寡糖刺激β－内啡肽产生的应用

摘要

本发明涉及至少一种寡糖或一种包含相同物质的植物提取物作为化妆品或皮肤病制剂，尤其是用于刺激皮肤中β－内啡肽产生的化妆品或皮肤病制剂的应用，所述寡糖包含2－6个糖和包含至少2个半乳糖单元，优选2个连位的糖链末端的半乳糖基元。本发明能够对敏感皮肤提供护理，尤其能抗皮肤敏感性，不适反应，能提供一种健康的感觉，和能产生一种局部止痛作用。

说明书

本申请是01812430.5(申请日2001年7月5日，题目：寡糖刺激β- 内啡肽产生的应用)的分案申请。

本发明基本上涉及含有至少两个半乳糖单元的寡糖或含有它们的植物 提取物作为化妆品或皮肤病制剂的应用。

本发明基本上涉及含有至少两个半乳糖单元的寡糖或含有它们的植物 提取物作为化妆品或皮肤病制剂的应用，还涉及将它们应用于美容护理的 方法。更具体地，本发明涉及寡糖或包含它们的植物提取物作为化妆品制 剂或制造药物组合物，尤其是皮肤病组合物的应用，所述寡糖包含2-6个 糖并含有至少两个半乳糖单元，优选两个连位半乳糖单元和更优选两个连 位半乳糖单元位于糖链的末端，所述皮肤病组合物显著地刺激皮肤中β- 内啡肽的产生和优选刺激皮肤角质细胞产生β-内啡肽，还涉及一种将它 们应用于美容护理或治疗的方法。下述物质为特别提及的包含至少两个 连位半乳糖单元的寡糖：D-水苏糖，其通常更多称为水苏糖或称为O-α-D- 吡喃半乳糖基-[1→6]-O-α-D-吡喃半乳糖基-[1→6]-β-D-呋喃果糖 基-α-D-吡喃葡萄糖苷，经验化学式C₂₄H₄₂O₂₁，并且是市场上可购买的，或 鹰嘴豆醇(ciceritol)，或O-α-D-吡喃半乳糖基-[1→6]-O-α-D-吡 喃半乳糖基-[1→2]-4-O-甲基-D-chiroinositol，经验化学式C₁₉H₃₄O₁₆。

这些寡糖可从植物，尤其是灰叶属植物和尤其是灰毛豆(Tephrosia purpurea)中分离得到。这些寡糖还可从大豆、鹰嘴豆、羽扇豆属植物 或小扁豆中分离得到。

文件FR-2708198B已经描述了灰叶属尤其是灰毛豆提取物用于制备化 妆品或药物组合物，尤其是皮肤病组合物的应用，以及基于意外的发现将 其用于美容治疗的方法，所述意外的发现为这种提取物对腺苷酸环化酶具 有有效的刺激活性。

在本发明中，目前已完全意外地发现，，某些寡糖或包含它们的植物 提取物，特别是灰叶属植物和尤其是灰毛豆的提取物能刺激皮肤中β-内 啡肽的产生和显著刺激皮肤角质细胞产生β-内啡肽，所述寡糖包含2-6 个糖并含有至少两个半乳糖单元，优选两个连位半乳糖单元和更优选两个 连位半乳糖单元位于糖链的末端。

因此，本发明的一个主要目的是解决一个新技术问题，即提供一种获 得新的化妆品或皮肤病制剂或新的化妆品或皮肤病组合物的溶液，其能刺 激皮肤中β-内啡肽的产生和显著刺激皮肤角质细胞产生β-内啡肽。

本发明的另一个主要目的是解决一个新技术问题，即提供一种获得新 的化妆品或皮肤病制剂，或药物组合物，尤其是皮肤病组合物的溶液，其 能够呵护敏感性皮肤，克服皮肤过敏及不适反应，令皮肤保持健康的状态 并且具有光滑皮肤，抗刺激，止痒或局部止痛作用。

本发明首次以一种特别简单、可靠和可再产的化妆品或药品的方式解 决了这些技术问题，所述方式可在工业生产范围内应用。

因此，根据第一个特征，本发明包括至少一种寡糖或包含它的植物提 取物作为化妆品或皮肤病制剂来刺激皮肤中β-内啡肽的产生的应用，所 述寡糖包含2-6个糖并含有至少两个半乳糖单元，优选两个连位半乳糖单 元和更优选两个连位半乳糖单元位于糖链的末端。

