抗磷脂抗体测定试剂以及抗梅毒螺旋体抗体测定试剂

摘要

本发明的目的在于提供一种长期贮存稳定性出色、能够进行梅毒感染的诊断等的抗磷脂抗体测定试剂，以及可以防止血清干扰的发生从而准确度良好地进行梅毒感染的诊断的抗梅毒螺旋体抗体测定试剂。本发明是在梅毒感染的诊断中使用的抗磷脂抗体测定试剂，是含有载持有抗磷脂抗原的不溶性载体和共聚物的抗磷脂抗体测定试剂，所述共聚物具有来自2－甲基丙烯酰氧基乙基磷酰胆碱的链段和来自亲水性单体的链段。

说明书

技术领域

本发明涉及一种能够准确度良好地进行梅毒感染的诊断而且长期贮存稳定性出色的抗磷脂抗体测定试剂，以及可以防止血清干扰的发生从而可以准确度良好地进行梅毒感染的诊断的抗梅毒螺旋体抗体测定试剂。

背景技术

作为梅毒病原体的梅毒螺旋体(Treponema Pallidum)一旦感染生物，即产生针对该病原体的抗体和具有与磷脂反应性的抗体。抗磷脂抗体测定试剂是通过测定与血中的磷脂具有反应性的抗体的有无来判断梅毒感染的试剂。

以往，在抗磷脂测定中，进行使用判断板的RPR卡片试验(card test)等用手法，不过近年来，正在出售可以在生物化学自动分析装置中适用的试剂(自动化试剂)。

在该自动化试剂中，为了减轻患者的采血负担，与用手法相比，大多以少量的血清测定。所以，试剂与血中的抗体的反应引起的抗原抗体反应量也变为少量。因而，在自动化试剂中，有时添加促进抗原抗体反应的增感剂。作为通常使用的增感剂，包括聚乙二醇、葡聚糖等。另外，作为抗磷脂抗体测定试剂中的增感剂，专利文献1中显示聚乙烯吡咯烷酮及支链淀粉是有效的。

但是，这样的增感剂虽然促进抗原抗体反应的效果出色，但在长期保存试剂的情况下稳定性存在问题，长期保存后，灵敏度降低，不能保持试剂性能。

另一方面，作为梅毒病原体的梅毒螺旋体一旦感染生物，即产生针对该病原体的抗体。抗梅毒螺旋体抗体测定试剂是通过测定血中的抗梅毒螺旋体抗体的有无来判断梅毒感染的试剂。

以往，在抗梅毒螺旋体抗体测定中，进行利用血细胞凝集的TPHA等用手法，不过近年来，正在出售可以在生物化学自动分析装置中适用的试剂(自动化试剂)。在该自动化试剂中，为了减轻患者的采血负担，与用手法相比，大多以少量的血清测定。所以，试剂与血中的抗体的反应引起的抗原抗体反应量也变为少量。因而，在自动化试剂中，有时添加促进抗原抗体反应的增感剂。作为通常使用的增感剂，包括聚乙二醇、葡聚糖等。另外，作为抗梅毒螺旋体抗体测定试剂中的增感剂，专利文献2公开了含有糖苷衍生物作为单体单元的水溶性聚合物及/或溶性共聚物是有效的。

但是，这样的增感剂虽然促进抗原抗体反应的效果出色，但不能以一部分标本得到正确的测定结果。具体而言，在标本为血清的情况下，通过使血清中内含的成分变动，发生给测定带来不良影响的被称为血清干扰的现象，不能得到正确的测定结果，

专利文献1：日本特开平10-282096号公报

专利文献2：日本专利第2947600号公报

发明内容

鉴于所述现状，本发明的目的在于提供一种能够准确度良好地进行梅毒感染的诊断而且长期贮存稳定性出色的抗磷脂抗体测定试剂，以及可以防止血清干扰的发生，从而可以准确度良好地进行梅毒感染的诊断的抗梅毒螺旋体抗体测定试剂。

本发明的抗磷脂抗体测定试剂是在梅毒感染的诊断中使用的抗磷脂抗体测定试剂，其中，内含载持有抗磷脂抗原的不溶性载体和共聚物，所述共聚物具有来自2-甲基丙烯酰氧基乙基磷酰胆碱的链段和来自亲水性单体的链段。

另外，本发明的抗梅毒螺旋体抗体测定试剂是在梅毒感染的诊断中使用的抗梅毒螺旋体抗体测定试剂，其中，内含载持有抗梅毒螺旋体抗原的不溶性载体和共聚物，所述共聚物具有来自2-甲基丙烯酰氧基乙基磷酰胆碱的链段和来自亲水性单体的链段。

以下详述本发明。

本发明人等进行了潜心研究，结果发现通过在抗磷脂抗体测定试剂中内含作为增感剂的具有来自2-甲基丙烯酰氧基乙基磷酰胆碱的链段以及来自亲水性单体的链段的共聚物，测定灵敏度提高，而且可以长期保持贮存稳定性，以至完成本发明的抗磷脂抗体测定试剂。

