一种细胞反应器及包括该反应器的人工肝支持系统

摘要

本发明提供一种细胞反应器及包括该反应器的人工肝支持系统。所述细胞反应器包括一个容器，该容器底部设有液体出口，容器顶部设有封盖，封盖上设有液体入口，容器底部和容器顶部封盖内分别设有一层100～400目的滤网，液体出口和入口处设置有与其密封配合的盖子，容器内部两层滤网之间容纳长有肝细胞的微载体和树脂的混合物。该反应器连接在血液净化装置的透析液循环通路上构成人工肝支持系统，使肝细胞不与血液直接接触，生物安全性好，而且该反应器可以通过再生处理多次使用，大大降低了生物人工肝的治疗成本。

说明书

技术领域

本发明属于生物医学技术领域，具体涉及一种细胞反应器及其制备方法和再生方法，还涉及包括该细胞反应器的人工肝支持系统。

背景技术

肝功能衰竭是各种肝病的终末期表现，其发生率和死亡率很高，人工肝支持系统是目前较方便有效的治疗手段，它可为患者提供肝功能支持治疗，从而使患者成功过渡到肝移植或者自身受损肝脏功能恢复。人工肝包括三种类型：非生物型人工肝、生物型人工肝和混合型人工肝。其中非生物型人工肝包括血液透析、血浆置换、活性炭吸附等，虽然可以起到一定的解毒作用，但与真正的肝脏功能相差甚远。而生物型人工肝由于使用生长有肝细胞的细胞反应器对患者血浆进行解毒和代谢，其功能更完善，但是患者血液中大量的毒性物质难以短期内清除，会对细胞反应器内的肝细胞产生损伤。混合型人工肝系统综合了前两种人工肝的优点，先将血液/血浆通过非生物肝循环，降低血中有毒物质的浓度，然后再通过生物肝进行解毒、代谢、合成和分泌，其替代肝脏的作用最好，因此具有良好的应用前景。

混合型人工肝系统和生物型人工肝系统中真正发挥肝脏功能的是生物肝循环部分，但生物肝循环装置类型繁多，目前尚无最佳方案。由于生物肝循环部分是人工肝的主要部分，因此对这部分的改良是人工肝发展的重点。目前，世界上多个国家的研究中心对生物人工肝中使用的细胞材料和细胞反应器类型进行了大量研究，并且已有部分生物人工肝系统进入临床试验阶段，并获得了一定的疗效。而国内目前尚无可应用于临床的生物人工肝及其装置。细胞反应器作为生物人工肝系统的核心成分，不仅直接影响其中装载细胞的活性及功能，而且也直接影响生物人工肝系统的安全性。在本发明之前，临床使用的细胞反应器大致分为4种类型：中空纤维型，单层平板型，灌注床或支架型和微囊包被悬浮型。其中中空纤维型细胞反应器是目前应用最多的，它是将一束中空纤维管密封于透明有机材料的外壳中，该纤维将外壳分为内外两个腔，一般内腔流动患者的血浆，外腔可装置培养的肝脏细胞。该纤维同时还具有半透膜功能，隔离细胞的同时实现物质的双向运输，从而达到透析和解毒功能的目的。

然而，该反应器在生物人工肝的制备中存在一定缺陷。首先，该反应器中的中空纤维密集排列，使管外的容量和有效交换面积很小，不易装载大量肝细胞；其次，当肝细胞装入后细胞不能均匀分布于中空纤维之间，导致血浆从无细胞的空隙通过使细胞的解毒效率降低；第三，装入的肝细胞容易密集堆积，使细胞营养成分交换受限，降低了肝细胞的活性和功能。

理论上，理想的细胞反应器应具备以下条件：1、中空纤维外有容纳足够肝细胞的空间，使一个细胞反应器能满足对1例肝衰竭患者的治疗。2、能够提供肝细胞存活和功能的微环境。3、允许中小分子通过中空纤维双向运输，并阻隔大分子物质交换。4.尽可能延长细胞反应器应用于治疗的时间，或能够再生使用。然而，到目前为止国际上还没有符合这些条件的细胞反应器应用于临床。

发明内容

本发明所要解决的一个技术问题是提供一种细胞反应器，该细胞反应器避免了中空纤维型生物反应器内中空纤维外空间狭小和肝细胞装置后分布不均的问题。还可以解决肝细胞直接培养在生物反应器内肝细胞生长不良及难以观察肝细胞生长情况的问题。

