基于核酸外切酶Ⅰ末端保护分析检测小分子与结合蛋白相互作用的光学生物传感技术

摘要

本发明公开了一种基于单链核酸外切酶I末端保护分析检测小分子与结合蛋白相互作用的光学生物传感技术，它包括(1)末端有机小分子修饰的含有血红素适体序列的寡核苷酸DNA单链与蛋白的相互作用及核酸外切酶I保护分析；(2)末端保护的含有血红素适体序列的寡核苷酸DNA单链的显色与化学发光检测。该方法灵敏度高、操作简便、特异性强，可与目前生物检测中普遍使用的酶标仪联合使用，也可目视检测，可望成为一种用于生物医学中信号转导与分子调控机理研究、食品与农产品安全检测、环境毒物检测、药物筛选的通用技术。

说明书

技术领域

本发明属于一种检测有机小分子与结合蛋白相互作用的光学生物传感技术，包括末端有机小分子修饰的寡核苷酸DNA单链与蛋白的相互作用及核酸外切酶I保护分析。

背景技术

有机小分子与结合蛋白相互作用、药物与化学毒素等有机小分子以及小分子结合蛋白的快速筛查与检测对于临床诊断、医学研究、食品与公共安全、药物筛选、环境监测等领域具有极其重要的意义。目前常用的有机小分子与结合蛋白相互作用的检测技术主要有表面等离子共振、酶互补片断免疫分析以及荧光各向异性分析等。这些检测技术灵敏度不高、可靠性差，且需要精密的仪器，不能满足准确快速检测的需求。

发明内容

本发明要解决的技术问题是，针对现有技术存在的不足，提出一种基于单链核酸外切酶I末端保护分析检测小分子与结合蛋白相互作用的光学生物传感技术，它对DNA序列没有依赖性，只要求该序列包含血红素核酸适体，且该核酸序列具有血红素核酸适体的催化活性即可，从而可利用血红素核酸适体的过氧化物酶催化活性，通过催化显色反应与化学发光响应进行DNA外切酶I处理后保护的寡核苷酸DNA单链的定量检测。

本发明的技术方案是，所述基于单链核酸外切酶I末端保护分析检测小分子与结合蛋白相互作用的光学生物传感技术包括：

(1)末端有机小分子修饰的含有血红素适体序列的寡核苷酸DNA单链与蛋白的相互作用及核酸外切酶I保护分析；

(2)末端保护的含有血红素适体序列的寡核苷酸DNA单链的显色与化学发光检测。

以下对本发明做出进一步说明。

所述末端有机小分子修饰的含有血红素适体序列的寡核苷酸DNA单链与蛋白的相互作用及核酸外切酶I保护分析为：

对于小分子与其结合蛋白的相互作用，检测步骤是：取所述有机小分子修饰含有血红素适体序列的寡核苷酸DNA单链的储备液置于微量管中；再于微量管中加入包含小分子结合蛋白的样品溶液；然后加入核酸外切酶I反应，得末端保护反应的产物；

对于有机小分子的检测，采用竞争反应检测步骤：取所述有机小分子修饰含有血红素适体序列的寡核苷酸DNA单链的储备液置于微量管中；再加入包含待测小分子的样品溶液，混合均匀后加入小分子结合蛋白或单克隆抗体溶液；再加入核酸外切酶I，得末端保护反应的产物。

所述末端保护的含有血红素适体序列的寡核苷酸DNA单链的显色与化学发光检测可以采用以下方法之一：

(1)吸收光度法检测：在所述末端保护反应的产物中加入血红素及2，2’-联氮双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二铵盐，再加入双氧水，用紫外分光光度计测其在300-500nm范围内任意波长处的吸光度值；

(2)化学发光法检测：在所述末端保护反应的产物中加入血红素及鲁米诺，再双氧水，于300-500nm范围内任意波长处记录其化学发光强度。

本发明中，所述包含血红素核酸适体的寡核苷酸DNA单链的末端有机小分子的修饰通过现有的交联反应技术实现。例如，对于带有羧基的有机小分子，可以采用1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳二亚胺与琥珀酰亚胺交联反应技术与3’端NH₂标记的包含血红素核酸适体的寡核苷酸DNA单链进行交联；对于带氨基的有机小分子，可以采用4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯的交联反应技术与与3’端标记有巯基的包含血红素核酸适体的寡核苷酸DNA单链进行交联。交联反应产物可用透析纯化。