在另一个有利的实施方案中，所述应用的特征在于上述提及的寡糖是 水苏糖。

在本发明的另一个有利的实施方案中，上述提及的寡糖是鹰嘴豆醇。

在本发明内容内的一个有利的实施方案中，可以使用含有上述限定的 寡糖的植物种子提取物，所述植物优选选自灰叶属，大豆，鹰嘴豆，羽扇 豆属植物和小扁豆。更优选地，所述植物提取物来源于灰毛豆种子。

在一个有利的实施方案中，所述种子提取物是一种利用线性的、支化 的或环状的C₁-C₆醇的含水-含醇提取物。尤其优选的醇是甲醇、乙醇或丁 醇。水/醇的相对比例可以在很宽的范围内改变。当前优选的混合物是以 占重量的相对比例计算，约2/3的醇对1/3的水。溶剂/原材料的重量比 为约5/1-约50/1或更高，并且优选为约12/1，所述原材料可用于这种提 取物。

可以在室温或适当加热的条件下，尤其是在20℃-70℃和优选在约45 ℃的提取温度下进行提取。这提供了一种浓缩的含水产物，其在如加入相 同的醇或不同的醇，尤其是丙二醇或乙醇或大量的水后可被再溶解。在 30/70重量等级的醇/水混合物中实现所述产物的三倍剂型是普遍有利的， 所述醇优选为丙二醇。也可以加入一种表面活性剂如。

所获得的提取物基本上是由寡糖，更确切地是由果糖、蔗糖、棉子糖、 水苏糖和鹰嘴豆醇组成。

在本发明的另一个有利的实施方案中，上述提及的寡糖，或包含它的 植物提取物，还结合以另一种化妆品或皮肤病可接受的活性物质，其优选 选自维生素A及其酯，尤其是维生素A棕榈酸酯；α-羟酸，尤其是水杨 酸及其衍生物或乳酸、羟基乙酸或苹果酸；酶PLA2的抑制剂，如黄柏植 物或印苦楝糖苷(azadirachta indica)植物的提取物；具有抗炎活性的 物质，如洋甘草植物的提取物18β-甘草亭酸；具有免疫调节活性的物质 如聚糖；表面活性剂，尤其是硫酸月桂酯家族；生物碱，优选双苄基异喹 啉和尤其是尖刺碱或顶花防己碱；PAF抑制剂，尤其是银杏biloba提取物； 和PGE2酶的抑制剂。

在本发明的另一个有利的实施方案中，将上述提及的寡糖，或包含它 的植物提取物施用于皮肤，以护理敏感的皮肤，显著缓解或消除不适反应， 提供一种健康的感觉或发挥局部止痛作用。

根据第二个特征，本发明还包含一种美容护理方法，其特征在于它包 含对问题皮肤的区域施用美容有效量的至少一种寡糖或包含它的植物提 取物，任选以化妆品可接受的赋形剂形式，所述寡糖包含2-6个糖并含有 至少两个半乳糖单元，优选两个连位半乳糖单元和更优选两个连位半乳糖 单元位于糖链的末端。

根据第三个特征，本发明还包括一种治疗处理，尤其是缓解疼痛和止 痒的方法，其特征在于包括对有问题人的皮肤区域给药治疗有效量的至少 一种寡糖或包含它的植物提取物，任选以药用赋形剂形式，优选为了实施 涉及刺激在皮肤中产生β-内啡肽的治疗处理，所述寡糖包含2-6个糖并 含有至少两个半乳糖单元，优选两个连位半乳糖单元和更优选两个连位半 乳糖单元位于糖链的末端。

在另一个有利的实施方案中，基于组合物的总重量，用干重表示，在 前述特征的任一项中可使用0.0001％-10％，优选0.01-5％的寡糖或包含它 们的提取物。

从下述涉及本发明的各种实施例的说明性描述中，本发明的其它目的 和优点将变得清晰明显，所提供的实施例仅仅是为了说明而不能以任何方 式限制本发明的范围。然而，所述实施例形成了本发明的主要部分和任何 一种特征以它的共性的形式形成了本发明的一部分并被同样地要求，相对 于本领域的任何一种状况，所述特征显示新颖性。在说明书和权利要求中， 除非另外指出，百分比为重量百分比，温度以摄氏度表示，压力为大气压。

实施例1

富含寡糖，尤其是具有两个位于糖链末端的连位半乳糖单元的寡糖提取物 的制备(本发明的产物I₁)

研磨100g市场上可购买的灰毛豆种子，并通过1mm的筛网。将这些 研磨的种子加入到提取溶剂和水的混合物中，所述混合物包含约0.84kg 醇，和约0.36kg蒸馏水，即包含约70％重量醇的含水-含醇提取混合物。

