一种复方异常黑胆质成熟剂的总酚的提取制备方法

摘要

本发明提供一种复方异常黑胆质成熟剂的总酚的提取制备方法，其中异常黑胆质成熟剂由破布木果、牛舌草、甘草、铁线蕨、地锦草等十味药材按比例配制，进行煎煮、浸泡、过滤、减压浓缩干燥成浸膏固体，并粉碎得干粉；此干粉加热水溶解，过滤，滤液加乙醇沉淀，搅拌，静置，过滤，所得滤液减压浓缩，经聚酰胺柱处置，先后以水和稀乙醇洗脱，洗脱液弃去，用较高浓度乙醇洗脱，洗脱液减压浓缩，干燥，粉碎，得到体外抗癌活性较强的总酚产品，其总酚含量30％以上，总黄酮含量13％以上。本发明提取制备方法成本低，简便实用，安全，制得的总酚稳定性良好，可制成片剂、胶囊、口服液、颗粒剂、汤剂、糖浆剂、丸剂等使用。

说明书

技术领域

本发明涉及总多酚的的提取制备，尤其适应一种复方异常黑胆质成熟剂的总酚的提取制备方法。

背景技术

异常黑胆质成熟剂是以破布木果、牛舌草、甘草、铁线蕨、地锦草等十味药材按比例配制，进行煎煮、浸泡、过滤、稀释而成的维吾尔医复方制剂，主要用于治疗由异常黑胆质所导致的肿瘤、糖尿病、高血压、冠心病等疑难杂症，其治疗原则是首先使用异常黑胆质成熟剂使异常黑胆质成熟和堆积到肠粘膜，而后使用异常黑胆质清除剂使已成熟的异常黑胆质排出体外，从而达到治疗目的。此法为维吾尔医独有，无法与其它医学相比。

近年来的研究表明，异常黑胆质成熟剂具有清除活性氧自由基，提高机体抗氧化，保护淋巴细胞、线粒体及DNA氧化损伤，抗辐射损伤，抗血栓形成，改善机体免疫功能，调节机体神经-内分泌-免疫网络功能，抑制人肝癌细胞(Hep G2)、人宫颈癌细胞(HeLa)、T淋巴细胞、乳腺癌细胞(Bcap-37)、人结肠癌细胞(Caco-2)等癌变细胞体外增殖，抑制由1，2-二甲肼(DMH)诱导的大鼠结肠隐窝病灶的形成，逆转人肝癌耐药细胞株多药耐药性等功能。目前，异常黑胆质成熟剂的研究重点在于对异常黑胆质成熟剂有效部位的提取及生物活性与药用价值的检测。

本发明的申请人获得的复方异常黑胆质成熟剂的处方组成及制备方法的专利，仅仅对异常黑胆质成熟剂的处方组成、水提物的制备方法及其防治疾病的部分作用机理进行了阐述，未对异常黑胆质成熟剂进行进一步的提取和分离，更未涉及到从异常黑胆质成熟剂中提取总酚。

本发明用人早幼粒细胞白血病细胞株(HL-60)体外存活率试验为导向，对异常黑胆质成熟剂的体外抗癌活性部位一总酚组分进行了追踪分离。该制备方法安全可靠，无环境污染，制得的异常黑胆质成熟剂总酚体外抗癌活性强，适用于规模化生产，至今未见国内外任何报道。

发明内容

本发明的目的在于，提供一种复方异常黑胆质成熟剂的抗癌有效部位的提取制备方法，该方法提取的异常黑胆质成熟剂总酚稳定性良好，可制成片剂、胶囊、口服液、颗粒剂、汤剂、糖浆剂、丸剂等使用。

按照以下方法，我们实现了本发明的技术解决方案：一种复方异常黑胆质成熟剂的总酚的提取制备方法，取复方异常黑胆质成熟剂的干粉适量，加1～10倍量30～100℃水，搅拌5～60分钟使之溶解，趁热过滤；滤液冷却至4～25℃，加入0.5～6倍量的乙醇，搅拌10～30分钟，在4～25℃条件下静置12～48小时沉淀，过滤。滤液减压浓缩，加水稀释后经聚酰胺柱处置；用3～18柱体积量的水洗脱1～5次，弃去洗脱液。再以0～30％乙醇洗脱1～5次，弃去洗脱液。然后以30～80％乙醇洗脱1～5次，收集洗脱液。洗脱液减压回收乙醇，浓缩至无醇味，减压干燥成干粉，得到异常黑胆质成熟剂的总酚产品。