进一步地，本发明中，所述末端有机小分子修饰的寡核苷酸DNA单链与蛋白的相互作用及核酸外切酶I保护分析技术是：

a.对于小分子与其结合蛋白的相互作用的检测及核酸外切酶I保护分析的步骤是：取5μL所述有机小分子修饰且包含血红素核酸适体的寡核苷酸DNA单链的储备液置于微量管中，加入12.5μL 2×HEPES缓冲溶液，该缓冲溶液为25mM HEPES，50mM NaCl，50mM KCl，pH 7.0；再加入5μL包含小分子结合蛋白的样品溶液，在37℃恒温反应0.5小时，然后加入0.5μl核酸外切酶I，置于37℃反应5分钟后，升温至80℃反应20分钟进行热灭活以终止酶反应，得核酸外切酶处理后的溶液a；

b.对于有机小分子的检测及核酸外切酶I保护分析采用的竞争反应检测步骤是：取5μL所述有机小分子修饰且包含血红素核酸适体的寡核苷酸DNA单链的储备液置于微量管中，加入12.5μL 2×HEPES缓冲溶液，该缓冲溶液为25mM HEPES，50mM NaCl，50mM KCl，pH 7.0；再加入5μL包含待测小分子的样品溶液，混合均匀后加入一定浓度的小分子的结合蛋白或(鼠源)单克隆抗体3μL，小分子的结合蛋白或(鼠源)单克隆抗体终当量浓度为加入的有机小分子修饰寡核苷酸DNA单链浓度的5倍；在37℃恒温反应0.5小时；然后加入0.5μL核酸外切酶I，置于37℃反应5分钟后，升温至80℃反应20分钟，进行热灭活以终止酶反应，得核酸外切酶处理后的溶液b。

注意，以上反应条件为最优条件，所述溶液体积均可成倍变化不改变最优结果。改变比例或试剂加入顺序可使有机小分子修饰寡核苷酸DNA单链的保护效率在3％～100％内变化。

本发明中，所述末端保护的寡核苷酸DNA单链的显色与化学发光检测可以采用以下方法之一：

(1)吸收光度法检测：在所述核酸外切酶处理后的溶液a或核酸外切酶处理后的溶液b中加入500nM的血红素2μL，室温反应10分钟，随后加入1μL 50mM 2，2’-联氮双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二铵盐(ABTS)，再加入2×HEPES缓冲溶液30μL和灭菌水30μL，并加入1％的双氧水(H₂O₂)2μL，用紫外分光光度计测其在414nm的吸光度值；所述缓冲溶液为25mM HEPES，200mM NaCl，20mM KCl，pH 8.0；注意，以上所述反应条件为最优条件，所述溶液体积均可成倍变化不改变检测灵敏度。改变比例或试剂加入顺序可使灵敏度相对变化在0.1％～100％内变化。

(2)化学发光法检测：在所述核酸外切酶处理后的溶液a或核酸外切酶处理后的溶液b中加入500nM的血红素2μL，室温反应10分钟，随后加入5μL浓度为50μM的鲁米诺，再加入2×HEPES缓冲溶液12.5μL和灭菌水5μL，并加入1％的双氧水(H₂O₂)2μL，于425nm处记录其化学发光强度值并确定最大发光峰值；所述缓冲溶液为25mMHEPES，200mM NaCl，20mM KCl，pH 8.0。注意，以上所述反应条件为最优条件，所述溶液体积均可成倍变化不改变检测灵敏度。改变比例或试剂加入顺序可使灵敏度相对变化在1％～100％内变化。

本发明建立的基于核酸外切酶I端点保护分析检测有机小分子与结合蛋白相互作用的光学生物传感技术，利用血红素核酸适体的过氧化物酶催化活性，通过催化显色反应与化学发光响应进行DNA外切酶I处理后保护的寡核苷酸DNA单链的定量检测；该技术也可直接用于小分子结合蛋白的检测，也可通过样品溶液中小分子与小分子标记的寡核苷酸DNA单链竞争与抗体结合间接检测有机小分子。它灵敏度高，操作快速简便，可望为临床诊断、药物研发、药毒物分析、环境监测等提供一个通用技术平台。

具体实施方式：

实施例1：基于核酸外切酶I末端保护分析检测莱克多巴胺

1)3’端NH₂标记的寡核苷酸DNA单链和莱克多巴胺的交联：

称取34mg的盐酸莱克多巴胺及12mg琥珀酸酐溶于2ml吡啶，室温下反应24h，用薄层色谱跟踪反应(展开剂：90％的二氯甲烷，10％的含10％氨水的甲醇)，产物经旋转蒸发仪蒸干。称取产物10.6mg溶于2.5mL磷酸盐缓冲溶液(0.1M NaH2PO4，pH 7.4)，再加入1mg的1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳二亚胺(EDC)，在室温下搅拌15min，再加入2.8mg琥珀酰亚胺(NHS)，在室温反应30min。取260μl活化后的生物素溶液加入到260μL浓度为1μM的3’端NH2标记包含血红素核酸适体的寡核苷酸DNA单链(序列为GGGTAGGGCGGGTTGGGTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT)的溶液中，用1M的NaOH调其pH为7.4，在轻微搅拌下室温反应2h。反应后在混合液中加入3.6mg盐酸羟胺终止反应。

