鹿茸表皮生长因子(DEER EGF)提取及其制备方法

摘要

本发明涉及由鹿茸提取表皮生长因子(EGF)的方法，其包括对鹿茸浸提液进行一步阴离子交换层析，无需其他层析步骤就可以获得高纯度的鹿茸表皮生长因子。另外，本发明还涉及由该方法制备的富含表皮生长因子的鹿茸提取物以及该鹿茸提取物在药品、食品和化妆品等方面的应用。

说明书

                        技术领域

本发明属于鹿茸提取物的医用或食用制品领域。更具体地来说，本发明涉及由鹿茸提取表皮生长因子(EGF)的方法以及由该方法制备的富含表皮生长因子的鹿茸提取物。另外，本发明还涉及该鹿茸提取物在药品、食品和化妆品等方面的应用。

                        背景技术

鹿茸(鹿尚未骨化的幼角)和鹿角作为传统的中药材，具有强筋健骨、补肾壮阳、疏通血脉等功效，自古以来就被广泛应用于配制成为各种滋补药品、食品、保健品和化妆品。通过现代药物化学研究分析，鹿茸中含有许多种生理活性成分，包括磷脂、生物胺类化合物、前列腺素、维生素、氨基酸、无机盐、不保护脂肪酸、皮质醇等。随着现代生物技术高速发展，人们发现鹿茸中除了含有上述各种生理活性成分之外，其中还含有胰岛素样生长因子(IGF-1)、胰岛素、人生长激素(HGH)、促生长释放因子(GHRF-6)、神经生长因子(NGF)、表皮生长因子(EGF)、成纤维生长因子(FGF)等大分子活性蛋白质。以上各种活性成分，尤其是各种活性蛋白质，相互协同作用，发挥功效。其中，表皮生长因子具有突出的药理作用。

表皮生长因子具有刺激表皮细胞、内皮细胞、成纤维细胞等多种细胞增殖的性质，可用于治疗或预防多种疾病，如促进溃疡、烧烫伤及手术等伤口创面的愈合、对慢性萎缩性胃炎、口腔糜烂和缺血性损伤等病症有一定的治疗和预防作用(参见中国专利CN1075874A、CN1111505A、CN1290172A、CN1407899A等)。此外，表皮生长因子已经广泛作为化妆品添加剂而应用，促进表皮细胞增殖，改善皮肤外观状况。

然而，在传统的鹿茸加工过程中，鹿茸直接粉碎后服用，颗粒较大，造成吸收效率低下；有时，鹿茸的加工需要经过加热煎煮、烘干等步骤，高温会使其中的EGF等蛋白质变性，从而降低乃至丧失它们的功效。另一种传统的加工方式是将鹿茸浸泡在高浓度酒精含量的酒中，制成药酒服用。但是由于酒中含有高浓度的作为有机溶剂的酒精，会使EGF等蛋白质变性，而且从大颗粒鹿茸中也不利于溶解出EGF等蛋白质，因而会导致鹿茸中的EGF利用效率低下，造成资源浪费。另外，高浓度酒精含量的药酒也限制了每次的服用量。

为了提高鹿茸材料的使用效率，人们尝试了各种方法提取鹿茸中富含表皮生长因子的有效成分。例如，江润祥等(动物学报.33(4)：301-308)披露了一种鹿茸EGF及其制备方法，其制备工艺中需要对鹿茸浸提液组合使用DEAE-Sephacel柱层析和NiTED柱层析或Sephadaex G50柱层析和NiTED柱层析，不但需要换层析柱，而且收集到的产物为多组分，从洗脱图谱上看，大约有10％以上的部分的分子量不介于5500～13000之间。

针对现有技术中存在的缺陷，经过长期艰苦的研究摸索，本发明人获得了一种提取鹿茸表皮生长因子的方法，该方法对鹿茸预处理得到鹿茸浸提液后，仅仅需要一步层析就可以获得高纯度的表皮生长因子，大大简化了生产工艺的复杂程度，便于在大规模生产中控制质量，节约成本。

                          发明内容

本发明的发明目的在于提供提取鹿茸表皮生长因子的方法以及由该方法制备的富含表皮生长因子的鹿茸提取物，并提供了该鹿茸提取物在药品、食品和化妆品等方面的应用。

具体而言，在第一个方面，本发明提供了一种提取鹿茸表皮生长因子的方法，其包括，对鹿茸浸提液进行一步阴离子交换层析。在本文中，术语“鹿茸表皮生长因子”指的是来自鹿茸的具有表皮生长因子活性的蛋白质。通过本领域普通技术人员熟悉的实验手段就可以判断提取自鹿茸的蛋白质是否具有表皮生长因子活性，并检测出该蛋白质的纯度，例如通过面积归一法分析蛋白质电泳图谱。优选本发明的鹿茸表皮生长因子纯度大于90％，更优选大于95％。

