巴西苏木素类化合物在制备抗肿瘤药物中的用途

摘要

式I所示的巴西苏木素类化合物，和/或巴西苏木素类化合物药学上可接受的盐，和/或以巴西苏木素类化合物为有效成分的植物提取物在制备抗肿瘤药物中的用途；其中，R

说明书

技术领域

本发明涉及巴西苏木素类化合物的用途，尤其涉及巴西苏木素类化合物在制备抗肿瘤药物中的用途。

背景技术

苏木(Lignum Sappan)是一味传统中药材，为豆科(Leguminosae)云实属植物苏木(Caesalpinia sappan L.)的干燥心材。苏木生于高温多湿、阳光充足的平坝或坡地，分布于广西、广东、云南、贵州、四川、台湾。中医认为苏木味甘、咸、微辛，性平，有行血祛瘀，消肿止痛的功能，用于闭经痛经，产后瘀阻，胸腹刺痛，外伤肿痛。

现代药理学研究表明，苏木具有中枢抑制、抗炎、抗高血脂和调节血糖的作用，并有潜在的抗肿瘤作用。国内许多学者的实验研究表明，苏木水提物对HL-60(人早幼粒细胞白血病细胞株)有较强的细胞毒作用，其醇提物对人体肿瘤细胞HCT-8、KB、A2780有明显的抑制作用，直接作用于肿瘤细胞，诱导细胞凋亡，抑制癌细胞的增殖，并呈现出一定的浓度依赖关系(苏木的临床药理及化学成分研究进展.王栋，陈超，周珏.中医药信息，2003，20：15-16)。

适量的苏木水溶液能增强血管的收缩力，具有催眠作用，大量尚有麻醉作用，甚至死亡，能对抗士的宁与可卡因的中枢兴奋作用，但不能对抗吗啡的兴奋作用。10％的苏木煎液还有抗菌作用。

苏木的主要化学成分之一是巴西苏木素类化合物(如式I所示)：

巴西苏木素类化合物包括巴西苏木素(brazilin)、3’-O-甲基巴西苏木素(3’-O-methylbrazilin)、4’-O-甲基巴西苏木素(4’-O-methylbrazilin)、4-羟基巴西苏木素(4-hydroxylbrazilin)、8-羟基巴西苏木素(8-hydroxylbrazilin)等。巴西苏木素遇空气即氧化为巴西苏木红素(Brazilein)，巴西苏木红素是一种常用色素。1993年，Davis等人用具有光学构象选择性的方法首次合成了巴西苏木素类化合物中的三甲基巴西苏木素。2005年，巴西苏木素的全合成路线也被报道出来(Synthesis of(+/-)-brazilin using IBX.Y Huang，J Zhang，TR Pettus.Org Lett.，2005，7：5841-5844.)。苏木另含苏木酚(Sappanin，即2，4，3’，4’-四羟基联苯)，可做有机试剂，检查铝离子；又含挥发油，油的主要成分为水芹烯(d-α-Phellandrene)及罗勒烯(Ocimene)；还含鞣质。

国外的研究主要针对巴西苏木素的药理作用，主要集中在免疫调节、糖质代谢、抗凝血和杀菌等方面，特别是其杀菌和降血糖的作用。有研究发现巴西苏木素对多种耐药细菌有杀灭作用，最小抑菌浓度为4～32mg/mL(Theantibacterial principle of Caesalpina sappan.Hx Xu，SF Lee.Phytother Res.，2004，18：647-651.)。还有研究表明，巴西苏木素能够降低糖尿病小鼠的肝实质细胞的糖质新生能力，并能够通过降低丝氨酸的磷酸化作用增加胰岛素受体的功能，从而发挥降低血糖的作用(Mechanism of action of Brazilin ongluconeogenesis in isolated rat hepatocytes.HS Won，J Lee，LY Khil，SH Chae，et al.Planta Med.，2004，70：740-744.Brazilin inhibits activities of protein kinaseC and insulin receptor serine kinase in rat liver.SG Kim，YM Kim，LY Khil，et al.Arch Pharm Res.，1998，21：140-146.)。

2001年，RL Tolman等人发现巴西苏木素具有抑制DNA聚合酶活性的作用，并为此申请了国际发明专利WO 0,193,864。2003年，韩国学者在实验室中发现苏木乙酸乙酯提取物能够在DNA链上产生剪切作用，从而在双链上生成缺口。经过对粗提物的进一步细分，确定了巴西苏木素是产生这一作用的主要活性成分(A DNA strand-nicking principle of a higher plant，Caesalpinia sappan.W Mar，HT Lee，KH Je，et al.Arch Pharm Res.，2003，26：147-150.)。

