一种双黄连注射液的制备方法及其成分检测方法

摘要

本发明提供了一种双黄连注射液的制备方法，其先分别对黄芩、金银花和连翘进行提取，然后再进行注射液的制备。同时还提供了双黄连注射液的成分检测方法，该成分检测方法提高了产品质量的控制水平，保证产品的疗效，既有利于生产厂家和管理部门对产品的监测，也可以为医疗部门和患者的治疗提供较好的保障。

说明书

技术领域

本发明涉及一种双黄连注射液的制备方法及其成分检测方法，属于中药领域。

背景技术

双黄连注射液载于卫生部药品标准中药成方制剂第十一册(WS3-B-2104-96)，是由金银花、黄芩和连翘三味药组成。用于外感风热引起的发热、咳嗽、咽痛。适用于病毒及细菌感染的上呼吸道感染、肺炎、扁桃体炎、咽炎等。方中金银花甘寒，芳香疏散，善清肺经热邪，为君药；黄芩苦寒，善清肺火及上焦实热；连翘苦微寒，散上焦风热，有清热解毒之功，为臣药。三药使用，共奏辛凉解表，清热解毒之功。

专利文献99106224.8公开了一种精制双黄连注射液的生产工艺，包括：1.将金银花及连翘生药煎煮；2.所得滤液浓缩后加入乙醇；3.溶液静置；4.回收乙醇，加去离子水，调pH；5.静置，超滤膜过滤，浓缩；6.向浓缩液中加入乙醇；7.静置，回收乙醇；8.溶液过滤，得到浸膏；9.将上述浸膏、常规方法得到的黄芩甙粉及注射用水混合，加热煮沸；10.微孔滤膜过滤，得到双黄连注射液。其中，金银花有效成分-绿原酸遇高温易破坏，所以采用金银花及连翘共提，金银花的收率较低。

而且现有双黄连注射液质量标准中对金银花、黄芩和连翘三味药均进行了定性鉴别，但只建立了黄芩的含量测定方法；而其处方成分金银花为君药、连翘为臣药，在处方中也起重要作用，是反映药物内在质量的重要指标成分，因而发明人认为在该质量标准的基础上应该增加其他2种成分的含量测定方法，弥补原质量控制方法的不足，提高产品质量的控制水平，保证产品的疗效。

发明内容

本发明的目的是提供一种双黄连注射液的制备方法。

本发明的另一目的是提供双黄连注射液的成分检测方法，该方法提高了产品质量的控制水平，保证产品的疗效。

为了实现本发明目的，本发明的一种双黄连注射液的制备方法，由如下步骤制备：

1)金银花浓浸膏的制备

称取金银花，加4～16倍水于60～85℃保温浸泡30～180分钟，浸泡2～3次，分次过滤，收取滤液浓缩至相对密度1.15～1.25(80±5℃测)，待温度降至40℃以下，加入乙醇至含醇量75～80％，静置12～24小时，过滤，滤液回收乙醇至无乙醇味，并浓缩至相对密度1.12～1.23(80±5℃测)；待冷至40℃以下，加入膏重2～6倍量的纯化水，轻轻搅拌，静置12～24小时，取上清液过滤，滤液浓缩至相对密度1.15～1.25(80±5℃测)；待冷至40℃以下，边搅拌边加入乙醇，至含醇量达到80～85％，静置12～24小时，取上清液调pH值8.0～10.0，静置24～36小时，取上清液过滤，滤液回收乙醇至无醇味，并浓缩至相对密度1.12～1.23(80℃±5℃测)，得金银花浓浸膏；

2)连翘浓浸膏的制备

称取连翘，水煎3次，第一次，加入4～12倍量水，浸泡30分钟，加热煮沸1.0～3.0小时，过滤；第二、第三次各2～8倍量水，煮沸1.0～2.0小时，合并药液浓缩至相对密度1.15～1.25(80±5℃测)，待温度降至40℃以下，加入乙醇至含醇量75～80％，沉淀12～24小时，过滤，滤液回收乙醇至无乙醇味；待冷至40℃以下，加入膏重2～6倍量的纯化水，搅拌，静置12～24小时，取上清液过滤，滤液浓缩至相对密度1.15～1.25(80±5℃测)；待冷至40℃以下，边搅拌边加乙醇，使含醇量达到80～85％，静置12～24小时，取上清液调pH值8.0～10.0，静置24～36小时，取上清液过滤，滤液回收乙醇至无醇味，并浓缩至相对密度1.12～1.23(80±5℃测)，得连翘浓浸膏；

3)黄芩苷的制备

取黄芩片，加入2～12倍量水，至少煎煮2次，每次1～3小时，过滤，合并滤液，浓缩至生药量3～6倍，静置1～3小时后滤取上清液调pH值至1.0～3.0，70～80℃保温1～3小时，静置12～20小时，滤过，沉淀加5～10倍量水，调节pH值至6.0～8.0，再加等量乙醇，搅拌使溶解，过滤，滤液调pH值至1.0～3.0，60～70℃保温30～60分钟，静置12～20小时，滤过，沉淀用乙醇洗至pH值为6.0～8.0，回收乙醇，离心得沉淀物；取沉淀物加入1～3倍量(以黄芩苷干品重量计)40℃以下的注射用水，浸润4～10小时，再加入4～8倍量(以黄芩苷干品重量计)40℃以下的注射用水，搅拌2～10分钟后，调pH值至6.0～7.0，加入0.5％的药用炭，煮沸30～60分钟，待冷却至60～80℃后，用乙醇过滤，滤液调pH值至1.0～3.0，60±5℃保温30～60分钟，静置4～10小时，弃去上清液，沉淀物用95％的乙醇洗涤至pH＞4.0，抽干，干燥得黄芩苷；

4)双黄连注射液的制备

按生药比1∶2∶1，分别取金银花浓浸膏、连翘浓浸膏和黄芩苷，将金银花、连翘浓浸膏分别加注射用水稀释，混匀后加入黄芩苷搅拌，溶解得双黄连浓配液；绢布过滤，微孔滤膜过滤，加注射用水稀释至全量的90％，加入处方量的药用炭，煮沸15～30分钟并冷却至70℃以下，调pH值6.8～7.5，定容至全量，搅拌均匀，进行粗滤，粗滤后的药液冷却至10～40℃，精滤，灌装，115～118℃灭菌30分钟，即得。