为了解决上述技术问题，本发明所提供的技术方案是：

本发明提供了一种细胞反应器，所述细胞反应器包括一个容器，该容器底部设有液体出口，容器顶部设有封盖，封盖上设有液体入口，容器底部和容器顶部封盖内分别设有一层100～400目的滤网，液体出口和入口处设置有与其密封配合的盖子，容器内部两层滤网之间容纳长有肝细胞的微载体和树脂的混合物。

本发明所述的细胞反应器中装载长有肝细胞的微载体和树脂的混合物，其中所述肝细胞为动物或人的原代肝细胞、永生化的人或动物肝细胞系或肝肿瘤细胞，所述树脂颗粒直径为100～4000μm，树脂占装载总体积的5～30％，所述长有肝细胞的微载体与树脂混合的体积比为3∶1～9∶1。掺入树脂的目的是为增加流过反应器的液体与肝细胞的接触面积，由于细胞培养的微载体的直径一般在50～200μm左右，本发明使用的树脂直径比微载体大2～20倍，当将微载体与比其直径大的树脂混合后，混合物中会存在很多孔隙，因此可以保证流过细胞反应器的液体与微载体上肝细胞的充分接触。所用的树脂颗粒可以是任何医用树脂材料制备的树脂颗粒，其具体材料包括但不局限于聚氯乙烯、聚乙烯、聚丙烯、低密度聚乙烯、超高分子量聚乙烯、聚四氟乙烯、氟化乙丙烯聚合物、聚甲基丙烯酸甲酯、聚氧甲烯、聚对苯二甲酸乙二酯、聚氨酯、硅橡胶、聚砜、聚乳酸、聚羟基乙酸等。

长有肝细胞的微载体和树脂混合装载反应器具有明显的优点：一是肝细胞生长在微载体上，使培养的肝细胞密度大大增加，肝细胞可以长时间保持存活和良好的功能状态并且非常方便细胞的转移和装载；二是掺入直径较大的树脂混合，使装载后的微载体周围保持一定的液体流通孔道，避免了灌流死腔，保证了液体与肝细胞的充分接触；另外如果使用的树脂是吸附树脂，还具有吸附毒素的作用。

本发明的细胞反应器的另一个特征是易于放大，可将多个本发明的细胞反应器串联使用，以增强其功能。

本发明所要解决的另一个技术问题是提供一种细胞反应器的制备方法。其技术方案为：

一种上述细胞反应器的制备方法。首先将新鲜分离的或体外扩增培养的肝细胞接种在微载体上，按照肝细胞系1×10⁷～1×10⁸细胞∶1～2g微载体∶500ml～1L培养基的比例混合，在摇动情况下培养，使细胞贴附于微载体上。其中所述的肝细胞可以是任何适用于人工肝治疗的肝细胞，所述的微载体可以是任何一种适于细胞培养的微载体，包括各种实心微载体和各种空心微载体。待肝细胞在微载体上生长至80～100％汇合后，将其与直径较大的树脂颗粒混合，其中树脂的直径为100～4000μm，树脂占总体积约5～30％。将长有肝细胞的微载体与树脂按照体积比为3∶1～9∶1混合均匀后打开容器顶部带滤网的封盖，装入该混合物，然后盖好顶部封盖。

本发明的细胞反应器制备方法的优点是，所用容器容易进行细胞装载操作，避免了中空纤维型生物反应器内中空纤维外空间狭小和肝细胞装置后分布不均的问题。肝细胞在微载体上生长至所需密度并生长状态良好时再灌装到生物反应器中，解决了肝细胞直接培养在生物反应器内肝细胞生长不良及难以观察肝细胞生长情况的问题。

本发明所要解决的另一个技术问题是提供细胞反应器的再生方法，其技术方案为：

一种上述细胞反应器的再生方法。该方法包括将使用后的细胞反应器用无血清细胞培养基灌流，充分去除透析液后，将其出口端用与之密封配合的盖子封闭，向容器中加入细胞培养基，入口端加盖与之配套的盖子，并将盖子拧松至允许空气透过的程度，放入细胞培养箱中培养；或者通过蠕动泵用培养基对细胞反应器中肝细胞进行灌流培养，根据细胞活性的状态和患者治疗间隔的需要，再生培养的时间可选择1～7天。再生培养后的细胞反应器可重复用于制备人工肝。

本发明最后要解决的技术问题是提供一种人工肝支持系统，该人工肝支持系统包括血液净化装置和一个或多个上述细胞反应器，所述血液净化装置是任何可以商业获得的血液净化装置，将所述血液净化装置的透析液出口端与所述细胞反应器的液体入口端连接，细胞反应器的液体出口端与血液净化装置的透析液入口端连接，构成循环回路，所述多个细胞反应器串联排列。

