公开/公告号CN1934101A
专利类型发明专利
公开/公告日2007-03-21
原文格式PDF
申请/专利权人 尼瑞斯药品公司;
申请/专利号CN200580008571.9
申请日2005-02-04
分类号C07D403/06(20060101);C07D403/14(20060101);C07D405/14(20060101);C07D407/14(20060101);C07D487/04(20060101);A61K31/496(20060101);A61P31/00(20060101);A61P35/00(20060101);
代理机构11204 北京英赛嘉华知识产权代理有限责任公司;
代理人王达佐;韩克飞
地址 美国加利福尼亚州
入库时间 2023-12-17 18:25:15
法律状态公告日
法律状态信息
法律状态
2015-09-30
专利权的转移 IPC(主分类):C07D403/06 变更前: 变更后: 登记生效日:20150908 申请日:20050204
专利申请权、专利权的转移
2015-08-12
专利权的转移 IPC(主分类):C07D403/06 变更前: 变更后: 登记生效日:20150724 申请日:20050204
专利申请权、专利权的转移
2013-03-06
专利权的转移 IPC(主分类):C07D403/06 变更前: 变更后: 登记生效日:20130204 申请日:20050204
专利申请权、专利权的转移
2011-10-19
专利申请权的转移 IPC(主分类):C07D403/06 变更前: 变更后: 登记生效日:20110908 申请日:20050204
专利申请权、专利权的转移
2011-10-12
授权
授权
2007-06-06
实质审查的生效
实质审查的生效
2007-03-21
公开
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相关申请
本申请是2003年8月1日提交的美国专利申请第10/632,531号的部分继续申请，并且要求2004年2月4日提交的美国临时申请第60/542,073号和2004年11月1日提交的美国临时申请第60/624,262号的优先权，所有这些申请的发明名称均为“脱氢苯基阿夕斯丁(dehydrophenylahistins)及其类似物以及脱氢苯基阿夕斯丁及其类似物的合成”；在此将每个申请的全部内容引入作为参考。
技术背景
技术领域
本发明涉及化学和医药领域的化合物及合成制备方法。更具体地，本发明涉及用于治疗癌症和真菌感染的化合物和制备这类化合物的方法。
相关领域的概述
研究者认为存在单一、通用的控制真核细胞周期进程的调节的细胞机理。参见，例如Hartwell，L.H.等，Science(1989)，246：629-34。同时，已知当细胞周期的控制机理中出现异常时，就可能产生癌症或免疫紊乱。因此，正如已知的，抗肿瘤试剂和免疫抑制剂可以是调节细胞周期的物质。因此，需要制备真核细胞周期抑制剂(作为抗肿瘤和增强免疫的化合物)的新方法，且这些抑制剂可作为化疗、抗肿瘤试剂用于治疗人类癌症。参见，例如Roberge，M.等，Cancer Res.(1994)，54，6115-21。
真菌，特别是病原体真菌及相关感染对临床医学的挑战日益增加。现有的抗真菌剂效果有限且有毒性，而对现有药物或开发中的药物具有耐药性的病原体真菌菌株却不断发展和/或被发现。例如，除其它外可在人体中致病的真菌包括：念珠菌属(Candida spp.)，包括白色念珠菌(C.albicans)、热带念珠菌(C.tropicalis)、乳酒念珠菌(C.kefyr)、克鲁斯氏念珠菌(C.krusei)和光滑念珠菌(C.galbrata)；曲霉属(Aspergillus spp.)，包括烟曲霉(A.fumigatus)和黄曲霉(A.flavus)；新型隐球菌(Cryptococcusneoformans)；芽生菌(Blastomyces spp.)，包括皮炎芽生菌(Blastomycesdermatitidis)；卡氏肺囊虫(Pneumocystis carinii)；粗球孢子菌(Coccidioidesimmitis)；蛙生蛙粪霉(Basidiobolus ranarum)；耳霉属(Conidiobolus spp.)；荚膜组织胞浆菌(Histoplasma capsulatum)；根霉菌属(Rhizopus spp.)，例如米根霉(R.oryzae)和小孢根霉(R.microsporus)；小克银汉霉属(Cunninghamella spp.)；根粘菌属(Rhizomucor spp.)；巴西芽生菌(Paracoccidioides brasiliensis)；波氏足肿菌(Pseudallescheria boydii)；西伯氏鼻孢子虫(Rhinosporidium seeberi)和申克氏孢子丝菌病(Sporothrixschenckii)(Kwon-Chung，K.J.& Bennett，J.E.1992 Medical Mycology，Leaand Febiger，Malvern，PA)。
近来，据报道tryprostatin A和B(其为由脯氨酸和异戊二烯化(isoprenylated)的色氨酸残基组成的哌嗪二酮)和五种其它的结构相关的哌嗪二酮抑制了有丝分裂期(M phase)中的细胞周期的进行，参见Cui，C.等1996 J Antibiotics 49：527-33；Cui，C.等1996 J Antibiotics 49：534-40，且这些化合物也影响了微管组装，参见Usui，T.等1998 Biochem J 333：543-48；Kondon，M.等1998 J Antibiotics 51：801-04。此外，已报道有天然和合成化合物可通过与微管素(tubulin)上的秋水仙碱结合位点(CLC-位点)结合抑制有丝分裂，从而抑制真核细胞周期，其中所述微管素是一种由两个50kDa亚基(α和β微管素)组成的大分子并且是微管的主要构成成分。参见，例如Iwasaki，S.，1993 Med Res Rev 13：183-198；Hamel，E.1996 Med ResRev 16：207-31；Weisenberg，R.C.等，1969 Biochemistry 7：4466-79。微管被认为参与了多种基本的细胞功能，例如轴突转运、细胞运动以及细胞形态的确定。因此，微管功能抑制剂可具有广泛的生物活性，且可用于医药和农用化学品目的。也有可能，秋水仙碱(CLC)位点配体可被证明具有作为真核细胞周期抑制剂的价值，并因此可用作化疗试剂，其中所述配体如CLC、五加前胡素(参见Kupchan，S.M.等，1973 J Am Chem Soc95：1335-36)、鬼臼毒素(参见Sackett，D.L.，1993 Pharmacol Ther59：163-228)和combretastatin(康布瑞塔卡汀)(参见Pettit，G.R.等1995 J MedChem 38：166-67)。
