一种大肠杆菌和使用该大肠杆菌制备L-半胱氨酸的方法

摘要

本发明公开了一种大肠杆菌和使用该大肠杆菌制备L-半胱氨酸的方法。该大肠杆菌的基因组以大肠杆菌BL21(DE3)为模板，具有如SEQ ID NO.1所示序列的丝氨酸乙酰转移酶，缺失基因metC、基因tnaA、基因gshA、基因dfp。将上述大肠杆菌先放入种子培养基中培养，后再放入发酵培养基中，发酵得到L-半胱氨酸。本发明的有益效果是：利用本发明大肠杆菌发酵制备L-半胱氨酸，其底物的转化率和L-半胱氨酸的产量得到很大提高，底物的转化率可达到30％，比现有技术提高50％以上；L-半胱氨酸的产量相对于现有技术可提高20％以上。

说明书

技术领域

本发明涉及一种大肠杆菌，以及利用大肠杆菌进行发酵制备L-半胱氨酸的方法。

背景技术

L-半胱氨酸广泛地应用于医药、食品、化妆品及饲料等行业。目前L-半胱氨酸的生产主要有天然产物提取法、化学合成法、微生物转化法和微生物发酵法。天然产物提取法采用人或动物毛发作为原料，经酸水解或碱水解法提取L-胱氨酸，再经电解还原制得L-半胱氨酸。化学合成法是利用氯代烷类化合物经过氧化反应——加成反应——还原反应——取代反应，最后得到半胱氨酸。微生物转化法是利用DL-2-氨基-Δ²-噻唑林-4-羧酸作为前体经微生物酶转化得到半胱氨酸。这几种方法不仅产率低，能耗大，而且在生产过程中要用到大量的化学试剂，对环境有相当大的危害。

细菌中L-半胱氨酸的合成途径已经被研究清楚了，L-丝氨酸在丝氨酸乙酰转移酶(E.C：2.3.1.30)催化下，与乙酰辅酶A反应生成O-乙酰基丝氨酸，然后在O-乙酰基丝氨酸巯羟基裂解酶(E.C：2.5.1.47)催化下，形成L-半胱氨酸。

野生型大肠杆菌中，L-半胱氨酸对丝氨酸乙酰转移酶(SAT)有很强烈的反馈抑制作用(IC₅₀＝0.8μM)。有文献报道SAT的第95位点的缬氨酸残基被精氨酸替代，第96位点的天冬氨酸被脯氨酸替代后，L-半胱氨酸对其的反馈抑制作用会大幅度减弱(IC₅₀＝1100μM)。(IC₅₀表示SAT活性降低到50％的L-半胱氨酸的含量)。

除了对SAT的反馈抑制作用，细菌体内L-半胱氨酸的含量还受半胱氨酸脱巯基酶的调控。在大肠杆菌中目前已报导的半胱氨酸脱巯基酶有(E.C：4.1.99.1和E.C：4.4.1.8)，它们的编码基因分别是tnaA和metC。但这两个酶的脱巯基作用只在体外实验中得到证明，L-半胱氨酸在细胞内代谢途径中的作用尚不明确。

尽管已经有通过利用L-半胱氨酸对其反馈抑制作用被减弱的SAT的编码基因以及敲除半胱氨酸脱巯基酶的表达基因的方法来制备L-半胱氨酸的技术。甚至还有人通过过量表达一种氨基酸胞外运输蛋白编码基因，提高L-半胱氨酸胞外运输能力来制备L-半胱氨酸。但是目前这些生产L-半胱氨酸的技术的产量及转化率都无法满足工业化的需求，需要有一个更完善的L-半胱氨酸制备技术及一种更高产高效的L-半胱氨酸生产菌种。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是要提供一种大肠杆菌和使用该大肠杆菌制备L-半胱氨酸的方法，可使底物的转化率及L-半胱氨酸的产量得到提高。

发明人经过长期和深入的研究，发现抑制谷氨酸半胱氨酸连接酶和磷酸泛酸半胱氨酸连接酶能提高大肠杆菌的L-半胱氨酸的含量，这两个酶的编码基因分别是gshA和dfp。并以大肠杆菌BL21(DE3)为初始菌种，通过基因工程手段对其产L-半胱氨酸能力进行定向改造，得到一种能够生产L-半胱氨酸的菌种以及利用该菌种制备L-半胱氨酸的方法。通过增加丝氨酸乙酰转移酶活性，降低半胱氨酸脱巯基酶活性并提高氨基酸胞外运输能力，使大肠杆菌BL21(DE3)制备L-半胱氨酸的能力得到大幅度提高。

