一种用于原产地人参保护的HPLC指纹图谱鉴别方法

摘要

本发明提供一种用于原产地人参保护的HPLC指纹图谱鉴别方法，其特征在于包括如下步骤：A.建立原产地人参的液相色谱指纹图谱：以同一原产地的人参为标准品，通过液相色谱分析建立其指纹图谱；B.检测样品：取待检测的人参样品分别用与标准品相同的条件检测，得出检测样品的谱图，将两者的指纹图谱用直接观察法或指纹图谱软件分析作为定性依据。本发明采用液相色谱建立的人参药材指纹图谱预处理方法简单，峰数多且分离度较好，这说明人参药材由于生长的地理环境和气候的不同而导致主要化学成分含量差别很大。人参的HPLC的指纹图谱可为区别原产地与非原产地高端保健品人参提供参考依据，并为其他中药材指纹图谱的建立提供借鉴。经方法学的考察表明：其精密度、稳定性和重现性均具有较好的应用前景。

说明书

技术领域

本发明涉及一种用于原产地人参保护的HPLC指纹图谱鉴别方法，属于液相色谱分析技术领域。

背景技术

由于人参丰富的营养价值和药理作用，人参药材一直备受关注。在国外市场，已经出现了很多高端的人参药材提取物所制成的保健食品以及保健药品。人参药材也成为欧美天然药物市场上最为畅销的植物药制剂之一。而不同产地的人参，由于环境气候水土等条件的影响，它所含有的成分不尽相同因而也就导致了临床疗效的差异。因此，很多不法商贩用一些非原产地的人参以次充好，以假乱真，极大地危害到了消费者的身心健康。许多假冒伪劣的人参药材制剂也充斥着高端保健品市场。这对于人参药材的原产地鉴别就提出了一定的要求。

目前，我国对于人参药材指纹图谱的研究已经有了一定的进展。有些工作者已经总结出一些实际的工作经验，应用于人参药材的科学研究。目前，高效液相色谱法测量人参常规组分具有流动相简单，精密度高，分离效果好，准确性高等特点。高阳、袁永越等曾利用高效液相色谱法标示出人参药材指纹图谱中的18个共有峰并且测定其相似度。张雪香等利用HPLC法测定了吉林产3种红参中多种皂苷等单体的含量。张小勇等也采用HPLC法对吉林抚松县产人参茎叶粉和人参浸膏中单体皂苷Rb1和Re分别进行了分离测定。此方法适合于人参单体皂苷的含量分析。石威等应用高效液相色谱-蒸发光散射检测系统和微波萃取辅助萃取技术，采取梯度洗脱的方法研究了人参根中人参皂苷的萃取和分离测定。同时还有一些科研人员利用高效液相色谱法对西洋参、人参制剂和饮片中的成分进行了分离测定。但是国内对于高端保健品人参的特征识别因子的研究还处于发展阶段。

发明内容

本发明的目的在于提供一种不受检测者的主观影响短，利用HPLC法建立人参指纹图谱以及鉴别原产地与非原产地高端保健品人参的检测方法。

本发明的技术方案是这样实现的：这种用于原产地人参保护的HPLC指纹图谱鉴别方法，包括如下步骤：

A、建立原产地人参的液相色谱指纹图谱

以同一原产地的人参为标准品，通过液相色谱分析建立其指纹图谱；

B、检测样品

取待检测的人参样品分别用与标准品相同的条件检测，得出检测样品的谱图，将两者的指纹图谱用直接观察法或指纹图谱软件分析作为定性依据。

所述的用于原产地人参保护的HPLC指纹图谱鉴别方法，具体包括如下步骤：

A、对照品溶液的制备

精确称取人参皂苷Re对照品适量，加甲醇溶解制成1.00mg/mL的对照品溶液。

B、标准品溶液的制备

将同一产地的人参标准品置于60℃干燥箱中加热4小时至恒重，粉碎过筛，收集80目以下的粉样；

准确称量2.0g人参粉样加入自动控温溶剂回流液固提取器，加入100mL甲醇提取5h。提取液旋转蒸发回收溶剂，浓缩液倒入10mL容量瓶中；

用甲醇清洗旋转蒸发器内壁，每次2ml，共清洗3次，清洗液也倒入容量瓶中并稀释至刻度，0.45μm滤膜滤过，取续滤液作为标准品溶液；

C、指纹图谱建立与分析

液相色谱条件：

色谱柱：Inertsil ODS-3，250mm×4.6mm，5μm；

检测波长：203nm；

流动相：乙腈-0.05％磷酸水溶液梯度洗脱；

流速：1mL/min；

洗脱程序：0～7min、乙腈0％，7～10min、乙腈变至10％，10～30min、乙腈变至30％，30～40min、乙腈变至35％，40～45min、乙腈变至50％，45～60min、乙腈变至70％，60～90min、乙腈变至90％；

进样量：20μL；

柱温：30℃；

精密吸取标准品溶液和对照品溶液适量，注入液相色谱仪，记录90min的色谱图，根据多批样品的指纹图谱给出的相关参数，所有组分在90min全部出峰，选取分离度以及峰形均较好的15min～90min作为标准品指纹图谱，确定其中11个峰为共有特征峰，其中，根据保留时间和峰高加高法确定3号峰为人参皂苷Re，将其作为内参比峰；

