奶山羊SCD基因的单核苷酸多态性及其检测方法

摘要

本发明公开了一种奶山羊SCD基因的单核苷酸多态性及其检测方法，其基因单核苷酸多态性包括：以包含SCD基因的待测奶山羊全基因组DNA为模板，以引物对P为引物，PCR扩增奶山羊SCD基因；用限制性内切酶NdeI消化PCR扩增产物之后，再对酶切后的扩增片段进行琼脂糖凝胶电泳；根据电泳结果鉴定奶山羊SCD基因第5001bp的碱基多态性。该方法是一种在DNA水平上筛查和检测与奶山羊泌乳性状密切相关的分子遗传标记，以用于奶山羊的辅助选择和分子育种，加快奶山羊良种繁育速度。

说明书

技术领域

本发明属于分子遗传学领域，涉及以奶山羊的功能基因的单核苷酸多态性(SNP)作为分子遗传标记，特别涉及一种奶山羊SCD基因的单核苷酸多态性及其检测方法。

背景技术

奶山羊是我国的主要的畜牧之一，但是现在面临着优秀奶山羊品种种源不足和种群遗传品质较差的压力。传统的育种方法应用测试动物的表现型和其亲代、祖代及其它亲属在小的动物模型中的遗传信息，设想性状受到许多基因遗传差异的影响，每个基因对性状有相对较小的贡献，因此对性状的估计不可避免有些偏差。分子遗传标记是近年来现代遗传学发展最快的领域之一，新的方法正在不断涌现，已定位的标记基因数目与日俱增。这将为数量遗传学提供分子水平信息，家畜育种也将跨入分子育种阶段。应用分子遗传标记的现代育种技术是加快良种选育和提高种群遗传品质，从而增加奶山羊的产奶量和改善乳品质的先进的有效的方法。

分子遗传标记辅助选择就是将现代生物技术与常规选择方法相结合，通过对遗传标记的选择来间接选择控制某性状的数量性状位点(QTL)，使之能够同时利用标记位点信息和数量性状的表型信息，更准确估计动物个体的育种值，提高选择效率，加快育种进展。标记辅助选择主要经历了三个阶段：第一阶段是家畜各性状间的遗传分析；第二阶段是蛋白质(酶)标记对数量性状的标记阶段；第三个阶段是分子遗传标记阶段。随着分子标记技术日渐成熟与丰富，使覆盖整个基因组的标记成为可能，通过与QTL间的连锁分析，实现分子标记辅助选择的目标。

单核苷酸多态性(Single Nucleotide Polymorphism，SNP)作为新的遗传标记已广泛应用于基因定位、克隆、遗传育种及多样性的研究。SNP是基因组中存在的一种数量非常丰富的变异形式，占人类基因组中遗传多态性的90％以上。SNP与罕见的变异不同，通常在种群中频率等于或小于1％的此种变异被称为突变，而只有频率大于1％时才被称为单核苷酸多态性。

目前，主要采用几种不同的方法来发现SNPs：DNA序列测定方法、PCR-SSCP与DNA测序结合法、AS-PCR方法、PCR-RFLP法、TaqMam技术与分子信标(Molecular Beacons)等。在这些SNP检测技术中，(1)DNA序列测定法是最为准确的SNP检测方法，但是，其检测费用极其昂贵，且需要有DNA测序仪等大型仪器，同时，在测序过程中需要非常熟练的技术人员和经验，所以，DNA序列测定法不是一种应用于生产实际的理想SNP检测方法；(2)PCR-SSCP与DNA测序结合法检测SNP可以适当降低检测费用，但是，PCR-SSCP的实验过程比较长，操作比较繁琐，且实验过程中存在假阳性问题，所以，也并非理想的SNP检测手段；(3)AS-PCR方法作为一种新型的SNP检测方法，在未来的应用领域中具有非常广阔的前景，但是，该方法需要设计特别的引物，且只能针对特定的基因位点，同时，检测过程中还存在误检的概率，因此，目前不具有普遍应用的特点；(4)TaqMam技术与分子信标(Molecular Beacons)都是在荧光能量转移(FluorescenceResornance Energ Transfer，FRET)基础上建立起来的，利用荧光标记及仪器达到检测目的.焦磷酸测序(Pyrosequencing)则是利用测序过程中可释放的焦磷酸和酶类产生荧光，是不依赖平板胶或毛细管电泳、不依赖DNA的荧光标记技术，很可能成为未来的主流技术.(5)RFLP-PCR方法是一种检测SNP的有效技术，在发现SNP位点后引入限制性内切酶进行切割，然后进行琼脂糖、聚丙烯凝胶电泳分析，就能准确地鉴别SNP位点.RFLP-PCR方法不仅具有DNA测序法的准确性，又克服了费用昂贵、繁琐操作、假阳性的缺点，而且所检测的序列位点无特殊性要求.