虽然已经从各种真菌中分离出哌嗪二酮型代谢产物作为霉菌毒素(参见Horak R.M.等，1981JCS Chem Comm 1265-67；Ali M.等，1898Toxicology Letters 48：235-41)或作为次级代谢产物(参见Smedsgaard J.等，1996 J Microbiol Meth 25：5-17)，但对这种哌嗪二酮型代谢产物或其衍生物的具体结构及其抗肿瘤活性特别是体内活性所知甚少。这些化合物不仅已经作为霉菌毒素被分离出来，并且Hayashi等在J.Org.Chem.(2000)65，第8402页上还描述了一种哌嗪二酮型代谢产物—苯基阿夕斯丁(phenylahistin)的化学合成方法。本领域中，通过对母体苯基阿夕斯丁进行酶催化脱氢制备了一种这类哌嗪二酮型代谢产物的衍生物—脱氢苯基阿夕斯丁。随着癌症发生率的上升，迫切需要通过化学方法制备一类基本纯净的、具有动物细胞特异增殖抑制活性和高抗肿瘤活性及选择性的哌嗪二酮型代谢产物衍生物。因此，迫切需要一种有效的、通过合成制备基本纯净的、具有结构和生物学特性的哌嗪二酮型代谢产物衍生物。
同时，国际公开号为WO/0153290的PCT申请(2001年7月26日)描述了一种通过将苯基阿夕斯丁或特定的苯基阿夕斯丁类似物暴露于从白色链霉菌(Streptomyces albulus)获得的脱氢酶来制备脱氢苯基阿夕斯丁的非合成方法。
发明内容
本发明公开了一类具有通式(I)结构的化合物以及通过合成生产这类化合物的方法：
所公开的化合物具有通式(I)的结构，其中：
每一R1、R4和R6分别选自氢原子、卤原子和饱和的C1-C24烷基、不饱和的C1-C24烯基、环烷基、环烯基、烷氧基、环烷氧基、芳基、取代的芳基、杂芳基、取代的杂芳基、氨基、取代的氨基、硝基、叠氮基、取代的硝基、苯基及取代的苯基基团、羟基、羧基、-COO-R7、氰基、烷硫基、包括多卤代烷基的卤代烷基、卤代羰基以及羰基-CCO-R7，其中R7选自氢原子、卤原子和饱和C1-C24烷基、不饱和的C1-C24烯基、环烷基、环烯基、烷氧基、环烷氧基、芳基、取代的芳基、杂芳基、取代的杂芳基、氨基、取代的氨基、硝基、叠氮基、取代的硝基、苯基和取代的苯基基团；
R1’和R1”独立地选自氢原子、卤原子和饱和C1-C24烷基、不饱和的C1-C24烯基、环烷基、环烯基、烷氧基、环烷氧基、芳基、取代的芳基、杂芳基、取代的杂芳基、氨基、取代的氨基、硝基、叠氮基、取代的硝基、苯基及取代的苯基基团、羟基、羧基、-COO-R7、氰基、烷硫基、包括多卤代烷基的卤代烷基、卤代羰基以及羰基-CCO-R7，其中R7选自氢原子、卤原子和饱和C1-C24烷基、不饱和的C1-C24烯基、环烷基、环烯基、烷氧基、环烷氧基、芳基、取代的芳基、杂芳基、取代的杂芳基、氨基、取代的氨基、硝基、叠氮基、取代的硝基、苯基和取代的苯基基团；
每一R2、R3和R5分别选自氢原子、卤原子和饱和的C1-C12烷基、不饱和的C1-C12烯基、酰基、环烷基、烷氧基、环烷氧基、芳基、取代的芳基、杂芳基、取代的杂芳基、氨基、取代的氨基、硝基和取代的硝基基团、磺酰基和取代的磺酰基基团；
X1和X2分别选自氧原子、氮原子和硫原子，且均可为未取代的或被如上定义的R5基团所取代；
Y选自氮原子、被上述R5基团取代的氮原子、氧原子、硫原子、氧化的硫原子、亚甲基基团及取代的亚甲基基团；
n为等于0、1或2的整数；
每一独立的非零n对应的每一Z和每一Z1、Z2、Z3和Z4分别独立地选自碳原子、硫原子、氮原子或氧原子；及
虚线表示的键可以是单键或双键；
在特定的化合物中需满足，如果R1、R1’、R2、R3、R4和R5均为氢原子，则X1和X2不能均为氧原子，且R6不能为3，3-二甲基-1-丁烯和氢原子。
所述方法包括如下步骤：
将二酰基哌嗪二酮与第一醛反应制备中间体化合物；及
将所述中间体化合物与第二醛反应制备具有所述通式结构的一类化合物，其中：
所述第一醛和第二醛选自噁唑甲醛(oxazolecarboxaldeyhyde)、咪唑甲醛、苯甲醛、咪唑甲醛衍生物和苯甲醛衍生物，从而形成化合物，其中
所公开的化合物具有通式(I)的结构，其中：
每一R1、R4和R6分别选自氢原子、卤原子和饱和的C1-C24烷基、不饱和的C1-C24烯基、环烷基、环烯基、烷氧基、环烷氧基、芳基、取代的芳基、杂芳基、取代的杂芳基、氨基、取代的氨基、硝基、叠氮基、取代的硝基、苯基及取代的苯基基团、羟基、羧基、-COO-R7、氰基、烷硫基、包括多卤代烷基的卤代烷基、卤代羰基以及羰基-CCO-R7，其中R7选自氢原子、卤原子和饱和C1-C24烷基、不饱和的C1-C24烯基、环烷基、环烯基、烷氧基、环烷氧基、芳基、取代的芳基、杂芳基、取代的杂芳基、氨基、取代的氨基、硝基、叠氮基、取代的硝基、苯基和取代的苯基基团；
R1’和R1”独立地选自氢原子、卤原子和饱和C1-C24烷基、不饱和的C1-C24烯基、环烷基、环烯基、烷氧基、环烷氧基、芳基、取代的芳基、杂芳基、取代的杂芳基、氨基、取代的氨基、硝基、叠氮基、取代的硝基、苯基及取代的苯基基团、羟基、羧基、-COO-R7、氰基、烷硫基、包括多卤代烷基的卤代烷基、卤代羰基以及羰基-CCO-R7，其中R7选自氢原子、卤原子和饱和C1-C24烷基、不饱和的C1-C24烯基、环烷基、环烯基、烷氧基、环烷氧基、芳基、取代的芳基、杂芳基、取代的杂芳基、氨基、取代的氨基、硝基、叠氮基、取代的硝基、苯基和取代的苯基基团；
每一R2、R3和R5分别选自氢原子、卤原子和饱和的C1-C12烷基、不饱和的C1-C12烯基、酰基、环烷基、烷氧基、环烷氧基、芳基、取代的芳基、杂芳基、取代的杂芳基、氨基、取代的氨基、硝基和取代的硝基基团、磺酰基和取代的磺酰基基团；
X1和X2分别选自氧原子、氮原子和硫原子，且均可为未取代的或被如上定义的R5基团所取代；
Y选自氮原子、被上述R5基团取代的氮原子、氧原子、硫原子、氧化的硫原子、亚甲基基团及取代的亚甲基基团；
n为等于0、1或2的整数；
