提高卤虫滞育孢囊孵化百分率的方法

摘要

从一定量的包括滞育孢囊的卤虫孢囊开始孵化卤虫无节幼体的方法，其通过在预定的孵育期内，在允许至少一部分孢囊孵化并释放自由游动的无节幼体的条件下，在孵化介质中孵育孢囊而进行，在该方法中，使孢囊接触包含至少一个－(OH)C＝C(OH)－结构的化合物，来破坏至少许多所述滞育孢囊的滞育，以便使它们能够在所述的预先决定的孵育期内产生自由游动的无节幼体，从而将孵化的孢囊的孵化百分率从没有使该孢囊接触所述化合物时的全部孢囊总数的X％提高至它们接触所述化合物时的高于X％的孵化百分率。

说明书

技术领域

本发明涉及通过在预先决定的孵育期内在允许至少一部分孢囊孵化并释放自由游动的无节幼体的条件下在孵化介质中孵育孢囊，从一定量的一个或多个卤虫(Artemia)物种的孢囊(cyst)(包括滞育孢囊)开始，孵化卤虫无节幼体(Artemia nauplii)的方法，在该方法中，使孢囊接触化合物来破坏至少一定数量所述滞育孢囊的滞育，以便使它们能够在所述的预先决定的孵育期内产生自由游动的无节幼体，从而将孵化的孢囊的孵化百分率从所述孢囊没有接触所述化合物时的全部孢囊总数的X％提高至它们接触所述化合物时的高于X％的孵化百分率。

背景技术

卤虫无节幼体通常用作水产养殖中的活食物生物，更特别用作海洋鱼和虾早期幼体阶段的活食物。作为活食物的卤虫无节幼体不是按原样上市销售，而是作为从其中可以孵化出无节幼虫的卤虫孢囊上市销售。存在可以产孢囊的不同的卤虫物种，如Artemia franciscana，Artemia persimilis，Artemia urmiana，Artemia tunisian，Artemiatibetiana，Artemia sinica和Artemia parthogenetica。

在卤虫的被囊胚胎或孢囊中，动物的胚胎发育在原肠胚阶段中断(或进入滞育)。就这样由雌性释放至水生环境中，这些滞育或休眠的胚胎在经受其他孵化促进环境条件时将不再发育成自由游动的无节幼体。只有在通过外部刺激去活化滞育控制机制时，才重新发育。在自然环境中，已知冷休克(冬眠)和脱水能终止滞育。在孵育条件允许时，因此激活的(或静止的)胚胎可以重新发育。

滞育的以及静止的孢囊可以存活长期的脱水和缺氧、极端温度和压力。在自然环境中，这样的抵抗力是物种的存活策略，因为孢囊通常暂时是给定群落生境中动物的唯一生活阶段。在它们的自然环境之外，当被充分脱水并适当储存时，即，在干燥的环境中，优选在低温以及远离光和氧气时，孢囊保持生存力持续相当长的一段时间(几年)。产生自由游动的无节幼体需要的这种延长的耐储性的特性和随之发生的全年现货供应的可利用性，以及短的孵育时间使它们成为最方便的、最不劳动密集的用于水产养殖的活食物的来源(Van Stappen，1996)。

从自然环境收集用于后者水产养殖应用的卤虫孢囊。在这样收集的未加工产品中，存在着不同比例的静止和滞育的孢囊。在应用一系列加工和调节程序后获得干的、即可使用的商业产品。在加工中，将未加工的产品纯化(除去碎片)，洗涤(除去盐)，并且最终干燥。标准调节技术通常设法复制冬眠(储存于冷的仓库中)和/或干燥(用热空气作为加工程序的一部分来干燥)的自然条件，并且通常导致实际上全部单个孢囊中滞育机制的去活化。

然而，许多时候加工过的孢囊的孵化率仍然是差的，因为胚胎不能进入自由游动的无节幼体的阶段。

以H％，Heff或Houtput来测量孵化率，并考虑孵化方法的最后结果，即，自由游动的无节幼体。孵化百分率(H％)是从100个完整孢囊出现的自由游动的无节幼体的数量，孵化效率(Heff)是从一克孢囊产品孵出的自由游动的无节幼体的数量，孵化产量(Houtput)是从一克孢囊产品孵出的自由游动的无节幼体的重量。