硬脂酰辅酶A去饱和酶(SCD)是酯酰去饱和酶超家族的成员，控制饱和脂肪酸向不饱和脂肪酸转化的关键酶的含铁关键酶。它存在于内质网上，可在与辅酶A相结合的饱和脂肪酸烃链(棕榈酰和硬脂酰)的Δ⁹位引入双键形成单不饱和脂肪酸(棕榈油酰和硬脂油酰)。哺乳动物的硬脂酰辅酶A去饱和酶主要存在于乳腺和肝脏中。通过硬脂酰辅酶A去饱和酶催化形成的单不饱和脂肪酸可以转换为生物膜上的磷脂、甘油三酯和胆固醇。

不饱和脂肪酸不仅是细胞膜组成的关键成分，也参与能量代谢，细胞生长和分化，细胞凋亡，信号转导等过程，因此硬脂酰辅酶A去饱和酶的作用至关重要。研究表明，生物膜上饱和与不饱和脂肪酸的比例直接影响细胞膜的流动性，并且硬脂酸向油酸转化速率的变化与很多疾病的发生相关，如癌症，神经性疾病，糖尿病，肥胖，免疫混乱，心血管病等。

在反刍动物中，油酸是脂肪组织和乳中主要的不饱和脂肪酸，有研究表明奶牛乳中78％的共轭亚油酸是有硬脂酰辅酶A去饱和酶的催化形成的。为此，SCD基因遗传变异或SNP位点在动物生产实践中对泌乳性状、生长发育性状具有重要的作用。

关于动物SCD基因遗传变异的研究国内外多见于鼠、牛等动物，而少见奶山羊SCD基因遗传变异或SNP研究的报道。由于目前中国奶山羊SCD基因遗传变异领域的研究匮乏，使该基因位点的功能研究及该基因遗传变异与经济性状(如：泌乳、生长发育等性状)关联的研究成为空白。

发明内容

本发明解决的问题在于一种奶山羊SCD基因的单核苷酸多态性及其检测方法，寻找与奶山羊经济性状相关的SNP作为分子标记，加快奶山羊良种繁育速度。

本发明通过以下技术方案来实现：

一种奶山羊SCD基因的单核苷酸多态性，其基因单核苷酸多态性包括：

奶山羊SCD基因第5001位为G或A的单核苷酸多态性。

上述奶山羊SCD基因的单核苷酸多态性的检测方法为：

以包含SCD基因的待测奶山羊全基因组DNA为模板，以引物对P为引物，PCR扩增奶山羊SCD基因；用限制性内切酶NdeI消化PCR扩增产物之后，再对酶切后的扩增片段进行琼脂糖凝胶电泳；根据电泳结果鉴定奶山羊SCD基因第5001位的单核苷酸多态性；

所述的引物对P为：

上游引物P1：cctggcagtg ttattctacc at  22bp；

下游引物P2：ctcctacttg cctctgc        17bp。

所述的PCR扩增反应程序为：

94℃预变性5min；94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s，35个循环；72℃延伸10min。

所述的琼脂糖凝胶电泳为质量浓度为2％的琼脂糖凝胶电泳。

所述的根据琼脂糖凝胶电泳结SCD基因第5001位的碱基多态性为：GG型表现：345bp；GA型表现：345bp，321bp，24bp；AA型表现：321bp和24bp。

与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果：

本发明公开了与奶山羊泌乳性相关的功能基因SCD的核苷酸多态性，该核苷酸多态性能够作为一个分子遗传标记，利用标记位点信息和数量性状的表型信息，更准确估计动物个体的育种值，提高选择效率，加快育种进展。

针对上述SCD基因的SNP多态性，本发明还公开了其检测方法，通过设计特定的PCR引物扩增片段，能够用ACRS方法(扩增引入限制性酶切位点)简单、快速、成本低、精确的检测其单核苷酸的多态性。