每一独立的非零n对应的每一Z和每一Z1、Z2、Z3和Z4分别选自碳原子、硫原子、氮原子或氧原子；及
虚线表示的键可以是单键或双键。
在本发明化合物和方法的优选实施方案中，所述咪唑甲醛为5-(1，1-二甲基-2-乙基)咪唑-4-甲醛，且所述苯甲醛包含单独的甲氧基基团。本发明化合物的其它优选实施方案包括具有叔丁基基团、二甲氧基基团、氯基团和甲基噻吩基团的化合物和制备这些化合物的方法，以及表2、3和4中所示的化合物及制备这些化合物的方法。
本发明还公开了治疗肿瘤组织或预防癌症或病原真菌感染的方法和物质。这些方法和物质特别适用于治疗哺乳动物个体，更特别适用于人类，并且包括将所述个体脱氢苯基阿夕斯丁或其类似物给药。所述方法包括给予个体包括有效抗肿瘤或抗真菌剂量的脱氢阿夕斯丁或其类似物的组合物。
另一实施方案涉及治疗动物的疾病状态的方法，该方法可包括以有效减少血管增生的量或有效减少血管密度的量将本发明所述化合物给予所述动物。示例性疾病状态包括诸如癌的赘生物，以及其它与血管化作用相关的或依赖于血管化作用的疾病状态，例如包括，免疫性和非免疫性炎症、类风湿性关节炎、慢性关节风湿病、牛皮癣、糖尿病性视网膜病、新生血管性青光眼、早产儿视网膜病、黄斑变性、角膜移植排斥、晶状体后纤维组织增生症、虹膜发红、动脉粥样硬化斑块中毛细管增生、骨质疏松症等等。在一些实施方案中，所述疾病不是癌。
其它实施方案涉及诱导动物体内血管萎缩的方法。所述方法例如可包括用治疗有效量的本发明所述的通式(I)的化合物治疗所述动物。治疗有效量的所述化合物可引起脉管系统中的微管素解聚。
所述动物可优选地为人类。优选的疾病可以是肿瘤、糖尿病性视网膜病、与年龄相关的黄斑变性等等。在一些方面，所述疾病不是癌，或者尤其将癌排除在所述方法和用途之外。优选地，所述化合物为KPU-02。
其它实施方案还涉及用于治疗或预防血管增生的药物组合物，该组合物包括药物有效量的本发明公开的化合物以及药物可接受的载体。所述血管增生可以是疾病的症状，例如，癌、与年龄相关的黄斑变性和糖尿病性视网膜病。
一些实施方案涉及相对于非肿瘤组织的脉管系统，优先靶向肿瘤脉管系统的方法。所述方法可包括将本发明所述的具有通式(I)结构的化合物给予动物(优选为人类)的步骤。所述非肿瘤组织可以是，例如，皮肤、肌肉、脑、肾、心脏、脾、肠等等。所述肿瘤的脉管系统可相对非肿瘤组织的脉管系统优先地，例如以约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％和90％的程度被靶向。
其它实施方案涉及相对于非肿瘤组织的脉管系统，优先靶向肿瘤的脉管系统的方法，该方法可包括将相对于非肿瘤组织的脉管系统，优先靶向肿瘤的脉管系统的试剂给予动物。
另外的实施方案涉及具有通式(I)结构的化合物在药物制备中的应用，该药物用于治疗与增加的脉管系统相关的或依赖于脉管系统的疾病状态。在某些方面，所述疾病状态可以是癌，而在其它方面，尤其不包括特定类型的癌或所有的癌。所述疾病状态可以是任何其它的与血管过度形成相关的、与脉管系统相关的或依赖于脉管系统的疾病状态。例子包括免疫性和非免疫性炎症、类风湿性关节炎、慢性关节风湿病、牛皮癣、糖尿病性视网膜病、新生血管性青光眼、早产儿视网膜病、黄斑变性、角膜移植排斥、晶状体后纤维组织增生症、虹膜发红、动脉粥样硬化斑块中毛细血管增生、骨质疏松症等等。
附图的简要说明
本说明书引入并构成其一部分的附图只是为了说明本发明的某些优选实施方案。其与说明书的其它部分共同用来向本领域所属技术人员说明制备本发明某些化合物的优选方式。在所述附图中：
图1所示为制备脱氢苯基阿夕斯丁的反应路线图，包括将二酰基哌嗪二酮1与咪唑甲醛2反应制备中间体化合物3，再将中间体化合物3与苯甲醛4反应得到脱氢苯基阿夕斯丁。
图2所示为合成脱氢苯基阿夕斯丁粗产物的HPLC谱图。
图3所示为制备脱氢苯基阿夕斯丁的反应路线图，包括将二酰基哌嗪二酮1与苯甲醛4反应制备中间体化合物17，再将中间体化合物17与咪唑甲醛15反应得到脱氢苯基阿夕斯丁。
图4所示为由路线A和B制备的合成叔丁基-脱氢苯基阿夕斯丁粗产物的HPLC谱图。
图5显示了对脱氢PLH进行修饰使其具有有效细胞毒素活性的两种策略。
图6显示了脱氢PLH在苯基部分的推定活性构象。
图7苯基阿夕斯丁的Cytochrome P450代谢。
图8所示为叔丁基-脱氢PLH的Z-E转变。
图9显示了酰基-E-叔丁基-脱氢PLH的合成和前药的图像。
图10显示了3-Z-亚苄基-6-[5”-(1，1-二甲基烯丙基)-1H-咪唑-4”-Z-基-亚甲基]-哌嗪-2，5-二酮的温度梯度。
图11显示了3-Z-亚苄基-6-[5”-叔丁基-1H-咪唑-4”-Z-基-亚甲基]-哌嗪-2，5-二酮的温度梯度。
图12显示了与秋水仙碱和紫杉醇(taxol)相比，KPU-2、KPU-35和叔丁基-苯基阿夕斯丁对FITC-Dextran的HuVEC单层透过性的作用。
图13显示了KPU-2单独或与CPT-11组合时对HT-29人结肠肿瘤异种移植物(HT-29 Human Colon Tumor Xenograft)模型中估计的肿瘤生长的作用。
图14显示了KPU-2单独或与CPT-11组合时对从HT-29人结肠肿瘤异种移植物模型中的个体小鼠尸体上切除的肿瘤重量的作用。
图15显示了KPU-2单独或与CPT-11组合时对HT-29人结肠肿瘤异种移植物模型中估计的肿瘤生长的作用。
图16显示了KPU-2单独或与CPT-11组合时对从HT-29人结肠肿瘤异种移植物模型中的个体小鼠尸体上切除的肿瘤重量的作用。
图17显示了A.KPU-2、B.KPU-35和C.叔丁基-苯基阿夕斯丁单独或与CPT-11组合时对HT-29人结肠肿瘤异种移植物模型中估计的肿瘤生长的作用。
图18显示了A.KPU-2、B.KPU-35和C.叔丁基-苯基阿夕斯丁单独或与CPT-11组合时对从HT-29人结肠肿瘤异种移植物模型中的个体小鼠尸体上切除的肿瘤重量的作用。
图19显示了KPU-2单独或与CPT-11组合时对HT-29人结肠肿瘤异种移植物模型中肿瘤增长的作用：三个研究的比较。
图20显示了KPU-2单独或与CPT-11组合时对从HT-29人结肠肿瘤异种移植物模型中最终肿瘤重量的作用：三个研究的比较。
图21显示了KPU-2单独或与泰索帝(Taxotere)组合时对DU-145人前列腺肿瘤异种移植物模型中估计的肿瘤增长的作用。
图22显示了A.KPU-2、B.KPU-35和C.叔丁基-苯基阿夕斯丁单独或与泰索帝组合时对估计的肿瘤生长的作用，其中所述估计的肿瘤生长是在DU-145人前列腺肿瘤异种移植物(DU-145 Human Prostate TumorXenograft)模型存活部分进行的观测基础上得到的。