胚胎有时不能进入游动的无节幼体阶段的原因通常与不适当的孵育条件相关。然而，孢囊固有的因素也可能引起这种问题(例如：不足量的储存能量)。此外，在一些卤虫株系或相同株的一些批次中，或多或少大量的胚胎，尽管是存活的，却不能够开始孵化程序。对于这样的株系或批次，直至所应用的加工或调节技术明显不能去活化所有单个孢囊中的滞育，以便获得最大数量的自由游动的无节幼体时，补充性的和更特异性的滞育去活化程序将是必需的(Van Stappen，1996)。

所述的程序包括干燥孢囊的a.o.延长冷储存，重复的水合-脱水循环，特定化学物质(例如，过氧化氢)溶液中的短时孵育。这些技术是株系和批次特异性的，此外，孢囊常常以反复无常的方式应答。不适当地进行时，甚至获得不利的结果(例如，在不适当的时间-剂量组合下在化学物质溶液中的孵育)。将这些技术另外应用，并在直至那时已经应用加工技术之后，即，由孢囊的使用者来应用。它们需要后者大量的工作、技巧和足够的一般卤虫背景知识以及关于待处理的特定株系或批次的特定信息。没有这将是错误和/或不利结果的起源。这些特定的、补充的滞育停止技术的使用者不相宜的性质消除了卤虫孢囊的主要优势之一：水产养殖的易获得新鲜食品的来源。

EP1195088中公开了能够处理孢囊来提高其孵化百分率而不需要太多处理步骤的方法。在这个方法中，将0.5至30mg/l孵化介质范围内选定量的过氧化氢引入孵化介质中，其中以最大约每升5g孢囊干物质的密度来孵化孢囊，将孵化百分率从孢囊没有接触过氧化氢时的全部孢囊总数的X％提高至它们接触过氧化氢时的高于X％的值。

该方法的缺点是该方法中的孵化依赖于过氧化物的量。更特别地，在孵化介质中需要引入0.5至30mg/l的量，以允许破坏至少一定数量滞育卤虫孢囊的滞育，以便使这样的滞育孢囊能够在孵育期内产生自由游动的无节幼体。在过氧化物浓度低于最佳过氧化物浓度范围时，孵化没有达到其最大值，在过氧化物浓度高于最佳过氧化物浓度的范围时，过氧化物对无节幼体是毒性的，并且这反映在孵化低于最大值。该最佳浓度的范围非常小，并且由于其还依赖于卤虫的株系或批次，因此在可以计算过氧化氢剂量之前必需通过标准化的测试来测定每个批次或株系的最佳过氧化物浓度的范围。这种最佳范围的测定是费时的工作，没有小心谨慎地进行时，其能降低孵化百分率。

发明内容

因此，本发明的目的是提供一种提高卤虫孢囊孵化百分率的可替换方法，而没有限制允许最大孵化百分率的最佳浓度的狭窄范围。

为此，使孢囊接触至少一种包含至少一个-(OH)C＝C(OH)-结构的化合物，来破坏至少一定数量滞育孢囊的滞育，以便使它们能够产生自由游动的无节幼体，从而将孵化百分率从孢囊没有接触所述化合物时的全部孢囊总数的X％提高至它们接触所述化合物时高于X％的值。

本发明人已经发现，使孢囊接触所述化合物，更特别地，将所述化合物引入孵化介质中，能够破坏至少一定数量滞育孢囊的滞育，并因此提高孵化百分率。令人意外地，在这个新方法中，在所述化合物的非常大浓度范围内获得最大孵化，与EP1195088中所述的方法相反，其中最大孵化只可能在窄范围的过氧化氢或产生过氧化氢的化合物中。

该特征的重要优势是测定最佳浓度范围时，保持接近该最佳浓度不是那么关键。对卤虫的致死作用不常发生，即使在最佳结果的所述化合物的最小剂量双倍或三倍时。

另一个重要优势是与EP1195088中详细说明的过氧化物或产生过氧化物的化合物相比较，包含至少一个-(OH)C＝C(OH)-结构的化合物是较低侵蚀性的(较低的氧化性，较低的可燃性)，这对于加工孢囊的生产机构中的劳动者或对于使用孢囊的农夫是较低伤害的。

