一种利用新微生物菌株降解土壤中多环芳烃芘的方法

摘要

本发明公开了一种利用新微生物菌株降解土壤中多环芳烃芘的方法，属于微生物应用技术领域。本发明从土壤中筛选到一株具降解多环芳烃的恶臭假单孢菌新菌株PL2，CCTCC No.M 207114；进而提出利用该菌株降解土壤中多环芳烃芘的方法，包括培养基的配制；菌种的活化培养；菌种发酵培养及土壤接菌种与降解及土壤样品多环芳烃芘残留量的测定等步骤。该方法在较佳工艺条件下，仅3－10天时间，对多环芳烃(芘)的降解率可达到50％～70％，具有快速、高效、简单、实用等特点。可在受多环芳烃污染土壤地区的降解处理中推广应用。

说明书

技术领域

本发明涉及微生物应用技术领域，尤其涉及一种利用新的微生物菌株，降解被多环芳烃污染土壤的方法。

背景技术

多环芳烃(Polycyclic aromatic hydrocarbons，PAHs)是2个或2个以上的芳香环稠合在一起的一类惰性较强、性质稳定的化合物，是迄今为止人类已知最大的一类化学致癌物，美国环保局已把16种多环芳烃列入优先控制的有毒有机污染物的黑名单中。石油、煤、木材等的燃烧过程和石油、石油化工的生产过程及海上石油开发与石油运输中的溢油等均会造成环境中PAHs的污染，这些PAHs通过废水灌溉、大气降尘等多种途径又进一步导致对土壤的污染。其中，PAHs中的芘(Pyr)在土壤中占有较大的比重，同时其分子量较大，具有遗传毒性，故已被US EPA优先控制。

中国东南沿海长江三角洲南翼，交通比较发达，且存在很多冶炼、废旧电器拆卸、建材和造纸等方面的私营和乡镇企业，工业能源以煤炭为主；同时由于农村炊事、燃料结构已发生明显改变，导致露天燃烧农作物秸秆的现象十分普遍；某些区域甚至还存在进口电子洋垃圾如电力容器，废旧电器的大规模拆卸或焚烧现象，上述情况已导致浙江省某些地区土壤中PAHs等持久性有机污染物含量大量增加。土壤中的多环芳烃可以通过接触直接进入人体，或在一定条件下进入大气、水和生物等其他环境介质，危及人类的健康。有调查表明，浙江某地电子垃圾焚烧严重区域，土壤PAHs污染严重，该区癌症发病率较高，因此，土壤PAHs污染问题已不容忽视。为降低PAHs引起的生态环境恶化和对人体健康的危害，如何去除土壤中PAHs污染(污染土壤的修复)已是丞待解决的关键问题。

与物理和化学修复相比，生物修复具有经济性强、二次污染少，去除效率高等显著优点，是迄今为止处理烃类污染水体和土壤效果最好的一种方法，具有广阔的应用前景。其中有关利用微生物降解PAHs的报道已有不少，但目前已知的菌株对PAHs的降解速度及效能不甚理想(周乐等，一株高效菲降解菌的筛选及降解条件研究.应用生态学报，2005，16，2399～2402.)，但通过对多环芳烃降解菌株基因工程的构建和改造，可以加速对PAHs的转化。

多环芳烃理化性质不同，反映出的生物降解性也各不相同。一般说来，PAHs降解性随苯环数量增加而降低。目前，虽已筛选到许多对低环数PAHs的降解菌，其中，细菌如：气单胞菌属(Aeromonas)、芽胞杆菌属(Bacillus)、棒状杆菌属(Corynebacterium)、黄杆菌属(Flavobacteria)、微球杆菌属(Micrococcus)、假单胞菌属(Pseudomonas)、红球菌属(Rhodococcus)等；真菌如：镰刀菌(fusarium sp.)、青霉菌(penicillium sp.)、毛霉菌(mucor sp.)等；但上述菌对比较稳定的四环和多环PAHs的可溶性较差，难以达到好的降解效果(Tabak H.H.et al.Biodegradability of benzidine in aerobic suspendedgrowth reactors.Journal of the Water Pollution Control Federation.1981，53，1503-1518)；另外，虽已有少数能降解四环PAHs并一起作为唯一碳源和能源的细菌，如红球菌(Rhodococcus sp.)、微动假单胞菌(Pseudomonaspaucimobilis)和脱氮产碱菌(Alcaligenes denitrificans)，但它们的降解效果也不理想(Boonchan S.et al.Degradation and Mineralization ofHigh-Molecular-Weight Polycyclic Aromatic Hydrocarbons by DefinedFungal-Bacterial Cocultures.Applied and Environmental Microbiology，2000，66，1007～1019.)。

