一种牛乳铁蛋白工程菌及抗菌肽牛乳铁蛋白素的制备方法

摘要

本发明公开了一种牛乳铁蛋白工程菌及抗菌肽牛乳铁蛋白素的制备方法，牛乳铁蛋白工程菌，CCTCC NO：M206132。首先在LB平板上复苏工程菌photorhabdus luminescens TZR+表达质粒pBAD－CipB－BLfcin－Ampin；其次是挑单克隆于LB培养基中；第三是将培养菌photorhabdus luminescens TZR+pBAD－CipB－BLfcin－Ampin，接种于LB培养基中；第四是诱导；第五是离心，收集细胞；第六是用溶液I重悬细胞，转移到新离心管中；第七是离心收集细胞；第八是冻溶裂解细胞；第九是特性分离CipB融合乳铁蛋白素；第十是加胰蛋白酶酶解CipB融合牛乳铁蛋白素，释放纯牛乳铁蛋白素，便得到一种抗菌肽牛乳铁蛋白素。对宿主菌自杀强，高效表达，成本低廉。

说明书

                           技术领域

本发明涉及生物技术领域，更具体涉及一种牛乳铁蛋白工程菌，同时还涉及牛乳铁蛋白工程菌制备抗菌肽牛乳蛋白素的方法，该抗菌肽广泛应用于动物饲料中。

                           背景技术

Horoaki等(1991年)在研究脱铁牛乳铁蛋白(lactoferrin，LfB)的热稳定性时，发现在酸性条件下LfB明显发生了降解，然而其抗菌活性反而有所增加，于是推测Lf中存在耐热的抗菌活性多肽，酸性条件下其活性稳定，但中性或碱性环境中不稳定。Tomita等(1991年)研究了LfB的蛋白酶水解物的抗菌效果，结果表明，猪胰蛋白酶水解得到的小分子多肽具有较强的抗菌作用，其抗菌活性是未降解前的20倍以上。此后，Bellamy等(1992年)分离到乳铁蛋白N-端附近的一条多肽，具有比Lf强400多倍的抗菌活性，取名为牛乳铁蛋白素(BLactoferricin，LfcinB)，乳铁蛋白的另一个活性中心为Ampin。由于从天然牛乳中分离牛乳铁蛋白素造价高，无法实现其商业化生产，而目前利用基因工程技术生产牛乳铁蛋白素的根本制约因素是表达产物对宿主自杀作用强，表达水平低。有研究报道photorhabdus luminescensin基因CipA和CipB所编码的晶体蛋白占总细胞蛋白的40％(Bowen和Ensign，2001)，同时photorhabdus luminescensin易裂解，CipA和CipB所编码的晶体蛋白在pH 5-11下不溶解，但在pH 2-3下溶解，因此利用此性更易分离纯化。因此本研究设想通过两个牛乳铁蛋白活性中心LfcinB及Ampin和CipB融合表达来解决LfcinB对宿主自杀作用这一难题。

                           发明内容

本发明的目的在于提供一种牛乳铁蛋白工程菌，该工程菌易裂解，生产的新型抗菌肽牛乳铁蛋白素不仅表达量高，具有高效、广谱抗菌、抗病毒、抗氧化和调节免疫等生物学活性。

本发明的另一个目的在于提供一种牛乳铁蛋白工程菌制备抗菌肽牛乳铁蛋白素的方法，方法易行，操作简便，高效表达，成本低廉，该抗菌肽牛乳铁蛋白素具有高效广谱抗菌活性。

为了达到上述目的，本发明采用以下技术措施：

一种牛乳铁蛋白工程菌的制备方法如下：

所需材料为：

野生型photorhabdus luminescens subsp.akhurstii：购自德国生物材料资源中心(即the German Resource Centre for Biological Material，DSMZwww.dsmz.de)。TOPO TA克隆试剂盒：购自Invitrogen公司(www.invitrogen.com)。Red/ET试剂盒、pBAD24、Gentamycin和Apramycin抗性基因模板由德国gene brigdes公司(www.genebrigdes.com)提供。

photorhabdus luminescens subsp.Akhurstii和大肠杆菌GB2005培养基为LB培养基，其组成成分为：酵母提取物5g；蛋白胨10g；NaCl 5g；加水900ml，用1M NaOH将pH值调为7.0，定容至1L。LB固体培养基：在LB液体培养基中加入琼脂粉使其终浓度为1.5％。

