一种利用基因转化改善水稻产量性状的方法

摘要

本发明属于基因工程领域，涉及一种利用lrk1基因转化提高水稻产量及产量性状的方法。本发明利用基因枪微弹轰击法，将水稻lrk1基因转化水稻愈伤组织，经过恢复培养获得表达lrk1基因的水稻植株。结果显示，成功转化的水稻，其种子发芽势快于对照，苗期分蘖势好于对照，苗期生长势、苗期生长势和植株成熟穗子指标总体优于对照。本发明为水稻提高产量提供了一种低成本、高效益的新方法。

说明书

技术领域

本发明属于遗传工程领域，具体涉及一种利用lrk1基因转化提高水稻产量和改善产量性状的方法。

背景技术

目前国内外利用转基因改良作物经济性状的技术与方法主要是根据已知的功能基因与表型性状的关系，采用组成型表达载体或组织专一性表达载体将目的基因导入目标植物，以期获得作物特定经济性状或抗逆性性状的改良.

在农作物特别是谷类作物中，产量性状通常是由多基因或称数量基因控制的。分离与克隆这类产量性状基因的方法一般采用定位克隆技术，然后通过转基因验证其功能。以栽培水稻与江西东乡野生稻杂交与回交构建的基因系为材料，通过染色体定位与基因组序列分析分离克隆了来自东乡野生稻基因组的一组编码跨膜受体蛋白LRK的基因，共有8个首尾相连簇集排列的家族成员，分别命名为lrk1，lrk2，lrk3，lrk4，lrk5，lrk6，lrk7和lrk8。在有些籼稻品种中只含有7个lrk基因，它们缺少lrk1基因。粳稻中，lrk2，lrk3和lrk5基因不表达。籼稻中，缺少lrk1基因，lrk3和lrk5基因不表达(Guangming He，Xiaojin Luo，Feng Tian，Kegui Li，Zuofeng Zhu，Wei Su，Xiaoyin Qian，Xiangkun Wang，Chuangqing Sun and Jinshui Yang*HaplotypeVariation in Structure and Expression of a Gene Cluster that is Associated with aQuantitative Trait Locus for Improved Yield in Rice，Genome Research，2006，16：618-626)。

这个基因簇位于水稻2号染色体的端部，其DNA序列已经登录在国际基因组数据库NCBI，克隆编号为AY756174和DQ195081。经水稻苗期分子检测证实，在粳稻日本晴的8个lrk基因中，有5个基因表达，分别为lrk1，lrk4，lrk6，lrk7和lrk8。在籼稻9311(超级杂交稻亲本之一)中，也有5个lrk基因表达，分别为lrk2，lrk4，lrk6，lrk7和lrk8。

但是，尚未有利用这组lrk基因提高水稻产量或者明显改善产量性状的报道。

发明内容

本发明目的是提供一种利用基因转化提高水稻产量的方法。

本发明提供了一种提高水稻产量的方法，即用水稻lrk1基因转化水稻，所述的lrk1基因的蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO 2所示。

本发明中，水稻lrk1基因是指氨基酸序列如SEQ ID NO 2的蛋白。该术语还包括具有与水稻lrk1蛋白相同功能的、SEQ ID NO.2序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：若干个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括水稻lrk1蛋白的活性片段和活性衍生物。

本发明中，所述的lrk1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO 1所示。

本发明中，水稻lrk1基因的核苷酸序列包括编码具有水稻lrk1蛋白活性的多肽的核苷酸序列，如SEQ ID NO.1中32-3181位核苷酸序列及其简并序列。该简并序列是指，位于SEQ ID NO.1序列的编码框32-3181位核苷酸中，有一个或多个密码子被编码相同氨基酸的简并密码子所取代后而产生的序列。由于密码子的简并性，所以与SEQ ID NO.1中32-3181位核苷酸序列同源性低至约70％的简并序列也能编码出SEQ ID NO.2所述的序列。该术语还包括能在中度严紧条件下，更佳地在高度严紧条件下，与SEQ ID NO.1中从核苷酸32-3181位的核苷酸序列杂交的核苷酸序列。还术语还包括与SEQ ID NO.1中从核苷酸32-3181位的核苷酸序列的同源性至少70％，较佳地至少80％，更佳地至少90％的核苷酸序列。

本发明中，所述的方法具体包括以下步骤：

(1)将lrk1基因编码序列插入植物表达载体构建重组表达载体；

(2)诱导处理水稻愈伤组织；

(3)用(1)所得的重组表达载体转化水稻愈伤组织；

(4)恢复培养(3)所得的水稻愈伤组织。

本发明中，所述的植物表达载体可以是常规的水稻表达载体。构建重组序列的方法参考《分子克隆》的标准方法，例如，将lrk1基因编码序列克隆到植物表达载体的多克隆位点。

本发明中，所述的植物表达载体可以是已经市售或者文献报道过的植物表达载体，例如pCAMBIA1304等。

本发明中，步骤(3)中用基因枪微弹轰击法实现重组表达载体转化水稻愈伤组织。除此以外，还可以参用其他常规的基因转化方法。

本发明中，恢复培养水稻愈伤组织是先在不含筛选剂的诱导培养基上生长，然后再在含有筛选剂的培养基上筛选，并将筛选后的愈伤组织光照培养。

本发明中，所述的筛选剂是潮霉素。

在进行筛选时，可以采用筛选剂浓度逐步提高的方法，也可以配合光照条件进行。例如在本发明的一个实施例中，采用下述含有30mg/和50mg/L潮霉素的筛选培养基、同时配合暗培养约两周进行筛选。