图23显示了KPU-2单独或与泰索帝组合时对DU-145人前列腺肿瘤异种移植物模型中从尸体上切除的个体肿瘤重量的作用。
图24显示了KPU-35单独或与泰索帝组合时对DU-145人前列腺肿瘤异种移植物模型中从尸体上切除的个体肿瘤重量的作用。
图25显示了A.KPU-2、B.KPU-35和C.叔丁基-苯基阿夕斯丁单独或与泰索帝组合时在MCF-7人乳房肿瘤异种移植物(MCF-7 Human BreastTumor Xenograft)模型中的作用。
图26显示了KPU-2单独或与泰索帝组合时对A549人肺肿瘤异种移植物(A549 Human Lung Tumor Xenograft)模型中估计的肿瘤增长的作用。
图27显示了KPU-2单独或与泰索帝组合时对A549人肺肿瘤异种移植物模型中从尸体上切除的肿瘤重量的作用。
图28显示了KPU-2单独或与太平洋紫杉醇(Paclitaxel)组合时对移植了MDA-231人乳房肿瘤模型的小鼠乳房颊脂垫中估计的肿瘤重量的作用。
图29显示了A.KPU-2、B.KPU-35和C.叔丁基-苯基阿夕斯丁单独或与太平洋紫杉醇组合时在小鼠黑瘤B16 F10转移性肿瘤模型(MurineMelanoma B16 F10 Metastatic Tumor Model)中的作用。
图30显示了KPU-35和KPU-02对图30的背部皮肤皱褶室中的肿瘤脉管系统的作用。
图31显示了KPU-02与CPT-11组合对HT-29人结肠肿瘤异种移植物模型中评估的肿瘤重量的作用。
图32显示了KPU-02与CPT-11组合对HT-29人结肠肿瘤异种移植物模型中离体的肿瘤重量的作用。
图33显示了HuVEC细胞中由KPU-02和KPU-35诱导的快速的微管素解聚作用。
图34显示了KPU-02对HuVEC细胞中单层渗透性的作用。
图35显示了KPU-02对应用125I-IAP技术的P22大鼠肉瘤模型中肿瘤血流量的作用。
图36显示了给药后1小时和24小时，腹腔注射(IP)的15mg/kgKPU-02(表示为％载体对照)对不同组织中血流量的作用。
图37显示了在P22大鼠肉瘤模型中，由腹腔注射的7.5mg/kg和15.0mg/kg的KPU-02诱导的肿瘤坏死。
图38列出了叔丁基-脱氢-PLH的多种衍生物在HT-29细胞中的活性。
图39显示了叔丁基-脱氢-PLH衍生物的3D QSAR(CoMFA)分析。
图40显示了叔丁基-脱氢-PLH衍生物的X-射线结晶学分析。
图41显示了与秋水仙碱相比，多种苯基阿夕斯丁衍生物的生物活性。
图42显示了叔丁基-脱氢-PLH(KPU-2)和KPU-35对HeLa细胞的细胞周期进程的作用。
图43显示了与太平洋紫杉醇相比，脱氢-PLH和叔丁基-脱氢-PLH(KPU-2)对药物敏感的和耐药的肿瘤细胞系的作用。
图44A显示了在DMSO药物载体(◇)、1.25μM(□)、2.5μM(-)和5μM(○)KPU-02的存在下，微管蛋白(microtubule protein)聚合作用的混浊度光谱。
图44B显示了在DMSO药物载体(◇)、1.25μM(□)、2.5μM(-)和5μM(○)CA4的存在下，微管蛋白聚合作用的混浊度光谱。
图44C显示了在DMSO药物载体(◇)、1.25μM(□)、2.5μM(-)和5μM(○)CLC的存在下，微管蛋白聚合作用的混浊度光谱。
图45显示了不存在或存在一系列KPU-02(○)、CA4(□)和秋水仙碱(◇)浓度时MT的抑制作用。
图46A显示了在KPU-02存在下，在稳态时，在体外的微管平均长度的频率直方图。
图46B显示了在CA4存在下，在稳态时，在体外的微管平均长度的频率直方图。
图46C显示了在CLC存在下，在稳态时，在体外的微管平均长度的频率直方图。
图47A显示了在KPU-02存在下，在稳态时，体外形成的富含MAP的微管的电子显微镜图。
图47B显示了在CA4存在下，在稳态时，体外形成的富含MAP的微管的电子显微镜图。
图47C显示了在CLC存在下，在稳态时，体外形成的富含MAP的微管的电子显微镜图。
图48显示了在KPU-02、CA4和秋水仙碱的存在下，在稳态时MT长度减少的图解概述。
图49A显示了在增加的KPU-02存在下，微管素的荧光发射光谱。
图49B显示了在487nm的荧光发射最大值的拟合曲线，以获得微管素的对于KPU-02的Kd值。插图显示了残数。
图49C显示了结合数据的双倒数转换。
图50显示了在不存在(◇)或存在10μM KPU-02(○)或10μM CA4(□)时，含有多种浓度的[3H]CLC的秋水仙碱结合微管素的竞争性抑制分析的图解结果。
图51显示了在KPU-02(o)、CA4(a)和秋水仙碱(0)的存在下培养的MCF7细胞中，KPU-02、CA4和CLC对有丝分裂进程的抑制作用的对数[化合物]响应曲线。
图52显示了MCF7细胞的免疫荧光显微图像。a-d：对照中-(a)对照中微管素、(b)KPU-02、(c)CA4和(d)CLC处理的细胞中的微管素；e-h：对照中-(e)对照中的DNA、(f)KPU-02、(g)CA4和(h)CLC处理的细胞中的DNA。
图53A显示了用KPU-02处理的MCF7细胞的免疫荧光显微图像。
图53B显示了用CA4处理的MCF7细胞的免疫荧光显微图像。
图53C显示了用CLC处理的MCF7细胞的免疫荧光显微图像。
图54A显示了用KPU-02处理的MCF7细胞的免疫荧光显微图像。
图54B显示了用A4处理的MCF7细胞的免疫荧光显微图像。
图54C显示了用CLC处理的MCF7细胞的免疫荧光显微图像。
在某些附图中，所示的化合物是用可替换的名称表示的。这些可替换名称的转换的完整列表如下：
优选实施方案的详细说明
在法律允许的范围内，本文引用的每一参考文献包括美国专利都视为全文引入作为本说明书的参考。在此将美国专利申请的第10/632,531号和PCT申请第PCTUS03/24232号的全部内容引入作为参考，两个申请均于2003年8月1日提交，且名称均为“脱氢苯基阿夕斯丁及其类似物以及脱氢苯基阿夕斯丁及其类似物的合成”。