其制备方法优选的为：

1)金银花浓浸膏的制备

称取金银花，第一遍加入10倍量水，于80℃保温浸泡1小时，第二遍加入10倍量水，于80℃保温浸泡40分钟，分次过滤，收取滤液浓缩至相对密度1.18～1.22(80±5℃测)，待温度降至40℃以下，加入90％以上乙醇至含醇量75％，静置12小时，过滤，滤液回收乙醇至无乙醇味，并浓缩至相对密度1.15～1.20(80±5℃测)；待冷至40℃以下，加入膏重4倍量的纯化水，轻轻搅拌，静置12小时，取上清液过滤，滤液浓缩至相对密度1.18～1.22(80±5℃测)；待冷至40℃以下，边搅拌边加入95％乙醇，使含醇量达到85％，静置12小时，虹吸上清液用20％氢氧化钠溶液调pH值8.5～9.0，静置24小时，取上清液过滤，滤液回收乙醇至无醇味，并浓缩至相对密度1.15～1.20(80±5℃测)。得金银花浓浸膏；

2)连翘浓浸膏的制备

称取连翘，第一遍加入8倍量水，浸泡30分钟，加热煮沸1.5小时，过滤；第二、第三遍各6倍量水，煮沸1.0小时，合并药液浓缩至密度1.18～1.22(80±5℃测)，待温度降至40℃以下，加入90％以上乙醇至含醇量75％，沉淀12小时，过滤，滤液回收乙醇至无乙醇味；待冷至40℃以下，加入膏重4倍量的纯化水，轻轻搅拌，静置12小时，取上清液过滤，滤液浓缩至相对密度1.18～1.22(80±5℃测)；待冷至40℃以下，边搅拌边加入95％乙醇，使含醇量达到85％，静置12小时，虹吸上清液用20％氢氧化钠溶液调pH值8.5～9.0，静置24小时，取上清液过滤，滤液回收乙醇至无醇味，并浓缩至相对密度1.15～1.20(80±5℃测)，得连翘浓浸膏；

3)黄芩苷的制备

取黄芩片，加入8倍量水，煎煮2小时，过滤，加入6倍量水，煎煮1小时，合并滤液，浓缩至生药量4～5倍，静置1小时后滤取上清液用2mol/L盐酸调pH值至1.0～2.0，80℃保温1小时，静置12小时，滤过，沉淀加6～8倍量水，用40％氢氧化钠溶液调节pH值至6.5～7.5，再加等量乙醇，搅拌使溶解，过滤，滤液用2mol/L盐酸调pH值至1.0～2.0，60℃保温30分钟，静置12小时，滤过，沉淀用乙醇洗至pH值为6.5～7.5，回收乙醇，离心得沉淀物；取沉淀物加入2倍量(以黄芩苷干品重量计)40℃以下的注射用水，浸润4小时以上，再加入4倍量(以黄芩苷干品重量计)40℃以下的注射用水，搅拌2分钟后缓缓加入10％氢氧化钠溶液，调pH值至6.5～7.0，加入0.5％的药用炭，煮沸30分钟，待冷却至60～80℃后，加入药液体积0.5倍量的90％以上乙醇，趁热过滤，滤液用10％HCl调pH值至1.5～2.0，60±5℃保温30分钟，静置4小时以上，弃去上清液，沉淀物用95％的乙醇洗涤至pH＞4.0，抽干，干燥得黄芩苷；

4)双黄连注射液的制备

按生药比1∶2∶1，分别取金银花浓浸膏、连翘浓浸膏和黄芩苷。将金银花、连翘浓浸膏分别加注射用水稀释，混匀后加入黄芩苷搅拌使溶解得双黄连浓配液；绢布过滤，微孔滤膜过滤，加注射用水稀释至全量的90％，加入处方量的药用炭，煮沸15分钟并冷却至70℃以下，调pH值6.8～7.5，定容至全量，搅拌均匀，进行粗滤，粗滤后的药液冷却至10～40℃，精滤，灌装，115～118℃灭菌30分钟，即得。

本发明双黄连注射液的成分检测方法，该方法包括黄芩、金银花与连翘中任意两种或三种成分的含量测定。

本发明的双黄连注射液的成分检测方法，包括所述的黄芩、金银花和连翘的含量测定：

(1)黄芩的含量测定  照高效液相色谱法(中国药典2005年版一部附录VID)测定。

色谱条件与系统适用性试验  以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以体积比40-60∶0.5-2∶60-40的甲醇-冰醋酸-水为流动相，优选为48∶1∶52；检测波长为276nm，理论板数按黄芩苷峰计算不低于1000。

对照品溶液的制备  精密称取黄芩苷对照品，加40～60％甲醇或乙醇制成每1ml含0.2mg的溶液，优选采用50％甲醇或乙醇，即得。

供试品溶液的制备  精密量取本品1ml，置50ml量瓶中，加40～60％甲醇或乙醇稀释至刻度，优选采用50％甲醇或乙醇，摇匀，即得。

测定法  分别精密吸取供试品溶液与对照品溶液各8μl，分别注入液相色谱仪，分别量取峰面积，外标法计算含量，即得。

本品每1ml含黄芩以黄芩苷(C₂₁H₁₈O₁₁)计，为6.0～12.0mg。

(2)金银花  照高效液相色谱法(中国药典2005年版一部附录VID)测定。

色谱条件与系统适用性试验  以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以体积比10-30∶90-70∶0.1-2的甲醇-水-冰醋酸为流动相，优选为20∶80∶1；检测波长为324nm；流速：1ml/min；柱温：室温。理论板数按绿原酸峰计算应不低于2000。