本发明对SCD基因的SNP进行了基因分型和基因频率分析，以及与萨能奶山羊体尺性状之间进行了性状关联分析；结果显示SCD基因的核苷酸多态位点能够成为分子遗传辅助育种的标记。

由于SCD基因功能主要涉及不同泌乳期产奶量这个经济性状，本发明提供的检测方法为SCD基因的SNP与体尺性状关系的建立奠定了基础，以便用于中国奶山羊乳用经济性状的标记辅助选择，快速建立遗传资源优良的奶山羊种群。

附图说明

图1为奶山羊血样基因组DNA电泳检测图；

图2为奶山羊SCD基因第5外显子及侧翼区362bp克隆测序PCR产物电泳图；

图3为引入酶切位点的设计与基因克隆PCR引物的对比图；

图4为奶山羊SCD基因ACRS-PCR扩增的345bp片段的电泳图；

图5为奶山羊SCD基因第5外显子及侧翼区345bp PCR产物的NdeI酶切电泳检测SCD基因多态性的电泳结果图；泳道1，3：GG基因型个体(345bp)；泳道2、5：GA基因型个体(345bp，321bp，24bp)；泳道4：AA基因型个体(321bp，24bp)；M：Marker(2000bp，1000bp，750bp，500bp，200bp)另外，由于24bp较小，故在琼脂糖电泳分析中不可见，但345bp和321bp片段能鉴别GA型和AA型；

图6为奶山羊SCD基因SNP的不同基因型测序峰图。

具体实施方式

本发明以SCD基因保守序列设计引物扩增SCD基因第5外显子及侧翼区362bp片段，分别以2种奶山羊品种的基因组为模板，进行PCR扩增，并对PCR产物纯化，经测序后寻找该扩增片段的单核苷酸多态；针对发现的单核苷酸多态进行性状关联性分析，并提供其检测方法，使得SCD基因的核苷酸多态性成为一种能够快速、方便检测的分子遗传标记，为加快建立具有优质经济性状的奶山羊种群提供依据。

a、奶山羊SCD基因部分DNA序列的克隆及其多态性的检测

1、奶山羊血样的采集及处理

取奶山羊血样10mL，加入0.5mol/L的EDTA 500μL抗凝，缓慢颠倒3次后放入冰盒，-80℃保存备用。

本发明采用了2个奶山羊品种，具体如表1所示。

表1奶山羊样品来源表

  品种  样品  样品名称  样品来源  采样方式  采样时间  西农萨能奶山羊(SN)  268  血样  陕西千阳西农萨能奶  山羊种羊场核心群  随机采样  2008.7-9月  关中奶山羊(GZ)  440  血样  陕西三原县良种奶山  羊繁育中心  随机采样  2008.7-9月

2、血样基因组DNA的提取、纯化

(1)将冷冻血样室温解冻，转移500μL至1.5mL Eppendorf管，加入等体积PBS缓冲液，充分混匀，12000r/min离心10min(4℃)，弃去上清液，重复上述步骤至上清液透明、沉淀呈淡黄色。

(2)在离心管中加入DNA抽提缓冲液500μL，摇动，使血细胞沉淀脱离离心管管壁，37℃水浴1h。DNA抽提缓冲液的配制：0.6057g的Tris、18.612g的EDTA和2.5g的SDS加超纯水500mL，灭菌、调pH至8.0，4℃保存备用。

(3)加蛋白酶K 3μL(20mg/mL)并混匀，55℃过夜至澄清，尚未澄清者，可补加1μL蛋白酶K混匀继续消化至澄清。

(4)将反应液冷却至室温，加Tris-饱和酚500μL，温和摇动离心管20min，使其充分混匀；4℃，12000r/min离心10min，将上清液转入另一1.5mL离心管中，重复一次。