(L+)阿拉伯糖，Ampcillin购于Sigma公司。

具体操作步骤

A、利用Red/ET同源重组技术来修饰野生型photorhabdus luminescens subsp.akhurstii晶体蛋白基因CipA和CipB，得到photorhabdus luminescens subsp.akhurstii突变株，命名为photorhabdus luminescens TZR其详细过程为：以photorhabdusluminescens subsp.akhurstii基因组DNA为模板，以GGA TCC ACA CAT ACAACA TCT CAT TTG C和CAG CTG GAT CCT GTT GCA TAA CCT GAGGAT GGC为引物，通过PCR扩增获得CipA基因；以photorhabdus luminescens subsp.akhurstii基因组DNA为模板，以GAA TTC TAT TAT  AAT AGA TGA ATGGGA TG和AAT TCT AAC AAC TGT ATT AAT TGC GAC引物，通过PCR扩增获得CipB基因。采用TOPO TA克隆试剂盒进行质粒构建按TOPO TA克隆试剂盒说明书进行得到质粒pTA-CipA和pTOPO-CipB。采用Red/ET同源重组方法分别将Gentamycin和Apramycin抗性基因替换photorhabdus luminescens subsp.akhurstii的CipA和CipB中部分序列而得到质粒pTA-GentaInCipA和pTA-CipB-Apra。用BamHI对pTA-GentaInCipA进行酶切得到GentaInCipA，采用电穿孔法(1200V/cm)将酶切产物CipA-Genta转化入photorhabdus luminescens subsp.akhursti+pASK-αβγA中，通过筛选得到敲除CipA基因photorhabdus luminescenssubsp.akhurstii突变株+pASK-αβγA。用EcoRI对pTA-ApraIncipB进行酶切得到ApraInCipB，采用电穿孔法(1200V/cm)将酶切产物CipA-Genta转化入photorhabdus luminescens subsp.akhursti+pASK-αβγA中，通过筛选得到敲除CipA和CipB基因photorhabdus luminescens subsp.akhurstii TZR+pASK-αβγA，42℃热激去除质粒pASK-αβγA。通过筛选得到敲除CipA和CipB基因photorhabdusluminescens subsp.akhurstii TZR，应用克隆PCR及SDS-PAGE电泳进行鉴定。(全过程见附图1)

B、利用Red/ET同源重组技术构建表达质粒pBAD-CipB-BLfcin-Ampin，构建质粒的详细过程为：以photorhabdus luminescens subsp.Akhurstii基因组为模板，通过三次PCR扩增将牛乳铁蛋白素基因BLfcin和Ampin引入，最终得到带同源臂的PCR产物CipB-BLfcin-Ampin，利用Red/ET同源重组技术，以pBAD24为载体，构建表达质粒pBAD-CipB-BLfcin-Ampin，经限制性酶切鉴定及测序结果可知所构建质粒正确无误。(全过程见附图2)

C、采用电穿孔法(1200V/cm)将表达pBAD-CipB-BLfcin-Ampin转化入photorhabdus luminescens TZR中，通过筛选得到牛乳铁蛋白工程菌。该菌株已保藏，保藏编号：CCTCC NO：M206132。

一种牛乳铁蛋白工程菌制备抗菌肽牛乳铁蛋白素的方法，其步骤是：

A、材料与溶液配制

所用工程菌为本发明所提供工程菌photorhabdus luminescens TZR+pBAD-CipB-BLfcin-Ampin。

工程菌培养基为LB培养基，其组成成分为：酵母提取物5g；蛋白胨10g；NaCl 5g；加水900ml，用1M NaOH将pH值调为7.0，定容至1L。(固体培养基加入1.5％终浓度的琼脂粉)。溶液I：100mM Tris-Cl(pH 8.0)，150mM NaCl，1mM EDTA。溶液II：0.5M的醋酸钠溶液。溶液III：0.5M的醋酸溶液。