对照品溶液的制备  取绿原酸对照品适量，精密称定，置棕色量瓶中，加水(甲醇、乙醇)制成每1ml含40μg的溶液，即得。

供试品溶液的制备  精密量取本品6ml，置50ml棕色量瓶中，用水(甲醇、乙醇)稀释至刻度，摇匀，即得。

测定法  分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。

本品每1ml含金银花以绿原酸(C₁₆H₁₈O₉)计，为0.05～2.0mg。

(3)连翘  照高效液相色谱法(中国药典2005年版一部附录VID)测定。

色谱条件与系统适用性试验  以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以体积比10-40∶90-60的乙腈-水为流动相，优选为25∶75；检测波长为278nm；流速：1ml/min；柱温：室温。理论板数按连翘苷峰计算应不低于2000。

对照品溶液的制备  取连翘苷对照品适量，精密称定，加30～90％甲醇或乙醇制成每1ml含60μg的溶液，优选采用50％甲醇或乙醇，即得。

供试品溶液的制备  精密量取本品10ml，置中性氧化铝柱(100～120目6g，内径1cm)上，用30～90％乙醇40ml洗脱，优选采用70％甲醇或乙醇，收集洗脱液，浓缩至干，残渣加30～90％甲醇或乙醇适量，优选采用50％甲醇或乙醇，温热使溶解，转移至5ml量瓶中，并稀释至刻度，摇匀，即得。

测定法  分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。

本品每1ml含连翘以连翘苷(C₂₉H₃₆O₁₅)计，为0.05～0.4mg。

本发明的一种双黄连注射液的质量控制方法，也可以包括金银花和连翘的含量测定方法，黄芩和金银花的含量测定方法，或黄芩和连翘的含量测定方法。

本发明的双黄连注射液的制备方法，采用三种原料分别提取有效成分，将金银花改为用热水先浸泡再醇沉，避免了金银花有效成分的破坏，使绿原酸的收率有所提高。  本发明双黄连注射液的成分检测方法，提高了产品质量的控制水平，保证产品的疗效。既有利于生产厂家和管理部门对产品的监测，也可以为医疗部门和患者的治疗提供较好的保障。

附图说明

图1-1为金银花阴性液色谱图；

图1-2为金银花检测时双黄连注射液标准色谱图；

图2-1为连翘阴性液色谱图；

图2-2为连翘检测时双黄连注射液色谱图。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

实施例1双黄连注射液制备方法

1)金银花浓浸膏的制备

称取金银花，第一遍加入10倍量水，于80℃保温浸泡1小时，第二遍加入10倍量水，于80℃保温浸泡40分钟，分次过滤，收取滤液浓缩至相对密度1.20±0.02(80±5℃测)，待温度降至40℃以下，加入90％乙醇至含醇量75％，静置12小时，过滤，滤液回收乙醇至无乙醇味，并浓缩至相对密度1.18(80±5℃测)；待冷至40℃以下，加入膏重4倍量的纯化水，轻轻搅拌，静置12小时，取上清液过滤，滤液浓缩至相对密度1.20±0.02(80±5℃测)；待冷至40℃以下，边搅拌边加入95％乙醇，使含醇量达到85％，静置12小时，虹吸上清液用20％氢氧化钠溶液调pH值8.5，静置24小时，取上清液过滤，滤液回收乙醇至无醇味，并浓缩至相对密度1.15～1.20(80±5℃测)。得金银花浓浸膏；

2)连翘浓浸膏的制备

称取连翘，第一遍加入8倍量水，浸泡30分钟，加热煮沸1.5小时，过滤；第二、第三遍各6倍量水，煮沸1.0小时，合并药液浓缩至相对密度1.18～1.22(80±5℃测)，待温度降至40℃以下，加入90％乙醇至含醇量75％，沉淀12小时，过滤，滤液回收乙醇至无乙醇味；待冷至40℃以下，加入膏重4倍量的纯化水，轻轻搅拌，静置12小时，取上清液过滤，滤液浓缩至相对密度1.18～1.22(80±5℃测)；待冷至40℃以下，边搅拌边加入95％乙醇，使含醇量达到85％，静置12小时，虹吸上清液用20％氢氧化钠溶液调pH值9.0，静置24小时，取上清液过滤，滤液回收乙醇至无醇味，并浓缩至相对密度1.15～1.20(80±5℃测)，得连翘浓浸膏；

3)黄芩苷的制备

取黄芩片，加入8倍量水，煎煮2小时，过滤，加入6倍量水，煎煮1小时，合并滤液，浓缩至生药量5倍，静置1小时后滤取上清液用2mol/L盐酸调pH值至1.0，80℃保温1小时，静置12小时，滤过，沉淀加8倍量水，用40％氢氧化钠溶液调节pH值至7.5，再加等量乙醇，搅拌使溶解，过滤，滤液用2mol/L盐酸调pH值至1.0，60℃保温30分钟，静置12小时，滤过，沉淀用乙醇洗至pH值为7.5，回收乙醇，离心得沉淀物；取沉淀物加入2倍量(以黄芩苷干品重量计)40℃的注射用水，浸润4小时，再加入4倍量(以黄芩苷干品重量计)40℃的注射用水，搅拌2分钟后缓缓加入10％氢氧化钠溶液，调pH值至6.5，加入0.5％的药用炭，煮沸30分钟，待冷却至60℃后，加入药液体积0.5倍量的90％乙醇，趁热过滤，滤液用10％HCl调pH值至1.5，60±5℃保温30分钟，静置4小时，弃去上清液，沉淀物用95％的乙醇洗涤至pH＞4.0，抽干，干燥得黄芩苷；

4)双黄连注射液的制备

按生药比1∶2∶1，分别取金银花浓浸膏、连翘浓浸膏和黄芩苷。将金银花、连翘浓浸膏分别加注射用水稀释，混匀后加入黄芩苷搅拌使溶解得双黄连浓配液；绢布过滤，微孔滤膜过滤，加注射用水稀释至全量的90％，加入处方量的药用炭，煮沸15分钟并冷却至70℃，调pH值6.8，定容至全量，搅拌均匀，进行粗滤，粗滤后的药液冷却至40℃，精滤，灌装，118℃灭菌30分钟，即得。