(5)加氯仿500μL，充分混匀20min，4℃，12000r/min离心10min，将上清液转入另一1.5mL离心管中。

(6)加0.1倍体积的NaAc缓冲液及2倍体积的冰冷的无水乙醇，混合转动离心管直至白色的絮状沉淀析出，-20℃保存30～60min。

(7)4℃，12000r/min离心10min，弃去上清液，用70％的冰冷乙醇漂洗DNA沉淀2次。

(8)4℃，12000r/min离心10min，弃去上清液，室温下使乙醇挥发干净。

(9)干燥后的DNA溶于80～100μL的TE-缓冲液或超纯水，4℃保存直至DNA完全溶解，0.8％琼脂糖凝胶电泳检测其质量，-80℃保存。

(10)500μL的DNA溶液中加入10％SDS使其终浓度为0.1％，加入蛋白酶K至终浓度达到50μg/mL；

(11)5℃保温10h左右；

(12)等体积苯酚、氯仿、异戊醇(25∶24∶1)和氯仿分别抽提一次；

(13)12000r/min离心5min分相，吸取上层水相至另一离心管中；

(14)加入1/10体积3mol/L醋酸钠和2倍体积冰冷无水乙醇沉淀DNA；

(15)倒掉液体，70％乙醇洗涤后晾干，加入60μL灭菌超纯水溶解，4℃待检测。

3、DNA池的构建

(1)1％琼脂糖凝胶电泳检测

选部分DNA样品进行琼脂糖凝胶电泳检测，选择DNA样品条带均一、无拖尾、无降解的样品进行DNA池的构建。

(2)OD值测定

用紫外光光度计测定DNA样品在260nm、280nm处的OD值。计算DNA含量和OD₂₆₀/OD₂₈₀的比值。如OD₂₆₀/OD₂₈₀比值小于1.6，说明样品中含有较多的蛋白质或酚，则应进行纯化；若比值大于1.8，则应该考虑去除RNA纯化。

DNA质量(ng)＝50×OD₂₆₀值×稀释倍数

(3)品种DNA池的构建

DNA检测完毕后，取出一定的量稀释至50ng/μL，然后从关中奶山羊品种50个浓度为50ng/μL DNA样品中取10μL混合构建成品种DNA池；

按照同样的方法也构建萨能奶山羊品种DNA池。

奶山羊血样基因组DNA、组织样基因组DNA的检测结果见图1，从图中可以看出奶山羊基因组DNA的质量非常高。

4、克隆测序PCR扩增引物设计

由于山羊SCD基因的序列至今未知，故从NCBI数据库中(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)获得同源动物牛的GenBank登录号为：NC_007327的SCD基因DNA序列，以该基因序列保守区序列为参考利用Primer 5.0设计山羊SCD基因第5外显子及侧翼区362bp片段的PCR引物对，其引物对序列如下：

上游引物：gcctgccctg tcttatc    17；

下游引物：ctcctacttg cctctgc    17。

5、PCR克隆奶山羊SCD基因

分别以2个奶山羊品种的DNA池为模版，用设计的克隆测序引物进行PCR扩增，PCR总反应体系为25μL，见表2；PCR总反应程序，见表3。

表2PCR反应体系

  体系成分  体积(μL)  10×PCR缓冲液(MBI)  2.5  MgCl₂(25mmol/L)  1.5  dNTPs(2.5mmol/L)  2.5  上游引物(10pmol/L)  0.25  下游引物(10pmol/L)  0.25  Taq DNA聚合酶(0.5U/μL)  2.0  DNA模板(50ng/μL)  1.0

  体系成分  体积(μL)  灭菌超纯水(H₂O)  15.0  总体积  25.0

表3PCR反应程序

6、PCR产物纯化和测序

PCR扩增完成之后进行琼脂糖凝胶电泳，电泳结果如图2所示，可以清楚看到362bp的条带，说明目的基因克隆成功；然后进行PCR产物的切胶回收及纯化：在紫外灯下从琼脂糖凝胶上切下含目的片段的凝胶，放入1.5mL离心管中，然后用PCR产物回收纯化试剂盒(北京天根生物公司)纯化PCR产物，按照试剂盒说明书操作，具体步骤如下：

(1)首先向吸附柱中加入500μL平衡液BL，12000rpm离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。

(2)将单一的目的DNA条带从琼脂糖凝胶中切下放入干净的离心管中，称取重量。

(3)向胶块中加入等体积溶液PC，60℃水浴放置10分钟左右，其间不断温和地上下翻转离心管，以确保胶块充分溶解。

(4)将上一步所得溶液加入一个吸附柱中，12000rpm离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放入收集管中。

(5)向吸附柱中加入700μL漂洗液，12000rpm离心1分钟，倒掉废液，将吸附柱重新放入收集管中。

(6)向吸附柱中加入500μL漂洗液，12000rpm离心1分钟，倒掉废液，将离心吸附柱放入收集管中，12000rpm离心2分钟，尽量除去漂洗液。将吸附柱置于室温或50℃温箱数分钟，彻底晾干。