本发明提供了通过合成制备包括脱氢苯基阿夕斯丁和脱氢苯基阿夕斯丁衍生物的新型化合物的方法，还提供了以相对高的收率生产药物可接受的细胞周期抑制剂、抗肿瘤试剂和抗真菌试剂的方法，其中所述化合物和/或其衍生物属于这些细胞周期抑制剂、抗肿瘤试剂和抗真菌剂的活性成分。本发明的其它目的包括提供不能通过现有的非合成方法获得的新型化合物。本发明的目的也包括提供治疗癌症特别是人类癌症的方法，该方法包括将抑制肿瘤生长有效剂量的一类新型抗肿瘤化合物中的某些化合物给药的步骤。本发明还提供预防或治疗个体中的病原真菌的方法，包括将有效抗真菌剂量的一类新型抗真菌化合物中的某些化合物对所述个体给药，例如以可产生所需的抗真菌作用的剂量和方式将脱氢苯基阿夕斯丁或其类似物给药。这些目标在本发明公开的所述化合物以及制备和使用这类化合物的方法的优选实施方案中得以实现，而不必在本发明的所有实施方案中都实现。
本发明还公开了化合物和生产这类化合物的方法，其中所述化合物如通式(I)所示：
其中：
每一R1、R4和R6分别选自氢原子、卤原子和饱和的C1-C24烷基、不饱和的C1-C24烯基、环烷基、环烯基、烷氧基、环烷氧基、芳基、取代的芳基、杂芳基、取代的杂芳基、氨基、取代的氨基、硝基、叠氮基、取代的硝基、苯基及取代的苯基基团、羟基、羧基、-CO-O-R7、氰基、烷硫基、包括多卤代烷基的卤代烷基、卤代羰基以及羰基-CCO-R7，其中R7选自氢原子、卤原子和饱和C1-C24烷基、不饱和的C1-C24烯基、环烷基、环烯基、烷氧基、环烷氧基、芳基、取代的芳基、杂芳基、取代的杂芳基、氨基、取代的氨基、硝基、叠氮基、取代的硝基、苯基和取代的苯基基团；
R1’和R1”独立地选自氢原子、卤原子和饱和C1-C24烷基、不饱和的C1-C24烯基、环烷基、环烯基、烷氧基、环烷氧基、芳基、取代的芳基、杂芳基、取代的杂芳基、氨基、取代的氨基、硝基、叠氮基、取代的硝基、苯基及取代的苯基基团、羟基、羧基、-CO-O-R7、氰基、烷硫基、包括多卤代烷基的卤代烷基、卤代羰基以及羰基-CCO-R7，其中R7选自氢原子、卤原子和饱和C1-C24烷基、不饱和的C1-C24烯基、环烷基、环烯基、烷氧基、环烷氧基、芳基、取代的芳基、杂芳基、取代的杂芳基、氨基、取代的氨基、硝基、叠氮基、取代的硝基、苯基和取代的苯基基团；
R、R1’和R1”或者彼此共价结合或者彼此非共价结合；
每一R2、R3和R5分别选自氢原子、卤原子和饱和的C1-C12烷基、不饱和的C1-C12烯基、酰基、环烷基、烷氧基、环烷氧基、芳基、取代的芳基、杂芳基、取代的杂芳基、氨基、取代的氨基、硝基和取代的硝基基团、磺酰基和取代的磺酰基基团；
X1和X2分别选自氧原子、氮原子和硫原子，且均可为未取代的或被如上定义的R5基团所取代；
Y选自氮原子、被上述R5基团取代的氮原子、氧原子、硫原子、氧化的硫原子、亚甲基基团及取代的亚甲基基团；
n为等于0、1或2的整数；
每一独立的非零n对应的每一Z和每一Z1、Z2、Z3和Z4分别选自碳原子、硫原子、氮原子或氧原子；及
虚线表示的键可以是单键或双键。
所述方法包括通过如下步骤制备通式(I)化合物的方法：
将二酰基哌嗪二酮与第一醛反应制备中间体化合物；和
将所述中间体化合物与第二醛反应制备具有所述通式结构的一类化合物，其中
所述第一醛和第二醛选自噁唑甲醛、咪唑甲醛、苯甲醛、咪唑甲醛衍生物和苯甲醛衍生物，从而形成通式(I)的化合物，其中
每一R1、R4和R6分别选自氢原子、卤原子和饱和的C1-C24烷基、不饱和的C1-C24烯基、环烷基、环烯基、烷氧基、环烷氧基、芳基、取代的芳基、杂芳基、取代的杂芳基、氨基、取代的氨基、硝基、叠氮基、取代的硝基、苯基及取代的苯基基团、羟基、羧基、-CO-O-R7、氰基、烷硫基、包括多卤代烷基的卤代烷基、卤代羰基以及羰基-CCO-R7，其中R7选自氢原子、卤原子和饱和C1-C24烷基、不饱和的C1-C24烯基、环烷基、环烯基、烷氧基、环烷氧基、芳基、取代的芳基、杂芳基、取代的杂芳基、氨基、取代的氨基、硝基、叠氮基、取代的硝基、苯基和取代的苯基基团；
R1’和R1”独立地选自氢原子、卤原子和饱和C1-C24烷基、不饱和的C1-C24烯基、环烷基、环烯基、烷氧基、环烷氧基、芳基、取代的芳基、杂芳基、取代的杂芳基、氨基、取代的氨基、硝基、叠氮基、取代的硝基、苯基及取代的苯基基团、羟基、羧基、-CO-O-R7、氰基、烷硫基、包括多卤代烷基的卤代烷基、卤代羰基以及羰基-CCO-R7，其中R7选自氢原子、卤原子和饱和C1-C24烷基、不饱和的C1-C24烯基、环烷基、环烯基、烷氧基、环烷氧基、芳基、取代的芳基、杂芳基、取代的杂芳基、氨基、取代的氨基、硝基、叠氮基、取代的硝基、苯基和取代的苯基基团；
每一R2、R3和R5分别选自氢原子、卤原子和饱和的C1-C12烷基、不饱和的C1-C12烯基、酰基、环烷基、烷氧基、环烷氧基、芳基、取代的芳基、杂芳基、取代的杂芳基、氨基、取代的氨基、硝基和取代的硝基基团、磺酰基和取代的磺酰基基团；
X1和X2分别选自氧原子、氮原子和硫原子，并且
Y选自氮原子、被上述R5基团取代的氮原子、氧原子、硫原子、氧化的硫原子、亚甲基基团及取代的亚甲基基团；
每一独立的非零n对应的每一Z和每一Z1、Z2、Z3和Z4分别选自碳原子、硫原子、氮原子或氧原子；及
虚线表示的键可以是单键或双键。
本发明还提供了通式(I)和式(II)化合物的药物可接受的盐和酯类前药，以及通过本发明公开的方法合成这类化合物的方法。
术语“酯类前药”，特别是当指通过本发明方法合成的通式(I)化合物的酯类前药时，指所述化合物的化学衍生物，其可在体内迅速转化(例如在血液或组织内水解)得到所述化合物。术语“酯类前药”指本发明公开的化合物的衍生物，其可通过加入多种可在生理条件下水解的成酯基团中的任意基团形成。前药的酯基团的例子包括pivoyloxymethyl、乙酸基甲基、2-苯并[c]呋喃酮亚基、2，3-二氢化茚基和甲氧基甲基以及其它本领域公知的这类基团(包括(5-R-2-氧-1，3-二氧杂环戊烯-4-基)甲基基团)。前药的酯基团的其它例子可在例如T.Higuchi和V.Stella的“Pro-drugs asNovel Delivery Systems”’卷14，A.C.S.Symposium Series，AmericanChemical Society(1975)；和“Bioreversible Carriers in Drug Design：Theoryand Application”，E.B.Roche编辑，Pergamon Press：New York，14-21(1987)(为含有羧基的化合物提供可用作前药的酯的例子)中找到。