实施例2

1)金银花浓浸膏的制备

称取金银花，第一遍加入4倍量水，于60℃保温浸泡80分钟，第二遍加入8倍量水，于80℃保温浸泡60分钟，第三遍加入12倍量水，于85℃保温浸泡30分钟，分次过滤，收取滤液浓缩至相对密度1.18～1.22(80±5℃测)，待温度降至40℃以下，加入95％乙醇至含醇量80％，静置18小时，过滤，滤液回收乙醇至无乙醇味，并浓缩至相对密度1.15～1.20(80±5℃测)；待冷至40℃以下，加入膏重6倍量的纯化水，轻轻搅拌，静置24小时，取上清液过滤，滤液浓缩至相对密度1.18～1.22(80±5℃测)；待冷至40℃以下，边搅拌边加入95％乙醇，使含醇量达到90％，静置18小时，虹吸上清液用20％氢氧化钠溶液调pH值9.0，静置24小时，取上清液过滤，滤液回收乙醇至无醇味，并浓缩至相对密度1.15～1.20(80±5℃测)。得金银花浓浸膏；

2)连翘浓浸膏的制备

称取连翘，第一遍加入12倍量水，浸泡40分钟，加热煮沸3小时，过滤；第二、第三遍各8倍量水，煮沸2小时，合并药液浓缩至相对密度1.15～1.20(80±5℃测)，待温度降至40℃以下，加入90％乙醇至含醇量80％，沉淀20小时，过滤，滤液回收乙醇至无乙醇味；待冷至40℃以下，加入膏重2倍量的纯化水，轻轻搅拌，静置24小时，取上清液过滤，滤液浓缩至相对密度1.15～1.20(80±5℃测)；待冷至40℃以下，边搅拌边加入95％乙醇，使含醇量达到90％，静置18小时，虹吸上清液用20％氢氧化钠溶液调pH值8.0，静置36小时，取上清液过滤，滤液回收乙醇至无醇味，并浓缩至相对密度1.20～1.23(80±5℃测)，得连翘浓浸膏；

3)黄芩苷的制备

取黄芩片，加入2倍量水，煎煮1小时，过滤，加入8倍量水，煎煮2小时，加入10倍量水，煎煮1小时，合并滤液，浓缩至生药量3倍，静置1小时后滤取上清液用2mol/L盐酸调pH值至2.0，70℃保温3小时，静置20小时，滤过，沉淀加5倍量水，用40％氢氧化钠溶液调节pH值至6.0，再加等量乙醇，搅拌使溶解，过滤，滤液用2mol/L盐酸调pH值至2.0，70℃保温60分钟，静置20小时，滤过，沉淀用乙醇洗至pH值为7.0，回收乙醇，离心得沉淀物；取沉淀物加入3倍量(以黄芩苷干品重量计)40℃以下的注射用水，浸润10小时，再加入6倍量(以黄芩苷干品重量计)40℃以下的注射用水，搅拌6分钟后缓缓加入10％氢氧化钠溶液，调pH值至7.0，加入0.5％的药用炭，煮沸40分钟，待冷却至70℃后，加入药液体积0.5倍量的90％以上乙醇，趁热过滤，滤液用10％HCl调pH值至1.0，60±5℃保温60分钟，静置10小时，弃去上清液，沉淀物用95％的乙醇洗涤至pH＞4.0，抽干，干燥得黄芩苷；

4)双黄连注射液的制备

按生药比1∶2∶1，分别取金银花浓浸膏、连翘浓浸膏和黄芩苷。将金银花、连翘浓浸膏分别加注射用水稀释，混匀后加入黄芩苷搅拌使溶解得双黄连浓配液；绢布过滤，微孔滤膜过滤，加注射用水稀释至全量的90％，加入处方量的药用炭，煮沸15分钟并冷却至70℃以下，调pH值7.5，定容至全量，搅拌均匀，进行粗滤，粗滤后的药液冷却至30℃，精滤，灌装，118℃灭菌60分钟，即得。

实施例3

1)金银花浓浸膏的制备

称取金银花，第一遍加入6倍量水，于70℃保温浸泡1小时，第二遍加入16倍量水，于85℃保温浸泡30分钟，分次过滤，收取滤液浓缩至相对密度1.18～1.22(80±5℃测)，待温度降至40℃以下，加入90％乙醇至含醇量78％，静置24小时，过滤，滤液回收乙醇至无乙醇味，并浓缩至相对密度1.15～1.20(80±5℃测)；待冷至40℃以下，加入膏重2倍量的纯化水，轻轻搅拌，静置20小时，取上清液过滤，滤液浓缩至相对密度1.18～1.22(80±5℃测)；待冷至40℃以下，边搅拌边加入95％乙醇，使含醇量达到85％，静置24小时，虹吸上清液用20％氢氧化钠溶液调pH值8.5，静置24小时，取上清液过滤，滤液回收乙醇至无醇味，并浓缩至相对密度1.15～1.20(80±5℃测)。得金银花浓浸膏；

2)连翘浓浸膏的制备

称取连翘，第一遍加入4倍量水，浸泡60分钟，加热煮沸1小时，过滤；第二、第三遍各2倍量水，煮沸1.5小时，合并药液浓缩至相对密度1.22～1.25(80±5℃测)，待温度降至40℃以下，加入95％乙醇至含醇量78％，沉淀24小时，过滤，滤液回收乙醇至无乙醇味；待冷至40℃以下，加入膏重6倍量的纯化水，轻轻搅拌，静置20小时，取上清液过滤，滤液浓缩至相对密度1.18～1.22(80±5℃测)；待冷至40℃以下，边搅拌边加入95％乙醇，使含醇量达到85％，静置24小时，虹吸上清液用20％氢氧化钠溶液调pH值10.0，静置30小时，取上清液过滤，滤液回收乙醇至无醇味，并浓缩至相对密度1.12～1.16(80±5℃测)，得连翘浓浸膏；