上步的抗癌有效部位的提取制备方法，滤液减压浓缩至相对密度0.99～1.25。

上步的抗癌有效部位的提取制备方法，趁热过滤所需温度为30～100℃。

上步的抗癌有效部位的提取制备方法，选择的聚酰胺粒度为40～150目。

上步的抗癌有效部位的提取制备方法，浓缩时采用减压浓缩，干燥时采用真空干燥或冷冻干燥或喷雾干燥。

所述的有效部位，成品可制成片剂、胶囊、口服液、颗粒剂、汤剂、糖浆剂和丸剂等。

本发明所得总酚提取物中总酚含量采用Folin-Ciocalteu法测定，以没食子酸为对照，其总酚含量30％以上。

本发明所得总酚提取物中总黄酮含量采用2005版中国药典法测定，以芦丁为对照，其总黄酮含量13％以上。

本发明所得总酚提取物采用人早幼粒细胞白血病细胞株(HL-60)体外存活率试验，评价了体外抗癌活性，结果表明所得总酚提取物明显降低癌细胞存活率，其24小时、48小时和72小时IC₅₀值分别为105.7μg/ml，95.1μg/ml和72.3μg/ml。

我们还采用二极管阵列高效液相色谱技术从本发明所得总酚提取物中鉴定出8种酚类化合物，即咖啡酸(caffeic acid)、芦丁(rutin)、异槲皮苷(isoquercitrin)、异鼠李素-3-O-芸香糖苷(isorhamnetin 3-O-rutinoside)、芹菜素7-O-葡萄糖苷(apigenin7-O-glucoside)、迷迭香酸(rosmarinic acid)、木犀草素(luteolin)和芒柄花素(formononetin)。

本发明取材于民族药，原料特质，选择最佳的提取方法，首次用癌细胞存活率为导向实现了对一种复方异常黑胆质成熟剂总酚的成功提取与制备，既拓展了医药研制和医用范围，又为维药增添新产品，提取制备方法简便实用，成本低，应用范围广，所得总酚提取物对癌细胞具有明显的抑制作用，彰显技术进步。

实验例

复方异常黑胆质成熟剂总酚提取物中总酚和总黄酮含量的测定

1.试验材料

1)试剂：没食子酸，纯度≥98％，德国Carl Roth公司生产，批号：48792593。Folin-Ciocalteu试剂，德国Merck集团生产，批号：HC807325。芦丁，纯度99.5％，德国Merck集团生产，批号：148423。其它试剂均为分析纯。

2)仪器：Beckman DU-640紫外分光光度计，美国Beckman公司。Sartorius BP210D精密电子天平，德国Sartorius集团。

3)被测药物：复方异常黑胆质成熟剂总酚提取物，按本发明方法制备。

2.实验方法

1)总酚含量的测定

精确称取复方异常黑胆质成熟剂总酚提取物干粉三份，每份约3mg，分别置于5mL容量瓶中，用60％乙醇溶解，定容，为样品待测液。取160μl样品待测液于5mL容量瓶中，加入蒸馏水至2.5ml，再加入0.25ml Folin-Ciocalteu试剂，6分钟后加入0.75ml 20％Na₂CO₃溶液，用水定容至刻度，混匀，室温下反应2小时，采用可见分光光度法，以没食子酸为对照品，在765nm处测定吸光值，代入回归方程得到总酚含量。

总酚含量(％)＝(酚类化合物质量/干物料质量)×100％

2)总黄酮含量的测定

精密称取复方异常黑胆质成熟剂总酚提取物三份，每份约3mg，分别置于5mL容量瓶中，加入1ml 60％乙醇溶解，加去离子水2ml和5％亚硝酸钠水溶液0.15ml，摇匀。6分钟后加10％硝酸铝水溶液0.15ml，摇匀后在室温下静置6分钟。加1M氢氧化钠溶液1ml，立即用去离子水定容至5ml，采用可见分光光度法，以芦丁为对照品，以不含硝酸铝的样品溶液作空白，在510nm波长处测定供试品溶液的吸光度，代入回归方程得到总酚含量。