(L+)阿拉伯糖，Ampcillin，胰蛋白酶购于Sigma公司。

B、重组抗菌肽牛乳铁蛋白素的制备方法

1)在含有100ug/mlAmpcillin的LB平板上复苏工程菌photorhabdus luminescensTZR+表达质粒pBAD-CipB-BLfcin-Ampin；

2)从复苏平板上挑单克隆于含有100ug/mlAmpcillin的LB培养基中，30℃振摇(240rmp/min)过夜(约12h)；

3)将1体积过夜培养菌photorhabdus luminescens TZR+pBAD-CipB-BLfcin-Ampin，接种于50体积含有100μg/ml Ampcillin的LB培养基中，30℃振摇培养6h(OD约为1-1.5)；

4)加10％(L+)阿拉伯糖至终浓度为0.2％，30℃诱导18h；

5)4000rmp(4℃)离心10min，收集细胞；

6)用溶液I重悬细胞，转移到新离心管中；

7)4000rmp(4℃)，10min离心收集细胞，弃上清，可马上进行下一步细胞裂解实验或保存于-80℃备用；

8)加无菌双蒸水反复冻溶(3-6次)裂解细胞；

9)加等体积溶液II(pH值为7.0)于离心管中，6000rmp(4℃)，10min离心，弃上清，加等体积溶液III(pH值为3.0)于离心管中，6000rmp(4℃)，10min离心，收集上清(约占总菌体蛋白20％)。(利用CipB所编码的晶体蛋白在pHpH5-11下不溶解，但在pH 2-3下溶解的特性分离CipB融合乳铁蛋白素)；

10)加胰蛋白酶酶解CipB融合牛乳铁蛋白素，释放纯牛乳铁蛋白素(约占总菌体蛋白5％)，便得到一种抗菌肽牛乳铁蛋白素。

本基因工程技术生产新型抗菌肽牛乳铁蛋白素解决了牛乳铁蛋白素对宿主菌自杀作用强这一难点，所生产的新型抗菌肽牛乳铁蛋白素不仅表达量高，具有高效、广谱抗菌、抗病毒、抗氧化和调节免疫等生物学活性，而且同现有其它基因工程技术生产新型抗菌肽牛乳铁蛋白素相比具备以下特点：

1、使用本表达系统生产新型抗菌肽牛乳铁蛋白素可克服牛乳铁蛋白素对宿主菌的自杀性，其原因是本表达系统应用photorhabdus luminescens subsp.akhurstii晶体蛋白CipB作为融合蛋白；

2、利用Red/ET同源重组技术敲除photorhabdus luminescens subsp.akhurstii基因CipA和CipB作为宿主菌，该宿主菌具有易裂解的特点；

3、CipB是photorhabdus luminescens subsp.akhurstii中的一种表达量极高的晶体蛋白(达菌体蛋白表达量的40％)，分子量小(11.3kDa)，以CipB作为乳铁蛋白素融合表达蛋白解决了牛乳铁蛋白素对宿主菌自杀作用强这一难点，进而实现了牛乳铁蛋白素的高效表达(20％)；

4、与从天然牛乳中获得牛乳铁蛋白素的成本相比，本基因工程技术生产新型抗菌肽牛乳铁蛋白素更廉价。

保藏单位：中国典型培养物保藏中心，地址：中国.武汉.武汉大学，邮编：430072，保藏日期：2006年11月27日，保藏编号：CCTCC NO：M206132，分类命名：发光杆菌TZR photorhabdus luminescens TZR。

