麦冬皂苷D在制备调控血管内皮细胞信号转导基因药物中的应用

摘要

本发明将信号转导基因芯片包括120条NFKB介导的信号转导基因，经运用基因芯片技术检测结果显示，H

说明书

一、技术领域

本发明涉及麦冬皂苷D在制药中的新用途，具体地说是涉及麦冬皂苷D在制备调控血管内皮细胞周期基因药物中的应用，属中药技术领域。

二、背景技术

1.麦冬通过保护血管内皮细胞来完成养阴行血之功效

麦冬为临床滋养阴液的常用之品，是养阴生津的代表药物之一。麦冬，百合科植物麦冬Ophiogon japonicus(Thumb.)Ker-Gawl.的干燥块根。主要含多种糖甙：麦门冬皂苷B、D，23，24二羟基罗斯考皂，麦冬甙元-3-O-a-L-吡喃鼠李糖基(1-2)-β-D-吡喃葡萄糖甙，甲基麦冬黄烷酮A、B，麦冬黄烷酮A、B，6-醛基异麦冬黄烷酮A、B，麦冬甙元，丙三醇以及β-谷甾醇、豆甾醇。另含挥发油，从中分得长叶烯、α-广藿香烯、β-广藿香烯、香附子烯、愈创奥烯、α-律草烯、樟脑、芳樟醇等成分。麦冬始载于《神农本草经》，味甘、微苦，性微寒，归肺、胃、心经。具有养阴生津、润肺清心的功效。

前期研究发现养阴代表中药麦冬的药物血清胚层有效部位群/组分/成分，具有不同程度的保护血管内皮细胞的作用，其中正丁醇部位的药效作用更为显著，以标准品麦冬皂苷D为对照进行高效液相分析发现，其中含有麦冬皂苷D成分。

2.麦冬皂苷D的研究进展

沿阶草属麦冬主产于四川绵阳，三台和浙江慈溪，萧山等地。杭麦冬与川麦冬的总皂苷的含量差异与栽培年限相关，杭麦冬生长周期为2～3年，川麦冬的栽培期为1年。不同产地麦冬的单体成分麦冬皂苷B、D含量也有较大差别，杭麦冬主含麦冬皂苷B、含少量皂苷D；而川麦冬主含麦冬皂苷D、含少量皂苷B。

研究发现麦冬皂苷D可显著抑制静脉血栓模型大鼠早期外周血中性粒细胞活化、粘附；减轻血栓重量；降低血清sICAM-1含量；其副作用低；麦冬皂苷D还可下调大鼠静脉血栓部位TF蛋白表达，并抑制MAPKp38和JNK磷酸化，提示麦冬皂苷D可通过影响上述信号通路，降低炎症反应，抑制血栓形成。另麦冬皂苷有显著性的抗炎作用，鲁斯可皂苷元和麦冬皂苷D为其中的两种活性成分。

同种不同产地样品中麦冬皂苷D的含量有较大差别，浙江产麦冬含量较低，四川产麦冬含量较高。对浙江产麦冬、四川产麦冬不同批次样品测定，发现麦冬皂苷D的含量差别较大，且同一产地浙江产麦冬中麦冬皂苷D的含量相差更大。生长年限对麦冬皂苷D的含量有一定的影响，年限长，含量略有增加。因此麦冬皂苷D含量的高低仅仅可作为川麦冬质量指标，而不适合作为浙麦冬质量的指标。

由于皂苷为一类极性较大，结构复杂的化合物，它无紫外吸收，无专一显色剂，再加上麦冬皂苷测定经常受糖的干扰，若采用紫外检测末端吸收法，则灵敏度低，且有干扰峰，无法使用。因此，我们采用比色法测定麦冬总皂苷含量为0.2855％，利用HPLC-ELSD法测定麦冬皂苷D的含量为0.03229％。为进一步获取其内在成分的信息，我们进行了ESI-TOF-MS测试，以ESI正离子为麦冬皂苷主要电离方式，乙腈-水梯度洗脱，205nm为检测波长提取紫外色谱图，确定35.52min为麦冬皂苷D，其裂解方式为先脱去与岩藻糖(1→2)连接的鼠李糖及(1→3)连接的木糖，后脱去岩藻糖。采用两种测试方法全面综合分析麦冬皂苷D。