(7)将吸附柱放到一个干净的离心管中，向吸附膜中间位置悬空滴加适量的洗脱缓冲液，室温放置2分钟。12000rpm离心1分钟收集DNA溶液。

(8)为了提高DNA的回收量，可将离心得到的溶液重新加回离心吸附柱中，重复步骤7。

把以上两个品种DNA池为模板的PCR纯化产物送上海生物工程有限公司进行双向测序。奶山羊SCD基因目的片段362bp的测序结果如SEQ IDNO.1所示。

对测序峰图进行分析，其中在同一位点有两个不同峰的是发生了单核苷酸突变；位于奶山羊SCD基因的第5001位(SEQ ID NO.1第40位)出现了G、A两种检测结果，即为筛查到的奶山羊SCD基因的SNP多态性，该位点是为G或A的碱基多态性。

b、奶山羊SCD基因G＞A突变多态性的ACRS-PCR检测

由于筛查到的碱基多态性不能被常用的内切酶进行PCR-RFLP来鉴定，所以需要利用经过重新设计的ACRS引物(引入酶切位点的引物)来扩增SCD基因。当奶山羊的SCD基因第5001位发生G＞A突变时，即G突变为A，利用ACRS引物扩增的SCD基因序列catgtg也相应地变成catatg，从而成为NdeI的限制性内切酶识别位点；可直接通过NdeI对目的片段的酶切进行基因分型。

1、ACRS-PCR引物设计

针对SEQ ID NO.1包含的第40位的G＞A突变，利用引入酶切位点在线设计软件(http://helix.wustl.edu/dcaps/dcaps.html)进行设计引物，引入酶切位点的设计与基因克隆PCR引物的对比如图3所示，下游引物保持不变，以包含突变位点的区段作为引入酶切位点引物的上游，具体引物引物设计为：

cctggcagtg ttattctacc at    22；

c为引入错配的碱基，它与突变型“A”形成NdeI内切酶识别序列；

上述引物能够扩增奶山羊SCD基因外显子3及侧翼区的345bp片段，由于上游引物设计使得该片段比克隆测序片段少了17bp。

2、ACRS-PCR反应条件

PCR产物扩增体系和反应条件分别如同表2和表3所述，PCR扩增产物的1.0％琼脂糖凝胶电泳图谱如图4所示，可以看到设计的引物对P能够扩增345bp的片段。

3、PCR扩增产物的NdeI酶切

(1)20μL NdeI酶切反应体系：10μL PCR产物，10×缓冲液(含BSA)2.5～3.0μL，NdeI(10U/μL)为1.0μL，8.0μL灭菌纯水(H₂O)；

(2)酶切消化条件：37℃恒温培养箱中消化5～10h。

(3)NdeI消化PCR产物后琼脂糖凝胶电泳分析

用2.0％的琼脂糖凝胶，120V电压电泳1小时，EB染色检测酶切结果，用Kodak DC 120凝胶成像分析系统照相分析，并判型、记录其基因型；

由于ACRS-PCR扩增的345bp片段中不包含其它的NdeI酶切识别位点，当SCD基因第5001位发生G＞A突变时，PCR扩增的SCD基因产物被限制性内切酶NdeI识别后，在ca/tatg对扩增片段酶切，将扩增片段切为2段；而当SCD基因第5001位没有发生突变，不能形成新的限制性内切酶NdeI酶切识别位点，扩增片段不能被酶切；

由于奶山羊为2倍体动物，所以当发生G＞A的突变时，可形成3种不同的基因型，分别为GG、AG、AA，其ACRS-PCR检测的凝胶结果图如图5所示：

其中，GG基因型为野生型，它的两条DNA链的SNP位点均不能被NdeI酶切，表现为345bp条带；发生突变后的野生型AA的两条链的SNP位点均能被酶切，表现为321bp和24bp条带；杂合子GA的两条链中的一条的SNP位点能够被识别而另一条不能被识别，表现为345bp，321bp和24bp条带；由于24bp较小，故在琼脂糖电泳分析中不可见，但345bp和321bp片段能鉴别GA型和AA型，根据条带的个数和条带的大小，如5所示的凝胶电泳检测结果能够很清楚的判定是否发生了点突变，将三种基因型区分开，从而检测其SNP多态性。