发明内容

本发明目的是，针对目前已有菌株对PAHs的降解，尤其是对四环和多环PAHs的降解速度及效能不甚理想的不足，提供一种降解四环多环芳烃芘效能较高的新微生物菌株；其次是提供一套利用该菌株快速、高效降解污染土壤中四环多环芳烃芘的方法。

以下是本发明技术方案的详细描述。

微生物菌株的筛选与鉴定：

本发明从浙江省杭州市某汽车修理站附近取土样5份，水样2份，一共7份样品，取完后在12h之内迅速筛选菌种，筛选的具体方法是：将样品在富集培养基中富集培养24h后，再涂布于筛选培养基平板上；经过平板筛选，共分离获得6株可降解多环芳烃的菌株；经进一步复筛，最终得目标菌株PL2。

本发明筛选得到的菌株PL2，按《常见细菌系统鉴定手册》以及《伯杰氏细菌鉴定手册(第八版)》的生理生化鉴定，菌株的形态为短杆状，宽017μm-110μm，长119μm-310μm，无芽孢，革兰氏阴性，有亚极生鞭毛，在LB平板、血平板上30℃培养24h，菌落呈圆形光滑状、湿润、不透明、边缘整齐、白色、易挑取，在LB液体培养基中呈混浊，不形成菌膜。

16S rDNA序列分析：以提取到的细胞总DNA为模板，利用引物：p16S-8：5’-aga gtt tga tcc tgg ctc ag-3’和p16S-1541：5’-aag gag gtg atc cagccg ca-3’扩增菌株的16S rDNA基因，将基因产物同T载体连接，经测序确认该片段实际长度为1476bp，将该序列(已提交GenBank，GenBank登记号为FJ204928)与GenBank中相关数据进行相似性分析发现，该菌与恶臭假单孢菌(Pseudomonas putida)的同源性最高(homology，99％/1476bps，based on 16SrDNA)。

经上述生理生化鉴定结合分子鉴定，可确认该菌株PL2为恶臭假单孢菌(Pseudomonas putida)。

生物样品材料保藏：恶臭假单孢菌(Pseudomonas putida)菌株PL2已于2007年7月25日保存在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC No.M207114。

根据以上微生物学特征鉴定，该新菌株PL2属于恶臭假单孢菌(Pseudomonasputida)，该株微生物不属于现己公开专利菌种的任何一种，该株微生物具有降解多环芳烃芘的能力，可以用于土壤中多环芳烃的降解。

一种利用新微生物菌株降解土壤中多环芳烃芘的方法，该方法按以下步骤进行：

(1)培养基的配制：该培养基的组分与各组分的重量百分比含量为：蔗糖0.5％-8％，酵母粉0.1％-2.0％，(NH₄)₂SO₄ 0.1％-0.5％，K₂HPO₄ 0.1％-1.5％，NaCl 0.1％-1.5％，MgSO₄ 0.01％-0.1％，CaCO₃ 0.1％-0.5％，以自来水补足至100％，pH值4.0-8.0，经灭菌后，备用；

(2)菌种的活化培养：采用步骤(1)培养基，将恶臭假单孢菌(Pseudomonasputida)新菌株PL2CCTCC No.M 207114，活化、培养后，得到菌液，备用；

(3)菌种发酵培养：将步骤(2)菌液按体积5％接种量接入步骤(1)培养基中；在20℃-40℃，初始pH 4.0-8.0，振荡条件下培养24h-72h，至菌体对数生长期后，进行离心分离，得到菌体；