本发明的抗磷脂抗体测定试剂内含具有来自2-甲基丙烯酰氧基乙基磷酰胆碱的链段以及来自亲水性单体的链段的共聚物(以下也简称为共聚物)。

作为所述亲水性单体使用甲基丙烯酸的情况下，所述共聚物的结构如下述通式(1)所示。

所述2-甲基丙烯酰氧基乙基磷酰胆碱由于具有甲基丙烯酰基，所以可以与其他聚合性单体共聚。作为可以共聚的亲水性单体，例如可以举出甲基丙烯酸2-羟乙酯、(甲基)丙烯酸酯、(甲基)丙烯酰胺等(甲基)丙烯酸系单体等。

作为所述亲水性单体，没有特别限定，例如可以举出(甲基)丙烯酸、(甲基)丙烯酰胺等。其中，由于需要与血液成分中的蛋白质等发生静电排斥，所以优选阳离子性的(甲基)丙烯酸。在此，(甲基)丙烯酸是指丙烯酸或甲基丙烯酸。

作为所述共聚物中的所述来自2-甲基丙烯酰氧基乙基磷酰胆碱的链段与来自亲水性单体的链段的比，没有特别限定，只要根据需要适当选择即可，但优选摩尔比为5∶5～3∶7。如果所述来自2-甲基丙烯酰氧基乙基磷酰胆碱的链段的比不到该比例，则有时不能有效地防止抗梅毒螺旋体抗体测定中的血清干扰的发生。

作为所述共聚物的重均分子量，没有特别限定，优选下限为5000，优选上限为500万。如果不到5000，则有时失去凝集促进效果，如果超过500万，则在向试剂中添加时，粘性过于上升，有时重复性等变差。

本发明的抗磷脂抗体测定试剂中的所述共聚物的含量的优选下限为0.1(w/v)％，优选上限为1.2(w/v)％。如果不到0.1(w/v)％，则有时不能有效地防止血清干扰的发生，如果超过1.2(w/v)％，则试剂的粘性过于上升，有时重复性降低。

更优选下限为0.2(w/v)％，更优选上限为0.8(w/v)％。

本发明的抗磷脂抗体测定试剂含有载持有抗磷脂抗原的不溶性载体。

作为所述抗磷脂抗原，例如优选为例如由心磷脂、卵磷脂以及胆固醇构成的脂质抗原。

所述心磷脂优选使用从牛的心脏中纯化而成的心磷脂，也可以为化学合成的心磷脂。

所述卵磷脂优选使用从鸡的蛋黄中纯化而成的卵磷脂，但也可以使用卵磷脂的含量为60～80％的蛋黄素。

所述胆固醇可以为动物来源的胆固醇，也可以为化学合成的胆固醇。

作为所述心磷脂、卵磷脂以及胆固醇的混合比，只要是具有能够判断梅毒感染的有无的性能的程度即可，没有特别限定，相对心磷脂1，优选卵磷脂为8～12，胆固醇为1～5。

作为所述不溶性载体，没有特别限定，优选使用由具有苯基的聚合性单体及/或阴离子性的聚合性单体的聚合物所构成的物质。

作为所述具有苯基的聚合性单体，没有特别限定，例如可以举出苯乙烯、二乙烯基苯、乙基苯乙烯、α-甲基苯乙烯、对氯苯乙烯、氯甲基苯乙烯等。它们可以单独使用，也可以并用。

作为所述阴离子性的聚合性单体，没有特别限定，例如可以举出苯乙烯磺酸盐、(甲基)丙烯酸、二乙烯基苯磺酸盐、乙基苯乙烯磺酸盐、α-甲基磺酸盐等。作为这种情况下的盐，没有特别限定，例如可以举出钠盐、钾盐、锂盐、铵盐等。它们可以单独使用，也可以并用两种以上。其中，优选苯乙烯磺酸盐及/或(甲基)丙烯酸。通过内含所述苯乙烯磺酸盐及/或(甲基)丙烯酸，得到的不溶性载体自身成为具有良好的乳化力的物质。

使用所述阴离子性的聚合性单体得到的不溶性载体成为具有表面电荷的物质，因此即使没有乳化剂也可以在溶液中良好地分散。此外，如果在不溶性载体的悬浮液中存在乳化剂，则在使其载持脂质抗原从而成为抗磷脂抗体测定试剂的情况下，有时乳化剂会妨碍特异抗原抗体反应引起的高分子球状体的凝集，或者根据情况不同而参与非特异反应，所以优选不含有乳化剂。