                             附图说明

图1为获得photorhabdus luminescens TZR全过程示意图

图2为牛乳铁蛋白素表达质粒pBAD-CipB-BLfcin-Ampin构建全过程示意图

其中：P1：P2：P3：P4：

                         具体实施方式

突变株photorhabdus luminescens TZR的制备及牛乳铁蛋白素表达质粒pBAD-CipB-BLfcin-Ampin的构建

1材料

1.1菌种和载体

菌种及载体基因型和来源见表1。

                     表1 菌种及载体基因型和来源

  菌种或载体  基因型  来源  E.coli GB2005    photorhabdus luminescens   subsp.akhurstii     突变型    野生型      德国gene brigdes公司   (www.genebrigdes.com)   德国生物材料资源中心   (即the German Resource   Centre for Biological   Material，www.dsmz.de) 

  photorhabdus luminescens    TZR     pASK-αβγA    pYZP-Genta    pR6k-Apra    pTA-CipA    pTA-CipB    pTA-GentaInCipA     pTA-ApraInCipB     pBAD24    pBAD-CipB-BLfcin-Ampin    photorhabdus   luminescens subsp.    akhurstii；cipAl∷Ω   -Gentar；cipBl∷Ω-Aprar   Redα，Redβ，Redγ，RecA，   Ap^r   Genta^r    Apra^r    带有CipA基因的PCR2.1   TOPO载体   带有CipB基因的PCR2.1   TOPO载体   用Gentamycin抗性基因   替换了部分CipA基因，   Apra^r   用Apramycin抗性基因   替换了部分CipB基   因，Genta^r   Ap^r    CipB，牛乳铁蛋白素基因   BLfcin-Ampin，Ap^r   由本发明获得       德国gene brigdes公司   (www.genebrigdes.com)   德国gene brigdes公司   (www.genebrigdes.com)   德国gene brigdes公司   (www.genebrigdes.com)   由本发明获得    由本发明获得    由本发明获得     由本发明获得     德国gene brigdes公司   (www.genebrigdes.com)   由本发明获得  

注：Ap^r，ampicillin resistance；Apra^r，Apramycin resistance；Genta^r，Gentamycinresistance.

1.2工具酶

RNaseA、ProteinaseK、限制性内切酶购自New England Biolabs公司。Taqpolymerase购自Eppendorf公司。

1.3试剂盒

PCR纯化试剂盒购自Inviteck公司，小量、中量及大量提取质粒试剂盒为QIAGEN公司产品。细菌基因组DNA提取试剂盒为TaKaRa公司产品。PCR2.1TOPO TA克隆试剂盒：购自Invitrogen公司(www.invitrogen.com)。Red/ET试剂盒由德国gene brigdes公司(www.genebrigdes.com)提供。

1.4大肠杆菌GB2005(德国gene brigdes公司提供)及发光杆菌photorhabdusluminescens subsp.akhurstii培养基

LB液体培养基：酵母提取物5g；蛋白胨10g；NaCl 5g；加水定容至1L。LB固体培养基：在LB液体培养基中加入终浓度为1.5％的琼脂粉。

(一)根据附图1操作流程所示，制备突变株photorhabdus luminescens TZR的具体实施方法如下：

A、CipA和CipB基因的获得

以photorhabdus luminescens subsp.akhurstii基因组DNA为模板，以GGA TCCACA CAT ACA ACA TCT CAT TTG C和CAG CTG GAT CCT GTT GCATAA CCT GAG GAT GGC为引物，按50μl反应体系(ddH₂O：38μl；dNTP(5mM)：2.0μl；10*Taq buffer：5.0μl；Oligo up(50pmol/l)：1.5μl；0ligo down(50pmol/l)：1.5μl；模板(100ng)：1.0μl；Taq polymarase：1.0μl。)及反应程序(预变性95℃，3min；32个循环(变性95℃，40sec；退火50℃，40sec；延伸72℃，2min50sec)；最后延伸72℃，10min)进行PCR扩增获得CipA基因。以photorhabdus luminescens subsp.akhurstii基因组DNA为模板，以GAA TTCTAT TAT AAT AGA TGA ATG GGA TG和AAT TCT AAC AAC TGT AT TAAT TGC GAC引物，按50μl反应体系(ddH₂O：38μl；dNTP(5mM)：2.0μl；10*Taqbuffer：5.0μl；Oligo up(50pmol/l)：1.5μl；Oligo down(50pmol/l)：1.5μl；模板(100ng)：1.0μl；Taq polymarase：1.0μl。)及反应程序(预变性95℃，3min；32个循环(变性95℃，45sec；退火50℃，40sec；延伸72℃，1min50sec)；最后延伸72℃，10min℃)进行PCR扩增获得以CipB基因。