(4)土壤样品接菌种与降解：将步骤(3)菌体与含多环芳烃芘的土壤样品按重量10-50∶100的比例，混合，利用菌体降解3-10d；

(5)土壤样品多环芳烃芘残留量的测定：采用高效液相色谱方法对步骤(4)经菌体降解后的土壤样品进行多环芳烃芘残留量的测定；土壤样品5.00g加入20.00mL二氯甲烷，40℃以下超声提取2h，离心，吸取上清液10.00mL加入茄形瓶，旋转蒸干，再加入2.00mL环己烷溶解，吸取0.50mL上硅胶柱，用正己烷/二氯甲烷混合液(v/v＝1∶1)洗脱，弃去第一组分1.00mL，收集第二组分2.00mL，用纯氮吹干，乙腈定容，进行高效液相色谱分析：分析用流动相为乙腈与水按体积80∶20的混合液，流速为1.0ml/min，分离柱为PAH分配色谱柱，柱温为30℃，进样量5.0μL，激发波长为250nm、发射波长为385nm下对样品进行测定，其中，芘出峰时间为7.40min，可测定出样品中芘的含量，并计算出菌种对多环芳烃芘的降解率。

所述的方法，其中所述培养基的组分与各组分的重量百分比含量为：蔗糖0.5％，酵母粉2％，(NH₄)₂SO₄0.1％，K₂HPO₄1％，NaCl 1.5％，MgSO₄0.02％，CaCO₃0.2％，自来水94.68％，pH值7。

所述的方法，其中所述培养条件为：温度25℃，初始pH为7.0，在搅拌、通风、振荡条件下培养48h。

本发明的有益效果是：

一、本发明从微生物群中筛选得到可降解多环芳烃芘的恶臭假单孢菌株PL2：CCTCC No.M 207114，其在适合条件下，能有效降解多环芳烃芘。

二、本发明将恶臭假单孢菌菌株PL2用于土壤中多环芳烃芘的降解实验，结果表明，该菌可有效降解土壤中的多环芳烃芘，10天内芘最高降解率达到70％(见实施例3、4、5、6)，因此该菌在降解土壤中多环芳烃芘的领域中具有较广泛的应用前景。

具体实施方案

通过下面实施例旨在对本发明作进一步的详细说明，而不是限制本发明的范围。以下实施例中采用的：

微生物：为恶臭假单孢菌(Pseudomonas putida)菌株PL2CCTCC No.M207114；

多环芳烃芘：美国SUPELCO公司，纯度为92.2％

实施例1：(新菌株PL2的筛选)

本发明从浙江省杭州市某汽车修理站附近取得土样5份，水样2份，共7份样品后，在12h之内迅速从中筛选菌种；筛选的具体方法是：先将样品在富集培养基中富集培养24h后，涂布在含多环芳烃芘的筛选培养基平板上；经过平板筛选，共分离获得6株可降解多环芳烃的菌株；将该6株菌株先分别按5％接种量投入发酵培养基培养24h后，再向培养基中加入终浓度为50mg/L的多环芳烃芘，并继续培养3天后，分别测定多环芳烃芘的降解率，从中筛选出降解能力最强的菌株PL2，作为进一步研究的出发菌株；

所述富集培养基配方为：蔗糖0.5％，酵母粉2％，(NH₄)₂SO₄0.1％，K₂HPO₄1％，NaCl 1.5％，MgSO₄0.02％，CaCO₃0.2％，自来水94.68％，pH值7；

所述筛选培养基为：蔗糖0.5％，酵母粉2％，(NH₄)₂SO₄0.1％，K₂HPO₄1％，NaCl1.5％，MgSO₄0.02％，CaCO₃0.2％，多环芳烃芘0.5％，自来水94.18％，pH值7；

所述发酵培养基配方为：蔗糖0.5％，酵母粉2％，(NH₄)₂SO₄0.1％，K₂HPO₄1％，NaCl 1.5％，MgSO₄0.02％，CaCO₃0.2％，自来水94.68％，pH值7。