筛选完成后，所得即含有lrk1基因的愈伤组织，可以将筛选后存活的愈伤于分化培养基上光照培养，待分化出小植株后，再转入生根壮苗培养基，长大后移入温室。

本发明提供了一种利用lrk1基因转化提高水稻产量及产量性状的方法。本发明利用基因枪微弹轰击法，将水稻lrk1基因转化水稻愈伤组织，经过恢复培养获得表达lrk1基因的水稻植株。结果显示，成功转化的水稻，其种子发芽势快于对照，苗期分蘖势好于对照，苗期生长势、苗期生长势和植株成熟穗子指标总体优于对照。本发明为水稻提高产量提供了一种低成本、高效益的新方法。

附图说明

图1是含lrk1基因的表达载体结构图。lrk1基因插入表达载体的位置有箭头标示。

图2是转lrk1基因的种子发芽势快于对照9311的结果图1。

图3是转lrk1基因的种子发芽势快于对照9311结果图2。具体方法为：浸种两天，催芽两天，催苗4天。

图4是lrk1转基因苗期分蘖势好于对照9311结果图1。

图5是lrk1转基因苗期生长势图。左，9311对照；右：转lrk1基因9311。

图6是lrk1转基因9311成熟单株图。左，9311对照，株高110厘米，分蘖数为9；右，lrk1转基因9311单株，株高105厘米，分蘖数为12。

图7是lrk1转基因9311植株成熟穗子图。上，9311对照，穗长29.5厘米，第一枝梗为12，第二枝梗为54，总颖花数为244，千粒重为28克，生育期：5/1播种，始穗：8/7，采收：9/5；下，lrk1转基因9311，穗长29.0厘米，第一枝梗为13，第二枝梗为73，总颖花数为293，千粒重为26克，生育期：5/1播种，始穗：8/2，采收：9/5。

具体实施方式

实施例1lrk1基因的功能验证

1)lrk1基因表达载体的构建

采用pCAMBIA1304为表达载体，将东乡野生稻lrk1基因插入到pCAMBIA1304载体35S组型启动子下游。含lrk1基因的表达载体结构图如下：

2)lrk1基因转化实验与结果

采用目前国内超级杂交稻的主要亲本之一9311为转基因受体。将9311成熟种子去壳消毒后接种在脱分化植物组织培育基上诱导愈伤组织。在愈伤组织诱导2-3周后，采用基因枪微弹轰击法，将含lrk1基因的纯化的pCAMBIA1304质粒DNA导入9311愈伤组织细胞。在添加30ppm潮霉素的MS培养基上连续培养3-4周筛选抗性细胞系，然后将筛选的细胞系转移到分化培养基诱导长芽和生根。

3)转化处理试管苗移载及转化植株后代的分子检测

将lrk1基因转化处理的9311试管苗移载田间，并在分蘖期取叶片提取DNA采用PCR扩放技术进行分子检测，于2005年秋获得阳性T0代。2005年冬，在海南岛加代繁殖，获得转基因T1代，共计7个株系。

4)lrk1转基因T2代群体产量性状的调查与统计

将lrk1基因转基因T2代于2006年春播种，四叶期将转化的7个lrk1转基因T2代株系种植在复旦大学试验田。7个株系每个株系各种植49株，行株距为6寸×6寸，重复三次，同时设立9311亲本对照。在分蘖盛期调查统计分蘖数，成熟期统计有效穗数，单株总粒数和千粒重，结果如下：

  株系号码  平均株  高(cm)  主穗  平均有  效穗  平均最  长剑叶  平均最  长穗长  平均每  株总粒  数  平均每  穗粒数  千粒重  株系1  95.96  6.65  31.12  22.42  1392  210  26

  株系号码  平均株  高(cm)  主穗  平均有  效穗  平均最  长剑叶  平均最  长穗长  平均每  株总粒  数  平均每  穗粒数  千粒重  株系2  96.24  7.62  33.55  25.18  1514  202  26  株系3  98.01  7.26  31.76  26.39  1451  200  26  株系4  104.50  7.40  31.9  26.9  1666  227  23  株系5  91.88  7.70  29.51  23.69  1407  183  26  株系6  105.95  8.81  36.39  27.27  1930  220  26  株系7  98.23  7.25  34.24  23.96  1547  215  26  平均数  98.68  7.53  32.64  25.12  1558  208  26  对照9311  115.75  5.89  27.02  25.86  1122  191  28

根据上述田间调查及考种数据，与对照相比，lrk1转基因9311的产量性状优于对照：

有效穗：增加27.8％；每株总粒数：增加38.9％；平均每穗穗粒数：增加8.9％。千粒重：减少7％。

水稻lrk1转基因增加产量的主要原因是增加分蘖力和有效穗以及穗粒数.转基因9311植株的平均穗长与对照基本一致，但穗粒数增加，主要是因为转基因株系的稻穗二次枝梗数增加，从而增加了每穗总粒数。

实施例2水稻lrk1基因转化籼稻9311的方法

1)选择lrk1全长ORF区段(见序列表)，采用PCR方法从东乡野生稻中将其扩增，并合成插入接头克隆到植物表达载体pCAMBIA1304，获得lrk1表达载体pCAMBIA1304/lrk1.

