一种六六六降解菌及其在降解六六六中的应用

摘要

本发明公开了一种六六六降解菌及其在降解六六六中的应用。该菌株为Sphingobium japonicum HZ-A1，其保藏登记号为CGMCC № 3539。本发明的菌株可以在12小时内完全降解20ppm的林丹。该菌在30天内可以降解土壤中20mg/kg的林丹，对污染的土壤中有良好的降解效果，具有应用于田间修复六六六污染的土壤和水体的潜力。

说明书

技术领域

本发明涉及一种六六六降解菌及其在降解六六六中的应用，特别涉及一株Sphingobium japonicum菌株及其在降解丙体六六六中的应用。

背景技术

六六六(Hexachlorocyclohexane，HCH)是一种广谱性的有机氯杀虫剂，主要有α、β、γ和δ(甲体、乙体、丙体、丁体)等4种异构体，其异构体的相对持久性与氯原子在环己烷结构上的排列方式有关，持久性顺序为β-HCH＞δ-HCH＞γ-HCH＞α-HCH。由于六六六的低水溶性和高氯状态，在环境中非常稳定。在斯德哥尔摩公约中，六六六已经被列为12种持久性有机污染物之一。在这4种异构体中，只有丙体六六六(γ-HCH，又称为林丹)具有杀虫活性，主要用来防治农作物害虫。

六六六由于其毒性大，难分解，分布广，危害重，在大量使用的同时也给环境造成难以修复的危害，加之由于其脂溶性大的特点，通过食物链的富积对人类自身的影响正在逐渐的显现出来并加大。随着人们认识的加深和替代品的出现，20世纪80年代后，大部分发达国家包括一些发展中国家禁止生产和使用混合六六六，六六六的总含量明显降低。20世纪90年代后，六六六的主要来自印度。同时，相当数量的未使用的混合六六六存在自然界中，包装容器的损坏和渗漏给人类和野生生命造成了严重的威胁。中国曾是生产和使用六六六的大国，自20世纪60年代初开始生产有机氯农药，到1983年停止生产，产量呈逐年持续增长趋势。这一时期六六六的大量使用造成了该类农药在土壤和农作物中的大量积累，在没有使用过农药的地区，如西藏南迦巴瓦峰土壤和西藏库拉岗日峰地衣、苔藓中都检测到了六六六。自1983年禁止生产六六六后，食物中的残留量有了明显降低，但这并不意味着六六六的危害不存在了。据对水体中的农药检测，黄河部分河段、白洋淀地区端村水域生态系统、珠江三角洲地区都检测到了一定浓度的六六六。

研究表明，六六六为环境内分泌干扰物，具有类雌激素行为，干扰体内正常内分泌物质的合成与代谢，可导致生殖和发育障碍，残留的六六六对人类和动物的健康构成了严重的威胁。但目前对于已经施用过六六六的环境综合治理，一直未见有比较成熟的技术。

发明内容

本发明的目的本发明的目的在于针对环境保护和生产实践中的实际问题和需求，提供一种从长期受农药污染土壤中筛选分离的，能以林丹为唯一碳源和能源生长，并可以高效降解丙体六六六(林丹)的菌株。

本发明所提供的菌株，是Sphingobium japonicum HZ-A1。

Sphingobium japonicum HZ-A1已于2009年12月28日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)，保藏登记号为：CGMCC №3539。

本发明的Sphingobium japonicum HZ-A1，是从长期受六六六和滴滴涕等有机氯农药污染的土壤中分离筛选的。HZ-A1的形态和生理生化特征为：在LB平板上30℃培养4天后形成黄色扁平的.具有清晰边缘、不透明的菌落该菌有极生鞭毛，G^-，直或弯杆状，具有接触酶和氧化酶活性，产黄色色素.菌体周围产荚膜，能利用葡萄糖、半乳糖、海藻糖和阿拉伯糖氧化产酸。

Sphinobium japonicum HZ-A1 CGMCC № 3539在降解六六六中的应用也属于本发明的保护范围。

所述应用中，所述六六六为丙体六六六。其中，所述降解六六六的方法是将所述Sphingobium japonicum HZ-A1 CGMCC №.3539接种到含有六六六的体系中培养。

所述培养的温度为15-45℃，优选为30℃。所述Sphingobium japonicum HZ-A1CGMCC № 3539的接种量为10⁵cfu/g以上，优选为10⁵-10⁶cfu/g。