3.麦冬皂苷D的提取分离

取5~10目麦冬药粉，加10倍量70％乙醇，热回流提取3次，每次2h。合并提取液，减压浓缩至无醇味。然后，将其溶于1000mL水中，用3倍量乙酸乙酯振摇提取3次，得到乙酸乙酯提取物和水层。将水层继续用3倍量正丁醇振摇提取3次，得到正丁醇提取物和水层，合并正丁醇液，用0.1mol/L NaOH振摇提取2次，弃去0.1mol/L NaOH。将正丁醇提取物进行大孔树脂柱洗脱，依次用水、10％乙醇、30％乙醇、60％乙醇、95％乙醇和乙醇梯度洗脱，分别得到相应的洗脱物。60％乙醇洗脱物经硅胶柱色谱，水饱和正丁醇洗脱，得到麦冬皂苷D。

三、发明内容

本发明的目的在于提供麦冬皂苷D在制药中的新用途，具体地说是提供麦冬皂苷D在制备调控血管内皮细胞信号转导基因药物中的应用。

保护血管内皮细胞是防治心脑血管病症的重要环节

血管内皮细胞(vascular endothelial cell，简称VEC)能合成多种血管活性物质，对血管的舒缩功能与血液的流动性有着不可替代的调节作用。血管内皮并非单纯的衬里，它有着活跃的生理功能。如对凝血和抗凝；纤溶抗纤溶；血小板聚集和抗聚集；白细胞粘附和抗粘附；血管舒缩以及平滑肌细胞间的调控(促增殖和抗增殖)都处于动态平衡状态，一旦受到损伤则失去平衡，有的学者称之为内皮功能障碍(Endothelial dysfunction)，是促进形成早期动脉粥样硬化的始动因素，也是目前研究的热点。VEC生理功能的动态平衡是维持血行正常的重要条件。因此，当VEC受到损伤时，不仅自身的生理功能被破坏，而且还会激活多种凝血和促凝因子，致使血液成分改变和粘度增高，导致血液速度减慢或出现旋涡，从而易于产生血瘀。VEC可因诸多因素受损，主要包括自由基、炎症介质、内毒素等。这些致病因素作用于VEC，可直接加速其凋亡而引起功能失衡，最终引起促栓作用形成微血栓而引发、加重心脑血管疾病。可见，VEC损伤心脑血管疾病中占有非常重要的地位。所以改善和保护血管内皮细胞形态及功能的完整性，是预防和治疗心脑血管疾病的重要着眼点。

本发明运用基因芯片技术，将人NFkB信号转导基因芯片包括120条NFkB介导的信号转导通路基因。即编码Rel，NFkB，and IkB家族、NFkB应答基因、胞外激活配体与受体的基因、传导信号的激酶与转录因子、可能与病毒复制、自身免疫疾病、炎症反应、肿瘤发生与凋亡调节有关的NFkB介导的信号转导基因。检测结果显示H₂O₂可以上调NFkB介导的41条信号转导通路相关基因，而麦冬皂苷D可以下调47条基因，包括上述的37条基因。H₂O₂可以下调NFkB介导的信号转导通路相关的一条基因NALP12，而麦冬皂苷D则可上调该通路相关的一条基因TBK1，从而达到保护血管内皮细胞形态及功能的完整性。

四、具体实施方式

实施例：麦冬皂苷D调控血管细胞信号转导基因的研究

从中药麦冬提取分离的有效成分麦冬皂苷D对人脐静脉血管内皮细胞有抗H₂O₂所致凋亡的作用。本发明运用基因芯片技术，针对血管内皮细胞信号转导相关基因，发现了麦冬皂苷D所调控的血管内皮细胞基因表达谱。

1材料与方法

1.1主要试剂：RPMI-1640培养基(GIBCO，USA)(每升含20％小牛血清、L-谷氨酰胺0.33mg、青霉素100u、链霉素100u、pH-7.4)；消化剂为0.25％胰蛋白酶(MERCK，USA)；四川绵阳产麦冬，购自南京市药材公司，经南京中医药大学中药鉴定教研室鉴定为Ophiopogon japonicus.(L.f.)Ker-Gawl.的块根。

RNA抽提试剂：TRIZOL^试剂(Invitrogen life technologies)，氯仿，异丙醇，75％乙醇(以DEPC处理的水配制)，无RNA酶的水，无RNA酶的糖原(Invitrogen life technologies)。

RNA质量检测试剂：TE：10mM Tris-HCl pH8，1mM EDTA，0.4M MOPS，pH7.0，0.1M乙酸钠，0.01M EDTA，甲醛，甲醛上样染液(ambion)，溴化乙锭(Ethidium Bromide，EB)，琼脂糖。

cRNA标记与合成试剂：TrueLabeling-AMP^TM线性RNA扩增试剂盒(cDNA合成：G1：TrueLabeling引物，RI：RNA酶抑制剂，G2：cDNA合成酶混合液，G3：5X cDNA合成缓冲液，H2O：除RNA酶的H2O。RNA线性扩增以及cRNA合成：G4：2.5X RNA扩增缓冲液，G5：扩增酶类混合液)。Biotin-16-dUTP(Roche Cat.No.1-093-070)，SuperArray ArrayGrade cRNA纯化试剂盒。