本文所用的术语“酯类前药”也指所述化合物的化学衍生物，其可在体内迅速转化(例如在血液中水解)得到所述化合物。术语“酯类前药”指本发明公开的化合物的衍生物，其可通过加入多种可在生理条件下水解的成酯基团中的任意基团形成。前药的酯基团的例子包括pivoyloxymethyl、乙酰氧基甲基、2-苯并[c]呋喃酮亚基、2，3-二氢化茚基和甲氧基甲基以及其它本领域公知的这类基团(包括(5-R-2-氧-1，3-二氧杂环戊烯-4-基)甲基基团)。前药的酯基团的其它例子可在例如T.Higuchi和V.Stella的“Pro-drugs as Novel Delivery Systems”’卷14，A.C.S.SymposiumSeries，American Chemical Society(1975)；和“Bioreversible Carriers in DrugDesign：Theory and Application”，E.B.Roche编辑，Pergamon Press：NewYork，14-21(1987)(为含有羧基的化合物提供了可用作前药的酯的例子)中找到。
术语“药物可接受的盐”，特别当指通过本发明公开的方法合成的通式(I)化合物的药物可接受的盐时，指化合物的任何药物可接受的盐，优选指化合物的酸加合盐。优选的药物可接受的盐的例子是碱金属盐(钠或钾)、碱土金属盐(钙或镁)或者从氨或诸如C1-C7烷基胺、环己基胺、三乙醇胺、乙二胺或三(羟甲基)氨基甲烷的药物可接受的有机胺衍生的铵盐。对于用所述方法合成的碱性胺化合物，优选的药物可接受的盐的例子是药物可接受的无机或有机酸的酸加合盐，例如氢卤酸、硫酸、磷酸或脂肪族或芳香族羧酸或磺酸，例如乙酸、琥珀酸、乳酸、苹果酸、酒石酸、柠檬酸、抗坏血酸、烟酸、甲磺酸、对甲苯磺酸或萘磺酸。
本文所用的术语“药物可接受的盐”也指化合物的任何药物可接受的盐，优选指化合物的酸加合盐。优选的药物可接受的盐的例子是碱金属盐(钠或钾)、碱土金属盐(钙或镁)或者从氨或诸如C1-C7烷基胺、环己基胺、三乙醇胺、乙二胺或三-(羟甲基)-氨基甲烷的药物可接受的有机胺衍生的铵盐。对于用所述方法合成的碱性胺化合物，优选的药物可接受的盐的例子是药物可接受的无机酸或有机酸的酸加合盐，例如氢卤酸、硫酸、磷酸、或脂肪族或芳香族的羧酸或磺酸，例如乙酸、琥珀酸、乳酸、苹果酸、酒石酸、柠檬酸、抗坏血酸、烟酸、甲磺酸、对甲苯磺酸或萘磺酸。
本发明公开的优选药物组合物包括通过本发明方法合成的通式(I)化合物的药物可接受的盐和酯类前药。因此，如果在药物制剂的生产过程中包括将药物赋形剂和盐形式的所述活性成分充分混合，则优选使用非碱性的即酸性或中性的赋形剂。
在本发明所述化合物的方法的优选实施方案中，可形成相对刚性的、平面伪三环结构。为了稳定这类相对刚性的、平面伪三环结构，R3优选为氢。
在本发明所述化合物的方法的其它优选实施方案中，n等于0或1，更优选为1，且每一Z2、Z3和Z4分别选自氧原子、氮原子和碳原子，更优选Z2、Z3和Z4中至少一个为碳原子，最优选Z2、Z3和Z4中至少两个为碳原子。所有的Z可同时为碳原子。
本发明所述化合物和方法的其它优选实施方案包括具有以下通式(Ia)和(Ib)结构的化合物：
其中各基团定义如本文所述。
本文所用的术语“卤原子”指任一元素周期表第7列的放射稳定的原子，即氟、氯、溴或碘，优选氟和氯。
本文所用的术语“烷基”指任意直链或支链、取代或未取代的饱和烃基，优选C1-C6的直链、饱和、未取代的烃基，最优选甲基、乙基、异丁基和叔丁基。在所述取代的饱和烃基中，优选C1-C6单卤素取代和二卤素取代及全卤素取代的饱和烃基以及氨基取代的烃基，最优选全氟甲基、全氯甲基、全氟叔丁基和全氯叔丁基。术语“取代的”具有其原本的含义，如相关领域中的同时期的各种专利中所述。参见，例如美国专利第6,583,143、6,509,331；6,506,787；6,500,825；5,922,683；5,886,210；5,874,443和6,350,759号。特别地，所述“取代的”的定义与美国专利第6,583,143号中所定义的一样宽泛，其中将术语取代的定义为任意至少一个氢原子被取代基所替代的基团，例如烷基、芳基、芳基烷基、杂芳基、杂芳基烷基、杂环基和杂环基烷基。术语“取代的”也和美国专利第6,509,331号中所定义的一样宽泛，其中将术语“取代的烷基”定义为指优选含1-10个碳原子、具有1-5个取代基且优选具有1-3个取代基的烷基基团，其中所述取代基选自烷氧基、取代的烷氧基、环烷基、取代的环烷基、环烯基、取代的环烯基、酰基、酰基氨基、酰氧基、氨基、取代的氨基、氨基酰基、氨基酰氧基、氧酰基氨基、氰基、卤素、羟基、羧基、羧基烷基、酮基、硫代酮基、硫醇基、硫代烷氧基、取代的硫代烷氧基、芳基、芳氧基、杂芳基、杂芳基氧基、杂环基、杂环基氧基、羟基氨基、烷氧基氨基、硝基、-SO-烷基、-SO-取代的烷基、-SO-芳基、-SO-杂芳基、-SO2-烷基、-SO2-取代的烷基、-SO2-芳基和-SO2-杂芳基。其它上述罗列的专利也提供了本领域所属技术人员公知的术语“取代的”的标准定义。术语“环烷基”指任何非芳香族碳氢环、优选所述环由5-12个原子构成。术语“酰基”指由含氧酸衍生的烷基或芳基基团，优选乙酰基。
本文所用的术语“烯基”指包括多不饱和烃基在内的任意直链或支链、取代或未取代的不饱和烃基，优选C1-C6的直链、单不饱和及双不饱和的、未取代的烃基。最优选单不饱和的、二卤素取代的烃基。在通式(I)化合物的R1和R4位特别优选为z-异戊二烯部分。术语“环烯基”指任意非芳香族碳氢环，优选所述环由5-12个原子构成。
本文所用的术语“芳基”、“取代的芳基”、“杂芳基”和“取代的杂芳基”指芳香族烃环，优选具有5、6或7个原子，最优选具有6个原子构成所述环。“杂芳基”和“取代的杂芳基”指环中具有至少一个杂原子(例如氧、硫或氮原子)和至少一个碳原子的芳香族烃环。
术语“烷氧基”指任意直链或支链、取代或未取代、饱和或不饱和的醚类，优选C1-C6直链、饱和、未取代的醚，更优选甲氧基，同样优选二甲基、二乙基、甲基-异丁基及甲基-叔丁基醚。术语“环烷氧基”指任意非芳香烃环，优选由5-12个原子构成环。
本文所用的术语“纯化的”、“基本纯化的”或“分离的”指不含其天然状态下通常相关的其它不相似化合物的化合物，因此本发明化合物构成所给样品质量(指重量)的至少0.5％、1％、5％、10％或20％，更优选至少50％或75％。
通式(I)化合物可由本领域公知并可得的试剂进行化学合成或制备。例如，如Loughlin等，2000 Bioorg Med Chem Lett 10：91或Brocchini等在公开号为WO 95/21832的国际申请中所述的二酰基哌嗪二酮(二乙酰基哌嗪二酮)修饰方法。所述二酰基哌嗪二酮(二乙酰基哌嗪二酮)可通过例如将廉价的2，5-哌嗪二酮(TCl Cat.No.G0100，25g)用醋酸钠和酸酐钠(sodium anhydride)二乙酰化来制备。所述具活性的哌嗪二酮的二乙酰基结构可被其它酰基基团替代，从而包括诸如Boc(叔丁氧基羰基)、Z(苯甲酰氧基羰基)的氨基甲酸酯。