综上所述，作为一类单一成分的化合物，巴西苏木素及其衍生物在细胞增殖方面的应用记载较少，尤其是到目前为止，国内外均没有关于巴西苏木素化合物在抗肿瘤方面的直接的药理学研究结果的报道。

发明内容

本发明的目的是提供式I所示的巴西苏木素类化合物，和/或巴西苏木素类化合物药学上可接受的盐，和/或以巴西苏木素类化合物为有效成分的植物提取物在制备抗肿瘤药物中的用途；

其中，

R₁、R₂、R₃和R₄各自独立地为氢原子，C_1-4直链或支链的烷基，或，C_1-4直链或支链的酰基，优选氢原子；

R₅为氢原子或羟基，优选氢原子。

所述的肿瘤可以是各种肿瘤，例如：人白血病、肾癌、肝癌、肺癌、直肠癌、胃癌、食道癌或乳腺癌等等。

在一较佳实施例中，所述的C_1-4直链或支链的烷基是指甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、叔丁基或仲丁基，优选甲基、乙基；所述的C_1-4直链或支链的酰基是指甲酰基、乙酰基、丙酰基、丁酰基或异丁酰基，优选甲酰基。

在另一较佳实施例中，所述的巴西苏木素类化合物是上述式I中的R₁、R₂、R₃、R₄和R₅都为氢原子，即式II的巴西苏木素：

上述式I的巴西苏木素类化合物可通过化学合成方式得到，也可以通过从豆科植物苏木(Caesalpinia sappan L.)的干燥心材中提取得到；所述的以巴西苏木素类化合物为有效成分的植物提取物也可以从豆科植物苏木的干燥心材中提取得到。

一种优选的巴西苏木素类化合物的提取方法包括如下步骤：

将干燥的苏木药材粉碎后用6倍量的95％乙醇热回流提取3次，每次1小时，合并提取液，减压浓缩，得到的浸膏进行乙酸乙酯和水的分配，取乙酸乙酯相蒸干，进行硅胶柱层析，用氯仿-甲醇系统进行梯度洗脱，共收集116个流份，根据TLC检测结果，合并流份，其中Fr.91～93经过反复硅胶柱层析进行纯化处理后，得到的橙色粉末即为巴西苏木素化合物。

在上述提取物中，式II化合物的重量纯度较佳地为40％～99.9％，更佳地为50～98％。

在又一较佳实施例中，本发明的化合物可以与药学上可接受的酸或碱衍生的盐形式使用。所述的巴西苏木素类化合物药学上可接受的盐较佳地是指巴西苏木素类化合物与下列物质所衍生形成的盐：盐酸、氢溴酸、硫酸、柠檬酸、酒石酸、磷酸、乳酸、丙酮酸、乙酸、琥珀酸、草酸、富马酸、马来酸、草酰乙酸、甲磺酸、乙磺酸、苯磺酸、羟乙磺酸、碱金属(如钠、钾等)、碱土金属(如镁、钙等)、酯、氨基甲酸酯或其他常规的“前体药物”的形式(当以这种形式给药时，在体内可转化成活性部分)。

在又一较佳实施例中，本发明所述的用途还包括将巴西苏木素类化合物和/或其盐和/或以该化合物为有效成分的植物提取物应用于制备治疗恶性肿瘤的药物组合物，它含有(a)有效量的作为活性成分的式I巴西苏木素类化合物和/或其盐和/或含有该化合物的植物提取物，和(b)药学上可接受的载体。

通常，在治疗肿瘤时，以巴西苏木素类化合物和/或其盐和/或以该化合物为有效成分的植物提取物为活性成分，以常规的制剂工艺，单独使用或与其他药物配合制备成在临床上可以使用的各种不同剂型的药物，如：散剂、丸剂、胶囊剂、片剂、微囊剂、软胶囊剂、膜剂、栓剂、注射剂、膏剂、酊剂、冲剂气雾剂或其它各种外用制剂等。

在一较佳实施例中，本发明的化合物可通过口服、静脉内、肌内或皮下途径给药。

本发明的积极进步效果在于：

1.本发明发现了存在于豆科植物苏木中的一类巴西苏木素类化合物能被用于治疗多种恶性肿瘤。细胞试验显示该化合物对细胞有丝分裂有显著的阻遏作用，并能杀死多种肿瘤细胞；动物试验也显示其能显著抑制肿瘤细胞生长，且对人体无毒副作用。