2)诱导水稻愈伤组织培养基

1.诱导及继代培养基：MS+2mg/L 2，4-D.

2.高渗培养基：MS+2mg/L 2，4-D+46.67g/L山梨醇+46.67g/L甘露醇.

3.第一轮筛选培养基：MS+2mg/L 2，4-D+30mg/L潮霉素.

4.第二轮筛选培养基：MS+2mg/L 2，4-D+50mg/L潮霉素.

5.分化培养基：MS+3mg/L 6-BA+0.5mg/L NAA+50mg/L潮霉素.

6.生根壮苗培养基：1/2MS+0.1mg/L NAA

注：1.以上培养基均含30g/L蔗糖+2.5g/L agar，pH 5.8

2.愈伤诱导、继代、筛选培养条件为26-28℃暗培养，分化、生根壮苗为26-28℃及16小时光周期

3)愈伤组织诱导与处理

1.取授粉后12-15天的未成熟种子，在无菌条件下，先用70％乙醇浸洗10min，转入0.1％升汞浸泡20min，无菌水清洗3次。

2.在无菌条件下剥离幼胚，接种于愈伤诱导培养基上，26-28℃暗培养约20天后切芽，继代一次。

3.在继代培养基中挑选生长旺盛、淡黄色的愈伤约30-50块(每块3mm左右)，置于高渗培养基上中央，排成直径约2.5cm的圆圈内，培养约4-5h后用于转化。

4)基因枪转化

1.基因枪：从宁波新芝科技有限公司购置的高压气体基因枪，型号：GJ-1000.

2.微粒子弹制备

3.称取60mg钨粉(直径约1um)，加入到1.5ml灭菌离心管中，再加入1ml无水乙醇，振荡1min，于10000rpm离心10s，弃上清，重复洗一次后，将金粉悬浮于1ml无菌水中现用或-20℃保存。

4.吸取50ul钨粉悬浮液于1.5ml离心管，依次加入5ug DNA、50ul2.5M CaCl₂、20ul 0.1M亚精胺，振荡5分钟，10000rpm离心20s，弃上清，以140ul无水乙醇漂洗两次，加入60ul无水乙醇，悬浮待用。

5)轰击受体材料

1.将基因枪放于超净工作台上，用70％酒精擦净真空室，并将可裂膜、载粒膜、金属挡网(均由宁波新芝科技有限公司供货)于70％酒精中消毒30分钟，然后用无菌滤纸吸干或吹净残余酒精.

2.打开电源开关，真空泵及氦气瓶阀。

3.将可裂膜装入固定、旋紧。

4.取10ul包被DNA的钨粉无水乙醇悬浮液，均匀涂布于载粒膜中心，放在超净台上吹干。

5.将载有微弹的载粒膜及挡网装入微弹发射装置，使有颗粒的一面朝下。

6.将培养皿放在托盘上，使愈伤集中于培养皿中央。

7.打开气瓶，调节压力1100Psi。

8.抽真空，当真空度达到需要值时，将VAC键转到Hold位置。

9.轰击，每皿轰击2次(第一次轰击后将培养皿旋转90度后进行第二次轰击)，按放气键使真空表读数回零，取出样品，轰击后于高渗培养基上继续培养12-16h。

6)转化愈伤组织筛选

1.将打枪后高渗培养基上的愈伤转入不含筛选剂的诱导培养基上恢复生长5-7天。

2.将愈伤转到含30mg/L潮霉素的筛选培养基上，均匀摆放，暗培养14-17天进行第一次抗性筛选。

3.将抗性愈伤转入含50mg/L潮霉素的筛选培养基上，暗培养8-12天进行第二次抗性筛选。

7)水稻rFCA基因RRM2结构域转化植株筛选与检测

1.转化试管苗分子检测

A，将筛选后存活的愈伤于分化培养基上光照培养30天。

B，待分化出小植株后，将小植株转入生根壮苗培养基，长大后移入温室。

2.转化植株的分子检测

分别采用PCR扩增和基因组Southern杂交杂法检测后选的转化植株，共获得两株含有转化的rFCA-RRM片段的阳性植株

序列表

<210>1

<211>3240

<212>DNA

<213>Oryza sativa

<220>

<221>CDS

<222>(32)..(3181)