芯片杂交试剂：Oligo GEArray^芯片Human NFkB Signaling PathwayMicroarray：OHS-025(美国SuperArray公司提供)。，20X SSC：(900ml H2O中溶解175.3g的NaCl和88.2g的二水柠檬酸钠，用1M的HCl调节pH到7.0，加水至1L)，20％SDS：(1L H2O中溶解200g十二烷基磺酸钠)。

化学发光检测试剂：化学发光检测试剂盒Chemiluminescent DetectionKit(SuperArray Bioscience，Catalog Number D-01)，GEA封闭液Q，5X缓冲液F，AP，缓冲液G，CDP-Star化学发光底物。

1.2麦冬皂苷D的提取分离：取5~10目麦冬药粉，加10倍量70％乙醇，热回流提取3次，每次2h。合并提取液，减压浓缩至无醇味。然后，将其溶于1000mL水中，用3倍量乙酸乙酯振摇提取3次，得到乙酸乙酯提取物和水层。将水层继续用3倍量正丁醇振摇提取3次，得到正丁醇提取物和水层，合并正丁醇液，用0.1mol/L NaOH振摇提取2次，弃去0.1mol/L NaOH。将正丁醇提取物进行大孔树脂柱洗脱，依次用水、10％乙醇、30％乙醇、60％乙醇、95％乙醇和乙醇梯度洗脱，分别得到相应的洗脱物。60％乙醇洗脱物经硅胶柱色谱，水饱和正丁醇洗脱，得到麦冬皂苷D。

1.3药物分组：分为对照组、造模组(100umolH₂O₂)和麦冬皂苷D组(100umolH₂O₂+1.29ug/ml麦冬皂苷D)。

1.4血管内皮细胞的培养：无菌条件下取胎龄为37~40wk的新生儿脐带(长约30~50cm)，排尽残血，剪去钳夹部分，投入灭菌保存液(0.14mol/L NaCl、4mmol/L KCl、15mmol/L Hepse、11mmol/L葡萄糖、pH7.3)中，4℃保存。然后用D-Hanks液(pH7.3~7.4)反复灌洗脐静脉，直至将余血冲洗干净。向静脉内注入0.25％的胰蛋白酶5~10ml，在37℃下孵育10min。收集脐静脉腔内的消化液，此后迅速注入适量(5ml)含20％小牛血清的培养液以终止酶消化作用并收集入刻度离心管中。收集细胞的全过程应在两分钟内完成。室温下1000rpm，离心10分钟，倒尽上清液，吸取1ml培养液于离心管中，吹打成悬液，用0.4％台酚蓝染色少量细胞悬液。计数活细胞在95％以上，再加入20％RPMI-1640培养基，调整细胞浓度为5×10⁷·L^-1，将此浓度的原代HUVEC移入细胞培养瓶中进行培养。置于5％CO₂培养箱内培养。第1个24h更换培养液的1/2，以后每隔24h换液1次。根据相差显微镜下细胞呈单层鹅卵石样排列、免疫细胞化学法染色细胞第VIII因子相关抗原呈阳性，确定培养细胞为内皮细胞。

1.5 RNA抽提

a.匀浆：直接在3.5cm直径的培养盘中加入1ml TRIZOL试剂裂解细胞，裂解时用枪吸打几次。加入TRIZOL试剂的量取决于培养盘的面积(每10cm2加1ml)而不是培养细胞的数量。

b.两相分离：匀浆后样品于15到30℃孵育5分钟，以便核酸蛋白复合体完全解离。每1ml的TRIZOL试剂匀浆的样品中加入0.2ml的氯仿，盖紧管盖。手动剧烈振荡管体15秒后，15到30℃孵育2到3分钟。4℃下12,000×g离心15分钟。离心后混合液体将分为下层的红色酚氯仿相，中间层核上层的无色的水相。RNA全部被分配于水相中。水相的体积大约使匀浆时加入的TRIZOL试剂的60％。

c.RNA沉淀：将水相转移到新离心管中。水相与异丙醇混合以沉淀其中的RNA，加入异丙醇的量为每个样品匀浆时加入1ml TRIZOL试剂的此时加0.5ml的异丙醇。混匀后15到30℃孵育10分钟后，于4℃ 12,000×g离心10分钟。

d.RNA清洗：移去上清液，每1mlTRIZOL试剂匀浆的样品中加入至少1ml的75％乙醇，清洗RNA沉淀。振荡后，4℃7,500×g离心5分钟。

e.重新溶解RNA沉淀：去除乙醇溶液，空气中干燥RNA沉淀5-10分钟。溶解RNA时，先加入无RNA酶的水用枪反复吹打几次，然后55到60℃孵育10分钟。获得的RNA溶液保存于-70℃。