B、用于修饰CipA和CipB基因的质粒构建

1)质粒pTA-CipA和pTA-CipB的构建

采用PCR纯化试剂盒按操作说明对CipA和CipB基因PCR产物进行纯化，按TOPO TA克隆试剂盒说明书进行操作，获得质粒pTA-CipA和pTA-CipB。

2)GentaInCipA和ApraInCipB基因的获得

以pYZP-Genta为模板，以CTTATTTATC AATTAATTAC ATTATATTTT GGAGTTTACATT GAA TTC TGA AGG CAC GAA CCC AGT TGA C和TAAGGAATTA GGTGGAGCTA TTTAACAATTTATGACTTTA TC GAA TTC GGC TTG AAC GAA TTG TTA GG(其中带下划线碱基为同源臂，其余碱基为引物)为引物，按50μl反应体系(ddH₂O：38μl；dNTP(5mM)：2.0μl；10*Taq buffer：5.0μl；Oligo up(50pmol/l)：1.5μl；Oligo down(50pmol/l)：1.5μl；模板(100ng)：1.0μl；Taq polymarase，1.0μl。)及反应程序(预变性95℃，3min；32个循环(变性95℃，40sec；退火50℃，40sec；延伸72℃，2min50sec)；最后延伸72℃，10min)进行PCR扩增获得带同源臂的Gentamycin基因。以pR6k-Apra为模板，以TATTTATCAA TCGGTTAGAT TAAATTTTGGAGTTTATGTC GGATCC GGT TCA TGT GCA GCT CCA TCA G(其中带下划线碱基为同源臂，其余碱基为引物)和TATTTTAATT CACGCACCCA TTTAGAAATT TAACAAATACTTCGGATCC TCA GCC AAT CGA CTG GCG AGC(其中带下划线碱基为同源臂，其余碱基为引物)为引物，按50μl反应体系(ddH₂O：38μl；dNTP(5mM)：2.0μl；10*Taqbuffer：5.0μl；Oligo up(50pmol/l)：1.5μl；Oligo down(50pmol/l)：1.5μl；模板(100ng)：1.0μl；Taq polymarase：1.0μl。)及反应程序(预变性95℃，3min；32个循环(变性95℃，45sec；退火50℃，40sec；延伸72℃，1min50sec)；最后延伸72℃，10min。)进行PCR扩增获得带同源臂的Apramycin基因。

3)pTA-GentaInCipA和pTA-ApraInCipB的构建

采用Red/ET试剂盒按说明书操作构建质粒pTA-GentaInCipA和pTA-ApraInCipB。

C、CipA基因敲除

1)用BamHI对pTA-GentaInCipA进行酶切得到GentaInCipA，采用PCR纯化试剂盒按操作说明纯化酶切产物GentaInCipA；

2)将40μl过夜菌photorhabdus luminescens subsp.akhurstii+pASK-αβγA接种于1.4ml含有100μg/ml Apramycin的LB培养基中，30℃振摇培养2h；

3)加2μl 2mg/ml水解四环素，30℃诱导培养1h；

4)采用电转的方法(1200V/cm)将酶切产物GentaInCipA转化入photorhabdusluminescens subsp.akhurstii+pASK-αβγA中；

5)30℃恢复培养1h；

6)将其铺在含有3μg/ml Gentamycin的LB平板上，30℃过夜培养。

D、CipB基因敲除

1)用EcoRI对pTA-ApraInCipB进行酶切，采用PCR纯化试剂盒按操作说明纯化酶切产物ApraInCipB；

2)将40μl过夜菌敲除CipA基因的photorhabdus luminescens subsp.akhursti+pASK-gba接种于含有100μg/ml Ampicillin的LB，30℃振摇培养2h；