该菌能以林丹为唯一碳源和能源生长，并可以在12小时内完全降解20mg/l的林丹。实验证明，使用pH值为7的无机盐培养液按10％接种量接种本发明的六六六降解菌，在30℃对10～100mg/l的林丹有良好的降解效果。实验室内的土壤修复实验表明该菌在30天内可以降解土壤中20mg/kg的林丹，对污染的土壤中有良好的降解效果，具有应用于田间修复六六六污染的土壤和水体的潜力。

附图说明

图1为菌株HZ-A1对20mg/lγ-六六六的降解曲线图

图2为菌株HZ-A1降解γ-六六六的产物的色谱和质谱图(A：色谱图；B：1，2，4-TCB质谱图；C：γ-PCCH质谱图)

图3为pH值对菌株HZ-A1降解γ-六六六的影响

图4为温度对菌株HZ-A1降解γ-六六六的影响

图5为底物浓度对菌株HZ-A1降解γ-六六六的影响

图6为HZ-A1在土壤中对γ-HCH(20mg/kg)的降解曲线图(◆-接菌的熏蒸样品；■-接菌的未经熏蒸样品；▲-未接菌的熏蒸样品；×-未接菌的未熏蒸样品)

具体实施方式

下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和生物材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。

实施例1、Sphingobiumjaponicum HZ-A1CGMCC № 3539的分离、纯化及鉴定。

本发明的发明人从长期受六六六和滴滴涕等有机氯农药污染的土壤中分离筛选一株对γ-HCH具有降解作用的菌株，具体步骤如下：将从北京宋家庄地区附近采集的长期受六六六和滴滴涕等有机氯农药污染的活性土样接种以到以γ-HCH(50mg/l)作为唯一碳源的无机盐溶液中振荡培养。转接培养6次后，菌悬液以10倍梯度稀释接种到含γ-HCH的无机盐固体培养基上，30℃恒温箱培养。选取生长快，菌落规则，传代稳定的菌落，纯化2～3次后得到纯菌株；将分离出的5株菌作为复筛菌株在LB培养基中扩大培养至相同的OD_600nm值1.0，以10％(10⁵cfu/g)的接种量接入含有20mg/l γ-HCH的无机盐培养基中，于30℃，180rpm摇床培养48h，以不接菌的培养基作为对照，用气相色谱(GC-ECD)定量测定降解率(降解率(％)＝(对照组六六六含量—样品组六六六含量)/对照组六六六含量×100)，最终筛选到降解效率最高的一株菌，将该菌株命名为HZ-A1，转入牛肉膏蛋白胨斜面保存。

上述无机盐培养液是按下述比例配制的：在1000ml水中，K₂HPO₄，1.5g/l；KH₂PO₄，0.5g/l；(NH₄)₂SO₄，0.5g/l；NaCl，0.5g/l；MgSO₄，0.2g/l；CaCl₂，0.05g/l；FeSO₄，0.02g/l；酵母粉，0.002g/l，pH7.0，121℃高压灭菌20min。无机盐固体培养基是将上述无机盐培养液加入占无机盐培养液总重量的1.5～2.0％(g/l)的琼脂。

上述LB培养基与文献(微生物学实验[M]，北京，高等教育出版社，1988，75-78)中相同。

上述所用的气相色谱的检测条件为：惠普5890II型气相色谱(Hewlett-Packard 5890series II)，ECD检测器，毛细柱为OV-1701，柱长25m，内径0.32mm，膜厚0.25μm，检测器温度300℃，进样口温度250℃，柱温210℃，载气为氮气，柱压7.7psi，柱流速5.4ml/min。在这些检测条件下，γ-HCH的保留时间分别为4.7min。将测得的每个样品对应的峰面积代入预先建立的峰面积-浓度标准曲线，就可以计算出γ-HCH的浓度。

采用安捷伦公司的气质联用仪(GC 6890N-MSD 5973N)分析γ-HCH的降解产物。色谱条件：色谱柱：J&W HP-5石英毛细柱(30m×0.25mm×0.25μm)；升温程序；80℃保持1.5min，以20℃/min升至190℃，保持0min，以5℃/min升至230℃，保持0min，以25℃/min升至290℃，保持0min；载气(He)流速1.0mL/min，进样量2μL，进样口温度250℃。质谱条件：电子轰击(EI)离子源；电子能量70eV；传输线温度280℃；离子源温度230℃；四级杆温度150℃。