1.6 RNA质量检测

a.紫外吸收测定法：取少量液体用TE稀释(一般1∶100稀释)后，读取其在分光光度计260nm和280nm处的吸收值，可以测定RNA溶液浓度和纯度。用来稀释的TE不需要经过无RNA酶处理，因为RNA的微量降解不会明显影响分光光度计的读值。测量前需先用稀释用的TE溶液将分光光度计调零。浓度测定在A260下读值为1表示40μgRNA/ml。样品RNA浓度(μg/ml)计算公式为：A260 X稀释倍数X 40μg/ml。RNA溶液的A260/A280的比值是一种RNA纯度检测方法，比值范围1.8到2.1。

b.变性琼脂糖凝胶电泳：制胶：1g琼脂糖溶于72ml水中，冷却至60℃，10ml的10X MOPS电泳缓冲液(0.4M MOPS，pH7.0，0.1M乙酸钠，0.01MEDTA)和18ml的37％甲醛溶液(12.3M)。灌制凝胶板，预留加样孔至少可以加入25μl溶液。胶凝后取下梳子，将凝胶板放入电泳槽内，加足量的1X MOPS电泳缓冲液至覆盖胶面几个毫米。取3μg RNA，加3倍体积的甲醛上样染液，加EB于甲醛上样染液中至终浓度为10μg/ml。加热至70℃孵育15分钟使样品变性。上样于胶孔中，5-6 V/cm电压下电泳至溴酚兰指示剂进胶至少2-3cm。紫外透射光下观察并拍照。

1.7 cRNA标记与合成

a.cDNA合成：先配制退火混合液：每个RNA样品均如下配制于一个灭菌的PCR管中：0.1-3.0μg总RNA，1.0μl G1，加去RNA酶的H2O至总体积为10μl。用移液枪轻轻吸打几次混合均匀，稍微离心使液体聚集于管底。70℃水浴10min后立刻放于冰中。再配制cDNA合成混合液，在离心管中依次加入，按每张芯片4μl除RNA酶的H2O，4μl 5X cDNA合成缓冲液(G3)，1μl RNA酶抑制剂(RI)，1μl cDNA合成酶混合液(G2)，总体积10μl。用移液枪轻轻吸打几次混合均匀，稍微离心使液体聚集于管底。置于冰上待用。cDNA合成反应：每10μl退火混合液中加入10μl的cDNA合成混合液。移液枪轻轻吸打几次混合均匀，稍微离心使液体聚集于管底。42℃水浴50分钟。短暂离心(约2秒)使液体聚集于管底。然后进行cRNA合成步骤或-20℃保存过夜。

b.cRNA合成，标记和扩增：先配制扩增混合液：试剂盒中所有管溶解后离心溶液至管底，置冰中待用。在离心管中依次加入扩增混合液：按每张芯片：16μl 2.5X RNA扩增缓冲液(G4)，2μl Biotin-16-UTP(Roche or ENZO)，2μl扩增酶类混合液(G5)，总体积为20μl。分别加入20μl扩增混合液。吸打混匀并离心至管底。37℃水浴4小时以上。

c.cRNA纯化：使用SuperArray ArrayGrade cRNA纯化试剂盒(货号：GA-012)。按步骤配制cRNA样品，将cRNA结合至纯化柱上，清洗纯化柱，再将cRNA从纯化柱中洗脱。

d.质量控制：取499μl的TE(pH8.0)至比色管中，确认管壁无气泡。比色管放入紫外分光光度计，调零。在比色管中直接加入1μl cRNA，吸打混合均匀。读出其在230，260和280nm的吸光率。取出比色管，弃去液体，洗干净凉干。计算浓度：A260×40×500(稀释倍数)＝样品浓度(μg/ml)。计算260/280和260/230比值以确定样品纯度。纯化的样品具有如下比值：RNA的260/280比值＞2.0，RNA的260/230比值＞2.0。