使用由所述具有苯基的聚合性单体及阴离子性的聚合性单体的聚合物所构成的不溶性载体的情况下，作为各聚合性单体的共聚物成分的含量，没有特别限定，相对所述具有苯基的聚合性单体的共聚物成分100重量份，阴离子性的聚合性单体的共聚物成分优选为50重量份以下。如果阴离子性的聚合性单体的共聚合部分超过50重量份，则得到的不溶性载体变有时得难以分散。更优选为30重量份以下。

虽然所述不溶性载体具有表面电荷，但该表面电荷根据基于所述的作为共聚合成分的阴离子性的聚合性单体的情况和基于在聚合时使用的聚合引发剂的切片的阴离子的情况而不同。基于所述聚合引发剂的切片的阴离子的情况是指例如在使用过硫酸钾等过硫酸盐的情况下，作为切片的硫酸根(-OSO₃^-)存在于共聚合粒子表面，该硫酸根逐渐接受加水分解而如下述式地改变的情况。

-SO₃^-+H₂O→-OH+HOSO₃^-

所述不溶性载体在成为悬浮液时优选表面电荷密度以阴离子的解离浓度表示为0.01～0.4μmol/m²。此外，所述悬浮液的介质是被用于免疫学测定试验的介质，例如可以举出水、生理盐水、血清等。如果不到0.01μmol/m²，则粒子间的排斥力弱，所以有时会破坏不溶性载体自身具有的乳化力，如果超过0.4μmol/m²，则不溶性载体间的电排斥力变强，不发生自身凝集，是稳定的，但由于抗原抗体反应引起的凝集也被妨碍，所以有时不能高灵敏度地测定。

另外，所述不溶性载体优选为粒径0.1～0.7μm的球状体。如果不到0.1μm，则凝集引起的光学变化量小，有时不能得到测定必需的高灵敏度，如果超过0.7μm，则粒子的凝集引起的光学变化量超过可测定区域，有时测定范围变小。更优选下限为0.2μm，更优选为上限为0.5μm。

作为聚合所述聚合性单体的方法，没有特别限定，可以举出使用聚合引发剂进行乳液聚合、悬浮聚合、种子聚合、分散聚合等的方法。

作为所述聚合引发剂，没有特别限定，例如可以举出过硫酸钾等过硫酸盐等。

作为在所述不溶性载体上载持所述抗磷脂抗原的方法，没有特别限制，可以举出通过以往公知的方法，利用物理及/化学键使其载持的方法等。

本发明的抗磷脂抗体测定试剂可以通过使载持有所述抗磷脂抗原的不溶性载体和所述共聚物分散及溶解于同一介质而作为单液系的胶乳试剂使用，另外，也可以作为双液系的试剂使用，所述双液系试剂含有内含载持有所述抗磷脂抗原的不溶性载体的第1试剂和向介质中添加了所述共聚物的缓冲液而组成的第2试剂。

作为所述介质没有特别限定，例如可以举出磷酸缓冲液、甘氨酸缓冲液、Tris盐缓冲液、Good′s缓冲液等。

另外，作为所述介质的pH，没有特别限定，优选下限为5.5，优选上限为8.5，更优选下限为6.5。

也可以在所述单液系的胶乳试剂中进一步适当溶解牛血清白蛋白、蔗糖、氯化钠、EDTA·2Na、表面活性剂等。

另外，在用作所述胶乳试剂与溶液状试剂的双液系试剂的情况下，也可以分别适当溶解牛血清白蛋白、蔗糖、氯化钠、EDTA·2Na、表面活性剂等。

另外，作为所述牛血清白蛋白的浓度，没有特别限定，优选下限为0.1％，优选上限为15％，更优选下限为1.0％，更优选上限为10.0％。

通过使用本发明的抗磷脂抗体测定试剂，利用光学测定或目视观察经与标本中的抗磷脂抗体发生抗原抗体反应而产生的凝集的程度，可以测定标本中的抗磷脂抗体。

作为光学测定所述凝集的程度的方法，可以使用公知的方法，例如利用使用的不溶性载体的粒子的尺寸、浓度的选择、反应时间的设定来测定散射光强度、吸收光度、透射光强度的增减。另外，还可以并用这些方法。此外，作为进行所述测定时的光的波长，优选为300～900nm。

作为在所述光学测定方法中使用的装置，可以举出能够检测散射光强度、透过光强度、吸光度等的光学仪器，只要是通常使用的生物化学自动分析机，就可以任意使用。

作为目视观察所述凝集的程度的方法，通常可以使用在判断板上混合标本和本发明的抗磷脂抗体测定试剂，摇动混合液，然后判断凝集的有无的方法等。此外，在观察凝集的程度时，除了利用目视的方法以外，还可以使用用摄像机拍摄凝集状态，实施图像处理的方法。

另外，本发明人等进行了潜心研究，结果发现通过在抗梅毒螺旋体抗体测定试剂中内含作为增感剂的具有来自2-甲基丙烯酰氧基乙基磷酰胆碱的链段以及来自亲水性单体的链段的共聚物，在测定血清中的抗梅毒螺旋体抗体的情况下，可以防止血清干扰的发生从而准确度良好地进行抗梅毒螺旋体抗体的测定，以至完成本发明的抗梅毒螺旋体抗体测定试剂。