3)黄芩苷的制备

取黄芩片，加入12倍量水，煎煮2小时，过滤，加入6倍量水，煎煮3小时，合并滤液，浓缩至生药量6倍，静置1小时后滤取上清液用2mol/L盐酸调pH值至3.0，75℃保温2小时，静置18小时，滤过，沉淀加10倍量水，用40％氢氧化钠溶液调节pH值至8.0，再加等量乙醇，搅拌使溶解，过滤，滤液用2mol/L盐酸调pH值至1.5，65℃保温40分钟，静置18小时，滤过，沉淀用乙醇洗至pH值为8.0，回收乙醇，离心得沉淀物；取沉淀物加入1倍量(以黄芩苷干品重量计)40℃以下的注射用水，浸润6小时，再加入8倍量(以黄芩苷干品重量计)40℃以下的注射用水，搅拌10分钟后缓缓加入10％氢氧化钠溶液，调pH值至7.0，加入0.5％的药用炭，煮沸60分钟，待冷却至80℃后，加入药液体积0.5倍量的90％以上乙醇，趁热过滤，滤液用10％HCl调pH值至3.0，60±5℃保温40分钟，静置6小时，弃去上清液，沉淀物用95％的乙醇洗涤至pH＞4.0，抽干，干燥得黄芩苷；

4)双黄连注射液的制备

按生药比1∶2∶1，分别取金银花浓浸膏、连翘浓浸膏和黄芩苷。将金银花、连翘浓浸膏分别加注射用水稀释，混匀后加入黄芩苷搅拌使溶解得双黄连浓配液；绢布过滤，微孔滤膜过滤，加注射用水稀释至全量的90％，加入处方量的药用炭，煮沸15分钟并冷却至70℃以下，调pH值7.0，定容至全量，搅拌均匀，进行粗滤，粗滤后的药液冷却至10℃，精滤，灌装，115℃灭菌40分钟，即得。

实施例4

由实施例1制备的双黄连注射液对三种成分进行检测。

1)金银花的含量测定

照高效液相色谱法(中国药典2005年版一部附录VI D)测定。以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇-水-冰醋酸(20∶80∶1)为流动相；检测波长为324nm；流速：1ml/min；柱温：室温。理论板数按绿原酸峰计算应不低于2000。取绿原酸对照品适量，精密称定，置棕色量瓶中，加水制成每1ml含40μg的溶液，即为对照品溶液。精密量取本品6ml，置50ml棕色量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，即得供试品溶液。分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定。本发明中双黄连注射液每1ml含金银花以绿原酸(C₁₆H₁₈O₉)计，为1.1mg。

2)连翘的含量测定

照高效液相色谱法(中国药典2005年版一部附录VI D)测定。以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈-水(25∶75)为流动相；检测波长为278nm；流速：1ml/min；柱温：室温。理论板数按连翘苷峰计算应不低于2000。取连翘苷对照品适量，精密称定，加50％乙醇制成每1ml含60μg的溶液，即为对照品溶液。精密量取本品10ml，置中性氧化铝柱(100～120目6g，内径1cm)上，用70％乙醇40ml洗脱，收集洗脱液，浓缩至干，残渣加50％乙醇适量，温热使溶解，转移至5ml量瓶中，并稀释至刻度，摇匀，即得供试品溶液。分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定。本发明中双黄连注射液每1ml含连翘以连翘苷(C₂₉H₃₆O₁₅)计，为0.2mg。

3)黄芩的含量测定

照高效液相色谱法(中国药典2005年版一部附录VI D)测定。以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇-冰醋酸-水(48∶1∶52)为流动相；检测波长为276nm，理论板数按黄芩苷峰计算不低于1000。精密称取黄芩苷对照品，加50％甲醇制成每1ml含0.2mg的溶液，即得对照品溶液。精密量取本品1ml，置50ml量瓶中，加50％甲醇稀释至刻度，摇匀，即得供试品溶液。分别精密吸取供试品溶液与对照品溶液各8μl，分别注入液相色谱仪，分别量取峰面积，外标法计算含量，即得。本品每1ml含黄芩以黄芩苷(C₂₁H₁₈O₁₁)计，为8.8mg。

实施例5

基本过程同实施例4，不同的是三种成分检测过程中的条件：

黄芩的含量测定中，以40∶2∶60的甲醇-冰醋酸-水为流动相；制备对照品溶液和供试品溶液，所用溶剂为40％乙醇。

金银花的含量测定中，以10∶90∶2的甲醇-水-冰醋酸为流动相；

连翘的含量测定中，以10∶90乙腈-水为流动相，制备对照品溶液所用溶剂为30％甲醇，供试品溶液洗脱用30％甲醇，溶解用的90％甲醇。

实施例6

基本过程同实施例4，不同的是三种成分检测过程中的条件：

黄芩的含量测定中，以60∶0.5∶40的甲醇-冰醋酸-水为流动相；制备对照品溶液和供试品溶液，所用溶剂为60％乙醇。

金银花的含量测定中，以30∶70∶0.1的甲醇-水-冰醋酸为流动相；

连翘的含量测定中，以40∶60乙腈-水为流动相，制备对照品溶液所用溶剂为90％甲醇，供试品溶液洗脱用90％甲醇，溶解用的30％甲醇。

对于产品成分检测也可以只针对金银花和连翘的含量测定方法、黄芩和金银花的含量测定方法，或黄芩和连翘的含量测定方法。

实验例1金银花含量测定及方法学考察

(1)仪器与试药

仪器：高效液相色谱仪Agilent 1200，色谱柱：Agilent ZORBAXEclipse XDB-C18 4.6×150mm 5μ。

对照品：绿原酸(来源于中国药品生物制品检定所，批号：110753-200413，供含量测定用)。

样品批号：20060801、20060802、20060803

试剂：甲醇为色谱纯，冰醋酸为分析纯。

(2)色谱条件

以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇-水-冰醋酸(10-30∶90-70∶0.1-2)为流动相；检测波长为324nm；流速：1ml/min；柱温：室温。理论板数按绿原酸峰计算应不低于2000。