在本发明中，术语“一步”指的是在本发明的方法中，仅仅在同一种层析柱(即阴离子交换层析柱)上进行上样和洗脱，而不包括进行其他层析的步骤。本发明由于只进行一种层析，因此工艺较之现有技术更简单，节约了生产成本，适合在大规模生产中推广。阴离子交换层析是本领域普通技术人员所熟知的，优选那些已经商品化的。目前已经有成熟的方法来检测表皮生长因子，通过这些检测方法测定阴离子交换层析所洗脱下来的峰，本领域技术人员很容易就判断并选择含鹿茸表皮生长因子的峰。例如，优选用本发明实施例中的活性检测方法来确定含鹿茸表皮生长因子的峰并收集。在本发明的一个具体实施方式中，阴离子交换层析优选为Q Sepharose Fast Flow柱层析。层析时，可以使用含不同NaCl浓度和/或不同pH的缓冲液分阶段进行洗脱，收集含鹿茸表皮生长因子的峰。本发明人的研究表明，对于使用Q Sepharose Fast Flow柱，含鹿茸表皮生长因子的峰出现在用含0.4～0.6mol/L NaCl的pH7～9的缓冲液洗脱下来的洗脱液中，因此在本发明的第一个方面中，优选将鹿茸浸提液上样于Q Sepharose FastFlow柱，并且用含0.4～0.6mol/L NaCl的pH7～9的缓冲液洗脱，收集含鹿茸表皮生长因子的峰。缓冲液是本领域普通技术人员所熟知的，如常用于多肽、蛋白质溶解的缓冲液(参见《分子克隆试验指南》(科学出版社，2002年))，如Tris-HCl缓冲液、磷酸钠缓冲液或磷酸钾缓冲液等。

本文中，鹿茸浸提液指的是用水或缓冲液对鹿茸进行浸渍而得的提取液，其中含有鹿茸中的水溶性成分，包括表皮生长因子。本发明优选选用新鲜鹿茸或冷藏的新鲜鹿茸作为原材料，这样有利于最大限度地保存EGF的含量和活性。本文中所用的术语“新鲜”指的是采集鹿茸后6小时内就开始进行加工制备本发明的纳米化制品或进行冷藏了，优选加工或冷藏不迟于采集后的3小时，更优选不迟于1小时，最优选不迟于20分钟。本文中所用的术语“冷藏”指的是将鹿茸保存于0℃以下的环境中，优选保存于-20℃的环境中。优选浸提鹿茸前先将鹿茸粉碎(如，切片、研磨、匀浆和/或超声波破碎)，这样有利于提高浸提出有效成份的效率。通过离心和/或过滤等方式，可以收集鹿茸浸提液，去除不溶物质。

优选本发明第一个方面的方法，其依次包括如下步骤：

(1)粉碎鹿茸并浸提出鹿茸浸提液；

(2)将鹿茸浸提液上样于Q Sepharose Fast Flow柱，再依次用pH8.0的不含NaCl的缓冲液和含0.5mol/L NaCl的pH8.0的缓冲液进行洗脱，收集含鹿茸表皮生长因子的峰。

在第二个方面，本发明提供了一种具有表皮生长因子活性的鹿茸提取物的制备方法，其包括，对鹿茸浸提液进行一步阴离子交换层析。其中，术语“一步”指的是在本发明的方法中，仅仅在同一种层析柱(即阴离子交换层析柱)上进行上样和洗脱，而不包括进行其他层析的步骤。本发明由于只进行一种层析，因此工艺较之现有技术更简单，节约了生产成本，适合在大规模生产中推广。阴离子交换层析是本领域普通技术人员所熟知的，优选那些已经商品化的。层析时，可以使用含不同NaCl浓度和/或不同pH的缓冲液分阶段进行洗脱，收集具有表皮生长因子活性的峰。在本发明的一个具体实施方式中，阴离子交换层析优选为Q Sepharose Fast Flow柱层析。目前已经有成熟的方法来检测表皮生长因子，优选用本发明实施例中的活性检测方法来确定含鹿茸表皮生长因子的峰并收集。本发明人的研究表明，对于使用Q Sepharose Fast Flow柱，具有表皮生长因子活性的峰出现在用含0.4～0.6mol/L NaCl的pH7～9的缓冲液洗脱下来的洗脱液中，因此在本发明的第一个方面中，优选将鹿茸浸提液上样于Q SepharoseFast Flow柱，并且用含0.4～0.6mol/L NaCl的pH7～9的缓冲液洗脱，收集具有表皮生长因子活性的峰。缓冲液是本领域普通技术人员所熟知的，如常用于多肽、蛋白质溶解的缓冲液(参见《分子克隆试验指南》(科学出版社，2002年))，如Tris-HCl缓冲液、磷酸钠缓冲液或磷酸钾缓冲液等。优选该方法可以进一步包括脱盐和/或浓缩的步骤。在本发明的具体实施方式中，层析后包括透析和聚乙二醇浓缩。