本发明还涉及一定量的一个或多个卤虫种的孢囊，预定将该孢囊在孵化介质中孵育，来产生自由游动的无节幼体，并且在不含包含至少一个-(OH)C＝C(OH)-结构的化合物的孵化介质中孵化它们时，显示出全部孢囊总数的X％的孵化百分率。根据本发明的孢囊的特征在于它们结合一定量的至少一种包含至少一个-(OH)C＝C(OH)-结构的化合物，该量足以将孢囊的孵化百分率从X％提高至将该量的所述化合物引入孵化介质中时高于X％的孵化百分率。

使用一种或多种包含至少一个-(OH)C＝C(OH)-结构的化合物替代EP1195088中提及的过氧化氢或产生过氧化物的化合物的优势是对孵化百分率的影响较少依赖于其量。此外，这些特定的化合物更易于溶于水，而没有失去其提高孵化百分率的特定活性。因此，更易于使它们停留(包被)在孢囊上。

再一个优势是所述化合物附着在孢囊上，当孢囊的密度低于或高于常规实践中所用的常见密度时仍然具有它们提高孵化百分率的比活。

另一个优势是将所述化合物引入孵化介质中时，TCBS-琼脂上的细菌数同时得到抑制，而没有伤害孵化过程中或孵化之后的自由游动卤虫无节幼体。

本发明的其他特征和优势将从以下根据本发明的孵化方法和容器中包装的孢囊的一些特定实施方案的描述中变得明显。在本说明中，参考其中附图。

在图中，对可购得的绿茶提取物给出数据，这种绿茶提取物含有最少98％的多酚，其中至少50％含有表没食子儿茶精没食子酸盐。将这种商业化合物称为“EGCG”并且以毫克化合物/升或ppm来计算剂量。

本发明一般性地涉及从含有一定数量滞育孢囊的卤虫孢囊开始，产生自由游动的卤虫无节幼体的方法。就如在常规孵化方法中一样，在允许孢囊孵化并释放自由游动的无节幼体的条件下在孵化介质中孵育孢囊，通常但不是必需的，在一天(24小时)的孵育期内。将干燥的孢囊或储存于盐水中的孢囊(湿的孢囊)加入至少含有水的孵化介质中时，即，孢囊开始水合时，孵育期开始。因为孵化介质的组成和最佳的孵化条件通常是本领域技术人员已知的并在文献中有描述，特别是在如上所提及的Van Stappen(1996)中，在此不需要对这种组成和这些条件作进一步描述。然而，应当注意到也可以在稍微不同于最佳条件的条件下孵化孢囊。例如，可以在低于或高于28℃的温度，例如，在约30℃的温度或在含有低于或高于35g/l溶解的盐的孵化介质中孵化孢囊。尽管在实践条件下，优选约2g/l或稍微低一些的孢囊密度，孢囊密度也可以低于或高于2g/l。然而，通常孢囊密度低于10g/l或甚至低于5g/l。

根据本发明的方法的本质特征是使孢囊接触至少一种提高孵化的化合物，该化合物包含至少一个-(OH)C＝C(OH)-结构，特别是通过将这种提高孵化的化合物引入孵化介质中，来破坏至少一定数量滞育卤虫孢囊的滞育，以便还能够使这样的滞育孢囊产生自由游动的无节幼体。在孢囊含有部分滞育孢囊的情况中，将孵化百分率从没有引入所述化合物的孵化介质中孵化孢囊时的全部孢囊总数的X％提高至在含有所述化合物的孵化介质中孵化时的高于X％的孵化百分率。清楚的是，在根据本发明的方法中，孵化至少部分滞育孢囊，但不必需孵化加入孵化介质中的所有滞育孢囊，尽管优选孵化尽可能多的滞育孢囊。