所述咪唑甲醛可根据例如Hayashi等，2000 J Organic Chem 65：8402中所公开的方法(如下)制备：
本文公开的合成方法优选在DMF中、作为碱的碳酸铯存在下及去氧气氛中进行。例如Watanabe等，18th International Congress of HeterocyclicChemistry in Yokohama，Japan(2001年7月30日)，Abstract，225页中所报道的，惰性气氛可避免用碳酸铯处理过程中可能发生的哌嗪二酮环的活性α-碳原子的氧化(如下)。
铯盐存在下活性羰基化合物的空气氧化
所述合成方法的其它实施方案包括对通式(I)所示化合物合成中所使用或涉及的化合物的修饰。这类衍生物可包括对苯环的修饰、引入其它芳香环系、芳香环的位置、咪唑环系的改变和/或进一步对所述咪唑环5-位的修饰。这类修饰的例子在例如实施例4中进行了论述。这类修饰的结果包括苯环和/或所述化合物中氮含量的上升，其可增强化合物的溶解性。其它修饰可结合已知的微管素抑制剂的衍生物，从而模拟微管素抑制剂的活性。其它修饰可简化β-酮酯的合成，其应用于制备本文公开的方法中使用的咪唑甲醛。
药物组合物
本发明还将本文公开的化合物(任意地或优选由本文公开的方法制备)应用于药物组合物，该药物组合物包括为储存及后续给药制备的药物可接受的载体，所述药物组合物包括含在药物可接受的载体或稀释剂中的药物有效量的上述产物。用于医疗用途的可接受的载体或稀释剂是药物领域公知的，且在例如Remington’s Pharmaceutical Science，MackPublishing Co.(A.R.Gennaro edit.1985)中进行了描述。防腐剂、稳定剂、染料甚至调味剂也可用在所述药物组合物中。例如苯甲酸钠、抗坏血酸和对羟基苯甲酸酯可用作防腐剂。此外，可使用抗氧化剂和悬浮剂。
所述脱氢苯基阿夕斯丁或脱氢苯基阿夕斯丁类似物组合物可制成或以以下形式使用：用于口服给药的片剂、胶囊或酏剂；用于直肠给药的栓剂；用于注射给药的无菌溶液、悬浮液；用于透皮给药的贴片；及皮下沉积物等等。注射剂可制成常规的形式，如液体溶液或悬浮液、适用于在注射或输注(infusion)前溶解或悬浮在液体中的固体形式，或乳剂。适合的赋形剂是例如水、盐水、葡萄糖、甘露糖醇、乳糖、卵磷脂、白蛋白、谷氨酸钠、半胱氨酸盐酸盐、人血清白蛋白等等。此外，如果需要，所述注射用药物组合物可含有微量的无毒辅助物质，如润湿剂、pH缓冲剂等等。如果需要，可使用吸收增强制剂(例如脂质体)。
用于非肠道给药的药物制剂包括水溶形式的所述活性化合物的水溶液。此外，所述活性化合物的悬浮液可制备成适当的油性注射悬浮液。适合的亲油溶剂或载体包括诸如芝麻油的脂肪油，或其它诸如大豆油、柚子或杏仁油的有机油，或诸如油酸乙酯或甘油三酯的合成脂肪酸酯，或脂质体。水性注射悬浮液可含有增加所述悬浮液粘度的物质，例如羧甲基纤维素钠，山梨糖醇或葡聚糖。任意地，所述悬浮液也可含有适合的稳定剂或增强所述化合物溶解性的试剂，使得可制备高浓度的溶液。
用于口服的药物制剂可通过将所述活性化合物与固体赋形剂结合、任意地对所得混合物进行研磨、及将所述混合物制成颗粒，加入适合的辅料之后(如果需要)，从而得到片剂或糖衣丸的核心。特别适合的赋形剂是填充剂，例如诸如乳糖、蔗糖、甘露糖醇或山梨糖醇的糖；诸如玉米淀粉、小麦淀粉、稻米淀粉、土豆淀粉、明胶、黄芪胶、甲基纤维素、羟基丙基甲基-纤维素、羧甲基纤维素钠等等的纤维素制剂，和/或聚乙烯吡咯烷酮(PVP)。如果需要可加入崩解剂，例如交联聚乙烯吡咯烷酮、琼脂或者藻酸或诸如藻酸钠的藻酸盐。对糖衣丸核心进行适当地包被。为达此目的，可使用浓缩的糖溶液，其可选择性地含有阿拉伯胶、滑石、聚乙烯吡咯烷酮、carbopol凝胶、聚乙二醇和/或二氧化钛、紫胶漆(lacquer)溶液和适合的有机溶剂或混合溶剂。为了鉴别或表示活性化合物剂量的不同组合，可向所述片剂或糖衣丸包衣中加入涂料或颜料。为达此目的，可使用浓缩的糖溶液，其可选择性地含有阿拉伯胶、滑石、聚乙烯吡咯烷酮、carbopol凝胶、聚乙二醇和/或二氧化钛、紫胶漆溶液和适合的有机溶剂或混合溶剂。为了鉴别或表示活性化合物剂量的不同组合，可向所述片剂或糖衣丸包衣中加入涂料或颜料。可使用本领域公知的方法来制备这类制剂(参见，例如美国专利第5,733,888号(注射用组合物)；5,726,181号(难溶于水的化合物)；5,707,641号(有治疗活性的蛋白或肽)；5,667,809号(亲油性试剂)；5,576,012号(增溶聚合试剂)；5,707,615号(抗病毒制剂)；5,683,676号(微粒药物)；5,654,286号(局部制剂)；5,688,529号(口服悬浮剂)；5,445,829号(缓释制剂)；5,653,987号(液体制剂)；5,641,515号(控释制剂)和5,601,845号(球形制剂))。
本文还公开了各种制药领域公知的用于包括眼内、鼻内和耳内(intraauricular)输送的药物组合物。药物制剂包括所述活性化合物的水性眼用溶液，其可为水溶性形式(如滴眼液)，或结冷胶(gellan gum)形式(Shedden et al.，2001 Clin Ther 23(3)：440-50)或水凝胶形式(Mayer et al.，1996 Ophthalmologica 210：101-3)；眼用软膏；眼用悬浮剂，例如微粒(悬浮在液体载体介质中的含药物的小聚合颗粒)(Joshi，A.，1994 J OculPharmacol 10：29-45)，脂溶性制剂(Alm等.，1989 Prog Clin Biol Res312：447-58)和微球(Mordenti，1999 Toxicol Sci 52：101-6)；及眼插入剂(ocular insert)。为了稳定和舒适，这类适合的药物制剂通常且优选制成无菌、等张和缓冲的。药物组合物也可包括滴剂和喷雾剂，其通常制备成在许多方面模拟鼻分泌物，从而确保维持正常的睫毛运动。如Remington’sPharmaceutical Science(Mack Publishing，18th Edition)中所述，及本领域所属技术人员公知的，适合的制剂通常且优选为等张、轻微缓冲以维持pH5.5-6.5，且通常并优选包括抗菌防腐剂和适当的药物稳定剂。用于耳内输送的药物制剂包括在耳中局部应用的悬浮剂和软膏。用于这类耳用制剂的通用溶剂包括甘油和水。