把交联反应产物移到1mL的透析管中，透析管的截留分子量为6000D。把透析管放入500ml磷酸盐缓冲溶液(0.1M NaH2PO4，pH 7.4)中在4℃透析12h，每隔3h更换一次透析液，最后一次用超纯水透析。透析之后的寡核苷酸DNA单链分管保存于-20℃的冰箱中备用。上述的-20℃保存的寡核苷酸DNA单链用灭菌水稀释10倍并保存于4℃冰箱中作为次级储备液备用。

2)莱克多巴胺的检测：

取5μl上述莱克多巴胺标记的寡核苷酸DNA单链次级储备液于微量管中，使最终DNA寡核苷酸链的浓度为400nM，加入2×HEPES缓冲溶液(25mM HEPES，50mM NaCl，50mM KCl，pH 7.0)12.5μL，再加入5μL待检测的莱克多巴胺样品溶液，混合均匀后加入2.5μL浓度为2000nM的莱克多巴胺鼠源单克隆抗体，室温反应45min，反应后加入1μL核酸外切酶I(NEB公司产品)在37℃酶切5min后，升温至80℃反应20min进行热灭活以终止酶反应。

在上述核酸外切酶处理后的溶液中加入500nM的血红素2μL，室温反应10min，随后加入1μL 50mM 2，2’-联氮双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二铵盐(ABTS)，再加入2×HEPES缓冲溶液(25mM HEPES，200mM NaCl，20mM KCl，pH 8.0)30μL和灭菌水30μL，迅速加入1％的双氧水(H₂O₂)2μL，用紫外分光光度计测其在414nm的吸光度值。

按上述1)、2)步骤对6个配制的莱克多巴胺标准溶液(浓度从10^-10M到10^-5M每隔一个数量级一个)进行检测，记录各标准溶液样品的吸光度值，用吸光度值对标准溶液中莱克多巴胺浓度作图获得标准曲线。

实施例2：基于核酸外切酶端点保护分析检测叶酸结合蛋白

1)3’端NH₂标记的寡核苷酸DNA单链和叶酸的交联：

称取10mg的叶酸溶于2.5mL磷酸盐缓冲溶液(0.1M NaH₂PO4，pH 7.4)，再加入1mg的1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳二亚胺(EDC)，在室温下搅拌15min，再加入2.8mg琥珀酰亚胺(NHS)，在室温反应30min。取260μl活化后的叶酸溶液加入到260μl浓度为10μM的3’端NH₂标记的寡核苷酸DNA单链(序列为GGGTAGGGCGGGTTGGGTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT)的溶液中，用1M的NaOH调其pH为7.4，在轻微搅拌下室温反应2h。反应后在混合液中加入3.6mg盐酸羟胺终止反应。

把交联反应产物移到1mL的透析管中，透析管的截留分子量为6000D。把透析管放入500mi磷酸盐缓冲溶液(0.1M NaH₂PO4，pH 7.4)中在4℃透析12h，每隔3h更换一次透析液，最后一次用超纯水透析。透析之后的寡核苷酸DNA单链分管保存于-20℃的冰箱中备用。上述的-20℃保存的寡核苷酸DNA单链用灭菌水稀释10倍并保存于4℃冰箱中作为次级储备液备用。以上所有的反应均在遮光的条件下进行。

2)叶酸结合蛋白的检测：

取7.5μl上述叶酸标记的寡核苷酸DNA单链次级储备液于微量管中，使最终DNA寡核苷酸链的浓度为100nM，加入2×HEPES缓冲溶液(25mM HEPES，50mM NaCl，50mM KCl，pH 7.0)12.5μL，再加入5μL待检测的叶酸结合蛋白样品溶液，室温反应45min，反应后加入0.5μL核酸外切酶I(NEB公司产品)在37℃酶切5min后，升温至80℃反应20min进行热灭活以终止酶反应。

在上述核酸外切酶处理后的溶液中加入500nM的血红素2μL，室温反应10min，随后加入5μL浓度为50μM的鲁米诺，再加入2×HEPES缓冲溶液(25mM HEPES，200mMNaCl，20mM KCl，pH 8.0)12.5μL和灭菌水5μL，迅速加入1％的双氧水(H₂O₂)2μL，于425nm处记录其化学发光强度值并确定最大发光峰值。

按上述1)、2)步骤对7个配制的叶酸结合蛋白标准溶液(浓度从10^-15M到10^-9M每隔一个数量级一个)进行检测，记录各标准溶液样品的化学发光峰值，用化学发光峰值对标准溶液中叶酸结合蛋白浓度作图获得标准曲线。