本发明的抗梅毒螺旋体抗体测定试剂内含载持有针对梅毒的抗原的不溶性载体，以及具有来自2-甲基丙烯酰氧基乙基磷酰胆碱的链段和来自亲水性单体的链段的共聚物(以下也简称为共聚物)。

作为所述亲水性单体，使用甲基丙烯酸的情况下，所述共聚物的结构如下述通式(1)所示。

本发明的抗梅毒螺旋体抗体测定试剂通过内含所述共聚物，即使在使用血清作为标本的情况下，也不会引起血清干扰，可以得到正确的测定结果。

此外，作为确认所述血清干扰的方法，例如可以使用被称为添加回收试验的方法。所述添加回收试验是如下所述的试验，即：将以高浓度内含作为被测定物质的抗原或抗体的标准物质添加至生理盐水(没有变动成分的血清的模型)，成为0.1～5％左右，求得添加前后的测定值的差，然后同样地进行，向内含作为被测定物质的抗原或抗体的血清中添加标准物质，求得在添加前后的测定值的差，将在向生理盐水中添加标准物质的情况下的测定值的差设为100％时的比例作为回收率算出，由此确认血清干扰的发生。

所述2-甲基丙烯酰氧基乙基磷酰胆碱由于具有甲基丙烯酰基，所以可以与其他聚合性单体共聚。作为可以共聚的亲水性单体，例如可以举出甲基丙烯酸2-羟乙酯、(甲基)丙烯酸酯、(甲基)丙烯酰胺等(甲基)丙烯酸系单体等。

作为所述亲水性单体，没有特别限定，例如可以举出(甲基)丙烯酸、(甲基)丙烯酰胺等。其中，由于需要与血液成分中的蛋白质等发生静电排斥，所以优选阳离子性的(甲基)丙烯酸。在此，(甲基)丙烯酸是指丙烯酸或甲基丙烯酸。

作为所述共聚物中所述的来自2-甲基丙烯酰氧基乙基磷酰胆碱的链段与来自亲水性单体的链段的比，没有特别限定，只要根据需要适当选择即可，但优选摩尔比为5∶5～3∶7。如果所述来自2-甲基丙烯酰氧基乙基磷酰胆碱的链段的比不到该比例，则有时不能有效地防止抗梅毒螺旋体抗体测定中的血清干扰的发生。

作为所述共聚物的重均分子量，没有特别限定，优选下限为5万，优选上限为500万。如果不到5万，则有时失去凝集促进效果，如果超过500万，则在向试剂中添加时，粘性过于上升，有时重复性等变差。

本发明的抗梅毒螺旋体抗体测定试剂中的所述共聚物的含量的优选下限为0.1(w/v)％，优选上限为1.2(w/v)％。如果不到0.1(w/v)％，则有时不能有效地防止血清干扰的发生，如果超过1.2(w/v)％，则试剂的粘性过于上升，有时重复性降低。

更优选下限为0.2(w/v)％，更优选上限为0.8(w/v)％。

本发明的抗梅毒螺旋体抗体测定试剂除了所述共聚物以外还含有载持抗梅毒螺旋体抗原的不溶性载体。

作为所述抗梅毒螺旋体抗原，例如优选使用来自梅毒螺旋体菌体的抗原。

作为所述不溶性载体，没有特别限定，例如可以举出由聚苯乙烯、苯乙烯-苯乙烯磺酸盐聚合物、丙烯腈-丁二烯-苯乙烯共聚物、氯乙烯-丙烯酸酯共聚物、聚醋酸乙烯丙烯酸酯等构成的物质。

作为所述不溶性载体的粒径，根据使用的测定方法或测定仪器而不同，但优选下限为0.05μm，优选上限为1.0μm。如果不到0.5μm，则凝集引起的光学变化量小，有时不能得到测定必需的高灵敏度，如果超过1.0μm，则胶乳粒子的凝集引起的光学变化量超过可测定区域，有时测定范围变小。

作为在所述不溶性载体上载持抗梅毒螺旋体抗原的方法，没有特别限制，可以举出通过公知的方法，利用物理、化学键使其载持的方法等。此外，此时使用的抗梅毒螺旋体抗原可以为菌体破碎物，也可以为纯化物。另外，也可以使用1种利用基因重组技术人工合成的抗原，或组合1种以上的来使用。

本发明的抗梅毒螺旋体抗体测定试剂可以通过使载持所述抗梅毒螺旋体抗原的不溶性载体和所述共聚物分散及溶解于同一介质而作为单液系的胶乳试剂使用，另外，也可以作为双液系的试剂使用，所述双液系试剂含有内含载持有所述抗梅毒螺旋体抗原的不溶性载体的第1试剂和向介质中添加了所述共聚物而成的缓冲液而组成的第2试剂。