总黄酮含量(％)＝(黄酮类类化合物质量/干物料质量)×100％

3.实验结果

表1复方异常黑胆质成熟剂总酚提取物中总酚含量和总黄酮含量

实验结果表明，复方异常黑胆质成熟剂总酚提取物中总酚含量和总黄酮含量分别为33.3％和13.9％。

复方异常黑胆质成熟剂总酚提取物薄层色谱分析

1.实验材料

1)试剂：芦丁购自德国Carl Roth，硅胶60F₂₅₄薄层板(铝板)购自德国Merck集团。其它试剂均为分析纯。

2)被测药物：复方异常黑胆质成熟剂总酚提取物，按本发明方法制备。

2.实验方法

将所得复方异常黑胆质成熟剂总酚提取物溶解于60％乙醇，点样于硅胶60F₂₅₄薄层板上，以乙酸乙酯-甲酸-冰醋酸-水(100∶11∶11∶26，v/v/v/v)为展开剂展开。同时点芦丁标准品溶液于同一薄层板上，干燥后先喷以1％二苯基硼酸-2-氨基乙基酯甲醇溶液，再喷以5％聚乙二醇4000乙醇溶液。在波长366nm的紫外光下观察斑点。

3.实验结果

结果表明，复方异常黑胆质成熟剂总酚提取物含黄酮类化合物(黄色或黄绿色斑点)。样品与芦丁在同一位置显相同颜色(黄色)斑点，提示，复方异常黑胆质成熟剂总酚提取物含芦丁。

复方异常黑胆质成熟剂总酚提取物高效液相色谱分析

1.实验材料

1)试剂：木犀草素、迷迭香酸、芹菜素7-O-葡萄糖苷和异鼠李素-3-O-芸香糖苷购自法国Extrasynthèse，咖啡酸购自美国Sigma-Aldrich，芒柄花素、芦丁和异槲皮苷购自德国Carl Roth。色谱纯乙腈购自比利时VWR International，冰醋酸(纯度≥99.8％)和二甲基亚砜购自德国Carl Roth。其它试剂均为分析纯。

2)仪器：日本岛津LC-10AD液相色谱仪，SCL-10A系统操作器，SPD-M20A二极管阵列检测器，SIL-10AD自动进样器，DGU-14A脱气机。色谱工作站为Shimadzu Class VP software。

3)被测药物：复方异常黑胆质成熟剂总酚提取物，按本发明方法制备。

2.实验方法

1)液相色谱条件：色谱柱为Hypersil BDS-C18柱(4.0mm×250mm，5μm)，美国安捷伦；保护柱为100RP-18(4.0mm×4.0mm，5μm)，德国惠普。检测波长为254nm，并在190～450nrn范围内对样品进行紫外波长扫描。流动相由A(水-冰醋酸，pH2.8)和B(乙腈-冰醋酸，其中冰醋酸量与A相等)组成。样品梯度洗脱条件：0～60min，流动相B由15％线性递增至50％；60～70min，流动相B由50％线性递增至99％；70～75min，流动相B保持99％；75～76min，流动相B由99％线性递减至15％。流速：1.2ml/min，柱压：140～172巴。柱温：室温，进样量：10μl。高效液相色谱分析前，流动相始终新鲜配制，且用前脱气。

2)样品处理：2mg复方异常黑胆质成熟剂总酚提取物加入60％甲醇-二甲基亚砜(4∶1，v/v)1ml，在室温下超声使溶解(5min)，超速离心10分钟(14800rpm)，上清液进样。

3.实验结果

复方异常黑胆质成熟剂总酚提取物及标准品混合物的高效液相色谱图见图1。通过比较标准品、样品和加入标准品的样品中所测成分的保留时间及紫外光谱图，在异常黑胆质成熟剂总酚提取物中鉴定出八种酚类化合物，即木犀草素(luteolin)、迷迭香酸(rosmarinicacid)、芹菜素-7-O-葡萄糖苷(apigenin 7-O-glucoside)、异鼠李素-3-O-芸香糖苷(isorhamnetin 3-O-rutinoside)、咖啡酸(caffeic acid)、芒柄花素(formononetin)、芦丁(rutin)和异槲皮苷(isoquercitrin)。

复方异常黑胆质成熟剂总酚提取物对HL-60癌细胞存活率的抑制作用

1.实验材料

1)癌细胞及培养液：HL-60细胞购自American Type Culture Collection-ATCC(Manassas，VA)。RPMI 1640培养液及其附加成分购自美国Life Technologies，Inc公司。

2)仪器：Vi-CELL^TMXR细胞存活率分析仪，美国Beckman公司。

3)被测药物：复方异常黑胆质成熟剂总酚提取物，按本发明方法制备。

2.实验方法

于37℃、5％CO₂培养箱中，以含10％小牛血清、1％L-谷氨酰胺和1％青霉素-链霉素的RPMI 1640培养液培养HL-60细胞，检测时将其按0.1×10⁶个/毫升的浓度接种于12孔培养板中，24小时后将复方异常黑胆质成熟剂总酚提取物60％乙醇溶液(用前用0.45μm的微孔滤膜过滤)以25、50、100、200和250μg/ml的五种不同终浓度分别加入上述HL-60细胞培养液中，同时设不加样品只加相同体积60％乙醇的细胞培养液为对照组。每种样品测三次后取平均值和SD值，经不同浓度样品处理的细胞分别于24、48、72h用台盼蓝染色法检测细胞存活率。