本发明的人工肝支持系统工作原理是，血液循环通路中，患者的动脉血由血液入口进入血液透析装置的透析柱，在中空纤维的半透膜内流动，半透膜外的透析液以相反方向流动。这样在血液刚进入透析柱的部位，血液中高浓度有毒物质在浓度梯度作用下，会通过半透膜进入透析液，随着有毒物质不断进入透析液，透析柱中血液向前流动的过程中毒素逐渐减少。而透析液循环通路中，液体流动方向与血液流动方向相反，在透析柱上血液入口与透析液的出口端在同一侧，因此物质交换后含有毒素的透析液经出口流出，进入细胞反应器，经反应器中肝细胞解毒后，透析液中毒素降低，肝细胞合成的物质增多，因此当透析液由透析柱上透析液入口进入时，肝细胞合成的物质在浓度梯度作用下通过半透膜，进入已经去除了毒素的血液，这种去除了毒素并增加了肝细胞合成物质的血液由透析柱血液出口流出，在血液监护警报系统监控下回到人体内。

本发明的人工肝支持系统的优点是：

1.将装载肝细胞的生物反应器连接在血液净化装置的透析液循环通路上，连接方式简便；而且肝细胞不与血液直接接触，生物安全性好。

2.采用多个生物反应器串联，提高人工肝的解毒效率。

3.生物反应器既是一个细胞反应器，又是一个细胞培养装置，可以通过再生处理多次使用，大大降低了生物人工肝的治疗成本。

下面结合附图和具体实施方式进一步说明本发明，但是应当指出，附图和实施例仅作为说明本发明的例子，不限制本发明的范围。

附图说明：

图1本发明细胞反应器示意图；

图2本发明的人工肝支持系统构造示意图；

图3生物反应器多次再生后微载体上肝细胞存活情况，图A-E分别为再生培养0、1、3、5、7次后的Gimsa染色照片，F为MTT测定的肝细胞存活百分比。

具体实施方式

实施例1细胞反应器的组成

一、细胞反应器的组成

如图1所示，本发明所述的细胞反应器包括一个容器10，该容器10底部设有液体出口8，容器顶部设有封盖3，封盖3上设有液体入口2，容器底部和容器顶部封盖内分别设有一层100～400目的滤网7、4，液体出口8和入口2处设置有与其密封配合的盖子9、1，容器内部两层滤网之间容纳长有肝细胞的微载体6和树脂5的混合物。

本发明所述的细胞反应器中装载长有肝细胞的微载体和树脂的混合物，其中所述肝细胞为动物或人的原代肝细胞、永生化的人或动物肝细胞系或肝肿瘤细胞，所述树脂颗粒直径为100～4000μm，树脂占装载总体积的5～30％，所述长有肝细胞的微载体与树脂混合的体积比为3∶1～9∶1。

本发明所述细胞反应器的组成中，上述树脂颗粒直径优选为300～1000μm，优选地，树脂占装载总体积的10～20％。

实施例2细胞反应器的制备方法

取Cytopore 2微载体(购自美国Pharmacia公司)，使用前的预处理按照生产商的说明进行。将适用于生物人工肝的细胞，例如永生化的人肝细胞系悬于无血清培养基Keratinocyte-SFM(美国Invitrogen公司)中，其中添加rEGF(终浓度0.1ng/ml)和BPE(bovine pituitary extract)20～30μg/ml)。按照人肝细胞系5×10⁷细胞∶1g微载体∶500ml培养基的比例混合，在摇动情况下培养，使细胞贴附于微载体上。每隔2天换液一次。微载体上的肝细胞形态和数量通过Gimsa染色进行观察。待微载体上细胞生长近汇合时(80～100％)，将其与灭菌的直径800μm树脂颗粒(购自珠海丽珠医用生物材料有限公司)混合，微载体与树脂颗粒的体积比约为9∶1。然后取无菌的本发明用于制备反应器的罐状容器，用盖子封闭底部开口，打开容器顶部封盖，装入此混合物，制备成待用的细胞反应器。