作为所述介质没有特别限定，例如可以举出磷酸缓冲液、甘氨酸缓冲液、Tris盐缓冲液等。

也可以在所述单液系的胶乳试剂中进一步适当溶解牛血清白蛋白、蔗糖、氯化钠、EDTA·2Na、表面活性剂等。

另外，在用作双液系试剂的情况下，也可以分别适当溶解牛血清白蛋白、蔗糖、氯化钠、EDTA·2Na、表面活性剂等。

另外，作为所述牛血清白蛋白的浓度，没有特别限定，优选下限为0.1％，优选上限为15％，更优选下限为1.0％，更优选上限为10.0％。

通过使用本发明的抗梅毒螺旋体抗体测定试剂，利用光学测定或目视观察经与标本中的抗梅毒螺旋体抗体发生抗原抗体反应而产生的凝集的程度，可以测定标本中的抗梅毒螺旋体抗体。

使用本发明的抗梅毒螺旋体抗体测定试剂进行抗原抗体反应时的pH的优选上限为4.5，优选下限为10.0，更优选下限为6.0，更优选上限为8.0。

另外，反应温度的优选下限为0℃，优选上限为50℃，反应时间可以适当选择。

作为光学测定所述凝集的程度的方法，可以使用公知的方法，例如利用使用的不溶性载体的粒子的尺寸、浓度的选择、反应时间的设定来测定散射光强度、吸收光度、透射光强度的增减。另外，还可以并用这些方法。此外，作为进行所述测定时的光的波长，优选为300～900nm。

作为在所述光学测定方法中使用的装置，可以举出能够检测散射光强度、透过光强度、吸光度等的光学仪器，只要是通常使用的生物化学自动分析机，就可以任意使用。

作为目视观察所述凝集的程度的方法，通常可以使用以下的方法，即在判断板上混合标本和含有本发明的抗梅毒螺旋体抗体测定试剂的溶液，摇动混合液，然后判断凝集的有无的方法等。此外，在观察凝集的程度时，除了利用目视的方法以外，还可以使用利用摄像机拍摄凝集状态，实施图像处理的方法。

利用本发明，可以提供能够准确度良好地进行梅毒感染的诊断而且长期贮存稳定性出色的抗磷脂抗体测定试剂，以及可以防止血清干扰的发生从而可以准确度良好地进行梅毒感染的诊断的抗梅毒螺旋体抗体测定试剂。

附图说明

图1是表示使用实施例1～3、比较例1～3中的1.0R.U.的抗磷脂抗体标准液时的吸光度变化量的推移的曲线图。

图2是表示使用实施例1～3、比较例1～3中的2.0R.U.的抗磷脂抗体标准液时的吸光度变化量的推移的曲线图。

图3是表示使用实施例1～3、比较例1～3中的4.0R.U.的抗磷脂抗体标准液时的吸光度变化量的推移的曲线图。

图4是表示使用实施例1～3、比较例1～3中的8.0R.U.的抗磷脂抗体标准液时的吸光度变化量的推移的曲线图。

图5是表示使用实施例4～6、比较例4～6中的1.0R.U.的抗磷脂抗体标准液时的吸光度变化量的推移的曲线图。

图6是表示使用实施例4～6、比较例4～6中的2.0R.U.的抗磷脂抗体标准液时的吸光度变化量的推移的曲线图。

图7是表示使用实施例7～10、比较例7～16中的37T.U.的抗梅毒螺旋体抗体标准液时的吸光度变化量的推移的曲线图。

具体实施方式

(1)抗磷脂抗体测定试剂的配制

按照下述顺序，配制由第1试剂和第2试剂构成的双液系的试剂。

(1-1)第1试剂的配制

在内含1％牛血清白蛋白(LotA：serologicals公司制)的磷酸缓冲液中，添加1.2重量％的用NaOH中和之后的利匹德尔(Lipidure)D02(日本油脂公司制，分子量55万)，由此配制第1试剂。

(1-2)第2试剂的配制

直接使用MediAce RPR(积水化学工业公司制)胶乳液作为第2试剂。该胶乳液是在平均粒径0.400μm、磺酸基量0.38μmol/m²的聚苯乙烯胶乳中，敏化由心磷脂、卵磷脂以及胆固醇构成的脂质抗原而成的产物。

(实施例2)

(1-1)在第1试剂的配制中，在内含1％牛血清白蛋白(LotA：serologicals公司制)的磷酸缓冲液中，添加0.70重量％的用NaOH中和之后的利匹德尔D03(日本油脂公司制，分子量100万)，由此配制第1试剂，除此以外，与实施例1同样地进行，配制抗磷脂抗体测定试剂。

(实施例3)

(1-1)在第1试剂的配制中，在内含1％牛血清白蛋白(LotA：serologicals公司制)的磷酸缓冲液中，添加0.45重量％的用NaOH中和之后的利匹德尔D05(日本油脂公司制，分子量100万)，由此配制第1试剂，除此以外，与实施例1同样地进行，配制抗磷脂抗体测定试剂。