实施例2：(新菌株PL2的鉴定)

对实施例1筛选得到的菌株PL2按《伯杰氏细菌鉴定手册(第八版)》，以及《常见细菌系统鉴定手册》进行生理生化特性鉴定(见表1)：

该菌株的形态为短杆状，宽017μm-110μm，长119μm-310μm，无芽孢，革兰氏阴性，有亚极生鞭毛，在LB平板、血平板上30℃培养24h，菌落呈圆形光滑状、湿润、不透明、边缘整齐、白色、易挑取，在LB液体培养基中呈混浊，不形成菌膜；在上述基础上，进一步将菌株PL2按精编分子生物学实验指南方法提取染色体DNA，以提取到的细胞总DNA为模板，利用引物：p16S-8：5’-aga gtt tga tcc tgg ctc ag-3’和p16S-1541：5’-aag gag gtg atc cagccg ca-3’扩增菌株的16S rDNA基因，将基因产物同T载体连接后，委托大连宝生物科技公司对该菌16S rDNA扩增及测序，得到该菌株的16S rDNA序列后，在NCBI网站上用BLAST检索GenBank中相关菌株的16S rRNA基因序列，并进行同源性比对；基于形态、生理生化特征和16S rDNA序列及系统发育学分析等方面的鉴定，将菌株PL2鉴定为假单孢菌，拟命名为恶臭假单孢菌(Pseudomonas putida)PL2，此株菌已于2007年7月25日保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC No.M 207114。