1.8芯片杂交

a.预杂交：加约5ml去离子水于杂交管中预湿芯片膜，拧紧管盖倒放5分钟。60℃预热GEAhyb杂交液(GEAhyb Hybridization Solution)多次颠倒试剂瓶以彻底溶解瓶中组分。去除杂交管中的水，加入2ml预热的GEAhyb杂交液，转动管子。确定管盖拧紧。将杂交管放在杂交炉中，旋紧盖子。加热后检测杂交管盖是否仍然密封。以转速5-10rpm 60℃预杂交1到两小时。

b.杂交：配制样品杂交液：加入4到20μg用TrueLabeling-AMP试剂盒制备的生物素标记的cRNA样品至0.75ml预热的GEAhyb杂交液中，混合均匀放于60℃。弃去杂交管中的预杂交液，加入含有标记的cRNA的样品杂交液。于60℃保持5到10rpm旋转杂交过夜。

c.洗膜：每张芯片需配制5ml的洗液1和5ml的洗液2。洗液1：2X SSC，1％SDS(混合10ml 20X SSC，5ml 20％SDS，和85ml ddH2O)。洗液2：0.1XSSC，0.5％SDS(混合0.5ml 20X SSC，2.5ml 20％SDS和97ml ddH2O)。洗液1和洗液2使用前均需要预热至60℃。加入5ml洗液1至杂交管中，简单转动几下，放回杂交炉中。60℃ 20到30rpm转动洗膜15分钟。弃去洗液。加入5ml洗液2至杂交管中，简单转动几下，放回杂交炉中。60℃ 20到30rpm转动下，洗膜15分钟。立刻弃去洗液，盖上杂交管盖以保持膜湿润，冷却至室温。

1.9化学发光检测

a.膜封闭：最后一次洗膜后，弃去洗液，立刻加入1.5ml GEAb封闭液Q，在杂交仪中30到40rpm孵育40分钟。

b.加入链亲和素偶联的碱性磷酸酶(AP)：配制1X缓冲液F：用水将5X缓冲液F稀释5倍。(每杂交管准备18ml的1X缓冲液F)。配制结合混合液：AP：1X缓冲液F(1∶7,500)混合。(每杂交管配制2ml结合缓冲液)。弃去杂交管中的GEA封闭液Q，加入2ml结合缓冲液，在杂交仪中轻轻摇动孵育10分钟。

c.洗膜：洗膜4次：加入4ml的1×缓冲液F温和振荡5分钟，弃去1×缓冲液F。加入3ml缓冲液G温和震荡分钟；倒掉，再用3ml缓冲液G重复洗一次。

d.检测：加入1.0ml CDP-Star化学发光底物至杂交管中，室温孵育2分钟。取出膜，放在一张滤纸上以去除多余的CDP-Star溶液，然后用于净的塑料膜两面包住，驱除气泡，用X-射线胶片曝光。

2.0图象采集和数据分析

a.图象和数据采集：X-射线胶片曝光后，将胶片上的图象用扫描仪扫描并转换为灰度TIFF格式的图片文件保存。运行ScanAlyze软件，将灰度TIFF格式图片的点阵转化为数字型数据，将此原始数据储存为Microsoft Excel文件。

b.数据分析：使用芯片配套软件GEArray Analyzer对原始数据进行去背景计算以及比较运算。每张芯片都点有负对照(PUC18DNA和空白)以及管家基因，包括β-actin，GAPDH，Cyclophilin A和核糖体蛋白L13a。原始数据将首先被减掉背景最小值，继而用管家基因来进行校正，校正后的数据用来进行样品间基因转录的相对丰度分析。

2.结果

NFkB信号通路芯片可检测以下基因表达：

NF-kappaB通路活化基因：

配体与受体基因：CARD10，IL1B，IL8，MYD88，TLR1，TLR2，TLR3，TLR4，TLR6，TLR8，TNF，TNFRSF10A，TNFRSF10B。膜分子基因：CARD11，CARD14，IRAK1，IRAK2。激酶基因：CHUK，IKBKB，IKBKG，IRAK1，IRAK2，MAP2K3，MAP2K4，MAP2K6，MAP3K14，MAP3K7，MAPK14。I-kappaB激酶/NF-kappaB串联基因：EDARADD，IKBKG，IRAK2，STAT1，TLR8。NF-kappaB胞浆隐蔽或释放基因：BCL3，IL10，NALP12，NFKBIA，TNFRSF7，TNFSF14。转录因子基因：IKBKB，IKBKG，IRAK1，NFKB1，NFKBIA，RELA，STAT1，TNF。炎症应答基因：IL1B，IL8，IRAK2，MYD88，NFKB1，TLR1，TLR2，TLR3，TLR4，TLR6，TLR8，TNF。

I-kappaB/NF-kappaB串联正调控基因：

配体与受体基因：F2R，GPR89，HTR2B，LTBR，SLC20A1，TICAM2，TNFRSF1A，TNFRSF5，TNFSF10，TNFSF6，TRIF。膜分子基因：EDG2，GJA1，HMOX1，RHOA，VAPA。激酶基因：IKBKE，MAP3K3，MAP3K7IP2，PLK2，RIPK1，RIPK2，TBK1。其它基因：APOL3，BCL10，BIRC2，CARD4，CASP1，CASP8，CFLAR，CTL2，CXXC5，ECM1，FADD，HNLF，LITAF，MALT1，PPM1A，PPP5C，REL，RFP2，RHOC，TRADD，TRAF5，TRAF6。