(比较例1)

(1-1)在第1试剂的配制中，在内含1％牛血清白蛋白(LotA：serologicals公司制)的磷酸缓冲液中，代替利匹德尔D02而添加1.2重量％支链淀粉(林原公司制)，进行溶解，除此以外，与实施例1同样地进行，配制抗磷脂抗体测定试剂。

(比较例2)

(1-1)在第1试剂的配制中，在内含1％牛血清白蛋白(LotA：serologicals公司制)的磷酸缓冲液中，代替利匹德尔D02而添加1.0重量％聚乙烯吡咯烷酮，进行溶解，除此以外，与实施例1同样地进行，配制抗磷脂抗体测定试剂。

(比较例3)

(1-1)在第1试剂的配制中，在内含1％牛血清白蛋白(LotA：serologicals公司制)的磷酸缓冲液中，代替利匹德尔D02而添加2.0重量％葡聚糖(分子量50万：西格玛公司制)，进行溶解，除此以外，与实施例1同样地进行，配制抗磷脂抗体测定试剂。

评价(1)

对在实施例1～3及比较例1～3中得到的抗磷脂抗体测定试剂，进行以下评价。

(1)配制后立即测定吸光度变化量

作为抗磷脂抗体标准液，采取20μLRPR标准血清(积水化学工业公司制，0.0、1.0、2.0、4.0及8.0R.U.的5种浓度)，在其中混合第1试剂180μm，在37℃下保持适当时间，然后进一步添加第2试剂60μL，搅拌。然后，测定在波长700nm下的从约80秒至300秒之间的吸光度的变化量，作为吸光度变化量(Δabs)。其中，吸光度测定使用自动分析装置日立7170型。另外，R.U.是使用作为抗磷脂抗体测定试剂的MediAce RPR(积水化学工业公司制)测定血清时，表示来自梅毒感染的抗磷脂抗体的抗体效价的单位。结果如表1所示。

(2)贮存稳定性的评价

在30℃下保存第1试剂，然后进行(1)抗磷脂抗体标准液的测定，通过求得将刚配制后设为100％时的Δabs的降低率来评价贮存稳定性。通常抗磷脂抗体试剂被保存在2～10℃下，但通过保存在30℃下，作为加速试验，可以评价贮存稳定性。

此外，测定是配制开始5天后、15天后、18天后以及25天后进行。

使用1.0、2.0、4.0以及8.0R.U.的抗磷脂抗体标准液时的结果分别如图1～4所示。

如图1、图2所示，可知在使用1.0R.U.或2.0R.U.的抗磷脂抗体标准液时，在25天后，使用支链淀粉、PVP、葡聚糖时的吸光度变化量降低15～30％。另一方面，使用利匹德尔D02、D03以及D05时，只降低5％以内。

(实施例4)

(1-1)在第1试剂的配制中，在内含1％牛血清白蛋白(LotB)的磷酸缓冲液中，添加0.66重量％的用NaOH中和之后的利匹德尔D03(日本油脂公司制)，除此以外，与实施例1同样地进行，配制抗磷脂抗体测定试剂。

(实施例5)

(1-1)在第1试剂的配制中，在内含1％牛血清白蛋白(LotC)的磷酸缓冲液中，添加0.66重量％的用NaOH中和之后的利匹德尔D03(日本油脂公司制)，除此以外，与实施例1同样地进行，配制抗磷脂抗体测定试剂。

(实施例6)

(1-1)在第1试剂的配制中，在内含1％牛血清白蛋白(LotD)的磷酸缓冲液中，添加0.66重量％的用NaOH中和之后的利匹德尔D03(日本油脂公司制)，除此以外，与实施例1同样地进行，配制抗磷脂抗体测定试剂。

(比较例4)

(1-1)在第1试剂的配制中，在内含1％牛血清白蛋白(LotB)的磷酸缓冲液中，代替利匹德尔D02添加1.1重量％支链淀粉(林原公司制)，进行溶解，除此以外，与实施例1同样地进行，配制抗磷脂抗体测定试剂。

(比较例5)

(1-1)在第1试剂的配制中，在内含1％牛血清白蛋白(LotC)的磷酸缓冲液中，代替利匹德尔D02添加1.1重量％支链淀粉(林原公司制)，进行溶解，除此以外，与实施例1同样地进行，配制抗磷脂抗体测定试剂。

(比较例6)

(1-1)在第1试剂的配制中，在内含1％牛血清白蛋白(LotD)的磷酸缓冲液中，代替利匹德尔D02添加1.1重量％支链淀粉(林原公司制)，进行溶解，除此以外，与实施例1同样地进行，配制抗磷脂抗体测定试剂。

评价(2)