在本实例中，抽提醇为96％体积/体积的乙醇。

在约45℃下，用该抽提混合物进行搅拌抽提约5小时。

随后将该混合物冷却至室温，即约25℃。真空下，用具有约11μm孔 径大小的滤器过滤。

在同一反应器中，在160-60mbar的真空压力下和在约58℃的真空浓 缩浴温度下浓缩该混合物，以提供约80g的浓缩物。

蒸发后，仍在同一反应器中，通过加入一种约30g的醇，在这种情况 下是化妆品级的丙二醇，剧烈搅拌约20分钟再溶解残余物。

可照此使用该产物或通过向溶液中加入14g商品活性碳(参考C× V，CECA，法国)，室温下搅拌15分钟纯化。然后用5μm孔径的滤器进行 常规真空过滤。

包含寡糖的滤液重约70g。毫无问题进行过滤。通过加入30/70重量 的丙二醇/水混合物将固体含量调至约5％。在任选并且可能有利地加入 0.5％重量的表面活性剂如后，用0.22μm孔径的滤器进行进一步 过滤。获得的产物称为本发明的产物I₁。

实施例2

除了将丁醇用作抽提醇以外，程序如实施例1中所描述。这提供了 称为产物I₂的本发明产物。

实施例3

除了将甲醇用作抽提醇以外，程序如实施例1中所描述。这提供了 称为产物I₃的本发明产物。

实施例4

从灰毛豆种子制备纯化的鹰嘴豆醇

程序如实施例1中所描述直至真空浓缩步骤，以在所述反应器中提供 约80g的浓缩物，所述真空浓缩浴温度约为58℃，真空压力为160～ 60mbar。

然后加入14g商品活性碳(参考来自CECA的C×V，法国)并在室温 下搅拌该混合物15分钟。

然后用5μm孔径的滤器以常规方式进行真空过滤。

然后用0.2μm孔径的滤器进行进一步的过滤，然后将滤液蒸发至干燥。

获得的收率为干重的7％。

然后以下述方式将该产物进行高效制备液相色谱分析：

试验条件

使用具有轴向压缩的钢柱(ID＝4cm/长＝30cm)。

固定相：Lichrospher 100 15μm(Merck)

柱的填充：将200g固定相分散于乙腈中。

压力/压缩：100bar

注入量：将630mg干燥的提取物溶于3ml水中。

洗脱梯度：乙腈：95                乙腈：50

                     72分钟

                       →

          水：5                   水：50

洗脱速度：100ml/min。

检测：SEDEX55光电倍增性光散射检测器(photomultiplying light-scattering detector)(Sedere，Alfortville，法国)(在2.5bar 的空气和45℃下PM为4)。

蒸发洗脱后的纯化产物，然后冻干以提供白色粉末，其具有160℃的 分解点和以0.93g/ml的浓度在水中+159.01°的旋光度[α]D²⁵。

纯化的收率约为7％，基于所述干提取物提供0.49％的总收率，纯度 大于90％。在相同的型分析柱上用高效液相色谱以相似的方式检测 纯度，检测结果表明存在一种非常高纯度的单一分子。用核磁共振和质谱 法进行的结构研究证实获得的化合物实际上具有鹰嘴豆醇的结构。

这样获得的产物用于下述实施例5的实验。

实施例5

灰毛豆提取物，水苏糖和鹰嘴豆醇对正常人角质细胞合成β-内啡肽的刺 激作用的论证

在文献中，尤其是J.Invest.Dermatol.1996，106，673-678；J.Clin. Invest.1994，93，2258-2262页中描述了构成表皮基本组分之一的人角质 细胞能合成并分泌某些神经激素如β-内啡肽。β—内啡肽是 propiomelanocortin(POMC)的衍生物，如同在文献，尤其是 J.Invest.Dermatol.1996，106，3-10；Biochim.Biophys.Acta 1997，1336， 315-322页中所描述，其非常可能在免疫调节现象和毛发周期中具有一定 作用。

如在J.Invest.Dermatol.1996，106，673-678中所描述，已提出 一种假说即由角质细胞产生的β-内啡肽足以进入血清并遥控作用于中枢 神经系统及循环的免疫细胞。POMC，一种最初于脑下腺中发现的激素，行 使神经肽前体的作用。在紧张情况或紫外线辐射期间神经激素被释放入有 机体并具有止痛作用，这对于开发意图用于尤其是敏感皮肤的美容产品是 重要的。