通过对培养基的碳源、氮源、矿物盐及维生素、发酵时间、温度、氢离子浓度指数等指标的研究，确定了利用上文所述菌种制备L-半胱氨酸的最佳发酵条件。

具体地说，本发明解决其技术问题所采取的技术方案是：本发明的大肠杆菌的基因组以大肠杆菌BL21(DE3)为模板，具有如SEQID NO.1所示序列的丝氨酸乙酰转移酶，缺失基因metC、基因tnaA、基因gshA和基因dfp。

进一步地，本发明所述大肠杆菌具有通过载体pET22b表达的基因bcr。

本发明使用大肠杆菌制备L-半胱氨酸的方法是：将大肠杆菌先放入种子培养基中培养，后再放入发酵培养基中得到L-半胱氨酸；所述大肠杆菌的基因组以大肠杆菌BL21(DE3)为模板，具有如SEQ ID NO.1所示序列的丝氨酸乙酰转移酶，缺失基因metC、基因tnaA、基因gshA和基因dfp。

进一步地，本发明所述大肠杆菌具有通过载体pET22b表达的基因bcr。

进一步地，本发明所述种子培养基中含有葡萄糖、蛋白胨、酵母浸出物和氯化钠，所述发酵培养基中含有葡萄糖、玉米粉、牛肉膏、乳糖、氯化钠、硫酸铵、硫酸镁、柠檬酸钠和硫代硫酸钠，所述种子培养基和发酵培养基的pH值均为7。

进一步地，本发明所述大肠杆菌在种子培养基中进行培养时的温度为35～40℃，培养时间为20～30小时；在发酵培养基中进行培养时的温度为35～40℃，培养时间为36～60小时。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：用基因工程手段改造大肠杆菌代谢途径，提高L-半胱氨酸在培养基中的积累。通过基因定点突变提高丝氨酸乙酰转移酶的活性，同时用基因敲除的手段抑制L-半胱氨酸在细菌体内的代谢，并提高半胱氨酸的胞外运输能力达到高产L-半胱氨酸的目的，满足了工业化需求。利用本发明大肠杆菌发酵制备L-半胱氨酸，其底物的转化率和L-半胱氨酸的产量得到很大提高，底物的转化率可达到30％，比现有技术提高50％以上；L-半胱氨酸的产量相对于现有技术可提高20％以上。

附图说明

图1是原始菌种和改造后菌种发酵制备L-半胱氨酸糖转化率的比较图。

图2是原始菌种和改造后的菌种发酵产L-半胱氨酸产量的比较图。

图3是L-半胱氨酸产量与发酵温度的关系图。

图4是L-半胱氨酸产量与发酵时间的关系图。

图5是导入pET22b-bcr前后L-半胱氨酸产量的比较图。

具体实施方式

下面通过实施例进一步说明本发明，且仅仅是为了说明的目的，而非限制本发明的范围。

本发明所得到的大肠杆菌是以大肠杆菌BL21(DE3)为初始菌种，使大肠杆菌BL21(DE3)的cysE基因编码的丝氨酸乙酰转移酶第95位的缬氨酸被精氨酸所替代，第96位的天冬氨酸被脯氨酸所替代，从而丝氨酸乙酰转移酶具有如SEQ IDNO.1所示的序列，使L-半胱氨酸脱巯基酶活性被抑制。接着，敲除胱硫醚β裂解酶表达基因metC，敲除半胱氨酸脱巯基酶表达基因tnaA，敲除谷氨酸半胱氨酸连接酶表达基因gshA，敲除磷酸泛酸半胱氨酸连接酶表达基因dfp。进一步地，通过载体pET22b表达氨基酸流出系统蛋白表达基因bcr，本发明获得的大肠杆菌可增加氨基酸胞外释放能力。

一、以下举例说明本发明大肠杆菌的获得方法。

(一)大肠杆菌BL21(DE3)丝氨酸乙酰转移酶(SAT)的改造

应用基因组定点突变技术，通过改变SAT表达基因cysE的第95、96位氨基序列减少L-半胱氨酸对SAT的反馈抑制，从而提高SAT的活性。具体步骤如下：

首先，根据基因cysE设计引物如下，

引物1：agctgagtcgacatgtcgtgtgaagaactggaa

引物2：agctgatctagaatagatgattacatcgcatcc

引物3：acccgcgacccggcaagacccaaatactcaacc

引物4：cggggttgagtatttgggtcttgccgggtcgcg

以上引物中下划线标注处为突变位点。其中，引物1和引物2是根据大肠杆菌cysE基因序列设计，以用作cysE基因克隆；引物3和引物4是根据大肠杆菌cysE基因序列设计，以用作cysE定点突变。