2.本发明化合物可将其单独或与其它药物共同作为活性成分制成治疗恶性肿瘤的药品。

附图说明

图1A为阴性对照组人胃癌HGC细胞周期示意图；

图1B为巴西苏木素组人胃癌HGC细胞周期示意图；

图2为巴西苏木素对雌性S180荷瘤小鼠体重的影响。

具体实施方式

以下结合具体实施例，进一步阐述本发明。这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。

从豆科植物苏木(Caesalpinia sappan L.)的干燥心材中提取巴西苏木素化合物

将干燥的苏木药材粉碎后用6倍量的95％乙醇热回流提取3次，每次1小时，合并提取液，减压浓缩，得到的浸膏进行乙酸乙酯和水的分配，得到的乙酸乙酯相蒸干，进行硅胶柱层析，用氯仿-甲醇系统进行梯度洗脱，共收集116个流份，根据TLC检测结果，合并流份，其中Fr.91～93经过反复硅胶柱层析进行纯化处理后，得到橙色粉末化合物，经TLC和HPLC检测(纯度90％以上)，为一个单体化合物，其分子式、UV、¹H-NMR和¹³C-NMR数据如下：

分子式：C₁₆H₁₄O₅

UVλ_max(MeOH，nm)：200，286

¹H-NMR(400MHZ，δ_ppm，CD₃OD)：7.18(1H，d，J＝8.4HZ)，6.47(1H，dd，J＝8.4，2.4HZ)，6.29(1H，d，J＝2.8HZ)，6.70(1H，s)，6.60(1H，s)，3.68(1H，d，J＝11.6HZ)，3.92(1H，dd，J＝11.2，1.2HZ)，3.96(1H，s)，2.76(1H，d，J＝15.6HZ)，3.02(1H，d，J＝15.6HZ)

¹³C-NMR(100MHZ，δ_ppm，CD₃OD)：156.7(4a)，154.5(3)，144.5(9)，144.1(10)，136.2(11a)，131.1(1)，130.1(7a)，114.3(1a)，111.7(8)，111.2(11)，108.8(2)，103.1(4)，76.9(6a)，69.6(6)，49.8(12)，39.2(7)

由上述数据可推得所得化合物为巴西苏木素，即式II化合物。该提取得到的巴西苏木素用于以下各实施例中。

实施例1体外试验中巴西苏木素对多种肿瘤细胞生长的抑制作用

体外培养小鼠肉瘤S180细胞、人胚肾癌293细胞、人肝癌HepG2细胞、人肺癌A549和CRL-5895细胞、人胃癌HGC-27细胞。细胞生长至对数生长期后，用胰酶消化细胞，1000rpm离心5分钟，弃上清，适量培养基悬浮，调整细胞浓度至8×10⁴/mL。将细胞悬液接种到96孔细胞培养板中，每孔100μL，放置细胞培养箱(37℃，5％CO₂)中培养24h后，用药组每孔加入细胞培养基稀释的巴西苏木素(式II)100μL，终浓度为0.5ug/mL，空白对照组加入等量的细胞培养基，各组均设6个复孔。培养箱中培养66h后，每孔加入5mg/mL的MTT 20μL，37℃放置4h。每孔加入三联液(5％ SDS，10mM HCl，5％异丙醇)，37℃过夜。492nm/620nm测吸光度(OD)。对OD值进行t检验，并计算药物对各肿瘤细胞生长的抑制率：抑制率＝(对照组OD值-给药组OD值)/对照组OD值×100％。

         表1巴西苏木素对多种肿瘤细胞生长的抑制作用

  细胞名称  用药组OD值  对照组OD值  抑制率(％)  S180  293  0.0203±0.00^*  0.0038±0.08^*  0.3098±0.01  0.2561±0.03  93.45  98.52  HepG2  A549  CRL-5895  HGC-27  0.0480±0.01^*  0.0375±0.00^*  0.1369±0.01^*  0.1085±0.01^*  0.2577±0.03  0.1989±0.03  0.2435±0.01  0.4342±0.08  81.37  81.15  43.78  75.01

^*表示p＜0.01，与对照组相比，差异有显著性。

实验结果：如表1所示，在各种肿瘤细胞培养液中加入巴西苏木素，终浓度为0.5μg/mL，共孵育66h后，用药组的OD值均低于空白对照组，差异有显著性(p＜0.01)，对小鼠S180细胞、人癌细胞293、HepG2、A549、CRL-5895、HGC-27的细胞生长抑制率分别为93.45％、98.52％、81.37％、81.15％、43.78％、75.01％。说明巴西苏木素在0.5ug/ml剂量在体外对小鼠肉瘤、人胚肾癌、肝癌、肺癌、胃癌均有很强的抑制肿瘤细胞生长的作用，抗瘤谱广。