孢囊中更高的孵化百分率的结果是在更多孢囊孵化时，孵化介质中释放更多用于异养海洋细菌的底物。令人意外地，当通过在孵化介质中引入所述化合物提高孢囊孵化时，孵化介质中的相同化合物同时抑制了细菌(主要是弧菌)的生长。

图4显示五个不同孢囊株系(孢囊1至孢囊5)的孵化介质的Marine琼脂和TCBS(硫代硫酸盐柠檬酸盐胆汁盐蔗糖琼脂)上的细菌数，这些孢囊中的至少一些处于滞育中，使其接触不同浓度的EGCG，在有效破坏最大数量特定株系孢囊滞育的范围中选择所述浓度。没有使用包含至少一个-(OH)C＝C(OH)-结构的提高孵化的化合物的孵化介质中在孵育24小时后在TCBS上的细菌数(主要是弧菌)通常高于10⁶CFU/ml。令人意外地，用EGCG孵化孢囊时，孵化介质中的弧菌量在孵育24小时后显著降低(与对照相比较，2-4个对数单位)。

在根据本发明的方法中，引入孵化基质中的含有至少一个-(OH)C＝C(OH)-结构的化合物的量优选为至少1mg/l，更优选至少3mg/l。使用至少5mg化合物/升孵化介质的量时，获得最佳结果，并且最优选至少10mg化合物/升孵化介质。基于被引入孵化介质中并提高孵化的含有至少一个-(OH)C＝C(OH)-结构的所有不同化合物的总和来计算所述量，因为在实践中含有可以用来提高孵化百分率的所述化合物的一些产品包括多于一种所述化合物的混合物。

可以在孵育期开始时将包含至少一个-(OH)C＝C(OH)-结构的化合物引入孵化介质中，特别是在将孢囊加入孵化介质中时将所述化合物引入孵化介质中。如下文中所解释的，这将是将所述化合物混合干燥孢囊时的情况。也可以在将孢囊加入孵化介质之前将包含至少一个-(OH)C＝C(OH)-结构的化合物引入孵化介质中。在这种情况中，应将引入孵化介质中的所述化合物的量理解为在向孵化介质中加入孢囊时其中存在的所述化合物的量，因为加入所述化合物后，其中一部分已经反应掉。

当包含至少一个-(OH)C＝C(OH)-结构的化合物没有和孢囊同时引入孵化介质中时，优选在孵育期开始后少于10小时，更优选少于8小时，将它们引入其中。在孵育期开始后少于6小时，尤其是少于5小时将所述化合物引入孵化介质中时，获得对孵化百分率的最佳效果。清楚的是不必将所述化合物的总量一次引入孵化介质中，但可以分几次将其引入其中。

为了获得最大孵化百分率，根据本发明待引入孵化介质中的包含至少一个-(OH)C＝C(OH)-结构的化合物的量取决于孢囊的具体株系或具体批次。它特别取决于滞育孢囊的数量，尤其是还取决于滞育的深度，即，取决于滞育阶段。然而，与使用过氧化氢(EP1195088)的现有技术的方法相反，其中可以达到最大孵化百分率的范围大得多，以至于可以使用至少双倍或三倍量而对卤虫无节幼体没有任何毒性影响。此外，最大孵化百分率值通常甚至高于使用过氧化氢的方法中的最大孵化百分率值。

图1中说明了EPGC对孵化百分率(H+和H-)的剂量作用对比过氧化氢的剂量作用。在这个实施例中，使用一系列1升的圆锥桶，其中将2g相同批次的卤虫孢囊，包括滞育孢囊(含水量：7.5％)，引入人造海水中(25g/l)。圆锥桶中的水温保持恒定在大约30℃，将水不断地充气和照明。在孢囊孵育开始时将不同剂量的EGCG和过氧化氢(H₂O₂)加入孵化介质中。每个处理重复进行三次，并且处理结果为三次的平均值。从图1中可以看出，在该实施例中，加入8mg/L过氧化氢获得最大78.9％的孵化百分率，对于EGCG的最大孵化百分率为83.8％。更重要的，在9mg过氧化物/L的浓度，孵化百分率已经显著降低。使用高于8mg/L过氧化氢剂量显现出来的H-和H+之间的差异证明了对自由游动的无节幼体的毒性影响。这种毒性影响在EGCG曲线中没有出现。在16mg EGCG/L的浓度，孵化百分率显示超过80％，并且甚至在引入至少两倍(40mg/L)或至少三倍(60mg/L)量EGCG时，孵化百分率停留在80％以上。剂量的范围比过氧化氢更宽得多，这实际上暗示了将方法扩大规模至商业实践时，对于超剂量存在较低的风险。