通过三轮PCR基因扩增得到突变的cysE核酸片段。反应体系如下表1所示。

表1

上述三轮PCR都是按照以下反应条件进行的：将50μl PCR反应液混匀后放入PCR仪，95℃孵育5分钟活化Taq酶，94℃热击30秒使DNA双链打开，55℃退火30秒使引物结合到DNA片段上，72℃延伸90秒。重复热击、退火和延伸这个循环35次，然后72℃孵育10分钟后，在4℃保存。

得到的DNA片度转入事先转入了质粒pKD46的BL21(DE3)大肠杆菌中，通过同源重组整合到大肠杆菌的基因组上，达到基因改造的目的，获得具有如SEQID NO：1所示序列的丝氨酸乙酰转移酶。质粒pKD46表达λ噬菌体的DNA重组酶，能够提高细菌内基因组重组的水平。

(二)大肠杆菌的L-半胱氨酸脱巯基酶的抑制

用卡那霉素抗性基因作为筛选标记，利用如SEQ ID No.6-13所示的引物5-12在卡那霉素抗性基因的两端加上目的基因两侧的同源臂，转入带有质粒pKD46的B121(DE3)大肠杆菌中，通过同源重组整合到大肠杆菌的基因组上，将目的基因敲除掉。

其中，引物5和引物6根据大肠杆菌tnaA基因序列设计，以用作tnaA的敲除；引物7和引物8根据大肠杆菌metC基因序列设计，以用作metC的敲除；引物9和引物10根据大肠杆菌gshA基因序列设计，以用作gshA的敲除；引物11和引物12根据大肠杆菌dfp基因序列设计，以用作dfp的敲除。

本发明利用这个方法分别敲除了丝氨酸乙酰转移酶(SAT)被改造后的大肠杆菌BL21(DE3)中的tnaA、metC、gshA和dfp基因。如前所述，其中，引物5和引物6用于敲除tnaA基因，引物7和引物8用于敲除metC基因，引物9和引物10用于敲除gshA基因，引物11和引物12用于敲除dfp基因。对此时大肠杆菌BL21(DE3)中的L-半胱氨酸的含量进行检测，可发现敲除其中任意一个基因都能使大肠杆菌BL21(DE3)中L-半胱氨酸的含量得到提高。上述四个基因被敲除后即得到本发明的大肠杆菌BL21(DE3)cysE*ΔtnaAΔmetCΔgshAΔdfp。该大肠杆菌的基因组以大肠杆菌BL21(DE3)为模板，具有如SEQ ID NO.1所示序列的丝氨酸乙酰转移酶，缺失基因metC、基因tnaA、基因gshA、基因dfp。

(三)大肠杆菌BL21(DE3)cysE*ΔtnaAΔmetCΔgshAΔdfp氨基酸排出功能的提高。

通过PCR得到bcr基因片段，bcr基因片段和质粒pET22b用BamH I和NcoI双酶切后进行连接，得到pET22b-bcr。然后将pET22b-bcr转入BL21(DE3)cysE*ΔtnaAΔmetCΔgshAΔdfp中，使该大肠杆菌的氨基酸排出功能得到提高。

上述bcr基因片段和质粒pET22b的连接体系如下：

10×buffer             1μl

PEG4000                1μl

T4连接酶               1μl

pET22b酶切产物         1μl

bcr酶切产物            6μl

                                      

总体积                 10μl

二、利用本发明的大肠杆菌BL21(DE3)cysE*ΔtnaAΔmetCΔgshAΔdfp制备L-半胱氨酸。

实施例1

分别挑取基因改造后得到的大肠杆菌BL21(DE3)cysE*ΔtnaAΔmetCΔgshAΔdfp和未改造的大肠杆菌BL21(DE3)单菌落到5ml种子培养基，在37℃温度条件下以250rpm的转速培养24小时；后从中取2ml加入装有200ml发酵培养液的1000ml摇瓶中，在37℃温度条件下以200rpm的转速发酵培养48小时。利用柱层析法，将发酵后的发酵培养液依次通过阴离子柱和阳离子柱得到L-半胱氨酸。