相对于脑啡肽，β-内啡肽的特殊作用已在文献中证实。例如，在 Exp.Dermatol.1997，6，222-229，Nissen J.B.等中证实与脑啡肽相反，β -内啡肽在角质细胞的分化中不具有作用。在本试验中，发明人完全意外 的证实，具有至少两个连位半乳糖，优选位于糖链末端的寡糖，尤其是存 在于灰毛豆提取物和具体地水苏糖和鹰嘴豆醇中的寡糖具有显著刺激正 常人角质细胞β—内啡肽合成的能力。活性试验检验如下：

活性试验

试验产物

本试验使用用实施例1的方法获得的含水-含醇灰毛豆提取物，或市 场上可购买的水苏糖(购自Sigma，法国)，或如实施例4中所描述的分离自 实施例1的含水-含醇灰毛豆提取物I₁。

细胞试验

在24孔板上培养正常人角质细胞至融合点，然后在含有二丁酰基 cAMP(2mM)，白细胞介素-1β(IL—1β)(500pg/ml)和试验产物存在的 条件下在培养基中培样24小时，所述试验产物即在这种情况下为依照实 施例1的灰毛豆提取物，或水苏糖或鹰嘴豆醇，使用的剂量分别示于表I 和II中。

5.1.用灰叶属提取物进行的试验

将用实施例1的方法获得的每种灰叶属提取物精确称重，并以 50mg/ml的浓度重溶于乙醇/水混合物(1/1)中。

用实施例1中描述的提取程序制备几种灰毛豆种子的提取物，分别称 为B1，B2和B3。对B3批次进行两组试验。

如下所示获得的结果列于表I。

为限制蛋白酶的作用，在每孔中加入抗蛋白酶-抑肽酶5μg/ml，亮肽 素1μg/ml和PMSF1mM。

加倍每个试验点。

培养24h后，回收培养上清并于—80℃冷冻。

平行进行阳性刺激对照，用500pg/ml IL—1β或2mM二丁酰基cAMP 如上处理细胞24小时。分泌的β-内啡肽用EIA(来自Peninsula Laboratories的试剂盒)分析，并以pg/ml的量表达。

获得的结果示于下表I中：

表I

 

角质细胞处理的实验条件 以pg/ml的量分 泌的β-内啡肽学生t(Student t)检验p值0.025％乙醇对照36±6灰毛豆1μg/ml(B1)74±80.0359灰毛豆5μg/ml(B1)98±150.0323灰毛豆25μg/ml(B1)77±110.0456对照3±4阳性对照：IL—1β 500pg/ml35±50.0208阳性对照：二丁酰基cAMP 2mM87±120.0115

 

对照3±4灰毛豆1μg/ml(B2)26±60.0442灰毛豆5μg/ml(B2)44±70.0196灰毛豆25μg/ml(B2)26±40.0324阳性对照：IL—1β 500pg/ml35±50.0208阳性对照：二丁酰基cAMP 2mM87±120.0115

 

对照1±1灰毛豆1μg/ml(B3)3±10.3081灰毛豆5μg/ml(B3)14±20.0047灰毛豆25μg/ml(B3)14±20.0047阳性对照：IL—1β 500pg/ml17±30.0036阳性对照：二丁酰基cAMP 2mM10±10.0065

 

对照1±3灰毛豆1μg/ml(B3)21±50.0280灰毛豆5μg/ml(B3)21±40.0179灰毛豆25μg/ml(B3)20±10.0121阳性对照：IL—1β 500pg/ml25±40.0065阳性对照：二丁酰基cAMP 2mM22±10.0067

5.2用水苏糖和鹰嘴豆醇进行的试验

除了以示于表II的剂量使用水苏糖和鹰嘴豆醇以外，下述程序与用 灰毛豆提取物的试验中的程序相同，获得的结果示于下表II中。

表II

 

角质细胞处理的试验条件 以pg/ml的量分 泌的β-内啡肽学生t(Student t)检验p值对照10±3水苏糖20ng/ml(Singma ref.S4001)16±1 0.0733 水苏糖100ng/ml(Singma ref.S4001)22±2 0.0086 水苏糖500ng/ml(Singma ref.S4001)30±13 0.0289 阳性对照：IL—1β 500pg/ml25±40.0065阳性对照：二丁酰基cAMP 2mM22±10.0067

 

对照1±2鹰嘴豆醇20ng/ml8±30.0380鹰嘴豆醇100ng/ml8±40.0765鹰嘴豆醇500ng/ml9±50.0863阳性对照：IL—1β 500pg/ml17±30.0036阳性对照：二丁酰基cAMP 2mM10±10.0065