D、取市售的人参样品分别用与标准品相同的条件处理和测定，得出检测样品的液相色谱指纹图谱，将两者的指纹图谱相比较或用中药色谱指纹图谱相似度评价系统导入进行分析作为定性依据，如果两者相似度小于90％即可认为非同一产品，相似度大于90％即认为是同一产品。方法学的考察

(1)方法精密度的测定

取同一长白山园参供试品溶液，按上述色谱条件，连续进样5次，计算各共有峰相对于内参比峰的相对保留时间和相对峰面积值。

表1方法精密度的测试

结果显示，相对峰面积的RSD在0.20％～1.6％之间，相对保留时间的RSD在0.05％～0.27％之间，表明方法精密度良好。

(2)方法重现性的测定

取同一产地长白山园参样品五份，按上述方法制备供试品溶液，按上述色谱条件，分别进样，计算各共有峰相对于内参比峰的相对保留时间和相对峰面积值。

表2 方法重现性的测试结果

结果显示，相对峰面积的RSD在0.20％～2.1％之间，相对保留时间的RSD在0.03％～0.16％之间，说明方法重现性良好。

(3)样品稳定性的测定

取同一长白山园参供试品溶液，按上述色谱条件，在0，4，12，24，48h进样，计算各共有峰相对于内参比峰的相对保留时间和相对峰面值。

表3 样品稳定性的测试

结果显示，相对峰面积的RSD在0.54％～2.8％之间，相对保留时间的RSD在0.10％～0.22％之间，说明样品至少在48小时内稳定。

本发明采用液相色谱建立的人参药材指纹图谱预处理方法简单，峰数多且分离度较好，这说明人参药材由于生长的地理环境和气候的不同而导致主要化学成分含量差别很大。人参的HPLC的指纹图谱可为区别原产地与非原产地高端保健品人参提供参考依据，并为其他中药材指纹图谱的建立提供借鉴。经方法学的考察表明：其精密度、稳定性和重现性均具有较好的应用前景。

附图说明

图1是长白山园参的HPLC指纹图谱

图2是长白山白参的HPLC指纹图谱

图3是长白山山参的HPLC指纹图谱

图4是辽宁园参的HPLC指纹图谱

图5是吉林园参的HPLC指纹图谱

图6是购于保定药店养殖参的HPLC指纹图谱

具体实施方式

1、建立原产地人参的液相色谱指纹图谱

A、建立原产地人参的液相色谱指纹图谱

1、对照品溶液的制备

精确称取人参皂苷Re对照品适量，加甲醇溶解制成1.00mg/mL的对照品溶液。

2、标准品溶液的制备

将市售的长白山园参作为标准品置于60℃干燥箱中加热4小时至恒重，粉碎过筛，收集80目以下的粉样；

准确称量2.0g长白山园参粉样加入自动控温溶剂回流液固提取器，加入100mL甲醇提取5h，提取液旋转蒸发回收溶剂，浓缩液倒入10mL容量瓶中；

用甲醇清洗旋转蒸发器内壁，每次2ml，共清洗3次，清洗液也倒入容量瓶中并稀释至刻度，0.45μm滤膜滤过，取续滤液作为标准品溶液；

3、指纹图谱建立与分析

液相色谱条件：

色谱柱：Inertsil ODS-3，250mm×4.6mm，5μm；

检测波长：203nm；

流动相：乙腈-0.05％磷酸水溶液梯度洗脱；

流速：1mL/min；

洗脱程序：0～7min、乙腈0％，7～10min、乙腈变至10％，10～30min、乙腈变至30％，30～40min、乙腈变至35％，40～45min、乙腈变至50％，45～60min、乙腈变至70％，60～90min、乙腈变至90％；

进样量：20μL；

柱温：30℃；

精密吸取标准品溶液和对照品溶液适量，注入液相色谱仪，记录90min的色谱图，根据多批样品的指纹图谱给出的相关参数，所有组分在90min全部出峰，选取分离度以及峰形均较好的15min～90min作为标准品指纹图谱，如图1所示，确定其中11个峰为共有特征峰，其中，根据保留时间和峰高加高法确定3号峰为人参皂苷Re，将其作为内参比峰；

4、再取市售的长白山白参、长白山山参、辽宁园参、吉林园参、及购于保定药店养殖参样品分别用与标准品相同的条件处理和测定，得出检测样品的液相色谱指纹图谱如图2-图6所示，将两者的指纹图谱相比较或用中药色谱指纹图谱相似度评价系统导入进行分析作为定性依据，如果两者相似度小于90％即可认为非同一产品，相似度大于90％即认为是同一产品。结果显示因样品的个体差异，共有特征峰的含量有极为明显差异。

表4 不同产地及种类人参指纹图谱检测

由图1-6及表4可知，几种产地及种类的人参药材的HPLC指纹图谱共有特征峰的相对保留时间重现性很好(RSD在0.11％～0.30％之间)，但是相对峰面积值存在极为显著差异(RSD在26％～102％之间)，这说明以上六个产地及种类的人参药材由于生长的地理环境和气候的不同而导致主要化学成分含量差别很大。

本发明所建立的人参的HPLC的指纹图谱预处理方法简单，峰数多且分离度较好，可为区别原产地与非原产地高端保健品人参提供参考依据，并为其他中药材指纹图谱的建立提供借鉴。

本发明列举的实施例旨在更进一步地阐明这种用于原产地人参保护的HPLC指纹图谱鉴别方法具体操作和应用方向，而不对本发明的范围构成任何限制。