3)加2μl 2mg/ml水解四环素，30℃诱导培养1h；

4)采用电转的方法(1200V/cm)将酶切产物ApraInCipB导入敲除CipA基因的photorhabdus luminescens subsp.akhursti+pASK-αβγA中；

5)30℃恢复培养1h；

6)将其铺在含有25μg/ml Apramycin的LB平板上，30℃过夜培养。

E、42℃热激去除质粒pASK-αβγA

1)将40ul过夜菌photorhabdus luminescens subsp.akhursti+pASK-αβγA接种于1.0ml 3μg/ml Gentamycin和25μg/ml Apramycin的LB平板上，42℃振摇培养过夜；

2)30℃恢复培养1h；

3)将其铺在含有3μg/ml Gentamycin和25μg/ml Apramycin的LB平板上，30℃培养过夜；

4)从含3μg/ml Gentamycin和25μg/ml Apramycin的LB平板上挑单克隆分别在含100ug/ml Ampcillin的LB平板及含3μg/ml Gentamycin和25μg/mlApramycin的LB平板上进行双划线；

5)将在含100μg/mlAmpcillin的LB平板不长，但能在含3μg/ml Gentamycin和25μg/ml Apramycin的LB平板上生长的菌落接种于1.0ml含3μg/mlGentamycin和25μg/ml Apramycin LB中，30℃振摇培养过夜；

6)用EcoRI进行限制性酶切，检测质粒是否存在并保存没有质粒的克隆。

(二)按附图2操作流程所示，构建牛乳铁蛋白素表达质粒pBAD-cipB-BLfcin-Ampin具体实施方法如下：

A、表达质粒pBAD-CipB-BLfcin-Ampin构建

1)带同源臂的CipB-BLfcin-Ampin PCR产物的获得

以photorhabdus luminescens subsp.akhurstii基因组DNA为模板，以P1(TCCATACCCG TTTTTTTGGG CTAAGCTTAG GAGATTACAT T ATG ATA ATT AAG AAA GATATT)和P2(CAGCATACGG CGCACACAGG TGATAGACGG AGCACCCAGT TTTTTCCAACGCCACTGCCA GCGACGACAT TTAAA CAT AAT TTC AAC ACC AAC TAT)(其中带下划线碱基为同源臂，斜体碱基为BLfcin基因，其余碱基为引物)为引物，按50l反应体系(ddH₂O：38ul；dNTP(5mM)：2.0μl；10*Taq buffer：5.0μl；Oligo up(50pmol/l)：1.5μl；Oligo down(50pmol/l)：1.5μl；模板(100ng)：1.0μl；Taq polymarase：1.0μl。)及反应程序(预变性95℃，3min；32个循环(变性95℃，55sec；退火54℃，55sec；延伸72℃，50sec)；最后延伸72℃，10min)，通过PCR扩增获得cipB-BLfcin基因。

以CipB-BLfcin基因PCR产物为模板，以P1(TCCATACCCG TTTTTTTGGGCTAAGCTTAG GAGATTACAT T ATG ATA ATT AAG AAA GAT ATT)和P3(ACGAGA TTTATTTTTACCAAA TTTTTCTTG AGCTTTAGAC AGCAGTTTCC AAAT CAG CAT ACG GCG CAC ACAGGT)(其中带下划线碱基为同源臂，斜体碱基为Ampin基因，其余碱基为引物)为引物，按50μl反应体系(ddH₂O：38μl；dNTP(5mM)：2.0μl；10*Taq buffer：5.0μl；Oligo up(50pmol/l)：1.5μl；Oligo down(50pmol/l)：1.5μl；模板(100ng)：1.0μl；Taq polymarase：1.0μl。)及反应程序(预变性95℃，3min；32个循环(变性95℃，55sec；退火54℃，55sec；延伸72℃，50sec)；最后延伸72℃，10min)，通过PCR扩增获得CipB-BLfcin-Ampin基因。