本实施例中，种子培养基含有葡萄糖、蛋白胨、酵母浸出物和氯化钠，发酵培养基中含有葡萄糖、玉米粉、牛肉膏、乳糖、氯化钠、硫酸铵、硫酸镁、柠檬酸钠和硫代硫酸钠，且种子培养基和发酵培养基的pH值均为7。

以下对本发明制备L-半胱氨酸方法的效果进行检测。

取发酵前和发酵后的发酵培养液，分别用3，5-二硝基水杨酸比色法测定其总糖含量，然后根据测得的数值计算出基因改造前的大肠杆菌BL21(DE3)和基因改造后的本发明大肠杆菌BL21(DE3)cysE*ΔtnaAΔmetCΔgshAΔdfp的糖转化率，结果如图1所示。由图1可知，基因改造前的原始大肠杆菌BL21(DE3)的糖转化率几乎为0，而本发明大肠杆菌BL21(DE3)cysE*ΔtnaAΔmetCΔgshAΔdfp的糖转化率则达到50％。

用ellman法检测发酵液中L-半胱氨酸的产量。具体如下：

取1ml发酵后的发酵培养液，在10000×g的离心力下离心1分钟，从中取100μl上清液加入3ml H₂O、800μl pH为8的Tris·HCl和100μl 20mM的DNTB，再用分光光度计测出其在412纳米波长下的吸光值(OD412)，根据L-半胱氨酸标准曲线计算出发酵后的发酵培养液中L-半胱氨酸的产量，结果如图2所示。由图2可知，基因改造前的大肠杆菌BL21(DE3)的L-半胱氨酸产量几乎为0，而本发明大肠杆菌BL21(DE3)cysE*ΔtnaAΔmetCΔgshAΔdfp的L-半胱氨酸产量则达到1000mg/l，相对于大肠杆菌BL21(DE3)中的L-半胱氨酸产量提高了很多。

实施例2-实施例10

挑取BL21(DE3)cysE*ΔtnaAΔmetCΔgshAΔdfp大肠杆菌单菌落到5ml LB培养基，在37℃温度条件下以250rpm的转速在种子培养基中培养至对数生长期。取2ml加入装有200ml的发酵培养基的1000ml摇瓶中分别在表2所示的发酵条件下进行发酵培养。利用柱层析法，将发酵后的发酵培养液依次通过阴离子柱和阳离子柱得到L-半胱氨酸。利用实施例1所记载的ellman法检测L-半胱氨酸的产量，结果如图3、图4和表2所示。

其中，种子培养基和发酵培养液的成分与实施例1相同。

表2

  实施例  发酵温度(℃)  发酵时间(小时)  摇瓶转速(转/分钟)  L-半胱氨酸产量(毫克/升)  实施例2  30  48  200  290  实施例3  35  48  200  811  实施例4  37  48  200  1050  实施例5  40  48  200  794  实施例6  45  48  200  188  实施例7  37  24  200  222  实施例8  37  36  200  818  实施例9  37  60  200  800  实施例10  37  72  200  196

实施例11

分别挑取本发明构建的带pET22b-bcr的BL21(DE3)cysE*ΔtnaAΔmetCΔgshAΔdfp和不带pET22b-bcr的BL21(DE3)cysE*ΔtnaAΔmetCΔgshAΔdfp大肠杆菌菌种，以实施例1的种子培养液和发酵培养液进行发酵培养，在37℃的温度条件下以200rpm转速培养48小时，然后用实施例1所记载的ellman法测定发酵液中L-半胱氨酸的产量。结果如图5所示，在大肠杆菌BL21(DE3)cysE*ΔtnaAΔmetCΔgshAΔdfp导入pET22b-bcr，使L-半胱氨酸的产量提高了200毫克/升，约20％。

由以上各实施例可以看到，使用本发明改造后的大肠杆菌BL21(DE3)cysE*ΔtnaAΔmetCΔgshAΔdfp发酵制备L-半胱氨酸的能力与改造前的大肠杆菌BL21(DE3)相比有了巨大的提高，另外再导入连接氨基酸流出系统蛋白表达基因bcr的表达载体pET22b后，L-半胱氨酸的产量有了更进一步的提高。

序列表

<110>杭州宝晶生物化工有限公司

<120>一种大肠杆菌和使用该大肠杆菌制备L-半胱氨酸的方法

<160>13

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>273

<212>PRT

<213>大肠杆菌种(Escherichia coli)