(3)供试品溶液的制备

精密量取本品6ml，置50ml棕色量瓶中，用水(甲醇、乙醇)稀释至刻度，摇匀，即得。

(4)对照品溶液的制备

取绿原酸对照品适量，精密称定，置棕色量瓶中，加水(甲醇、乙醇)制成每1ml含40μg的溶液，即得。

(5)线性范围试验

精密称定绿原酸对照品10.28mg，置100ml棕色量瓶中加水(甲醇、乙醇)溶解并稀释至刻度。从中取出4ml至10ml棕色量瓶中稀释至刻度。精密吸取上述溶液各2μl、5μl、10μl、15μl、20μl注入液相色谱仪，记录色谱图。以峰面积积分值为纵坐标Y，以进样量(μg)为横坐标X，进行线性回归，结果表明绿原酸进样量在0.08-0.82μg范围内，进样量与峰面积呈良好的线性关系，结果见表1。

                                  表1  线性范围试验

  进样量(μg)0.08    0.21    0.41    0.62    0.82  峰面积244.2    615.4    1240.8    1860.3    2490.2  回归方程Y＝-9.801+3037.34X              r＝0.9999

(6)精密度试验

精密吸取对照品溶液10μl，连续进样6次，依法测定峰面积，结果RSD＝0.16％，符合规定，见表2。

                                  表2  精密度试验

  进样次数    1    2    3    4    5    6  峰面积    1240.3    1244.0    1238.1    1240.8    1241.1    1242.5

(7)稳定性试验

取同一供试品溶液分别在制备好后0小时、2小时、4小时、6小时、8小时、24小时注入液相色谱仪，结果其峰面积均未见明显变化(RSD＝0.14％)，说明供试品溶液24小时内较稳定，结果见表3。

                                   表3  稳定性试验

放置时间(小时)    0    2    4    6    8    24峰面积    1161.1    1159.3    1160.4    1159.7    1156.9    1157.6

(8)专属性试验

取不含金银花的其他药材按生产工艺制备阴性对照液，取6ml置50ml棕色量瓶中，用水(甲醇、乙醇)稀释至刻度，摇匀，即得。注入液相色谱仪，进行测定，结果对样品测定无干扰(见图1-1，1-2)。

(9)重复性试验

精密量取样品6份(批号：20060801)各6ml，分别置50ml棕色量瓶中，用水(甲醇、乙醇)稀释至刻度，摇匀，即得。注入液相色谱仪，分别测定，重复性良好，结果见表4。

                                 表4  重复性试验

   1    2    3    4    5  平均值   RSD(％)含量   0.324    0.326    0.321    0.325    0.322  0.32   0.6

(10)回收率试验

精密量取重复性试验项下的5号供试品溶液6ml共6份，至棕色量瓶中，精密加入绿原酸对照品2.2762mg，加水(甲醇、乙醇)搅拌使溶解，并稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液即得。注入液相色谱仪，分别测定，计算回收率及RSD％值。结果见表5。

                             表5  回收率试验

  样品号  样品总含量  (mg)  样品理论量  (mg)  加入对照品量  (mg)  测得对照品量  (mg)  回收率  (％)  1  4.2213  1.9324  2.2762  2.2889  100.56  2  4.2050  1.9324  2.2762  2.2726  99.84  3  4.2143  1.9324  2.2762  2.2819  100.25  4  4.2291  1.9324  2.2762  2.2967  100.90  5  4.2343  1.9324  2.2762  2.3019  101.13  6  4.2241  1.9324  2.2762  2.2917  100.68

绿原酸的平均回收率为100.56％，RSD＝0.46％；结果表明该方法的回收率理想。

(11)样品含量测定

分别精密量取样品(批号：20060801、20060802、20060803)，每份6ml，置50ml棕色量瓶中，用水(甲醇、乙醇)稀释至刻度，摇匀，即得。注入液相色谱仪，分别测定，结果见表6。

      表6  样品含量测定

    样品批号    平均含量(％)    20060801    0.32    20060802    0.36    20060803    0.33

实验例2连翘含量测定及方法学考察

(1)仪器与试药

仪器：高效液相色谱仪Agilent 1200型，色谱柱：Agilent ZORBAXEclipse XDB-C184.6×150mm 5μ。

对照品：连翘苷(来源于中国药品生物制品检定所，批号：110821-200609，供含量测定用)。

样品批号：20060801、20060802、20060803

试剂：乙腈为色谱纯。

(2)色谱条件

以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈-水(10-40∶90-60)为流动相；检测波长为278nm；流速：1ml/min；柱温：室温。理论板数按连翘苷峰计算应不低于2000。

(3)对照品溶液的制备

取连翘苷对照品适量，精密称定，加30～90％甲醇或乙醇制成每1ml含60μg的溶液，即得。

(4)供试品溶液的制备

精密量取本品10ml，置中性氧化铝柱(100～120目6g，内径1cm)上，用30～90％乙醇40ml洗脱，收集洗脱液，浓缩至干，残渣加30～90％甲醇或乙醇适量，温热使溶解，转移至5ml量瓶中，并稀释至刻度，摇匀，即得。

(5)线性范围试验

精密称定连翘苷对照品14.80mg，置100ml量瓶中加30～90％甲醇或乙醇溶解并稀释至刻度。从中取出4ml至10ml量瓶中稀释至刻度。精密吸取上述溶液各2μl、5μl、10μl、15μl、20μl注入液相色谱仪，记录色谱图。以峰面积积分值为纵坐标Y，以进样量(μg)为横坐标X，进行线性回归，结果表明连翘苷进样量在0.12～1.18μg范围内，进样量与峰面积呈良好的线性关系，结果见表7。

                                 表7  线性范围试验

  进样量(μg)0.12    0.30    0.59    0.89    1.18  峰面积71.6    192.4    376.6    567.2    750.8  回归方程Y＝-1.97+639.11X              r＝0.9999

(6)精密度试验

精密吸取对照品溶液10μl，连续进样6次，依法测定峰面积，结果RSD＝0.35％，符合规定，见表8。

                                  表8  精密度试验

进样次数    1    2    3    4    5    6峰面积    374.7    376.6    375.2    376.8    373.4    374.3

(7)稳定性试验

取同一供试品溶液分别在制备好后0小时、2小时、4小时、6小时、8小时、24小时注入液相色谱仪，结果其峰面积均未见明显变化(RSD＝0.25％)，说明供试品溶液24小时内较稳定，结果见表9。