NF-kappaB通路相关因子基因：

胞外分子基因：BF，CSF2，CSF3，IFNA1，IFNB1，IFNG，IL1A，IL6。配体与受体基因：AGT，C3，CCL2，ICAM1，IL1R1，LTA，MAP3K7IP1，RAF1，TLR10，TLR7，TLR9。激酶基因：AKT1，CCL2，MAP3K1，MAPK3，MAPK8，RAF1。转录因子基因：ATF1，ATF2，EGR1，ELK1，FOS，JUN，NFKB2，RELB，TNFAIP3。炎症应答基因：C3，CCL2，FOS，IL1A，IL1R1，TLR10，TLR7，TLR9。

三组NFkB信号转导芯片经过分析比较，不同组间基因上、下调有显著差异：造模与对照组相比较有42条基因有显著差异，其中41条基因显示H₂O₂对其有显著的上调作用：

  基因文库  符号    描述  对照标准值    模型标准值  NM_005163  AKT1    V-akt murine thymoma viralq     oncogene homolog 1  2.8351E-1    7.2577E-1  NM_014349  APOL3    Apolipoprotein L，3  2.9464E-2    8.2093E-2  NM_005178  BCL3    B-cell CLL/lymphoma 3  1.7752E-1    5.2173E-1  NM_001710  BF    B-factor，properdin  5.7858E-2    1.5878E-1  NM_001166  BIRC2    Baculoviral IAP    repeat-containing 2  5.6997E-2    3.5213E-1  NM_014550  CARD10    Caspase recruitment    domain family，member 10  2.6655E-2    1.3752E-1  NM_020428  CTL2    CTL2 gene  2.0302E-1    5.0485E-1  NM_004425  ECM1    Extracellular matrix    protein 1  2.1791E-2    4.6844E-2  NM_001964  EGR1    Early growth response 1  1.5417E-2    6.5491E-2  NM_003824  FADD    Fas(TNFRSF6)-associated    via death domain  3.3608E-2    9.9233E-2  NM_016334  GPR89    G protein-coupled    receptor 89  9.7629E-2    2.8643E-1  NM_182547  HNLF    Putative NFkB activating    protein HNLF  4.2792E-2    1.1769E-1  NM_000619  IFNG    Interferon，gamma  1.2888E-2    4.1974E-2  XM_032491  IKBKB    Inhibitor of kappa light    polypeptide gene enhancer    in B-cells，kinase beta  3.4381E-2    1.3109E-1  NM_003639  IKBKG    Inhibitor of kappa light    polypeptide gene enhancer    in B-ceils，kinase gamma  8.1159E-2    3.9177E-1  NM_000877  IL1R1    Interleukin 1 receptor，    type I  1.7322E-1    5.2663E-1  NM_000600  IL6    Interleukin 6    (interferon，beta 2)  2.2248E-2    1.0022E-1  NM_002228  JUN    V-jun sarcoma virus 17    oncogene homolog(avian)  1.5877E-1    3.8711E-1  NM_002342  LTBR    Lymphotoxin beta receptor    (TNFR superfamily，member    3)  1.2344E-2    4.8906E-2  NM_002756  MAP2K3    Mitogen-activated protein    kinase kinase 3  1.1466E-2    6.7605E-2

  NM_003010  MAP2K4  Mitogen-activated protein  kinase kinase 4  1.0611E-1  3.9565E-1  NM_002758  MAP2K6  Mitogen-activated protein  kinase kinase 6  1.2572E-2  3.5700E-2  NM_003954  MAP3K14  Mitogen-activated protein  kinase kinase kinase 14  3.0641E-2  1.9370E-1  NM_003188  MAP3K7  Mitogen-activated protein  kinase kinase kinase 7  3.1255E-2  1.9398E-1  NM_006116  MAP3K7IP1  Mitogen-activated protein  kinase kinase kinase 7  interacting protein 1  1.3222E-2  6.7553E-2  NM_002746  MAPK3  Mitogen-activated protein  kinase 3  5.2204E-2  2.4704E-1  NM_002468  MYD88  Myeloid differentiation  primary response gene(88)  1.6105E-1  5.0705E-1  NM_003998  NFKB1  Nuclear factor of kappa  light polypeptide gene  enhancer in B-cells 1  (p105)  3.6381E-1  7.6281E-1  NM_006247  PPP5C  Protein phosphatase 5，  catalytic subunit  7.9543E-2  2.0647E-1  NM_002880  RAF1  V-raf-1 Murine leukemia  viral oncogene homolog 1  1.6557E-1  5.5414E-1  NM_021975  RELA  V-rel  reticuloendotheliosis  viral oncogene homolog A，  nuclear factor of kappa  light polypeptide gene  enhancer in B-cells 3，p65  (avian)  4.0890E-1  8.8398E-1  NM_006509  RELB  V-rel  reticuloendotheliosis  viral oncogene homolog B，  nuclear factor of kappa  light polypeptide gene  enhancer in B-cells 3  (avian)  2.2969E-1  5.2760E-1  NM_005798  RFP2  Ret finger protein 2  1.9025E-1  5.7568E-1