更优选本发明第二个方面的方法，其依次包括如下步骤：

(1)粉碎鹿茸并浸提出鹿茸浸提液；

(2)将鹿茸浸提液上样于Q Sepharose Fast Flow柱，再依次用pH8.0的不含NaCl的缓冲液和含0.5mol/L NaCl的pH8.0的缓冲液进行洗脱，收集具有表皮生长因子活性的峰。

在第三个方面，本发明提供了本发明第一个方面的方法提取的鹿茸表皮生长因子。本发明优选提取的鹿茸表皮生长因子纯度大于90％，更优选大于95％。该EGF具有刺激表皮细胞、内皮细胞、成纤维细胞等多种细胞增殖的性质，可用于治疗或预防多种疾病。在本发明的具体实施方式中，通过归一法分析蛋白质电泳图谱可测得其纯度，而且该EGF能刺激表皮细胞的增殖，生物学活性为1.65×10⁴IU/mL。

在第四个方面，本发明提供了本发明第二个方面的方法制备的具有表皮生长因子活性的鹿茸提取物。本发明优选该鹿茸提取物中鹿茸表皮生长因子的蛋白质纯度大于90％，更优选大于95％。在本发明的具体实施方式中，优选蛋白质纯度是通过归一法分析蛋白质电泳图谱而测得的。该鹿茸提取物具有表皮生长因子活性，能够刺激表皮细胞、内皮细胞、成纤维细胞等多种细胞增殖的性质，可用于治疗或预防多种疾病。在本发明的具体实施方式中，该鹿茸提取物能刺激表皮细胞的增殖，生物学活性为1.65×10⁴IU/mL。

在第五个方面，本发明提供了含有本发明第四个方面的鹿茸提取物的制剂。鹿茸提取物可以和药学上可接受的辅剂组合从而加工各种制剂。药学上可接受的辅剂包括药学上可接受的载体、赋形剂、稀释剂等，它们与活性成分相容。运用药学上可接受的辅剂制备制剂对本领域普通技术人员来说是公知的。本发明的制剂优选为单位剂量形式，如片剂、丸剂、胶囊(包括持续释放或延迟释放形式)、粉剂、混悬剂、颗粒剂、酊剂、糖浆剂、乳液剂、悬浮液、针剂等剂型，从而适合各种给药形式，例如口服、非肠道注射、粘膜、肌肉、静脉内、皮下、眼内、皮内或经过皮肤等的给药形式。在本发明的具体实施方式中，制剂优选为鹿茸表皮生长因子冻干剂，其由本发明第四个方面的鹿茸提取物冷冻干燥而得。

在第六个方面，本发明提供了本发明第三个方面的鹿茸表皮生长因子、本发明第四个方面的鹿茸提取物或本发明第五个方面的制剂在制备用于刺激细胞增殖的药品、食品和/或化妆品中的应用。由于EGF能够刺激表皮细胞、内皮细胞、成纤维细胞等多种细胞增殖的性质，因此可治疗多种疾病或改善这些疾病的症状，如促进溃疡、烧烫伤及手术等伤口创面的愈合、对慢性萎缩性胃炎、口腔糜烂和缺血性损伤等病症的治疗和预防。

对于药品来说，可以对需要促进刺激细胞增殖的患者进行给药。给药的剂量和形式一般由医师根据患者的具体情况(如年龄、体重、性别、病情、患病时间、身体状况等)确定。一般而言，EGF计，给药的剂量为0.001～100mg/kg患者体重，优选为0.01～1mg/kg，优选为0.02～0.1mg/kg。给药形式可以根据各种药物制剂的剂型来确定，适合的给药形式有口服、非肠道注射、粘膜、肌肉、静脉内、皮下、眼内、皮内或经过皮肤等给药形式，优选使用口喷剂或胶囊剂口服给药。