在图2中，在与图1相同的实验条件中使用三个不同的EGCG剂量，用于卤虫孢囊的五个不同株系或批次。最大孵化百分率随株系与株系或批次与批次的不同而不同，但是将例如30mg EGCG/L剂量应用于所有批次时，没有测定这些批次中每一批的最大孵化百分率的特定浓度，直到应用的剂量对这些批次中的任意一批没有毒性作用。因此，不是必需测定用于获得孢囊每个批次或株系的最大孵化百分率的最佳范围，但是优选，至少测定以上的浓度的下限，其对应的孵化百分率接近于最大孵化百分率。

在根据本发明的方法中，可以使用包括提高孵化的化合物的产品，该提高孵化的化合物包含至少一个-(OH)C＝C(OH)-结构，或多于一种这样的提高孵化的化合物的混合物。提高孵化的化合物中的-(OH)C＝C(OH)-结构优选是所述化合物的芳香族结构的一部分。更优选，提高孵化的化合物选自含有多酚和/或类黄酮的组，更优选这些多酚和/或类黄酮含有儿茶酚和/或棓酚结构(儿茶酚结构或基团：-C₆H₅O₂；棓酚结构或基团：-C₆H₅O₃)。

这样产品的实例是可购得的产品，如绿茶提取物，儿茶提取物，葡萄籽提取物等。这些产品通常含有高百分比的不同多酚和/或类黄酮的混合物。

多酚和类黄酮包括一大组次级植物代谢产物。目前超过5000种单独的化合物是已知的，这是基于非常少的核心结构。它们多数主要源自各种羟基化模式(至多六个羟基)和通过简单甲基化或不同的单-和双-糖的醚取代。原花色素大部分产生于绿茶(Camillia sinensis)、葡萄籽和皮(Vitis vinifera)，或可可(Theobroma cacao)。

尤其是含有儿茶酚和/或棓酚结构的多酚和/或类黄酮成为提高滞育孢囊孵化百分率的良好候选物。该组的实例是：儿茶酚，焦性没食子酸，焦性儿茶酚，没食子酸丙酯，没食子酸月桂酯，没食子酸辛酯，甲基儿茶酚，丙基儿茶酚，二羟基苯甲醛，鞣花酸水合物，多巴胺HCl，DL-异丙基肾上腺素硫酸盐脱水物，没食子苯乙酮，迷迭香酸，间苯三酚，并特别属于类黄酮组：二氢黄酮组，例如：木犀草素；黄酮醇组，例如：槲皮素，漆树黄酮，杨梅黄酮；二氢黄酮醇组，如：紫杉叶素；黄烷-3-醇组，例如：儿茶素，表儿茶素，表没食子儿茶精，表儿茶素没食子酸盐，表没食子儿茶精没食子酸盐和其他如花青素。

实际上，含有至少一个儿茶酚或棓酚形式的芳香族结构的大多数类黄酮或多酚是提高滞育孢囊孵化百分率的良好候选物。类黄酮的综述可以在Pietta(2000)的综述中找到，在此引入作为参考。

在实践中，使用含有上述化合物的混合物的产品(大部分是可购得的产品)。尽管如此，也可利用包括不超过一种所述化合物的产品。

可以通过采取一定数量的孢囊样品并在实质上相同的条件下(相同的温度，含盐量，孢囊密度等)孵化这些样品，来测定孢囊的最大孵化百分率(M％)，所述条件相互之间唯一的差异是每单位体积引入其中的一种或多种选定的包含至少一个-(OH)C＝C(OH)-结构的提高孵化的化合物的量不同。接着，可以测定对于产生孵化百分率可能提高的不同量的孵化百分率，特别是可以选择产生最高孵化百分率M％的最佳量。替代选择产生最大孵化百分率M％的量，也可能选择产生更小孵化百分率的量，特别是产生至少等于X％+0.4＊(M-X)％(X％＝没有添加提高孵化的化合物时的孵化百分率)的孵化百分率的量，并且优选是产生至少等于X％+0.6＊(M-X)％的孵化百分率的量，其为实质上对应于产生最优选选择的所述最大孵化百分率M％的所述量的量。