3.实验结果

表2复方异常黑胆质成熟剂总酚提取物不同浓度对HL-60癌细胞生长的抑制作用

^a检测进行三次，测定结果以“平均值±标准差”表示。

结果，复方异常黑胆质成熟剂总酚提取物显著降低HL-60癌细胞体外存活率。经计算，其24小时IC₅₀为105.7μg/ml，其95％可信区间下限和上限分别为71.4和156.5μg/ml，48小时IC₅₀为95.1μg/ml，其95％可信区间下限和上限分别为75.2和120.4μg/ml，72小时IC₅₀为72.3μg/ml，其95％可信区间下限和上限分别为68.5和76.4μg/ml(表3)。复方异常黑胆质成熟剂总酚提取物抑制HL-60细胞增殖作用的量效曲线见图2。

附图说明

图1复方异常黑胆质成熟剂总酚提取物及标准品混合物的高效液相色谱图。A：标准品混合物；B：复方异常黑胆质成熟剂总酚提取物。1：咖啡酸(caffeic acid)；2：芦丁(rutin)；3：异槲皮苷(isoquercitrin)；4：异鼠李素-3-O-芸香糖苷(isorhamnetin 3-O-rutinoside)；5：芹菜素-7-O-葡萄糖苷(apigenin 7-O-glucoside)；6：迷迭香酸(rosmarinic acid)；7：木犀草素(luteolin)；8：芒柄花素(formononetin)。

图2复方异常黑胆质成熟剂总酚提取物抑制HL-60细胞增殖作用的量效曲线。每种样品测三次后取平均值和SD值，经不同浓度样品处理的细胞分别于24、48、72h用台盼蓝染色法检测细胞存活率。纵坐标为细胞存活率，横坐标为药物终浓度(g)的对数值。实验数据采用GraphPad software Prism软件计算半数抑制浓度(IC₅₀值)为105.7μg/ml(24 h)、95.1μg/mL(48h)和72.3μg/mL(72h)。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步说明，下述各实施例仅用于说明本发明而并非对本发明的限制。

实施例一

取复方异常黑胆质成熟剂的干粉350g，加1050ml 60℃水，搅拌10分钟溶解，趁热过滤。滤液冷却至10℃，加入1.5倍量的无水乙醇，搅拌15分钟，在4℃条件下静置24小时沉淀，过滤。滤液减压浓缩，加水稀释后经聚酰胺柱处置；用3柱体积量的水洗脱2次，弃去洗脱液，再以60％乙醇洗脱3次，收集洗脱液。洗脱液减压回收乙醇，浓缩至无醇味，减压干燥成干粉，得到异常黑胆质成熟剂的总酚产品。成品总酚和总黄酮含量分别为33.3％和13.9％。

实施例二

取复方异常黑胆质成熟剂的干粉350g，加1050ml 60℃水，搅拌10分钟溶解，趁热过滤。滤液冷却至10℃，加入1.5倍量的无水乙醇，搅拌15分钟，在4℃条件下静置24小时沉淀，过滤。滤液减压浓缩，加水稀释后经聚酰胺柱处置；用3柱体积量的水洗脱2次，弃去洗脱液，再以40％乙醇洗脱3次，收集洗脱液。洗脱液减压回收乙醇，浓缩至无醇味，减压干燥成干粉，得到异常黑胆质成熟剂的总酚产品。成品总酚和总黄酮含量分别为39.1％和16.8％。

实施例三

取复方异常黑胆质成熟剂的干粉350g，加1050ml 60℃水，搅拌10分钟溶解，趁热过滤。滤液冷却至10℃，加入1.5倍量的无水乙醇，搅拌10分钟，在4℃条件下静置24小时沉淀，过滤。滤液减压浓缩，加水稀释后经聚酰胺柱处置；用3柱体积量的水洗脱2次，弃去洗脱液，以20％乙醇洗脱3次，弃去洗脱液。以60％乙醇洗脱3次，收集洗脱液，洗脱液减压回收乙醇，浓缩至无醇味，减压干燥成干粉，得到异常黑胆质成熟剂的总酚产品。成品总酚和总黄酮含量分别为34.5％和14.2％。