                                 表9  稳定性试验

    放置时间(小时)  0  2  4  6  8  24    峰面积  1020.1  1018.2  1018.5  1014.0  1015.9  1013.8

(8)专属性试验

取不含连翘的其他药材，按相同工艺制备阴性对照液，精密量取10ml，按供试品溶液的制备方法制备样品，注入液相色谱仪，进样测定，结果对样品测定无干扰(见图2-1，2-2)。

(9)重复性试验

共量取适量样品6份(批号：20060801)，从中各精密吸取10ml，分别置中性氧化铝柱(100～120目6g，内径1cm)上，用30～90％乙醇40ml洗脱，收集洗脱液，浓缩至干，残渣加30～90％甲醇或乙醇适量，温热使溶解，转移至5ml量瓶中，并稀释至刻度，摇匀，即得。注入液相色谱仪，分别测定，重复性良好，结果见表10。

                                  表10  重复性试验

  1  2  3  4  5  平均值  RSD(％)含量  0.080  0.081  0.081  0.079  0.080  0.08  1.04

(10)回收率试验

精密量取重复性试验项下的5号供试品溶液10ml共6份，精密加入连翘苷对照品mg，搅拌溶解后，分别置中性氧化铝柱(100～120目6g，内径1cm)上，用30～90％乙醇40ml洗脱，收集洗脱液，浓缩至干，残渣加30～90％甲醇或乙醇适量，温热使溶解，转移至5ml量瓶中，并稀释至刻度，摇匀，即得。注入液相色谱仪，分别测定，计算回收率及RSD％值。结果见表11。

                               表11  回收率试验

  样品号  样品总含量  (mg)  样品理论量  (mg)  加入对照品量  (mg)  测得对照品量  (mg)  回收率  (％)  1  1.812  0.802  1.014  1.010  99.61  2  1.814  0.802  1.014  1.012  99.80  3  1.807  0.802  1.014  1.005  99.11  4  1.814  0.802  1.014  1.012  99.80    5    1.815    0.802    1.014    1.013  99.90    6    1.813    0.802    1.014    1.011  99.70

连翘苷的平均回收率为99.64％，RSD＝0.32％；结果表明该方法的回收率较理想。

(11)样品含量测定

精密量取样品(批号：20060801、20060802、20060803)各10ml，按供试品溶液的制备方法制备样品，注入液相色谱仪，分别测定，结果见表12。

         表12  样品含量测定

    样品批号    平均含量(％)    20060801    0.08    20060802    0.08    20060803    0.09

本发明所述双黄连注射液具有清热解毒，清宣风热的功效。药效学研究表明按照本发明的制备方法以及产品检测方法来控制产品质量，所得的成品在抑菌、抗病毒，抗炎，解热，镇痛等方面有较好的疗效。

具体情况如下：

实验例3体内抑菌作用比较(对腹腔注射金黄色葡萄球菌引起小鼠死亡的保护作用)

取小鼠按体重随机分为7组每组10只，即空白对照组、双黄连注射液I(按现行制备工艺所得)高中低三个剂量组和双黄连注射液II(由实施例1所得)高中低三个剂量组。给药组腹腔注射(最后一次皮下注射)药液40ml/kg，每天一次，连续给药7天；空白对照组以同样方式给予注射用水。在最后一次给药30min后，各组腹腔注射金黄色葡萄球菌的硫乙醇酸盐培养液(37℃±1℃，24h，细菌数约10⁸/ml)，剂量为每只小鼠0.5ml，即刻观察，并连续观察7天，记录每天小鼠死亡情况，计算半数有效量(ED50)。结果表明，双黄连注射液I和双黄连注射液II对腹腔注射金黄色葡萄球菌引起的小鼠死亡均有一定保护作用，且双黄连注射液II的保护作用强于双黄连注射液I，但两者的ED50无显著性差异(P＞0.05)，见表13。

                   表13  双黄连注射液体内抑菌作用比较试验结果

    组别   剂量   (g·kg^-1含生药)    存活数    存活率  ED50±s    空白对照   --    0    0  --    高I   40    10    100  18.56±5.33    中I   20    6    60    低I   10    1    10    高II   40    10    100  16.80±3.1    中II   20    7    70    低II   10    2    20

实验例4体内抗病毒作用比较(对小鼠流感病毒性肺炎的影响)

取小鼠按体重随机分组，腹腔注射样品，病毒感染对照组和正常动物对照组均给予相同药液容积的注射用水。除正常对照组外，将小鼠用乙醚轻度麻醉，以15个LD50流感病毒液滴鼻感染，每只0.05ml。从感染前一天开始给药或水，每天2次，连续5天，第6天称取小鼠体重后固定，放血、解剖，摘取全肺称重，逐个计算肺指数值，并求出肺指数抑制率，结果见表14。肺组织用10％甲醛固定，乙醇系列脱水，二甲苯透明，石蜡包埋。切片厚度4～5μm，HE染色，普通光学显微镜观察肺组织形态学变化。按炎症细胞浸润程度分级标准，对细胞进行计分，并进行统计学处理，进行组间t检验比较，结果见表15。

     表14  双黄连注射液对流感病毒感染小鼠肺部炎症(肺指数)的影响(n＝10)

    组别    剂量    (g/kg含生药)    肺指数值    (x±s)    抑制率    (％)    感染对照组    --    1.60±0.20    --    正常对照组    --    0.99±0.09^**    --    双黄连注射液I    20    1.38±0.11^**    13.11    双黄连注射液II高    20    1.36±0.20^**    14.65    双黄连注射液II中    10    1.40±0.17^*    12.14    双黄连注射液II低    5    1.46±0.13    9.55

注：与感染对照组相比，^**P＜0.01，^*P＜0.05

  表15  双黄连注射液对流感病毒感染小鼠肺部炎症(病毒观察)的影响(n＝10)

    组别    剂量    (g/kg含生药)    肺指数值    (x±s)    抑制率    (％)    感染对照组    --    2.70±0.65    --    正常对照组    --    0.05±0.18^**    --    双黄连注射液I    20    1.85±0.72^**    31.06    双黄连注射液II高    20    1.75±0.60^**    33.35    双黄连注射液II中    10    2.00±0.57^*    26.84    双黄连注射液II低    5    2.10±0.63^*    23.10