  NM_003821  RIPK2  Receptor-interacting  serine-threonine kinase 2    1.2968E-1 4.3444E-1  NM_016610  TLR8  Toll-like receptor 8    6.3617E-2 3.5764E-1  NM_006290  TNFAIP3  Tumor necrosis factor，  alpha-induced protein 3    3.9438E-2 9.8835E-2  NM_003844  TNFRSF10A  Tumor necrosis factor  receptor superfamily，  member 10a    4.4091E-2 1.0868E-1  NM_003842  TNFRSF10B  Tumor necrosis factor  receptor superfamily，  member 10b    3.9440E-1 8.2024E-1  NM_001065  TNFRSF1A  Tumor necrosis factor  receptor superfamily，  member 1A    3.8156E-1 7.9128E-1  NM_003789  TRADD  TNFRSF1A-associated via  death domain    1.7161E-1 3.6494E-1  NM_014261  TRIF  TIR domain containing  adaptor inducing  interferon-beta    1.8841E-2 3.8352E-2

1条基因显示H₂O₂对其有显著的下调作用：

基因文库  符号    描述  对照标准值  模型标准值NM_033297 NALP12 NACHT，leucine rich repeat and PYD containing 12  5.5312E-3  1.9410E-3

麦冬组与模型组相比较有47条基因有显著差异，其中46条基因显示麦冬皂苷D可对抗H₂O₂的上调作用，对其有显著的下调作用：

 基因文库  符号    描述  模型标准值    麦冬标准值 NM_005163  AKT1    V-akt murine thymoma viral    oncogene homolog 1  7.258E-1    6.404E-2 NM_014349  APOL3    Apolipoprotein L，3  8.209E-2    1.824E-2 NM_005178  BCL3    B-cell CLL/lymphoma 3  5.217E-1    2.538E-2 NM_001710  BF    B-factor，properdin  1.588E-1    7.644E-2 NM_001166  BIRC2    Baculoviral IAP    repeat-containing 2  3.521E-1    4.509E-2 NM_014550  CARD10    Caspase recruitment domain    family，member 10  1.375E-1    5.003E-3 NM_000759  CSF3    Colony stimulating factor 3    (granulocyte)  1.808E-2    1.242E-3 NM_020428  CTL2    CTL2 gene  5.048E-1    1.238E-2 NM_001964  EGR1    Early growth response 1  6.549E-2    6.775E-3 NM_001992  F2R    Coagulation factor II    (thrombin)receptor  2.635E-1    1.598E-2 NM_003824  FADD    Fas(TNFRSF6)-associated    via death domain  9.923E-2    5.003E-3 NM_016334  GPR89    G protein-coupled receptor    89  2.864E-1    8.018E-2 NM_182547  HNLF    Putative NFkB activating    protein HNLF  1.177E-1    1.810E-2 NM_000867  HTR2B    5-hydroxytryptamine    (serotonin)receptor 2B  5.359E-2    3.031E-3 NM_024013  IFNA1    Interferon，alpha 1  1.698E-2    3.652E-3 NM_000619  IFNG    Interferon，gamma  4.197E-2    1.574E-2 XM_032491  IKBKB    Inhibitor of kappa light    polypeptide gene enhancer    in B-cells，kinase beta  1.311E-1    2.111E-2 NM_003639  IKBKG    Inhibitor of kappa light    polypeptide gene enhancer    in B-cells，kinase gamma  3.918E-1    4.079E-2 NM_000877  IL1R1    Interleukin 1 receptor，    type I  5.266E-1    1.108E-2 NM_000600  IL6    Interleukin 6(interferon，    beta 2)  1.002E-1    1.004E-2 NM_002228  JUN    V-jun sarcoma virus 17    oncogene homolog(avian)  3.871E-1    1.902E-1