实施例3：细胞反应器的再生方法

当一次治疗完成后，将生物肝循环部分的细胞反应器拆下，封闭底部出口，从其顶部入口端灌入无血清细胞培养基，待灌满后打开底部出口，使液体在重力作用下从底部出口流出，重复3～5次以充分去除透析液。然后待液体完全流出后将出口端用盖子封闭，向细胞反应器中加入细胞培养基，入口端加盖盖子，并将盖子拧松至允许空气透过，放入细胞培养箱中培养；或者在完全洗净透析液后，通过蠕动泵用培养基对细胞反应器中肝细胞进行灌流培养。再生培养12～24小时后，取少量微载体，使用Gimsa染色观察细胞存活情况。应用MTT分析存活细胞的百分比，如细胞活力恢复则弃培养基，用透析液洗涤后再次用于制备人工肝。如此反复，每个细胞反应器可重复使用多次。如图3所示，再生使用1、3、5、7次后微载体上细胞存活情况无明显下降。

实施例4：混合型人工肝支持系统的组成

本发明人工肝支持系统包括血液净化装置13和一个或多个实施例1所述的细胞反应器22。所述血液净化装置为现有技术中已经成熟的仪器，本实施例提供了一种结构的血液净化装置是为了更加清楚的说明本发明所述人工肝支持系统的结构和工作原理，不应理解为对本发明保护范围的限制。

如图1、2所示，血液净化装置13包括血液监护警报系统14，透析柱和透析液供给系统21，以及与患者动脉连接的血液通路11和与患者静脉连接的血液通路12。其中透析柱是发挥血液净化和解毒的主要场所，它包括透析柱内血液循环通路17、血液入口15、血液出口16，和透析柱内透析液循环通路18、透析液出口19、透析液入口20。血液监护警报系统14连接在透析柱外的血液循环通路中，控制血液循环状态；透析液供给系统21连接在透析柱外的透析液循环通路中，控制透析液循环状态；所述细胞反应器22为实施例1所述的结构。将所述血液净化装置13的透析液出口端19与细胞反应器22的液体入口端2连接，细胞反应器22的液体出口端8与血液净化装置13的透析液入口端20连接，构成循环回路，所述多个细胞反应器22串联排列，其规模和数量可根据实际应用的需要放大或缩小。

在本发明的人工肝支持系统中包括两个循环通路：血液循环通路和透析液循环通路。血液循环通路是患者或实验动物的血液引出体外后，经血液通路11进入血液净化装置的血液监护警报系统14，然后经透析柱血液入口15进入透析柱内血液循环通路17，经透析柱血液出口16流出，最后在血液监护警报系统14监控下经血液通路12回到患者体内。透析液循环通路由透析液供给系统21控制，透析液经透析柱上透析液入口20进入柱内透析液循环通路18，经透析柱上透析液出口19流出并进入细胞反应器22，细胞反应器22流出的透析液由入口20进入透析柱，如此构成透析液循环。

在透析柱内血液循环与透析液循环之间隔有半透膜，透析液的循环通路18中液体流动方向与血液循环通路17中血液流动方向相反，血液和透析液在此发生物质交换。结果是血液流经透析柱的过程中毒素浓度逐渐降低，肝细胞合成的生物物质逐渐增多，因此当血液流出透析柱时已经间接被细胞反应器中的肝细胞进行了解毒。

实施例5：混合型人工肝支持系统对肝衰竭患者血浆的解毒功能

为评价本发明新型可再生性混合型人工肝支持系统的解毒能力，和增减细胞反应器数量对解毒功能影响，我们利用临床肝衰竭患者的血浆对本发明的人工肝支持系统进行了评价。首先按照实施例2制备人工肝支持系统，然后将4L肝素抗凝的肝衰竭患者血浆通过血液通路11连接到血液净化装置上，启动血液监护警报系统以控制血循环状态，同时启动连接了细胞反应器的透析液的循环。连续进行人工肝治疗6小时，然后测定血浆中原始胆红素、尿素浓度和通过了不同串联数量的本发明装置后的胆红素、尿素浓度。结果如表1所示，经过本发明的人工肝支持系统解毒后，血浆中胆红素浓度下降，尿素浓度升高，而且每增加一个细胞反应器，效果也明显增加。

另外，我们也测试了再生使用的细胞反应器的效果，按照实施例3描述的再生方法，在对血浆每次解毒完成后，将细胞反应器再生处理，并用于同一份血浆的解毒治疗。结果如表2所示，再生使用的细胞反应器解毒效果良好，再生使用7次后仍具有较好解毒作用。

表1：细胞反应器数量对本发明人工肝支持系统血浆解毒作用的影响

表2：细胞反应器再生次数对本发明人工肝支持系统血浆解毒的影响

显然，本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无法对所有的实施方式予以穷举。凡是属于本发明的技术方案所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之列。