对在实施例4～6及比较例4～6中得到的抗磷脂抗体测定试剂，进行以下评价。

(1)配制后立即测定消光度变化量

作为抗磷脂抗体标准液，采取20μLRPR标准血清(积水化学工业公司制，0.0、1.0、2.0、4.0及8.0R.U.的5种浓度)，在其中混合第1试剂180μm，在37℃下保持适当时间，然后进一步添加第2试剂60μL，搅拌。然后，测定在波长700nm下从约80秒至300秒之间的吸光度的变化量，作为吸光度变化量(Δabs)。吸光度测定使用自动分析装置日立7170型。此外，结果如表2所示。

(2)贮存稳定性的评价

在30℃下保存第1试剂，然后进行(1)抗磷脂抗体标准液的测定，通过求得将刚配制后设为100％时的Δabs的降低率来评价贮存稳定性。通常抗磷脂抗体试剂被保存在2～10℃下，但通过保存在30℃下，作为加速试验，可以评价贮存稳定性。

此外，测定时从配制开始7天后以及14天后进行。

使用1.0以及2.0R.U.的抗磷脂抗体标准液时的结果分别如图5、6所示。

如图5、6所示，在组合使用BSA的LotD和支链淀粉的情况下，在30℃下保存14天之后可见大幅度的灵敏度的降低，但组合使用BSA的LotD和利匹德尔D03的情况下，只见灵敏度略微降低。因而，可以判断，对于贮存稳定性而言，难以受到BSA引起的影响。

(实施例7)

(1)抗梅毒螺旋体抗体测定试剂的配制

按照下述顺序，配制由抗梅毒螺旋体抗原载持胶乳液形成的第1试剂和标本稀释液组成的第2试剂构成的双液系的抗梅毒螺旋体抗体测定试剂。

(1-1)抗梅毒螺旋体抗原载持胶乳液的配制

在平均粒径0.400μm的聚苯乙烯胶乳液(固体成分10(w/v)积水化学工业公司制)100μl中，添加在100mM磷酸缓冲液(pH7.4)中以150μg/ml的蛋白浓度溶解的抗梅毒螺旋体抗原液400μl，在4℃下搅拌1小时。接着，添加内含1(w/v)％牛血清白蛋白(serologicals制；BSA，Lotl)的100mM磷酸缓冲液(pH7.4)2ml，搅拌1.5小时。

将所得的液体在10℃下，30分钟、18000rpm下离心分离得到沉淀物，将该沉淀物在内含0.25(w/v)％BSA(Lot1)的100mM磷酸缓冲液(pH7.4)4ml中，使胶乳悬浮，由此配制抗梅毒螺旋体抗原载持胶乳液。

(1-2)标本稀释液的配制

在内含1％BSA(Lot1)的100mM磷酸缓冲液(pH7.4)中添加0.2(w/v)利匹德尔(2-甲基丙烯酰氧基乙基磷酰胆碱与甲基丙烯酸的共聚物：分子量100万；日本油脂公司制)。

(实施例8)

在实施例7的(1-1)抗梅毒螺旋体抗原载持胶乳液的配制中，在得到的沉淀物中添加内含0.25(w/v)％BSA(Lot1)的100mM磷酸缓冲液(pH7.4)5ml，同时在(1-2)标本稀释液的配制中，添加0.6(w/v)％利匹德尔，除此以外，与实施例7同样地进行，配制抗梅毒螺旋体抗体测定试剂。

(实施例9)

在实施例7的(1-1)抗梅毒螺旋体抗原载持胶乳液的配制中，在得到的沉淀物中添加内含0.25(w/v)％BSA(Lot1)的100mM磷酸缓冲液(pH7.4)12ml，同时在(1-2)标本稀释液的配制中，添加1.0(w/v)％利匹德尔，除此以外，与实施例7同样地进行，配制抗梅毒螺旋体抗体测定试剂。

(比较例7)

在实施例7的(1-2)标本稀释液的配制中，在内含1％BSA(Lot1)的100mM磷酸缓冲液(pH7.4)中，代替利匹德尔添加1(w/v)％pGEMA(糖基乙基甲基丙烯酸酯的均聚物，平均分子量114万，日本精化公司制)，除此以外，与实施例7同样地进行，配制抗梅毒螺旋体抗体测定试剂。

评价(3)

(1)抗梅毒螺旋体抗体标准液的测定

作为抗梅毒螺旋体抗体标准液，采取16μL梅毒阳性标准血清(积水化学工业公司制，5种浓度)，在其中混合样本稀释液175μL，在37℃下保持适当时间，然后添加抗梅毒螺旋体抗原载持胶乳液25μL，搅拌，然后，测定从约80秒至300秒之间的在波长700nm下的吸光度的变化量，作为吸光度变化量(Δabs)。测定使用自动分析装置日立7170型。结果如表3所示。此外，T.U.是用作为抗梅毒螺旋体抗体测定试剂的MediAceTPLA(积水化学工业公司制)测定血清时，表示抗梅毒螺旋体抗体的抗体效价的单位，10T.U.以上为阳性。