菌株PL2 CCTCC No.M 207114的16S rDNA序列：

SEQ：1476bp

Composition  372 A；330 C；465 G；309  T；

Percentage： 25％A；22％C；32％G；21％ T；

1   CTAACACATG CAAGTCGAGC GGATGACGGG AGCTTGCTCC TTGATTCAGC GGCGGACGGG

61  TGAGTAATGC CTAGGAATCT GCCTGGTAGT GGGGGACAAC GTTTCGAAAG GAACGCTAAT

121 ACCGCATACG TCCTACGGGA GAAAGCAGGG GACCTTCGGG CCTTGCGCTA TCAGATGAGC

181 CTAGGTCGGA TTAGCTAGTT GGTGGGGTAA TGGCTCACCA AGGCGACGAT CCGTAACTGG

241 TCTGAGAGGA TGATCAGTCA CACTGGAACT GAGACACGGT CCAGACTCCT ACGGGAGGCA

301 GCAGTGGGGA ATATTGGACA ATGGGCGAAA GCCTGATCCA GCCATGCCGC GTGTGTGAAG

361 AAGGTCTTCG GATTGTAAAG CACTTTAAGT TGGGAGGAAG GGCAGTAAGT TAATACCTTG

421 CTGTTTTGAC GTTACCGACA GAATAAGCAC CGGCTAACTC TGTGCCAGCA GCCGCGGTAA

481 TACAGAGGGT GCAAGCGTTA ATCGGAATTA CTGGGCGTAA AGCGCGCGTA GGTGGTTTGT

541 TAAGTTGGAT GTGAAAGCCC CGGGCTCAAC CTGGGAACTG CATCCAAAAC TGGCAAGCTA

601 GAGTACGGTA GAGGGTGGTG GAATTTCCTG TGTAGCGGTG AAATGCGTAG ATATAGGAAG

661 GAACACCAGT GGCGAAGGCG ACCACCTGGA CTGATACTGA CACTGAGGTG CGAAAGCGTG

721 GGGAGCAAAC AGGATTAGAT ACCCTGGTAG TCCACGCCGT AAACGATGTC AACTAGCCGT

781 TGGAATCCTT GAGATTTTAG TGGCGCAGCT AACGCATTAA GTTGACCGCC TGGGGAGTAC

841 GGCCGCAAGG TTAAAACTCA AATGAATTGA CGGGGGCCCG CACAAGCGGT GGAGCATGTG

901 GTTTAATTCG AAGCAACGCG AAGAACCTTA CCAGGCCTTG ACATGCAGAG AACTTTCCAG

961 AGATGGATTG GTGCCTTCGG GAACTCTGAC ACAGGTGCTG CATGGCTGTC GTCAGCTCGT

1021 GTCGTGAGAT GTTGGGTTAA GTCCCGTAAC GAGCGCAACC CTTGTCCTTA GTTACCAGCA

1081 CGTTATGGTG GGCACTCTAA GGAGACTGCC GGTGACAAAC CGGAGGAAGG TGGGGATGAC

1141 GTCAAGTCAT CATGGCCCTT ACGGCCTGGG CTACACACGT GCTACAATGG TCGGTACAGA

1201 GGGTTGCCAA GCCGCGAGGT GGAGCTAATC TCACAAAACC GATCGTAGTC CGGATCGCAG

1261 TCTGCAACTC GACTGCGTGA AGTCGGAATC GCTAGTAATC GCGAATCAGA ATGTCGCGGT

1321 GAATACGTTC CCGGGCCTTG TACACACCGC CCGTCACACC ATGGGAGTGG GTTGCACCAG

1381 AAGTAGCTAG TCTAACCTTC GGGAGGACGG TTACCACGGT GTGATTCATG ACTGGGGTGA

1441 AGTCGTAACA AGGTAGCCGT AGGGGAACCT GCGCTG

表1菌株PL2与假单胞菌属部分成员生理生化特性的鉴定对照

注：+90％以上阳性，-90％以上阴性，d  10％-89％为阳性

实施例3：(利用菌株PL2降解土壤中多环芳烃芘的方法1)

按以下步骤进行：

(1)培养基的配制：该培养基的组分与各组分的重量百分比含量为：蔗糖0.5％，酵母粉2％，(NH₄)₂SO₄0.1％，K₂HPO₄1％，NaCl 1.5％，MgSO₄0.02％，CaCO₃0.2％，自来水94.68％，pH值7。

(2)菌种的活化培养：采用步骤(1)培养基，将恶臭假单孢菌(Pseudomonasputida)新菌株PL2 CCTCC No.M 207114，活化、培养后，得到菌液，备用；

(3)菌种的发酵培养：将步骤(2)菌液按5％接种量(v/v)接入步骤(1)培养基中，在培养条件25℃，在200r/min下培养48h，至菌体对数生长期后，进行离心分离，得到菌体；

(4)土壤样品接菌种与降解：将步骤(3)得到的菌体按重量10％的比例加入含有10μg/g芘的土壤样品中，利用菌体分解10d；另设含有10μg/g芘的土壤样品不接菌体为对照；

(5)土壤样品多环芳烃芘残留量的测定：采用高效液相色谱方法对步骤(4)后的土壤样品进行多环芳烃残留量的分析，土壤样品5.00g加入20.00mL二氯甲烷，40℃以下超声提取2h，离心，吸取上清液10.00mL入茄形瓶，旋转蒸干，加入2.00mL环己烷溶解，吸取0.50mL上硅胶柱，用正己烷/二氯甲烷混合液(v/v＝1∶1)洗脱，弃去第一组分1.00mL，收集第二组分2.00mL，用纯氮吹干，乙腈定容，进行高效液相色谱分析：分析用流动相为乙腈与水按体积80∶20的混合液，流速为1.0ml/min，分离柱为PAH分配色谱柱，柱温为30℃，进样量5.0μL，激发波长为250nm、发射波长为385nm下对样品进行检测，芘出峰时间为7.40min，经测定对照土壤样品中芘含量为9.986μg/g，接种土壤样品中芘残留量为2.991μg/g，按菌种降解率(％)＝(未接种的土壤芘含量-接种土壤芘含量)/未接种的土壤芘含量*100的公式计算，该菌种对芘的降解率为70.0％。

实施例4：(利用菌株PL2降解土壤中多环芳烃芘的方法2)

(1)培养基的配制：该培养基的组分与各组分的重量百分比含量为：蔗糖7％，酵母粉1％，(NH₄)₂SO₄0.25％，K₂HPO₄1.5％，NaCl 0.1％，MgSO₄0.05％，CaCO₃0.4％，自来水89.7％，pH 8，经灭菌后，备用；