<223>

<400>1

ccaacttcca tgctagtatc accagaaaac c atg cag cca cct cat ttt tca      52

                                   Met Gln Pro Pro His Phe Ser

                                   1               5

tac aag aca caa agc aac aga ctg ccc ata cct gtt ctt agc ctt gcc    100

Tyr Lys Thr Gln Ser Asn Arg Leu Pro Ile Pro Val Leu Ser Leu Ala

        10                  15                  20

ctt gtg ctg ctg ctc aac ttc acc tct ccc acc agt tca tgt aca gag    148

Leu Val Leu Leu Leu Asn Phe Thr Ser Pro Thr Ser Ser Cys Thr Glu

    25                  30                  35

cag gag aag aac tcc ctc ctc aat ttc ctc acc ggg ctt tct aag gat    196

Gln Glu Lys Asn Ser Leu Leu Asn Phe Leu Thr Gly Leu Ser Lys Asp

40                  45                  50                  55

gga ggc ctc agc atg tca tgg aag gat ggc gtg gat tgt tgc gag tgg    244

Gly Gly Leu Ser Met Ser Trp Lys Asp Gly Val Asp Cys Cys Glu Trp

                 60                  65                  70

gaa ggg atc acc tgc aga aca gat agg acc gtg act gat gtt tca ctg    292

Glu Gly Ile Thr Cys Arg Thr Asp Arg Thr Val Thr Asp Val Ser Leu

            75                  80                  85

cct tct agg agc ctc gag ggg tac atc tct cca tct ctt ggc aac ctg    340

Pro Ser Arg Ser Leu Glu Gly Tyr Ile Ser Pro Ser Leu Gly Asn Leu

        90                  95                  100

act gga ttg ctg cgc ctc aac ctg tcc tac aac ctg cta tcc agt gtc    388

Thr Gly Leu Leu Arg Leu Asn Leu Ser Tyr Asn Leu Leu Ser Ser Val

    105                 110                 115

cta ccg cag gaa ttg ctg tct tcc agc aaa ctc atc gtc ata gac atc    436

Leu Pro Gln Glu Leu Leu Ser Ser Ser Lys Leu Ile Val Ile Asp Ile

120                 125                 130                 135

agc ttt aac cgc ctg aat gga ggt ctc gac aag ttg cca tct tca acc    484

Ser Phe Asn Arg Leu Asn Gly Gly Leu Asp Lys Leu Pro Ser Ser Thr

                140                 145                 150

cct gcc agg cca ctg cag gta ctc aac atc tca agt aat ttg tta gca    532

Pro Ala Arg Pro Leu Gln Val Leu Asn Ile Ser Ser Asn Leu Leu Ala

            155                 160                 165

gga cag ttt cca tcc tcc aca tgg gta gtg atg gca aat ctg gcc gca    580

Gly Gln Phe Pro Ser Ser Thr Trp Val Val Met Ala Asn Leu Ala Ala

        170                 175                 180

ctc aat gtc agt aac aac agc ttt act ggg aaa ata cca act aat ttc    628

Leu Asn Val Ser Asn Asn Ser Phe Thr Gly Lys Ile Pro Thr Asn Phe

    185                 190                 195

tgc acc aac tca cca tcc tta gct gtg ctt gaa ctc agt tac aac caa    676

Cys Thr Asn Ser Pro Ser Leu Ala Val Leu Glu Leu Ser Tyr Asn Gln

200                 205                 210                 215

ttc agt ggg agc att ccc cct gaa ctt gga agt tgc tcc agg ctg aga    724

Phe Ser Gly Ser Ile Pro Pro Glu Leu Gly Ser Cys Ser Arg Leu Arg

                220                 225                 230

gtc ctc aag gct ggc cat aac aac ctt agt ggg act ctc cct gat gaa    772

Val Leu Lys Ala Gly His Asn Asn Leu Ser Gly Thr Leu Pro Asp Glu

            235                 240                 245

atc ttc aat gct acc tcg tta gag tgc ctc tct ttt cca aac aat aat    820

Ile Phe Asn Ala Thr Ser Leu Glu Cys Leu Ser Phe Pro Asn Asn Asn

        250                 255                 260

tta caa gga aca ctt gaa ggg gca aat gtt gtc aaa ctc ggt aag ctg    868

Leu Gln Gly Thr Leu Glu Gly Ala Asn Val Val Lys Leu Gly Lys Leu

    265                 270                 275

gct acc ctt gac ctt gga gag aac aac ttc agt ggt aac att cca gag    916

Ala Thr Leu Asp Leu Gly Glu Asn Asn Phe Ser Gly Asn Ile Pro Glu

280                 285                 290                 295

tct atc ggt cag ctc aac aga ttg gag gaa ctc cat ttg aac aac aac    964

Ser Ile Gly Gln Leu Asn Arg Leu Glu Glu Leu His Leu Asn Asn Asn

                300                 305                 310

aaa atg ttt ggg agc ata cca tca acc ctg agc aac tgc aca agt ctg    1012

Lys Met Phe Gly Ser Ile Pro Ser Thr Leu Ser Asn Cys Thr Ser Leu

            315                 320                 325

aaa acc atc gac ctc aat agc aac aat ttc agt gga gag ctc atg aat    1060

Lys Thr Ile Asp Leu Asn Ser Asn Asn Phe Ser Gly Glu Leu Met Asn