将HZ-A1采用美国BIOLOG微生物分类鉴定系统对降解菌进行分类鉴定。将纯化的HZ-A1菌株在Biolog培养基上培养16-24h；采用干管法以GN/GP-IF制备菌悬液，调整浊度52％T；菌悬液以每孔150μl接种于GN-Microplate鉴定板，测定每个孔的吸光度值，测定的结果与数据库比对，由软件自动给出鉴定结果。经BIOLOG技术鉴定该菌株为Sphingobium japonicum。

Sphingobium japonicum HZ-A1已于2009年12月28日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所)，保藏登记号为：CGMCC №.3539。

本发明提供的Sphingobium japonicum HZ-A1的形态和生理生化特征为：在LB平板上30℃培养4天后形成黄色扁平的.具有清晰边缘、不透明的菌落该菌有极生鞭毛，G^-，直或弯杆状，具有接触酶和氧化酶活性，产黄色色素.菌体周围产荚膜，能利用葡萄糖、半乳糖、海藻糖和阿拉伯糖氧化产酸。

本发明提供的六六六降解菌HZ-A1的代谢特性为：该菌能以林丹为唯一碳源和能源生长，并可以在12小时内完全降解20mg/l的林丹。使用pH值为7的无机盐培养液按10％(v/v)接种量接种本发明的六六六降解菌，在30℃对10～100mg/l的林丹有良好的降解效果。实验室内的土壤修复实验表明该菌在30天内可以降解土壤中20mg/kg的林丹，对污染的土壤中有良好的降解效果，具有应用于田间修复六六六污染的土壤和水体的潜力。

实施例2、对本发明提供的六六六降解菌HZ-A1的降解性能进行测定。

一、六六六的降解和菌株生长实验

HZ-A1的单菌落先在LB培养基中30℃扩大培养16h，培养至OD_600nm值为1.5，培养物4℃、6000rpm离心5min，用无菌的无机盐培养液(成分如实施例1中所述)洗涤菌体沉淀，并用无机盐培养液配置成菌悬浮液，以10％的接种量(1.5×10⁵cfu/g)分别接入含有20mg/lγ-HCH的无机盐培养基(K₂HPO₄，1.5g/l；KH₂PO₄，0.5g/l；(NH₄)₂SO₄，0.5g/l；NaCl，0.5g/l；MgSO₄，0.2g/l；CaCl₂，0.05g/l；FeSO₄，0.02g/l；酵母粉，0.002g/l；其余为水，pH7.0，121℃高压灭菌20min)中，于30℃，180rpm摇床培养12h，每隔2h取样一次，用气相色谱(GC-ECD)定量测定降解率(检测条件同实施例1)，用DU 800分光光度计测定培养物在600nm的光密度，来表征细胞的生长。液体培养基中农药的萃取过程如下：10ml液体培养基中加入等量正己烷，剧烈振荡，混合物在4℃、3000rpm离心10min分层，小心收集上层有机相。此有机溶剂萃取过程重复3次。抽提液中加入无水硫酸钠干燥后，用正己烷适当稀释，然后抽提液用气相色谱分析。在降解实验中，未接种菌株HZ-A1的培养基(含20mg/lγ-HCH)作为对照。

上述实验表明，在无机盐培养基中HZ-A1对林丹的降解能力，从图1中可以看出在12小时之内，随着培养基中的六六六作为菌体生长的碳源被利用，培养液的细胞密度也相应增长，HZ-A1可以完全降解20mg/l林丹。在降解过程中，随着氯离子的不断释放，有PCCH和1，2，4-TCB等中间产物生成(图2.B和C)。相比之下，在未接种菌株HZ-A1的培养基中没有检测到六六六的降解、和细胞的生长。图1中，◆为未接种HZ-A1的培养基中γ-六六六的浓度，■为接种HZ-A1的培养基中γ-六六六的浓度，▲为接种HZ-A1的培养基中菌株的生长速度(以OD_600nm表示)。图2为菌株HZ-A1在含γ-六六六的培养基中培养6小时取样的色谱和质谱图。

二、不同因素对菌株HZ-A1降解特性影响的研究

2.1pH值对菌株HZ-A1降解γ-六六六的影响

HZ-A1的单菌落先在LB培养基中30℃扩大培养16h，培养至OD_600nm值1.5，培养物℃、6000rpm离心5min，用无菌的无机盐培养液(成分如实施例1中所述)洗涤菌体沉淀，配置成菌悬浮液，以10％的接种量(1.5×10⁵cfu/g)分别接入含有20mg/lγ-HCH的无机盐培养基中，分别将初始培养液的pH值分别调为5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5，并以不接菌作为对照，每个样品两个平行。在30℃下、200rpm培养30h。用GC测定培养基中六六六的浓度，计算降解率(方法同实施例1)，萃取方法和GC检测条件如步骤一所述。