(2)菌种的活化培养：同实施例3；

(3)菌种接种与发酵培养：将步骤(2)菌液采用斜面接入步骤(1)培养基中，接种量为5％(v/v)，在30℃，200r/min培养条件下，培养72h，离心分离获得菌体；

(4)土壤样品的接种与降解：将步骤(3)得到的菌体以重量30％的比例加入含有10μg/g芘的土壤样品中，利用菌体分解7d；另设含有10μg/g芘的土壤样品不接菌体为对照；

(5)土壤样品多环芳烃芘残留量的测定：测定方法同实施例3；经测定对照土壤样品中芘含量为9.987μg/g，接菌种土壤样品中芘残留量为3.524μg/g，经计算，确定菌种对芘降解率为64.7％。

实施例5：(利用菌株PL2降解土壤中多环芳烃芘的方法3)

(1)培养基的配制：该培养基的组分与各组分的重量百分比含量为：蔗糖3.5％，酵母粉0.1％，(NH₄)₂SO₄ 0.5％，K₂HPO₄ 0.1％，NaCl 0.8％，MgSO₄ 0.1％，CaCO₃0.5％，自来水94.4％，pH值5，经灭菌后，备用；

(2)菌种的活化培养：同实施例3；

(3)菌种接种与发酵培养：将步骤(2)菌液采用斜面接入步骤(1)培养基中，接种量为5％(v/v)，在35℃，200r/min培养条件下，培养24h，离心分离获得菌体；

(4)土壤样品的接种与降解：将步骤(3)得到的菌体以重量50％的比例加入含有10μg/g芘的土壤样品中，利用菌体分解3d；另设含有10μg/g芘的土壤样品不接菌体为对照；

(5)土壤样品多环芳烃芘残留量的测定：测定方法同实施例3；经测定对照土壤样品中芘含量为9.983μg/g，接种土壤样品中芘残留量为4.988μg/g，经计算，确定菌种对芘降解率为50.0％。

实施例6：(菌株PL2对多环芳烃芘底物浓度为50mg/L降解效果的测定)

(1)培养基的配制：培养基配方为：蔗糖0.5％，酵母粉2％，(NH₄)₂SO₄ 0.1％，K₂HPO₄ 1％，NaCl 1.5％，MgSO₄ 0.02％，CaCO₃ 0.2％，自来水94.68％，pH值7，灭菌冷却至室温后，添加经过滤除菌后的多环芳烃芘，至终浓度为50mg/L，备用；

(2)菌种的活化培养：取100mL上述培养基，平均分装在2个250ml三角瓶中，灭菌；分别接入斜面菌种CCTCC No.M 207114，培养菌体，摇床转速150r/min，在30℃摇床培养24h作为种子液，备用；

(3)菌种发酵培养与多环芳烃芘降解：取步骤(1)1L培养基，平均分装入20个500mL摇瓶中，灭菌；接入步骤(2)种子液，接种量为1.5％(v/v)，进行培养，培养温度为28℃，摇床转速200r/min；培养8d后，向培养基中添加芘终浓度为50mg/L，继续培养3d；另设含有50mg/L芘的发酵液不接菌体为对照；

(4)发酵液中多环芳烃芘残留量的测定：从步骤(3)20个摇瓶中分别取20mL发酵液按以下方法进行测定：12000rpm，离心10min去除细胞，吸取上清液10.00mL入茄形瓶，用环己烷(20ml*3)萃取上清液，萃取液浓缩近干、乙腈定容10ml，再稀释10倍后进行高效液相色谱分析：分析用流动相为乙腈与水的混合液，比例为80∶20，流速为1.0mL/min，分离柱为PAH分配色谱柱，柱温为30℃，进样量5.0μL，激发波长为250nm、发射波长为385nm下对样品进行检测(芘出峰时间为7.40min)，测定样品中多环芳烃芘的残留量，并计算降解率，经测定未接种发酵液中芘含量为49.787mg/L，接种发酵液中芘残留量为20.129mg/L，经计算，确定菌种对芘降解率为59.6％。