        330                 335                 340

gtc aat ttc tcc aat cta ccc agt cta caa act tta gat ctt cgg cag    1108

Val Asn Phe Ser Asn Leu Pro Ser Leu Gln Thr Leu Asp Leu Arg Gln

    345                 350                 355

aac atc ttc agt ggt aaa att cca gaa aca ata tac tca tgc agc aac    1156

Asn Ile Phe Ser Gly Lys Ile Pro Glu Thr Ile Tyr Ser Cys Ser Asn

360                 365                 370                 375

cta act gcc ctg cgg cta tct ttg aat aaa ttc caa ggc cag tta tca    1204

Leu Thr Ala Leu Arg Leu Ser Leu Asn Lys Phe Gln Gly Gln Leu Ser

                380                 385                 390

aag gga cta ggc aat ctg aag tcc ctt tcc ttc ctg tca ctc ggt tac    1252

Lys Gly Leu Gly Asn Leu Lys Ser Leu Ser Phe Leu Ser Leu Gly Tyr

            395                 400                 405

aac aat ctc aca aac ata aca aat gca cta cag ata tta agg agc tcc    1300

Asn Asn Leu Thr Asn Ile Thr Asn Ala Leu Gln Ile Leu Arg Ser Ser

        410                 415                 420

agc aaa ctc acc acc ctt ctt att agc aac aac ttc atg aat gaa agt    1348

Ser Lys Leu Thr Thr Leu Leu Ile Ser Asn Asn Phe Met Asn Glu Ser

    425                 430                 435

ata cca gac gat gat aga att gat ggt ttt gag aat ctt cag gtt ctt    1396

Ile Pro Asp Asp Asp Arg Ile Asp Gly Phe Glu Asn Leu Gln Val Leu

440                 445                 450                 455

gac cta agt gga tgc tcc ttt tct gga aaa ata cct caa tgg tta tca    1444

Asp Leu Ser Gly Cys Ser Phe Ser Gly Lys Ile Pro Gln Trp Leu Ser

                460                 465                 470

aaa ctc tcg agg ttg gag atg ctg gtt tta gac aac aat caa cta act    1492

Lys Leu Ser Arg Leu Glu Met Leu Val Leu Asp Asn Asn Gln Leu Thr

            475                 480                 485

gga cca ata cct gac tgg atc agc agc cta aac ttc ctc ttc tat cta    1540

Gly Pro Ile Pro Asp Trp Ile Ser Ser Leu Asn Phe Leu Phe Tyr Leu

        490                 495                 500

gat gta tca aat aac aat ctg acg gga gaa att ccg atg gcc tta tta    1588

Asp Val Ser Asn Asn Asn Leu Thr Gly Glu Ile Pro Met Ala Leu Leu

    505                 510                 515

cag atg cca atg cta agg tca gac agg gct gca gca caa ttg gac act    1636

Gln Met Pro Met Leu Arg Ser Asp Arg Ala Ala Ala Gln Leu Asp Thr

520                 525                 530                 535

aga gca ttt gaa cta ccc ata tat ata gat gca aca cta ctt caa tac    1684

Arg Ala Phe Glu Leu Pro Ile Tyr Ile Asp Ala Thr Leu Leu Gln Tyr

                540                 545                 550

cgc aag gcc agt gct ttt ccc aaa gtg ctg aat cta ggt aac aat gaa    1732

Arg Lys Ala Ser Ala Phe Pro Lys Val Leu Asn Leu Gly Asn Asn Glu

            555                 560                 565

ttc acc ggt ttg atc cct caa gag att ggt cag ttg aaa gcg ctc ctt    1780

Phe Thr Gly Leu Ile Pro Gln Glu Ile Gly Gln Leu Lys Ala Leu Leu

        570                 575                 580

ttg ctt aat ttg agc ttt aac aaa tta tat gga gat atc ccc cag tcg    1828

Leu Leu Asn Leu Ser Phe Asn Lys Leu Tyr Gly Asp Ile Pro Gln Ser

    585                 590                 595

atc tgc aac ctc aga gac ctg cta atg ctg gat tta tca agc aat aat    1876

Ile Cys Asn Leu Arg Asp Leu Leu Met Leu Asp Leu Ser Ser Asn Asn

600                 605                 610                 615

cta act ggt aca atc cca gcc gca ctg aac aat tta acc ttt ctt atc    1924

Leu Thr Gly Thr Ile Pro Ala Ala Leu Asn Asn Leu Thr Phe Leu Ile

                620                 625                 630

gaa ttc aac gtc tcg tat aat gac cta gaa ggg cct atc cca act ggc    1972

Glu Phe Asn Val Ser Tyr Asn Asp Leu Glu Gly Pro Ile Pro Thr Gly

            635                 640                 645

gga cag ttt agt aca ttc aca aat tct agc ttt tat ggc aat cca aag    2020

Gly Gln Phe Ser Thr Phe Thr Asn Ser Ser Phe Tyr Gly Asn Pro Lys

        650                 655                 660

ctg tgt ggt cct atg ctt aca cac cat tgc agt tca ttt gat aga cat    2068

Leu Cys Gly Pro Met Leu Thr His His Cys Ser Ser Phe Asp Arg His

    665                 670                 675

ttg gtc tca aag caa caa caa aac aag aag gtc ata ctt gta att gtt    2116