(4)不同基因型个体PCR产物的测序验证

利用ABI 377和ABI 3730测序仪对不同基因型个体PCR产物分别进行正反双向测序；同时，进行SNP位置分析，结果表明包含345bp、321bp和24bp条带的杂合子GA基因型个体其第5001位的测序图的确表示为G或A，如图6b所示，自左向右第5个峰为两个峰；而CC基因型、GG基因型分别为C、G，分别如图6a，图6c所示。

c、奶山羊的SCD基因第5001位的SNP作为分子标记在不同奶山羊群体多态性中的应用

1、群体多态性中的诊断

利用上述的SNP多态性检测方法对萨能奶山羊268份DNA样品、关中奶山羊440份DNA样品，分别进行SNP多态性的鉴定；统计其SNP位点的频率以及与性状的关联情况。

2、SNP位点的频率统计分析

基因型频率是指一个群体中某一性状的某种基因型个体数占总个体数的比率。P_AA＝N_AA/N，其中P_AA代表某一位点的AA基因型频率；N_AA表示群体中具有AA基因型的个体数；N为检测群体的总数量。

基因频率是指一个群体中某一基因数对其等位基因总数的相对比率。计算的公式可以写成：P_A＝(2N_AA+N_Aa1+N_Aa2+......+N_Aan)/2N。式中，P_A表示等位基因A频率，N_AA表示群体中具有AA基因型的个体数量，N_Aai表示群体中具有Aai基因型个体数量，a1-an为等位基因A的n个不同的复等位基因；统计结果见表4。

表4奶山羊SCD基因第5001位SNP基因频率分布表

从表4可以看出：萨能奶山羊和关中奶山羊的G等位基因频率远高于A等位基因，这表明等位基因可能G与泌乳性状相关。

3、基因效应的关联分析

基因型数据：NdeI识别的基因型(GG、GA和AA)

生产数据：体尺数据(体长、体高、胸围)

关联分析模型：

利用SPSS(16.0)软件分析基因位点、公畜、场别效应、年龄和品种效应与生长性状的相关性。先对数据进行描述分析，确定是否存在离群值，再利用最小二乘分析对数据校正；根据数据特征，利用多元线性模型分析基因型效应。模型如下：

y_ijklmn＝μ+Genotype_i+S_j+B_k+F_l+Age_m+Xn+e_ijklmn

其中：y_ijklm为个体表型记录；F_l场别效应；S_j为种公畜效应；B_k：品种效应；Age_m为年龄效应；Xn为各种二级和二级以上互作效应，如：Age×Genotype，S_j×Genotype等；e_ijklmn为随机误差；运用SPSS(16.0)软件对数据进行分析，并用最小二乘法拟合线性模型，对各基因型间体尺指标进行差异显著性检验.

结果表明(见表5)：对于NdeI可识别的第5001位的SNP位点，GG基因型为优势基因型；对于体高，体长和胸围，GG基因型个体的数值均显著高于GA基因型个体，研究表明体尺性状与产奶性状呈正相关，这说明GG基因型可以成为一个提高奶山羊泌乳性状育种速度的分子遗传标记。AA基因型个体由于只有1个所以没有进行关联分析。

表5NdeI多态位点与萨能奶山羊体尺之间的方差分析

注：字母不同表示差异显著(P＜0.05)。

核苷酸序列表

<110>西北农林科技大学

<120>一种奶山羊SCD基因的单核苷酸多态性及其检测方法

<210>1

<211>362

<212>DNA

<213>奶山羊(Capra hircus)

<220>

<221r

<222>(40)

<400>1

gcctgccccc ttcttatcct ggcagtgtta ttctactatr tgatgagtgc cctgggcatc     60

acagcagggg tccatcgcct gtggagtcac cgaacctaca aagctcggct gcccctgcgg    120

gtcttcctga tcatcgccaa caccatggcg ttccaggtga gaagccagct gtgctcagct    180

ctttttctcc tcactcttta tcgatgagcc ggtggtggaa tggaggtgat cggtgcctgg    240

agagggacag cacctggata gccacttcac tttcctctct ccttgtggtt aagttcaggt    300

tcagtcccaa agtccataaa acataaggat acttctgagt gactggcaga ggaaagtagg    360

ag                                                                   362