 

对照3±3鹰嘴豆醇64ng/ml44±70.0168阳性对照：IL—1β 500pg/ml35±30.0077阳性对照：二丁酰基cAMP 2mM87±80.0056

将注意的是，对鹰嘴豆醇进行两组试验；如表II所示，对于这些 试验，一组空白对照和两组阳性对照同样受到影响，所述鹰嘴豆醇为实施 例4的鹰嘴豆醇。

这三批灰毛豆寡糖，它们是表I中试验的主体，在1—25μg/ml范围 内显示由正常人角质细胞释放的β-内啡肽的剂量依赖刺激作用。

在5μg/ml的浓度下获得最大作用。

而且，迄今为止，对存在于灰毛豆提取物中的两种分子即水苏糖和鹰 嘴豆醇进行的试验已证实对这些相同细胞产生β-内啡肽具有刺激作用， 所述水苏糖和鹰嘴豆醇是表II的主体。

本实施例中报道的试验中，阳性对照：IL-1β和二丁酰基cAMP同样 刺激培养的正常人角质细胞产生β-内啡肽，但根据所使用的细胞株，具 有不同的幅度。

在这些条件下，寡糖，尤其是以富含寡糖的提取物-在这种情况下为 灰叶属提取物-或分离的水苏糖和鹰嘴豆醇物质的形式存在的寡糖明显诱 导β-内啡肽的合成，并且因此可用于制造用于护理敏感皮肤的化装品， 这些产品是意图克服皮肤敏感性和不适反应，提供健康状态的感觉或具有 光滑皮肤，抗刺激，局部止痛或止痒作用。

在用于病理状况的治疗的药物应用范围内，寡糖，尤其是以植物提取 物和尤其是灰叶属提取物，或水苏糖或鹰嘴豆醇形式存在的寡糖将用于制 造药物产品，尤其是治疗皮肤病的产品。下面提供了化妆品和药物组合 物，尤其是皮肤病组合物的各种实施例。除非另外指出，所有成分以重量 百分比的形式表示。

实施例6

日晒后的润肤乳液

这种润肤乳液以那些本领域的技术人员熟知的常规方式从下述组分 中获得：

实施例1的灰毛豆提取物I₁        ：0.2

神经酰胺II                     ：0.5

甘油                           ：4

醋酸生育酚                     ：0.2

甘草提取物                     ：0.2

赋形剂                         ：qsp100

此种润肤乳液，用于阳光浴后，润滑皮肤。

实施例7

主体固化和松弛凝胶

该凝胶从下述组分制备：

实施例1的灰毛豆提取物I₁          ：1

madecassoside                   ：0.2

Sapindus mukurossi提取物         ：0.2

小麦蛋白                         ：2

甘油                             ：2

胶凝赋形剂                       ：qsp 100

这种主体固化凝胶在通过按摩施用期间给人以健康、愉悦之感。

实施例8

具有收敛和松弛作用的夜用乳液

这种乳液从下述组分制得：

实施例4的鹰嘴豆醇       ：0.1

madecassoside           ：0.1

无患子皂甙              ：0.1

葡萄子OPC               ：0.5

乳化的赋形剂            ：qsp100

将这种具有收敛作用的细乳状液施用于脸部的卵圆形部位，可松弛皱 纹，改良皮肤的健康状况和使脸部在早晨看起来更年轻。

实施例9

用于敏感的和过敏性皮肤的调色按摩霜

实施例1的灰毛豆提取物I₁      ：1

人参提取物                  ：0.1

麦角硫因                    ：0.2

适于按摩的乳化油脂赋形剂     ：qsp100

这种适于敏感皮肤的按摩霜调色表皮并放松身体。

实施例10

用于再生和放松敏感和娇嫩肌肤的细乳状液

水苏糖                          ：0.35

棕榈酸视黄醇酯                  ：0.1

醋酸生育酚                      ：0.2

大豆皂草精醇                    ：0.1

madecassoside                   ：0.1

阳光滤剂(sun filters)           ：8

赋形剂                         ：qsp 100

这种细再生乳状液刺激表皮的新陈代谢并恢复皮肤的光彩亮丽和朝 气。

实施例11

止痛和止痒的皮肤病乳霜

鹰嘴豆醇                      ：0.2

水苏糖                        ：0.2

乳化的赋形剂                  ：qsp100

这种施用于问题皮肤区域的乳霜减轻疼痛并消除和减缓多种原因引起 的搔痒。