Leu Val Ser Lys Gln Gln Gln Asn Lys Lys Val Ile Leu Val Ile Val

680                 685                 690                 695

ttt tgt gtc ctt ttt gga gcc att gtc att ctt ttg ttg ttg ggg tat    2164

Phe Cys Val Leu Phe Gly Ala Ile Val Ile Leu Leu Leu Leu Gly Tyr

                700                 705                 710

ctc ctt ctg tca atc agg ggt atg agt ttc acg acc aaa agt agg tgc    2212

Leu Leu Leu Ser Ile Arg Gly Met Ser Phe Thr Thr Lys Ser Arg Cys

            715                 720                 725

aac aat gat tac ata gaa gca tta tca ccg aac acc aat tca gat cat    2260

Asn Asn Asp Tyr Ile Glu Ala Leu Ser Pro Asn Thr Asn Ser Asp His

        730                 735                 740

ttg ttg gta atg ttg cag caa ggc aag gaa gca gaa aac aag ctc aca    2308

Leu Leu Val Met Leu Gln Gln Gly Lys Glu Ala Glu Asn Lys Leu Thr

    745                 750                 755

ttc act ggc att gtg gaa gct aca aac aat ttt aac cag gag cac atc    2356

Phe Thr Gly Ile Val Glu Ala Thr Asn Asn Phe Asn Gln Glu His Ile

760                 765                 770                 775

att gga tgt gga ggt tat gga tta gtc tac aag gca cag tta cct gat    2404

Ile Gly Cys Gly Gly Tyr Gly Leu Val Tyr Lys Ala Gln Leu Pro Asp

                780                 785                 790

ggc tct atg att gcc atc aag aaa ctt aat ggt gaa atg tgt ctg atg    2452

Gly Ser Met Ile Ala Ile Lys Lys Leu Asn Gly Glu Met Cys Leu Met

            795                 800                 805

gaa agg gag ttc agt gca gag gtt gaa acg ctc tcc atg gca cga cat    2500

Glu Arg Glu Phe Ser Ala Glu Val Glu Thr Leu Ser Met Ala Arg His

        810                 815                 820

gac aat ctt gtg cca ctc tgg ggt tac tgt atc cag gga aac tcg agg    2548

Asp Asn Leu Val Pro Leu Trp Gly Tyr Cys Ile Gln Gly Asn Ser Arg

    825                 830                 835

ctc ctc ata tat tct tac atg gag aat ggc agc ctg gat gat tgg ctt    2596

Leu Leu Ile Tyr Ser Tyr Met Glu Asn Gly Ser Leu Asp Asp Trp Leu

840                 845                 850                 855

cat aac aag gat gat gat acc agc aca att cta gat tgg cca aga cgg    2644

His Asn Lys Asp Asp Asp Thr Ser Thr Ile Leu Asp Trp Pro Arg Arg

                860                 865                 870

ctc aaa ata gca aaa ggg gca agc cat ggc ctt tct tac atc cac aat    2692

Leu Lys Ile Ala Lys Gly Ala Ser His Gly Leu Ser Tyr Ile His Asn

            875                 880                 885

atc tgc aag cct cgt att gtc cac cgt gac atc aaa tct agc aac atc    2740

Ile Cys Lys Pro Arg Ile Val His Arg Asp Ile Lys Ser Ser Asn Ile

        890                 895                 900

ctt ctc gac aaa gaa ttc aaa gct tat att gca gat ttt gga tta tca    2788

Leu Leu Asp Lys Glu Phe Lys Ala Tyr Ile Ala Asp Phe Gly Leu Ser

    905                 910                 915

cgg ttg atc ctt ccc aac aaa act cat gtc cca act gaa cta gtt ggc    2836

Arg Leu Ile Leu Pro Asn Lys Thr His Val Pro Thr Glu Leu Val Gly

920                 925                 930                 935

act ctt ggt tac atc cca cct gag tac gcc cag gca tgg gtt gct aca    2884

Thr Leu Gly Tyr Ile Pro Pro Glu Tyr Ala Gln Ala Trp Val Ala Thr

                940                 945                 950

ttg aaa ggt gat gta tac agt ttc gga gtg gtc ctg ctt gag ctt ctc    2932

Leu Lys Gly Asp Val Tyr Ser Phe Gly Val Val Leu Leu Glu Leu Leu

            955                 960                 965

act ggg agg agg cca gtt ccg ata ctg tct acc tca aag gaa ctt gtc    2980

Thr Gly Arg Arg Pro Val Pro Ile Leu Ser Thr Ser Lys Glu Leu Val

        970                 975                 980

cca tgg gta cag gag atg gta tca aat gga aag cag att gag gtg ctg    3028

Pro Trp Val Gln Glu Met Val Ser Asn Gly Lys Gln Ile Glu Val Leu

    985                 990                 995

gat  tta aca ttt caa ggc  aca ggg tgt gaa gag  caa atg cta aag     3073

Asp  Leu Thr Phe Gln Gly  Thr Gly Cys Glu Glu  Gln Met Leu Lys

1000                 1005                 1010

gtc  ctt gaa att gct tgc  aag tgt gtc aaa ggt  gat cct ttg cgg    3118

Val  Leu Glu Ile Ala Cys  Lys Cys Val Lys Gly  Asp Pro Leu Arg

1015                 1020                 1025