序列表

<110>浙江省农业科学院

<120>一种利用新微生物菌株降解土壤中多环芳烃芘的方法

<160>1

<210>1

<211>1476

<212>DNA

<213>来源于恶臭假单孢菌(Pseudomonas putida)

<400>1

1    CTAACACATG CAAGTCGAGC GGATGACGGG AGCTTGCTCC TTGATTCAGC GGCGGACGGG

61   TGAGTAATGC CTAGGAATCT GCCTGGTAGT GGGGGACAAC GTTTCGAAAG GAACGCTAAT

121  ACCGCATACG TCCTACGGGA GAAAGCAGGG GACCTTCGGG CCTTGCGCTA TCAGATGAGC

181  CTAGGTCGGA TTAGCTAGTT GGTGGGGTAA TGGCTCACCA AGGCGACGAT CCGTAACTGG

241  TCTGAGAGGA TGATCAGTCA CACTGGAACT GAGACACGGT CCAGACTCCT ACGGGAGGCA

301  GCAGTGGGGA ATATTGGACA ATGGGCGAAA GCCTGATCCA GCCATGCCGC GTGTGTGAAG

361  AAGGTCTTCG GATTGTAAAG CACTTTAAGT TGGGAGGAAG GGCAGTAAGT TAATACCTTG

421  CTGTTTTGAC GTTACCGACA GAATAAGCAC CGGCTAACTC TGTGCCAGCA GCCGCGGTAA

481  TACAGAGGGT GCAAGCGTTA ATCGGAATTA CTGGGCGTAA AGCGCGCGTA GGTGGTTTGT

541  TAAGTTGGAT GTGAAAGCCC CGGGCTCAAC CTGGGAACTG CATCCAAAAC TGGCAAGCTA

601  GAGTACGGTA GAGGGTGGTG GAATTTCCTG TGTAGCGGTG AAATGCGTAG ATATAGGAAG

661  GAACACCAGT GGCGAAGGCG ACCACCTGGA CTGATACTGA CACTGAGGTG CGAAAGCGTG

721  GGGAGCAAAC AGGATTAGAT ACCCTGGTAG TCCACGCCGT AAACGATGTC AACTAGCCGT

781  TGGAATCCTT GAGATTTTAG TGGCGCAGCT AACGCATTAA GTTGACCGCC TGGGGAGTAC

841  GGCCGCAAGG TTAAAACTCA AATGAATTGA CGGGGGCCCG CACAAGCGGT GGAGCATGTG

901  GTTTAATTCG AAGCAACGCG AAGAACCTTA CCAGGCCTTG ACATGCAGAG AACTTTCCAG

961  AGATGGATTG GTGCCTTCGG GAACTCTGAC ACAGGTGCTG CATGGCTGTC GTCAGCTCGT

1021 GTCGTGAGAT GTTGGGTTAA GTCCCGTAAC GAGCGCAACC CTTGTCCTTA GTTACCAGCA

1081 CGTTATGGTG GGCACTCTAA GGAGACTGCC GGTGACAAAC CGGAGGAAGG TGGGGATGAC

1141 GTCAAGTCAT CATGGCCCTT ACGGCCTGGG CTACACACGT GCTACAATGG TCGGTACAGA

1201 GGGTTGCCAA GCCGCGAGGT GGAGCTAATC TCACAAAACC GATCGTAGTC CGGATCGCAG

1261 TCTGCAACTC GACTGCGTGA AGTCGGAATC GCTAGTAATC GCGAATCAGA ATGTCGCGGT

1321 GAATACGTTC CCGGGCCTTG TACACACCGC CCGTCACACC ATGGGAGTGG GTTGCACCAG

1381 AAGTAGCTAG TCTAACCTTC GGGAGGACGG TTACCACGGT GTGATTCATG ACTGGGGTGA

1441 AGTCGTAACA AGGTAGCCGT AGGGGAACCT GCGCTG