以CipB-BLfcin-Ampin基因PCR产物为模板，以P1(TCCATACCCG TTTTTTTGGGCTAAGCTTAG GAGATTACAT T ATG ATA ATT AAG AAA GAT ATT)和P4(TCCGCCAAAACAGCCAAGCT TTCCTTTCGG GCTTTGTTAG CAGCCGGATC CCCTTA ACG AGA TTT ATT TTTACC AAA)(其中带下划线碱基为同源臂，其余碱基为引物)为引物，按50μl反应体系(ddH₂O：38μl；dNTP(5mM)：2.0μl；10*Taq buffer：5.0μl；Oligo up(50pmol/l)：1.5μl；Oligo down(50pmol/l)：1.5μl；模板(100ng)：1.0μl；Taq polymarase：1.0μl)及反应程序(预变性95℃，3min；32个循环(变性95℃，55sec；退火54℃，55sec；延伸72℃，50sec)；最后延伸72℃，10min)，通过PCR扩增获得带同源臂的CipB-BLfcin-Ampin基因。

B、pBAD-CipB-BLfcin-Ampin的构建

利用PCR纯化试剂盒按操作说明对带同源臂的CipB-BLfcin-Ampin PCR产物进行纯化。采用Red/ET同源重组的方法构建pBAD-CipB-BLfcin-Ampin。

C、工程菌的获得

1)将40ul过夜培养菌photorhabdus luminescens subsp.akhursti TZR接种于1.4ml含3μg/ml Gentamycin和25μg/ml Apramycin的LB培养基中，30℃振摇3h：

2)采用电转的方法(1200V/cm)分别将pBAD-CipB-BLfcin-Ampin转化入photorhabdus luminescens subsp.akhursti TZR中；

3)30℃恢复培养1h；

4)将其铺在含有100μg/ml Apramycin LB平板上，30℃过夜培养；

5)从过夜培养的含有100μg/ml Apramycin LB平板挑单克隆于1.8ml含有Amp100μg/ml的LB中，振摇过夜；

6)少量制备质粒DNA，溶于8ulddH₂O，取4μl质粒DNA用BamHI和HindIII进行限制性酶切鉴定并保存正确的克隆。

7)将1体积以上正确且过夜培养的克隆，接种于50体积含有100μg/mlAmpcillin的LB培养基中，30℃振摇培养6h(OD约为1-1.5)；

4)加10％(L+)阿拉伯糖至终浓度为0.2％，30℃诱导培养18h；

5)4000rmp(4℃)离心10min，收集细胞，取10μl进行SDS-PAGE鉴定，并保存能表达重组牛乳铁蛋白的克隆。

(三)、一种抗菌肽牛乳铁蛋白素的制备方法如下：

A、材料与溶液配制

所用工程菌为本发明所提供工程菌photorhabdus luminescens TZR+pBAD-CipB-BLfcin-Ampin。

工程菌培养基为LB培养基，其组成成分为：酵母提取物5g；蛋白胨10g；NaCl 5g；加水900ml，用1M NaOH将pH值调为7.0，定容至1L。(固体培养基加入1.5％终浓度的琼脂粉)。溶液I：100mM Tris-Cl(pH 8.0)，150mM NaCl，1mM EDTA。溶液II：0.5M的醋酸钠溶液。溶液III：0.5M的醋酸溶液。

(L+)阿拉伯糖，Ampcillin，胰蛋白酶购于Sigma公司。

B、重组抗菌肽牛乳铁蛋白素的制备方法

1)在含有100μg/mlAmpcillin的LB平板上复苏工程菌photorhabdus luminescensTZR+表达质粒pBAD-CipB-BLfcin-Ampin；

2)从复苏平板上挑单克隆于含有100μg/mlAmpcillin的LB培养基中，30℃振摇(240rmp/min)过夜(约12h)；

3)将1体积过夜培养菌photorhabdus luminescens TZR+pBAD-CipB-BLfcin-Ampin，接种于50体积含有100μg/ml  Ampcillin的LB培养基中，30℃振摇培养6h(OD约为1-1.5)；