agg  cct act atg ata gaa  gta gta gcc agt ctg  cac agt ata gac    3163

Arg  Pro Thr Met Ile Glu  Val Val Ala Ser Leu  His Ser Ile Asp

1030                 1035                 1040

cct  gac ggc ctg acc taa agatacaata atatgacaaa taatcttgta         3211

Pro  Asp Gly Leu Thr

1045

ctttcagtga actgagttga tctagtctc                                   3240

<210>2

<211>1049

<212>PRT

<213>Oryza sativa

<400>2

Met Gln Pro Pro His Phe Ser Tyr Lys Thr Gln Ser Asn Arg Leu Pro

1               5                   10                  15

Ile Pro Val Leu Ser Leu Ala Leu Val Leu Leu Leu Asn Phe Thr Ser

            20                  25                  30

Pro Thr Ser Ser Cys Thr Glu Gln Glu Lys Asn Ser Leu Leu Asn Phe

        35                  40                  45

Leu Thr Gly Leu Ser Lys Asp Gly Gly Leu Ser Met Ser Trp Lys Asp

    50                  55                  60

Gly Val Asp Cys Cys Glu Trp Glu Gly Ile Thr Cys Arg Thr Asp Arg

65                  70                  75                  80

Thr Val Thr Asp Val Ser Leu Pro Ser Arg Ser Leu Glu Gly Tyr Ile

                85                  90                  95

Ser Pro Ser Leu Gly Asn Leu Thr Gly Leu Leu Arg Leu Asn Leu Ser

            100                 105                 110

Tyr Asn Leu Leu Ser Ser Val Leu Pro Gln Glu Leu Leu Ser Ser Ser

        115                 120                 125

Lys Leu Ile Val Ile Asp Ile Ser Phe Asn Arg Leu Asn Gly Gly Leu

    130                 135                 140

Asp Lys Leu Pro Ser Ser Thr Pro Ala Arg Pro Leu Gln Val Leu Asn

145                 150                 155                 160

Ile Ser Ser Asn Leu Leu Ala Gly Gln Phe Pro Ser Ser Thr Trp Val

                165                 170                 175

Val Met Ala Asn Leu Ala Ala Leu Asn Val Ser Asn Asn Ser Phe Thr

            180                 185                 190

Gly Lys Ile Pro Thr Asn Phe Cys Thr Asn Ser Pro Ser Leu Ala Val

        195                 200                 205

Leu Glu Leu Ser Tyr Asn Gln Phe Ser Gly Ser Ile Pro Pro Glu Leu

    210                 215                 220

Gly Ser Cys Ser Arg Leu Arg Val Leu Lys Ala Gly His Asn Asn Leu

225                 230                 235                 240

Ser Gly Thr Leu Pro Asp Glu Ile Phe Asn Ala Thr Ser Leu Glu Cys

                245                 250                 255

Leu Ser Phe Pro Asn Asn Asn Leu Gln Gly Thr Leu Glu Gly Ala Asn

            260                 265                 270

Val Val Lys Leu Gly Lys Leu Ala Thr Leu Asp Leu Gly Glu Asn Asn

        275                 280                 285

Phe Ser Gly Asn Ile Pro Glu Ser Ile Gly Gln Leu Asn Arg Leu Glu

    290                 295                 300

Glu Leu His Leu Asn Asn Asn Lys Met Phe Gly Ser Ile Pro Ser Thr

305                 310                 315                 320

Leu Ser Asn Cys Thr Ser Leu Lys Thr Ile Asp Leu Asn Ser Asn Asn

                325                 330                 335

Phe Ser Gly Glu Leu Met Asn Val Asn Phe Ser Asn Leu Pro Ser Leu

            340                 345                 350

Gln Thr Leu Asp Leu Arg Gln Asn Ile Phe Ser Gly Lys Ile Pro Glu

        355                 360                 365

Thr Ile Tyr Ser Cys Ser Asn Leu Thr Ala Leu Arg Leu Ser Leu Asn

    370                 375                 380

Lys Phe Gln Gly Gln Leu Ser Lys Gly Leu Gly Asn Leu Lys Ser Leu

385                 390                 395                 400

Ser Phe Leu Ser Leu Gly Tyr Asn Asn Leu Thr Asn Ile Thr Asn Ala

                405                 410                 415

Leu Gln Ile Leu Arg Ser Ser Ser Lys Leu Thr Thr Leu Leu Ile Ser

            420                 425                 430

Asn Asn Phe Met Asn Glu Ser Ile Pro Asp Asp Asp Arg Ile Asp Gly

        435                 440                 445

Phe Glu Asn Leu Gln Val Leu Asp Leu Ser Gly Cys Ser Phe Ser Gly

    450                 455                 460

Lys Ile Pro Gln Trp Leu Ser Lys Leu Ser Arg Leu Glu Met Leu Val

465                 470                 475                 480

Leu Asp Asn Asn Gln Leu Thr Gly Pro Ile Pro Asp Trp Ile Ser Ser

                485                 490                 495