附图说明

图1是显示加入孵化介质中的过氧化氢和EGCG对包括滞育孢囊的卤虫孢囊孵化的剂量相关效果的图。计算为无节幼体加伞部加胚胎总数上的孵化的无节幼体数量的孵化百分率称为H-。计算为无节幼体加伞部加胚胎总数上的孵化的无节幼体加数量的孵化百分率称为H+。

图2是显示不同批次的包括滞育孢囊的卤虫孢囊之间EGCG的最佳剂量可变性的图。

图3是显示将EGCG引入孵化介质时对将其包被在孢囊上时孵化介质中孢囊密度对孵化百分率的影响的图，更特别是以每克孢囊8mgEGCG的量。

图4是显示孵化介质中引入30mg EGCG/l后24小时，Marine琼脂(MA)和TCBS-琼脂上的微生物数的图。

具体实施方式

在以下的实施例中，用下列产品获得最大孵化百分率，该产品包含以下浓度的不超过一种不同的化合物，该化合物包含至少一个-(OH)C＝C(OH)-结构：

焦性儿茶酚：孵化介质中14ppm

焦性没食子酸：孵化介质中14ppm

槲皮素：孵化介质中30ppm

甲基儿茶酚：孵化介质中15ppm

没食子酸丙酯：孵化介质中40ppm

预定用于根据本发明方法中的孢囊是一个或多个卤虫种的孢囊。将它们投放市场时，通常将它们包含于容器中，特别是在罐中。然而，还可以将它们包装于其他容器中，如袋子，坛子，瓶子等。容器可以含有不同量的孢囊，即孢囊的量例如在0.01和50kg之间，更特别在0.1和10kg之间变化。根据本发明，容器中优选含有所述量的孢囊并结合一定量的一种或多种上述提高孵化的化合物，其含有至少一个-(OH)C＝C(OH)-结构。将包装的孢囊以任意密度加入孵化介质中时，这种结合孢囊的提高孵化的化合物的量至少足以将上述量的所述化合物引入孵化介质中。

优选，结合所述量孢囊的所述提高孵化的化合物的量使得在孵化介质中存在该量的提高孵化的化合物下孵化孢囊时，孵化百分率至少等于X％+0.4＊(M-X)％，优选至少等于X％+0.6＊(M-X)％，最优选实质上等于M％。如上已经解释的，M％是在孵化介质中引入最佳量的提高孵化的化合物时在应用的孵化条件下可获得的最大孵化百分率，而X％是在相同孵化条件但没有添加这些化合物下的孵化百分率。

根据本发明，已经发现孵化介质中含有至少一个-(OH)C＝C(OH)-结构的化合物的最佳量取决于孵化介质中孢囊的密度。从发明人进行的实验可以看出，实际上在2g/l的孢囊密度下引入孵化介质中的提高孵化的化合物的浓度没有引起与使用更高的孢囊密度时(例如6g/l)相同的孵化百分率提高。这意味着在更高的孢囊密度下，为了获得对孵化百分率的相同效果，必需获得更高浓度的所述化合物。

因为含有至少一个-(OH)C＝C(OH)-结构的化合物比过氧化物更稳定，并且是溶于水的，因此更容易以均匀的方式将它们混合或包被在孢囊上，使得以低密度(例如，低于2g/L的密度)或高密度(例如，高于2g/l的密度，特别地甚至高于5g/l的密度)在罐中孵育孢囊时，孵化介质中所述化合物的浓度随着递增的孢囊密度而增加，使得仍然至少等于获得比没有将所述化合物加入孢囊中时更高的孵化百分率需要的最小浓度。相反，过氧化氢或产生过氧化氢的化合物大部分不稳定并因此难以附着于孢囊。通常，这些化合物必需与孢囊混合，特别是当将孢囊以高密度加入时，这将导致孵化介质中不正确的浓度。