4)加10％(L+)阿拉伯糖至终浓度为0.2％，30℃诱导18h；

5)4000rmp(4℃)离心10min，收集细胞；

6)用溶液I重悬细胞，转移到新离心管中；

7)4000rmp(4℃)，10min离心收集细胞，弃上清，可马上进行下一步细胞裂解实验或保存于-80℃备用；

8)加无菌双蒸水反复冻溶3-6次裂解细胞；

9)加等体积溶液II(pH值为7.0)于离心管中，6000rmp(4℃)，10min离心，弃上清，加等体积溶液III(pH值为3.0)于离心管中，6000rmp(4℃)，10min离心，收集上清(约占总菌体蛋白20％)。(利用CipB所编码的晶体蛋白在pHpH5-11下不溶解，但在pH2-3下溶解的特性分离CipB融合乳铁蛋白素)；

10)加胰蛋白酶酶解CipB融合牛乳铁蛋白素，释放纯牛乳铁蛋白素(约占总菌体蛋白5％)，便得到一种抗菌肽牛乳铁蛋白素。

11)通过体外抑菌试验表明重组牛乳铁蛋白素对革兰氏阴性菌大肠杆菌和沙门氏菌具有极好的抗菌性能(结果见表2)。通过断奶仔猪试验表明重组牛乳铁蛋白素能降低腹泻率，也能提高断奶仔猪生长性能和免疫功能(结果见表3、4)。

表2 重组牛乳铁蛋白素与不同抗生素对各种病原菌的最小抑菌浓度

                                                浓度单位：μg/ml

  枯草芽胞杆菌  (G⁺)K3-2  藤黄八叠球菌  (G⁺)T3-2  金葡萄球菌  (G⁺)J3-3  克雷伯肺炎杆菌  (G⁺)K3-4  大肠杆菌  (G^-)D3-3  沙门氏菌  (G^-)S2-1 LFc  3.12  ＞50  ＞50  ＞50  6.25  6.25

  洛克沙胂  效美素  土霉素  金霉素  阿散酸  大蒜素  喹乙醇  牛至油  盐霉素  杆菌肽锌  硫酸抗敌素  吉他霉素  3.12  0.78  0.78  3.12  6.25  6.25  3.12  0.39  3.12  25  6.25  0.78  25  12.5  0.78  6.25  50  3.12  6.25  1.56  25  25  25  0.1  ＞50  6.25  0.78  3.12  ＞50  3.12  50  1.56  6.25  6.25  12.5  0.39  25  25  1.56  ＞50  ＞50  25  12.5  3.12  25  ＞50  3.12  3.12  ＞50  50  ＞50  ＞50  ＞50  25  25  12.5  50  ＞50  6.25  50  ＞50  25  ＞50  ＞50  ＞50  50  50  12.5  ＞50  ＞50  12.5  ＞50

                 表3 重组牛乳铁蛋白素对断奶仔猪生长性能的影响

  项目  对照组  抗生素组  重组牛乳铁蛋白素  腹泻率(％)  初重Initial weight，kg  平均日增重ADG，g  料肉比F/G  50^a  8.03  556.1^b  1.69^a  20^c  8.04  645.6^a  1.50^c  24^c  8.05  631.0^a  1.56^c

表中同行肩注相同字母表示差异不显著(P＞0.05)，相邻字母表示差异显著(P＜0.05)，相间^a字母表示差异极显著(P＜0.01)。

      表4 重组牛乳铁蛋白素对断奶仔猪血清免疫球蛋白浓度的影响

  项目  对照组  抗生素组  重组牛乳铁蛋白素 IgG(mg/dL) IgA(mg/dL) IgM(mg/dL)  1.24^c  1.32^b  6.74^c  1.85^b  1.34^b  5.82^c  3.24^a  2.14^a  10.01^a

表中同行肩注相同字母表示差异不显著(P＞0.05)，相邻字母表示差异显著(P＜0.05)，相间字母表示差异极显著(P＜0.01)。