结果如图3所示，该菌株在pH6.5～8.5的范围内生长和降解效果均较好，其中在pH7.0时的降解能力最强。

2.2温度对菌株HZ-A1降解γ-六六六的影响

HZ-A1的单菌落先在LB培养基中30℃扩大培养16h，培养至OD_600nm值1.5，培养物4℃、6000rpm离心5min，用无菌的无机盐培养液洗涤菌体沉淀，配置成菌悬浮液，以10％的接种量(1.5×10⁵cfu/g)分别接入7份含有20mg/lγ-HCH的无机盐培养基中(pH7.0)，分别将培养温度分别调为15℃、20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃，200rpm培养30h，并以不接菌的培养基在与上述相同条件下放置作为对照，每个样品两个平行。用GC测定培养基中六六六的浓度，计算降解率(方法同实施例1)，萃取方法和GC检测条件如步骤一所述。

结果如图4所示，从图4中可以看出，菌株在25～35℃时的降解效率都比较高，其中在30℃时降解速度最快。

2.3菌株HZ-A1对不同浓度的γ-六六六的降解

HZ-A1的单菌落先在LB培养基中30℃扩大培养16h，培养至OD_600nm值1.5，培养物4℃、6000rpm离心5min，用无菌的无机盐培养液(成分如实施例1中所述)洗涤菌体沉淀，配置成菌悬浮液，以10％的接种量(1.5×10⁵cfu/g)分别接种于10ml含不同浓度(10，20，50，80，120和150mg/l)γ-六六六的无机盐培养基中，在30℃下、200rpm培养7天。并以不接菌作为对照，每个样品两个平行。用GC测定培养基中六六六的浓度，计算降解率(方法同实施例1)萃取方法和GC检测条件如步骤一所述。

结果如图5所示，结果表明，当外加γ-六六六的浓度在10～50mg/l时，菌株可以在一周内将其完全降解。然面，当外加γ-六六六的浓度超过80mg/l时，则表现出明显的底物抑制效应，γ-六六六的降解速度明显减慢。

三、HZ-A1对六六六污染土壤的生物修复

在校园中采集土壤样品，样品用直径2mm的滤网过滤，除去土壤中的颗粒物质。土壤样品存放于4℃冰箱。取一部分土壤样品，用氯仿熏蒸法对土壤进行消毒处理。先将氯仿加入盛有土壤的容器中，密闭容器，使其散发为气态，渗入土壤样本以杀死所有微生物，再开启容器使土样中残余气态氯仿全部散发。将γ-六六六加入到100g土壤中，使其终浓度为20mg/kg，搅拌混合均匀。将HZ-A1的细胞悬液以每g土壤10⁶个细胞接种量加入到100g熏蒸和未熏蒸的土壤中，搅拌混合均匀。未接种HZ-A1的熏蒸和未熏蒸的土壤作为对照。土壤置于30℃培养箱中培养15d。在整个培养期间，不断喷洒添加无菌的去离子水，以保持土壤的含水量在50％附近。测定HZ-A1在土壤中是否对γ-HCH具有降解作用，同时研究HZ-1在有额外的碳源存在下与土壤中其他微生物的相互关系，本研究中分别将HZ-1接种到熏蒸土壤和未熏蒸土壤两种处理中，未接种的熏蒸土壤和未接种的未熏蒸土壤作为对照，每个对照和处理都重复三次。

结果表明，在24天内，两种对照中的γ-HCH的浓度几乎都没有变化。从图6中可以看出，γ-HCH在经熏蒸的土壤中的降解速率明显比在未熏蒸土壤快，在熏蒸的土壤中18天基本可以完全降解，而在未熏蒸土壤中需要24天。24天后HZ-A1能从未经熏蒸的土壤中分离出来，这说明在该土壤中的降解作用主要由HZ-A1完成。

以上结果说明，HZ-A1菌株在施入土壤中后，没有出现不产生降解或降解率急剧下降的现象，它的降解性能仍然稳定和优良，这就为该菌株作为受六六六污染的土壤修复剂提供了科学的试验依据。本实验表明该菌对六六六污染的土壤有良好的修复能力，为该菌的大规模应用奠定了基础。