在图3中，观察到将提高孵化的化合物包被在孢囊上的优势。在与上文所述的相同孵化条件下，例如图1中所说明的，在1升圆锥桶中孵化卤虫孢囊，包括滞育孢囊，但是以每升2g孢囊或更高的不同密度。对一个系列的孢囊，在孵育孢囊的相同时刻将EGCG以20ppm(20mg/L)浓度加入孵化介质中。当使用更高的孢囊浓度时，将相同量的EGCG引入孵化介质中，EGCG的量不足以将孵化提高至最大孵化百分率(参见图3)。

在另一个系列中，将具有7.5％含水量的孢囊用每克孢囊8mgEGCG包被(即，每克孢囊干物质约8.6mg EGCG)并在孵化介质中孵育。在正常的密度(2g/L)，这种包被在孵化介质中获得16ppm(mg/L)EGCG的浓度。当使用更高密度时，浓度也变得更高，显示出将化合物包被在孢囊上的优势。在每升4g孢囊的密度，EGCG的浓度为32ppm(每克孢囊8mg EGCG×4g孢囊/升＝每升孵化介质32mgEGCG)。以6g/L的密度孵育孢囊时，浓度变成每升孵化介质48mgEGCG，并且该实施例中的孵化百分率保持80％以上。

结合所述量孢囊的含有至少一个-(OH)C＝C(OH)-结构的提高孵化的化合物，优选结合至少1mg/克孢囊干物质量的孢囊，优选至少2mg/g孢囊干物质，更优选至少3mg/g孢囊干物质和最优选至少5mg/g孢囊干物质，孢囊优选包含在容器中，特别是在罐中。在实践中，孢囊从来不是绝对干燥的，因此根据孢囊的含水量(其通常低于10％)，每克实际孢囊的所述化合物的相应量稍微小一些。在本专利申请中，孵化介质中的孢囊密度通常仍然表示为每升孵化介质的实际孢囊(其含水量低于10％)的克数。

结合孢囊的提高孵化的化合物优选是其所述结构是所述化合物的芳香结构一部分的化合物。这些化合物优选选自多酚和/或类黄酮，特别是含有儿茶酚和/或棓酚结构的多酚和/或类黄酮。

在实践中，有时候将包含超过一种所述化合物的混合物的产品结合包装中的孢囊。以上给出了这样产品的实际实例。

将一定量的孢囊包含在容器中时，可以通过将提高孵化的化合物包装在分开的包装中来使其结合容器中所含的孢囊，使得含有孢囊的容器和含有提高孵化的化合物的包装形成可以原样销售的套装(set)。优选，将所述提高孵化的化合物与孢囊共同包装，例如，固定在含有孢囊的容器外部或与该容器一起包含在相同的包装中。

然而，更优选，也可以将提高孵化的化合物包含在容器中。当使用液体溶液时，例如，可以将其包含于玻璃或塑料瓶或小瓶(瓶子)中并与容器特别是罐中的孢囊包装在一起。当使用固体的提高孵化的化合物时，可以将该化合物直接与孢囊混合成粉末或颗粒或片剂或其他固体形状。当然，例如，也可以与孢囊混合包装于胶囊中。最优选，将提高孵化的化合物附着或换句话说包被在孢囊上。这样，总是将正确量的孵化提高化合物加入孵化介质中，尤其是当只将容器中所含的一部分孢囊引入孵化介质中时。

参考文献：

Pietta，P-G.Reviews：flavonoids as antioxidants(综述：作为抗氧化剂的类黄酮)，(2000)在：J.Nat.Prod.Vol.63.p1035-1042Van Stappen，G.Introduction，biology and ecology of Artemia(卤虫的介绍，生物学和生态学)，(1996)在：Manual on the productionand use of live food for aquaculture(水产养殖的活食物的生产和使用指南)。Lavens，P.和Sorgeloos，P.编辑。Laboratory of Aquacultureand Artemia Reference Center(水产养殖和卤虫参照中心的实验室)，University of Ghent(根特大学)，比利时，p.79-136