μl。其次，进行PCR反应，其PCR扩增仪程序参数为：94℃变性5min；94℃40sec，64℃40sec，72℃40sec，35个循环；72℃延伸10min，4℃保存。4、PCR产物的检测：PCR反应结束后，将产物在8％的变性聚丙烯酰胺凝胶中进行电泳，电泳仪的功率为12瓦，电泳时间在1-1.5小时左右，即可终止。将胶板通过10％的冰醋酸溶液20min→蒸馏水6min→0.1％的硝酸银溶液20min→3％的碳酸钠溶液显色数分钟，终止反应即得到如图1所示的多态性图谱。