Leu Asn Phe Leu Phe Tyr Leu Asp Val Ser Asn Asn Asn Leu Thr Gly

            500                 505                 510

Glu Ile Pro Met Ala Leu Leu Gln Met Pro Met Leu Arg Ser Asp Arg

        515                 520                 525

Ala Ala Ala Gln Leu Asp Thr Arg Ala Phe Glu Leu Pro Ile Tyr Ile

    530                 535                 540

Asp Ala Thr Leu Leu Gln Tyr Arg Lys Ala Ser Ala Phe Pro Lys Val

545                 550                 555                 560

Leu Asn Leu Gly Asn Asn Glu Phe Thr Gly Leu Ile Pro Gln Glu Ile

                565                 570                 575

Gly Gln Leu Lys Ala Leu Leu Leu Leu Asn Leu Ser Phe Asn Lys Leu

            580                 585                 590

Tyr Gly Asp Ile Pro Gln Ser Ile Cys Asn Leu Arg Asp Leu Leu Met

        595                 600                 605

Leu Asp Leu Ser Ser Asn Asn Leu Thr Gly Thr Ile Pro Ala Ala Leu

    610                 615                 620

Asn Asn Leu Thr Phe Leu Ile Glu Phe Asn Val Ser Tyr Asn Asp Leu

625                 630                 635                 640

Glu Gly Pro Ile Pro Thr Gly Gly Gln Phe Ser Thr Phe Thr Asn Ser

                645                 650                 655

Ser Phe Tyr Gly Asn Pro Lys Leu Cys Gly Pro Met Leu Thr His His

            660                 665                 670

Cys Ser Ser Phe Asp Arg His Leu Val Ser Lys Gln Gln Gln Asn Lys

        675                 680                 685

Lys Val Ile Leu Val Ile Val Phe Cys Val Leu Phe Gly Ala Ile Val

    690                 695                 700

Ile Leu Leu Leu Leu Gly Tyr Leu Leu Leu Ser Ile Arg Gly Met Ser

705                 710                 715                 720

Phe Thr Thr Lys Ser Arg Cys Asn Asn Asp Tyr Ile Glu Ala Leu Ser

                725                 730                 735

Pro Asn Thr Asn Ser Asp His Leu Leu Val Met Leu Gln Gln Gly Lys

            740                 745                 750

Glu Ala Glu Asn Lys Leu Thr Phe Thr Gly Ile Val Glu Ala Thr Asn

        755                 760                 765

Asn Phe Asn Gln Glu His Ile Ile Gly Cys Gly Gly Tyr Gly Leu Val

    770                 775                 780

Tyr Lys Ala Gln Leu Pro Asp Gly Ser Met Ile Ala Ile Lys Lys Leu

785                 790                 795                 800

Asn Gly Glu Met Cys Leu Met Glu Arg Glu Phe Ser Ala Glu Val Glu

                805                 810                 815

Thr Leu Ser Met Ala Arg His Asp Asn Leu Val Pro Leu Trp Gly Tyr

            820                 825                 830

Cys Ile Gln Gly Asn Ser Arg Leu Leu Ile Tyr Ser Tyr Met Glu Asn

        835                 840                 845

Gly Ser Leu Asp Asp Trp Leu His Asn Lys Asp Asp Asp Thr Ser Thr

    850                 855                 860

Ile Leu Asp Trp Pro Arg Arg Leu Lys IleAla Lys Gly Ala Ser His

865                 870                 875                 880

Gly Leu Ser Tyr Ile His Asn Ile Cys Lys Pro Arg Ile Val His Arg

                885                 890                 895

Asp Ile Lys Ser Ser Asn Ile Leu Leu Asp Lys Glu Phe Lys Ala Tyr

            900                 905                 910

Ile Ala Asp Phe Gly Leu Ser Arg Leu Ile Leu Pro Asn Lys Thr His

        915                 920                 925

Val Pro Thr Glu Leu Val Gly Thr Leu Gly Tyr Ile Pro Pro Glu Tyr

    930                 935                 940

Ala Gln Ala Trp Val Ala Thr Leu Lys Gly Asp Val Tyr Ser Phe Gly

945                 950                 955                 960

Val Val Leu Leu Glu Leu Leu Thr Gly Arg Arg Pro Val Pro Ile Leu

                965                 970                 975

Ser Thr Ser Lys Glu Leu Val Pro Trp Val Gln Glu Met Val Ser Asn

            980                 985                 990

Gly Lys Gln Ile Glu Val Leu Asp  Leu Thr Phe Gln Gly  Thr Gly Cys

        995                 1000                 1005

Glu Glu  Gln Met Leu Lys Val  Leu Glu Ile Ala Cys  Lys Cys Val

    1010                 1015                 1020

Lys Gly  Asp Pro Leu Arg Arg  Pro Thr Met Ile Glu  Val Val Ala

    1025                 1030                 1035

Ser Leu  His Ser Ile Asp Pro  Asp Gly Leu Thr

    1040                 1045