注：与感染对照组相比，^**P＜0.01，^*P＜0.05

由表14、15结果可见，感染后小鼠肺指数值明显增大，炎症计分值明显增高，双黄连注射液在本试验条件下的剂量范围内对流感病毒感染小鼠引起的肺炎有明显的抑制作用，肺指数值明显降低，肺组织病变程度明显减轻，计分值明显降低。且在相同剂量条件下，双黄连注射液II的作用强于双黄连注射液I。

实验例5抗炎作用比较(对腹腔注射醋酸所致小鼠腹腔毛细血管通透性增高的影响)

取50只小鼠，雌雄各半，按体重随机分为5组。用药组按20ml/kg体重腹腔注射药液，空白对照组给予同体积的注射用水。每天给药一次，连续7天，于末次给药30分钟后，各小鼠均尾静脉注射0.5％伊文思兰生理盐水溶液0.1ml/10g体重，并立即腹腔注射0.6％醋酸生理盐水溶液0.2ml/只，20min后脱颈椎处死，打开腹腔，用6ml生理盐水洗涤腹腔，收集洗涤液并离心，取上清液于590nm处测吸收度。结果由表16可见，双黄连注射液能显著抑制腹腔注射醋酸所致小鼠腹腔毛细血管通透性的增高，与空白组比，20g/kg、10g/kg(含生药)组，差异非常显著(P＜0.01)，与剂量呈相关性。双黄连注射液II的作用强度与双黄连注射液I相似。

表16双黄连注射液对腹腔注射醋酸所致小鼠腹腔毛细血管通透性增高的影响

  组别  剂量  (g·kg^-1含生药)    吸收度  空白对照组  --    0.115±0.020  双黄连注射液I  20    0.076±0.031^**  双黄连注射液II高    20    0.074±0.050^**  双黄连注射液II中    10    0.085±0.033^*  双黄连注射液II低    5    0.091±0.027

注：与空白对照组比，^**P＜0.01，^*P＜0.05

实验例6解热作用比较

取预测温合格家兔，在试验日按要求测定给药前直肠体温后，按体温随机分组。给药组静脉注射药液，空白对照组给予注射用水，给药体积均为4ml/kg。除空白对照组外，各组给药后立即静脉注射细菌内毒素50ED/kg，以后每隔30min测直肠温度一次，以不同时间所测体温与给药前体温之差值，为体温升高值(体温下降在0.4℃以内者以0计)，结果见表17。

                       表17  双黄连注射液对细菌内毒素所致家兔体温升高的影响(n＝6)

组别  剂量  (g/kg含生药)  体重  (kg)  基础体温  (℃)  最高体温  (℃)  最高升温值  (℃)模型组  --  2.55±0.21  38.38±0.34  39.92±0.31  1.54±0.22空白对照组  --  2.40±0.19  38.40±0.22  38.70±0.30  0.30±0.16^**双黄连注射液I  20  2.34±0.28  38.64±0.23  3.36±0.26  1.02±0.20^**双黄连注射液II高  20  2.30±0.24  38.50±0.26  39.55±0.35  1.05±0.23^**双黄连注射液II中  10  2.35±0.18  38.37±0.20  39.47±0.20  1.10±0.21^**双黄连注射液II低  5  2.38±0.16  38.42±0.30  39.72±0.31  1.30±0.19^*

注：与模型组比较，^**P＜0.01，^*P＜0.05

结果表明，双黄连注射液给药剂量在20g/kg、10g/kg(含生药)时，对细菌内毒素引起的家兔体温升高具有良好的解热作用，与模型组比较差异非常显著(P＜0.01)。双黄连注射液II的解热作用与双黄连注射液I相似。

实验例7镇痛作用比较(扭体法)

将50只小鼠随机分为5组，用药组按20ml/kg体重腹腔注射药液，空白对照组给予同体积的注射用水。每日一次，连续5天，第5天上午给药45分钟后，腹腔注射0.6％醋酸0.2ml/只，观察记录15分钟内各鼠扭体次数，结果进行统计学处理。

        表18  双黄连注射液对醋酸所致小鼠疼痛的影响

    组别    剂量(g/kg含生药)    扭体次数    空白对照组    --    25.0±7.0    双黄连注射液I    20    17.9±4.1^*    双黄连注射液II高    20    15.5±3.2^*    双黄连注射液II中    10    18.2±3.5^*    双黄连注射液II低    5    19.0±5.6

注：与空白对照组比，^*P＜0.05

从表18可见，同等剂量下双黄连注射液II的镇痛作用好于双黄连注射液I。

实验例8止咳作用比较

取小鼠50只随机分为5组，用药组按20ml/kg体重腹腔注射药液，空白对照组给予同体积的注射用水。连续给药5天，一天一次，末次给药1小时后，利用超声雾化器喷雾26％氨水3秒，观察并记录小鼠的咳嗽潜伏期(即停止喷雾到咳嗽的时间)和2分钟内小鼠咳嗽次数(以其腹肌收缩、张大嘴和听到咳声为准)，结果见表19。

                表19  双黄连注射液对氨水所致小鼠咳嗽的影响

组别  剂量(g/kg含生药)    潜伏期    咳嗽次数空白对照组  --    4.9±1.5    33.2±7.6双黄连注射液I  20    8.8±2.2^**    21.2±6.0^*双黄连注射液II高  20    9.0±1.9^**    20.0±5.2^*双黄连注射液II中  10    7.9±2.5^*    24.6±6.5^*双黄连注射液II低  5    6.2±2.3    26.3±5.4

注：与空白对照组比较，^**P＜0.01，^*P＜0.05

从表19可见，双黄连注射液可显著延长氨水所致小鼠咳嗽潜伏期，还可明显减少小鼠咳嗽次数。双黄连注射液II的镇咳作用略好于双黄连注射液I。

从以上试验结果可见，同等剂量下的双黄连注射液II的主要药效学实验结果均优于双黄连注射液I。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。