对于食品和/或化妆品来说，由于是天然制品，而且鹿茸本身有着悠久的使用历史，健康人服用或外用一定量的本发明的EGF、提取物或制品有助于维持其正常的细胞增殖的功效。本发明的EGF、提取物或制品可以单独作为食品和/或化妆品使用，也可以添加到其他食品和/或化妆品中使用，例如，可以添加到常规的饮料、食品和/或化妆品中配合应用。

本发明引用了公开文献，这些文献是为了更清楚地描述本发明，它们的全文内容均纳入本文进行参考，就好像它们的全文已经在本文中重复叙述过一样。为了便于理解，以下将通过具体的附图和实施例对本发明进行详细地描述。需要特别指出的是，这些描述仅仅是示例性的描述，并不构成对本发明范围的限制。依据本说明书的论述，本发明的许多变化、改变对所属领域技术人员来说都是显而易见了。

                          附图说明

图1显示了EGF离子交换层析图谱，其中箭头所指的峰为鹿茸表皮生长因子所在的峰。

图2显示了EGF的SDS-PAGE图谱，其中右边的条带为鹿茸表皮生长因子，而左边的条带为分子量标记。

                        具体实施方式

实施例1，鹿茸的预处理

取新鲜鹿茸0.5kg，用冷冻切片机将鹿茸切成厚度为1～2mm的切片，然后加入适量(200mL)预冷的去离子水在4℃用匀浆机进行粉碎，匀浆操作进行至匀浆中没有可见的组织块时结束。然后向匀浆物中加入200mL预冷的去离子水，混匀后在冰浴条件下进行超声波破碎。对得到的破碎产物以5000转/分钟(rpm)离心20分钟，取上清液。在离心沉淀中加入200mL预冷的去离子水，重悬沉淀后再次以5000rpm离心20分钟，取上清液。然后，重复上述重悬、离心过程一次，取上清液。合并各次离心分离所得的上清液，装入截留分子量3500Da的透析袋(购自Sigma公司)，于4℃对0.02mol/L Tris-HCl缓冲液(pH8.0)透析30分钟，然后更换Tris-HCl缓冲液重复透析，共进行6次，得到经预处理后的鹿茸浸提液820mL。

实施例2，鹿茸表皮生长因子的层析纯化及冻干剂的制备

取820mL实施例1中得到的鹿茸浸提液上样于Q Sepharose^TM Fast Flow柱(柱参数为5.5cm×20cm))(购自Amersham公司)，然后进行洗脱。洗脱时依次以2mL/分钟的流速，先用300mL 0.02mol/L Tris-HCl缓冲液(pH8.0)洗脱下杂蛋白峰，然后用450mL含0.5mol/L NaCl的0.02mol/L Tris-HCl缓冲液(pH8.0)进行洗脱，并用紫外检测仪在280nm波长处进行检测(洗脱图谱如图1所示)。通过如实施例3所述的检测方法检测各个洗脱级分经透析得到的产物，发现如图1中“目的蛋白峰”所指的峰为鹿茸表皮生长因子。因此，收集该目的蛋白峰，装入截留分子量3500Da的透析袋，于4℃对0.02mol/L Tris-HCl缓冲液(pH8.0)透析30分钟，然后换Tris-HCl缓冲液重复透析，共进行6次。由此得到纯化的鹿茸表皮生长因子溶液280mL。将得到的鹿茸表皮生长因子溶液装入透析袋，用聚乙二醇20000进行浓缩。然后将浓缩液冷冻，在-70摄氏度下用冷冻干燥机进行冷冻干燥，得到鹿茸表皮生长因子冻干剂192mg。

实施例3，表皮生长因子的检测

根据《分子克隆试验指南》(科学出版社，2002年)和熊盛等的生物学活性检测法(中国卫生检验杂志，2006，16(10)：1153-1155，1174)检测鹿茸表皮生长因子。将实施例2得到的鹿茸表皮生长因子溶液进行SDS-PAGE(15％聚丙烯酰胺分离胶、4％积层胶、10mA恒流电泳)，电泳结束后以考马斯亮兰染色，电泳凝胶照片如图2所示，在分子量约7kD处有表皮生长因子单一条带，通过图像分析以面积归一法得其纯度达到97.2％。用表皮细胞的增殖来检测EGF的生物活性，以加入缓冲液的空白组为对照，在加入实施例2得到的鹿茸表皮生长因子溶液的实验组中，生物学活性为1.65×10⁴IU/mL。