实施例2巴西苏木素对人胃癌HGC细胞周期的影响

体外培养HGC细胞，生长状态良好时，消化并接种1×10⁵个细胞于6cm培养皿中，过夜贴壁。等细胞状态良好后，吸去培养基，加入以培养基稀释的巴西苏木素(式II)，终浓度为2μg/mL，阴性对照孔加入培养基，37℃培养24h。镜下观察细胞形态变化。用胰酶消化细胞(0.25％胰酶/0.02％EDTA)，轻轻吹下，移入离心管，2000rpm离心5min，PBS洗涤2次，1000rpm离心5min。向细胞沉淀中缓缓加入75％乙醇(-20℃预冷)800μL，边滴边振荡(Vortex)，尽量使之形成单细胞。4℃固定过夜后，1000rpm离心5min，PBS洗涤两次，离心。重悬于300μL PBS，加预先煮沸过的RNase(终浓度为50μg/mL)，37℃孵育30min。300目尼龙网过滤，加入碘化丙啶(PI)(终浓度为25μg/mL)，4℃避光1h，流式细胞仪检测细胞周期。

实验结果：巴西苏木素作用于HGC细胞24h后，细胞全部变圆，部分漂浮，收集细胞进行流式细胞仪检测。结果显示，(如图1A和图1B)巴西苏木素作用后，G1、S期细胞明显减少，G2期细胞明显增加，说明巴西苏木素在2μg/mL剂量下，使人胃癌HGC细胞停滞于G2-M期，使其受阻断，阻止肿瘤细胞进行正常的有丝分裂。

实施例3巴西苏木素对S180荷瘤小鼠肿瘤生长的抑制作用

实验动物：雌性、雄性SPF级KM小鼠，由上海斯莱克实验动物有限责任公司提供(许可证号：SCXK(沪)2003-0003；质量合格证编号：0011979)，体重为18～22g，SPF级动物房饲养，12h光照/12h黑暗，自由摄取饲料和水。

实验方法：取接种7天的S180腹水小鼠，无菌条件下抽取腹水，用生理盐水调整细胞浓度至5×10⁶/mL。将S180细胞悬液以0.2mL/只的量接种在小鼠右前肢腋部皮下。接种24h后，将雌雄小鼠分别随机分为2组(每组10只)：巴西苏木素组，用蒸馏水溶解巴西苏木素(式II)，给药剂量是1mg/kg；对照组给予蒸馏水，给药体积是0.1mL/10g，每天灌胃给药1次，连续10天。停药次日处死小鼠，剥取瘤块称重，计算每组平均值，进行t检验。计算抑瘤率，抑瘤率＝(对照组瘤重-给药组瘤重)/对照组瘤重×100％。

        表2巴西苏木素对S180荷瘤小鼠肿瘤生长的抑制作用

  组别  性别  数量  (只)  体重(g)  瘤重(g)  X±SD  P值  抑制率  (％)  实验前  实验后  对照组  巴西苏木素组  对照组  巴西苏木素组  雄性  雄性  雌性  雌性  10  10  10  10  20.60  20.73  21.59  21.46  30.13  30.67  31.48  31.38  1.93±0.45  1.17±0.40^*  1.83±0.38  0.90±0.52^*  -  0.007  -  0.000  -  39.38％  -  50.82％

^*表示p＜0.01，与对照组相比，差异有显著性。

实验结果：表2的数据显示，巴西苏木素连续给药10天后，给药组雌、雄小鼠肿瘤的重量低于对照组，差异有显著性(p＜0.01)，药物的抑瘤率分别达到50.82％和39.38％，说明巴西苏木素在1mg/kg剂量时能够明显抑制S180荷瘤小鼠肿瘤的生长。同时，巴西苏木素组的体重没有明显下降(如图2)，与对照组相比，差异没有显著性，说明药物基本无毒。

实施例4片剂的制备

利用常规技术，混合以下组分，然后压片，包薄膜衣，制成薄膜包衣片剂形式的药物组合物。其配方如下：

  成分  处方量(g/1000片)  巴西苏木素(如式II所示)  甘露醇  微晶纤维素  10％淀粉浆  羧甲基淀粉钠  硬脂酸镁  总量  5  54.1  35.4  3g  2  0.5  100

实施例5注射剂的制备

称取5.0g纯度为98％的巴西苏木素(如式II所示)，加入适量生理盐水，使其完全溶解；配制500g pH5.5的磷酸盐缓冲液，称取0.3g亚硫酸氢钠加入到上述磷酸盐缓冲液中；将缓冲液加入到巴西苏木素溶液中，再加入1.0g苯甲醇，加注射用水至总体积1000mL，混合均匀，加入0.01％针用活性碳100℃保温30分钟，G₃垂熔玻璃漏斗过滤、0.22μm微孔滤膜过滤，过滤后的药液分装成2mL/支的针剂500支，分装好的注射剂压塞、压铝盖成针剂。