    NM_004862  LITAF    Lipopolysaccharide-induced    TNF factor    4.314E-2    9.313E-4    NM_002342  LTBR    Lymphotoxin beta receptor    (TNFR superfamily，member    3)    4.891E-2    5.843E-3    NM_002756  MAP2K3    Mitogen-activated protein    kinase kinase 3    6.761E-2    7.176E-3    NM_003010  MAP2K4    Mitogen-activated protein    kinase kinase 4    3.957E-1    1.241E-1    NM_002758  MAP2K6    Mitogen-activated protein    kinase kinase 6    3.570E-2    1.313E-2    NM_003954  MAP3K14    Mitogen-activated protein    kinase kinase kinase 14    1.937E-1    3.459E-2    NM_003188  MAP3K7    Mitogen-activated protein    kinase kinase kinase 7    1.940E-1    2.334E-2    NM_006116  MAP3K7IP1    Mitogen-activated protein    kinase kinase kinase 7    interacting protein 1    6.755E-2    2.228E-2    NM_015093  MAP3K7IP2    Mitogen-activated protein    kinase kinase kinase 7    interacting protein 2    3.449E-2    8.272E-3    NM_002746  MAPK3    Mitogen-activated protein    kinase 3    2.470E-1    7.145E-2    NM_002468  MYD88    Myeloid differentiation    primary response gene(88)    5.070E-1    1.036E-1    NM_003998  NFKB1    Nuclear factor of kappa    light polypeptide gene    enhancer in B-cells 1(p105)    7.628E-1    2.793E-1    NM_020529  NFKBIA    Nuclear factor of kappa    light polypeptide gene    enhancer in B-cells    inhibitor，alpha    7.426E-1    1.883E-1    NM_006622  PLK2    Polo-like kinase 2    (Drosophila)    7.699E-1    2.706E-1    NM_006247  PPP5C    Protein phosphatase 5，    catalytic subunit    2.065E-1    7.025E-2    NM_002880  RAF1    V-rar-1 murine leukemia    viral oncogene homolog 1    5.541E-1    1.665E-1    NM_005798  RFP2    Ret finger protein 2    5.757E-1    2.265E-1

  NM_003821  RIPK2    Receptor-interacting    serine-threonine kinase 2    4.344E-1  7.914E-2  NM_003263  TLR1    Toll-like receptor 1    3.958E-2  1.720E-2  NM_016610  TLR8    Toll-like receptor 8    3.576E-1  4.233E-2  NM_006290  TNFAIP3    Tumor necrosis factor，    alpha-induced protein 3    9.883E-2  5.241E-3  NM_003844 TNFRSF10A    Tumor necrosis factor    receptor superfamily，    member 10a    1.087E-1  1.706E-2  NM_003842 TNFRSF10B    Tumor necrosis factor    receptor superfamily，    member 10b    8.202E-1  3.232E-1  NM_003789  TRADD    TNFRSF1A-associated via    death domain    3.649E-1  7.178E-2  NM_014261  TRIF    TIR domain containing    adaptor inducing    interferon-beta    3.835E-2  8.929E-3

1条基因显示麦冬皂苷D可对抗H₂O₂的下调，有显著的上调作用：

基因文库    符号    描述    模型标准值  麦冬标准值NM_013254    TBK1 TANK-binding kinase 1    1.560E-3  1.083E-2

3.讨论

人NFkB信号通路基因芯片包括120条NFkB介导的信号转导通路基因。即编码Rel，NFkB，and IkB家族、NFkB应答基因、胞外激活配体与受体的基因、传导信号的激酶与转录因子、可能与病毒复制、自身免疫疾病、炎症反应、肿瘤发生与凋亡调节有关的NFkB介导的信号转导基因。

检测结果显示H₂O₂可以上调NFkB介导的信号转导通路相关基因，包括：AKT1、APOL3、BCL3、BF、BIRC2、CARD10、CTL2、ECM1、EGR1、FADD、GPR89、HNLF、IFNG、IKBKB、IKBKG、IL1R1、IL6、JUN、LTBR、MAP2K3、MAP2K4、MAP2K6、MAP3K14、MAP3K7、MAP3K7IP1、MAPK3、MYD88、NFKB1、PPP5C、RAF1、RELA、RELB、RFP2、RIPK2、TLR8、TNFAIP3、TNFRSF10A、TNFRSF10B、TNFRSF1A、TRADD、TRIF、而麦冬皂苷D可以下调上述除ECM1、RELA、RELB、TNFRSF1A四条基因以外的其它基因，并下调其它基因，包括CSF3、F2R、HTR2B、IFNA1、IFNG、LITAF、MAP3K7IP2、NFKBIA、PLK2、TLR1。

H₂O₂可以下调NFkB介导的信号转导通路相关的一条基因NALP12，而麦冬皂苷D则可上调该通路相关的一条基因TBK1。

可见H₂O₂损伤HUVEC及麦冬皂苷D的保护作用是与NFkB信号通路的调控密切相关。