<400>1

Met Ser Cys Glu Glu Leu Glu Ile Val Trp Asn Asn Ile Lys Ala Glu

1               5                   10                  15

Ala Arg Thr Leu Ala Asp Cys Glu Pro Met Leu Ala Ser Phe Tyr His

            20                  25                  30

Ala Thr Leu Leu Lys His Glu Asn Leu Gly Ser Ala Leu Ser Tyr Met

        35                  40                  45

Leu Ala Asn Lys Leu Ser Ser Pro Ile Met Pro Ala Ile Ala Ile Arg

    50                  55                  60

Glu Val Val Glu Glu Ala Tyr Ala Ala Asp Pro Glu Met Ile Ala Ser

65                  70                  75                  80

Ala Ala Cys Asp Ile Gln Ala Val Arg Thr Arg Asp Pro Ala Ala Pro

                85                  90                  95

Lys Tyr Ser Thr Pro Leu Leu Tyr Leu Lys Gly Phe His Ala Leu Gln

            100                 105                 110

Ala Tyr Arg Ile Gly His Trp Leu Trp Asn Gln Gly Arg Arg Ala Leu

        115                 120                 125

Ala Ile Phe Leu Gln Asn Gln Val Ser Val Thr Phe Gln Val Asp Ile

    130                 135                 140

His Pro Ala Ala Lys Ile Gly Arg Gly Ile Met Leu Asp His Ala Thr

145                 150                 155                 160

Gly Ile Val Val Gly Glu Thr Ala Val Ile Glu Asn Asp Val Ser Ile

                165                 170                 175

Leu Gln Ser Val Thr Leu Gly Gly Thr Gly Lys Ser Gly Gly Asp Arg

            180                 185                 190

His Pro Lys Ile Arg Glu Gly Val Met Ile Gly Ala Gly Ala Lys Ile

        195                 200                 205

Leu Gly Asn Ile Glu Val Gly Arg Gly Ala Lys Ile Gly Ala Gly Ser

    210                 215                 220

Val Val Leu Gln Pro Val Pro Pro His Thr Thr Ala Ala Gly Val Pro

225                 230                 235                 240

Ala Arg Ile Val Gly Lys Pro Asp Ser Asp Lys Pro Ser Met Asp Met

                245                 250                 255

Asp Gln His Phe Asn Gly Ile Asn His Thr Phe Glu Tyr Gly Asp Gly

            260                 265                 270

Ile

 

<210>2

<211>33

<212>DNA

<213>人工序列

<400>2

agctgagtcg acatgtcgtg tgaagaactg gaa                                      33

 

<210>3

<211>33

<212>DNA

<213>人工序列

<400>3

agctgatcta gaatagatga ttacatcgca tcc                                  33

 

<210>4

<211>33

<212>DNA

<213>人工序列

<400>4

acccgcgacc cggcaagacc caaatactca acc                                  33

 

<210>5

<211>33

<212>DNA

<213>人工序列

<400>5

cggggttgag tatttgggtc ttgccgggtc gcg                                  33

 

<210>6

<211>62

<212>DNA

<213>人工序列

<400>6

acagggatca ctgtaattaa aataaatgaa ggattatgta tgaacaataa aactgtctgc     60

tt                                                                    62

 

<210>7

<211>57

<212>DNA

<213>人工序列

<400>7

gagagtggct aacatcctta tagccactct gtagtattaa gcggaacccc tatttgt         57

 

<210>8

<211>55

<212>DNA

<213>人工序列

<400>8

acagggatca ctgtaattaa aataaatgaa ggattatgta tcattaaatc tgggg          55

 

<210>9

<211>55

<212>DNA

<213>人工序列

<400>9

gagagtggct aacatcctta tagccactct gtagtattaa ccccagattt aatga          55

 

<210>10

<211>62

<212>DNA

<213>人工序列

<400>10

tagtttagac atccagacgt ataaaaacag gaatcccgac tgaacaataa aactgtctgc     60

tt                                                                    62

 

<210>11

<211>57

<212>DNA

<213>人工序列

<400>11

cacaataaaa tgtctgcaaa attgtccaaa agtggcaatg gcggaacccc tatttgt    57

 

<210>12

<211>55

<212>DNA

<213>人工序列

<400>12

tagtttagac atccagacgt ataaaaacag gaatcccgac tcattaaatc tgggg      55

 

<210>13

<211>55

<212>DNA

<213>人工序列

<400>13

cacaataaaa tgtctgcaaa attgtccaaa agtggcaatg ccccagattt aatga      55