[表3]

(2)添加回收试验

在生理盐水245μL中，添加2000T.U.抗梅毒螺旋体抗体标准液5μL，用与评价(1)相同的方法，测定添加前后的吸光度变化量，由此求得添加前后的抗体效价的测定值。同样地进行，在5种梅毒阳性血清245μL中分别添加2000T.U.抗梅毒螺旋体抗体标准液5μL，求得添加前后的抗体效价的测定值的差，然后将在生理盐水中添加抗梅毒螺旋体抗体标准液时的添加前后的抗体效价的测定值的差设为100％，算出回收率。结果如表4所示。

[表4]

如表4所示，可知在将利匹德尔用作反应促进剂的实施例7～9中，与各标本均将pGEMA用作反应促进剂的比较例7相比，添加回收率大幅度地改善。

(实施例10)

在实施例7的(1-2)标本稀释液的配制中，使用BSA(Lot2)，除此以外，与实施例7同样地进行，配制标本稀释液。

(实施例11)

在实施例7的(1-2)标本稀释液的配制中，使用BSA(Lot3)，除此以外，与实施例7同样地进行，配制标本稀释液。

(实施例12)

在实施例7的(1-2)标本稀释液的配制中，使用BSA(Lot4)，除此以外，与实施例7同样地进行，配制标本稀释液。

(比较例8)

在实施例7的(1-2)标本稀释液的配制中，使用BSA(Lot2)，除此以外，与比较例7同样地进行，配制标本稀释液。

(比较例9)

在实施例7的(1-2)标本稀释液的配制中，使用BSA(Lot3)，除此以外，与比较例7同样地进行，配制标本稀释液。

(比较例10)

在实施例7的(1-2)标本稀释液的配制中，使用BSA(Lot4)，除此以外，与比较例7同样地进行，配制标本稀释液。

(比较例11)

在实施例7的(1-2)标本稀释液的配制中，在内含1％BSA(Lot1)的100mM磷酸缓冲液(pH7.4)中，代替利匹德尔添加1(w/v)％支链淀粉(林原制)，除此以外，与实施例7同样地进行，配制抗梅毒螺旋体抗体测定试剂。

(比较例12)

在比较例11的(1-2)标本稀释液的配制中，使用BSA(Lot2)，除此以外，与比较例11同样地进行，配制标本稀释液。

(比较例13)

在比较例11的(1-2)标本稀释液的配制中，使用BSA(Lot3)，除此以外，与比较例11同样地进行，配制标本稀释液。

(比较例14)

在实施例7的(1-2)标本稀释液的配制中，代替BSA(Lot1)在内含1％BSA(Lot2)的100mM磷酸缓冲液(pH7.4)中，代替利匹德尔添加0.1(w/v)％藻酸钠(Nacalai Tesque制)，除此以外，与实施例7同样地进行，配制抗梅毒螺旋体抗体测定试剂。

(比较例15)

在比较例14的(1-2)标本稀释液的配制中，使用BSA(Lot3)，除此以外，与比较例14同样地进行，配制标本稀释液。

(比较例16)

在比较例14的(1-2)标本稀释液的配制中，使用BSA(Lot4)，除此以外，与比较例14同样地进行，配制标本稀释液。

评价(4)

(1)贮存稳定性试验

对在实施例7、实施例10～12以及比较例7～16中得到的抗梅毒螺旋体抗体测定试剂实施贮存稳定性试验。

在试剂刚制备后以及30℃下保存标本稀释液，然后用与评价(3)的(1)相同的方法，测定梅毒标准血清的37T.U.，求得将刚制备后的设为100％时的吸光度变化量的变化率，评价贮存稳定性。通常抗梅毒螺旋体抗体试剂被保存在2～10℃下，但通过保存在30℃下，作为加速试验，可以评价贮存稳定性。

此外，对实施例7、10～12，在制备7天后、24天后进行测定。对比较例7～10，在制备14天后、31天后进行测定。对比较例11～13，在制备11天后、20天后进行测定。对比较例14～16，在制备5天后、14天后进行测定。结果如图7所示。

如图7所示，在将利匹德尔作为反应促进剂的情况下，无论是BSA的哪一个批号，贮存稳定性均良好，而为其他反应促进剂的情况下，根据BSA的批号不同而有时贮存稳定性显著变差。因而，在将利匹德尔作为反应促进剂的情况下，提供不仅准确度高而且贮存稳定性也出色的抗梅毒螺旋体抗体测定试剂成为可能。

产业上的可利用性

利用本发明，可以提供一种长期贮存稳定性出色、能够进行梅毒感染的诊断的抗磷脂抗体测定试剂，以及可以防止血清干扰的发生从而可以准确度良好地进行梅毒感染的诊断的抗梅毒螺旋体抗体测定试剂。