当用作细胞周期抑制剂，肿瘤生长抑制剂、或真菌生长抑制剂化合物时，所述通式(I)化合物可通过口服或非口服途径给药。当口服给药时，可以胶囊、片剂、颗粒剂、喷雾剂、糖浆剂或诸如此类的形式给药。当非口服给药时，可以水性悬浮剂、油性制剂或类似形式给药，或以滴注、栓剂、油膏、软膏等形式给药，当通过注射或输注给药时，可在皮下、腹膜内、静脉内、肌肉内等进行。类似地，可按照本领域所属技术人员认为适当的方式进行局部、直肠或阴道给药，使所述化合物与肿瘤获得最理想的接触，从而抑制该肿瘤的生长。还可以考虑肿瘤切除前或后在肿瘤位置局部给药，例如可控释放的制剂、贮存制剂及输注泵输送。
给药方法
本发明还包括制备和给药所述公开的化合物和药物组合物的方法。除其它外，这类公开的方法包括：(a)通过口服途径给药，包括以胶囊、片剂、颗粒剂、喷雾剂、糖浆剂或诸如此类的形式给药；(b)通过非口服途径给药，包括以水性悬浮剂、油性制剂等等给药，或以滴注、栓剂、油膏、软膏等形式给药；可在皮下、腹膜内、静脉内、肌肉内、真皮内等等进行注射或输注给药；以及按照本领域所属技术人员认为适当的方式进行(c)局部给药，(d)直肠给药或(e)阴道给药，从而使所述化合物与活体组织接触；及(f)通过可控释放制剂、贮存制剂及输注泵输送给药。作为这类给药方式的其它例子及其它公开的给药方式，本文公开了各种给药所述公开的化合物和药物组合物的方法，包括通过眼内、鼻内和耳内途径给药的方式。
所需的所述脱氢苯基阿夕斯丁或脱氢苯基阿夕斯丁类似物组合物的药物有效量的剂量依赖于给药途径、被治疗的动物(包括人)类型和所考虑的具体动物的体质特征。所述剂量可以被调整为能够达到所需效果，但会依赖于诸如体重、饮食、同时进行的药物治疗的因素及其它医药领域所述技术人员公认的因素。
在实践所述方法的过程中，所述化合物或组合物可单独使用或彼此结合使用，或与其它治疗或诊断试剂结合使用。例如，如本文公开的，当与例如生物制剂和特定的化疗剂CPT-11、泰索帝(docataxel)和太平洋紫杉醇的其它活性物质(尤其是其它化疗剂)结合使用时，本文公开的化合物可有效治疗癌症。当与其它活性物质结合使用时，本文公开的化合物也可有效治疗癌症，这些活性物质包括抗血管剂(anti-vascular agents)、诸如Erbuitus(Imclone/bristol-Myers)和Iressa(AstraZeneca)的抗血管生成试剂、其它VEGF抑制剂和生物制剂，更特别地包括至少一种抗-VEGF抗体，特别是对VEGF受体的单克隆抗体，其包括DC101，一种阻断小鼠VEGF受体2(flk-1)的大鼠单克隆抗体。这类组合可应用在体内，通常在哺乳动物体内，优选在人体内，或者可应用在体外。在对其进行体内应用时，所述公开的化合物(单独或与其它化疗试剂或其它生物制剂组合)可使用各种剂量形式、通过多种途径对哺乳动物给药，所述途径包括非肠道、静脉内、通过输注或注射、皮下、肌肉内、结肠、直肠、阴道、鼻或腹膜内。这类方法也可应用于测试体内化学活性。
如对本领域所属技术人员显而易见地，有用的体内给药剂量及具体的给药方式会根据所治疗的哺乳动物种类、体重和年龄，所使用的具体化合物及使用这些化合物的具体目的而变化。本领域所属技术人员根据常规的药理学方法可确定有效剂量水平(即达到所需效果所必需的剂量水平)。通常，产物的人体临床应用从较低的剂量水平开始，随后不断提高剂量水平直到达到所需的效果。可选择地，可通过现有的药理学方法采用可接受的体外研究来建立本方法鉴定的组合物的有用剂量和给药途径。
在非人的动物研究中，潜在产物的应用首先从较高剂量开始，随后减少剂量直到无法实现所需效果或有害副作用消失为止。依赖所需效果和所述治疗表现(indication)，所述剂量可在很宽的范围内变化。通常，所用剂量可在约10微克/kg体重和100mg/kg体重之间，优选在约100微克/kg体重和10mg/kg体重之间。可选择地，本领域所属技术人员应该理解所用剂量可根据患者的表面积进行计算。口服给药可以每三天一次、每隔一天一次、每天一次、每天两次或每天三次的方式进行。
各医师可根据患者的状况选择确切的配方、给药途径和剂量。参见，例如Fingl等的The Pharmacological Basis of Therapeutics，1975。需要指出的是，所述医师应该能根据毒性或器官功能失常状况判断如何及何时停止、中断或调整给药。相反，当临床反应不足(不包括毒性)时所述医师也应该知道将治疗调至更高水平。在控制所关注的疾病时所采用的给药剂量值须根据待治疗的疾病状态的严重性和给药途径变化。例如可部分通过标准的预后评价方法来评价所述疾病状态的严重性。此外，所述剂量和大致的剂量频率也可根据个体患者的年龄、体重和反应进行调整。对兽医药物可应用与上述讨论相当的方案。
根据所治疗的具体疾病状态，这类试剂可针对全身或局部进行制剂或给药。可在Remington’s Pharmaceutical Sciences，18th Ed.，MackPublishing Co.，Easton，PA(1990)中找到各种组方和给药的技术。适合的给药途径可包括口服、直肠、透皮、阴道、透膜或肠内给药；非肠道输送，包括肌肉内、皮下、髓内注射以及鞘内、直接心室内、静脉内、通过输注、腹膜内、鼻内或眼内注射。
对注射或输注，所述试剂可组方于水溶液中，例如在诸如Hank’s溶液、Ringer’s溶液或生理盐水缓冲液的生理相容性缓冲液中。对那些透膜给药，在所述制剂中使用适于渗透障壁的渗透剂。这类渗透剂是本领域公知的。本发明范围还包括使用药物可接受的载体对本文公开的化合物进行组方，从而将本发明制成适合于全身给药的剂型。选择适当的载体和适合的制备方法，本文公开的组合物(特别是制成溶液的组合物)可通过非肠道给药，例如通过静脉内注射或输注。所述化合物可很容易地使用本领域公知的药物可接受的载体制成适合于口服给药的剂型。这类载体使得所述化合物可被制成片剂、丸剂、胶囊、液体、凝胶、糖浆剂、浆液、悬浮液等等，便于待治疗患者口服。
需要细胞内给药的试剂可采用本领域所属技术人员公知的技术进行给药。例如，这类试剂可被封装在脂质体中，然后按上述方法给药。脂质体形成过程中水溶液中的所有分子都被结合于其内部水溶液中。脂质体内成分均受到保护而不受外部微环境影响，并且因为脂质体与细胞膜融合，因此所述成分被有效地输入细胞质内。此外，由于其疏水性，小分子有机分子可直接进行细胞内给药。
对有效剂量的确定是本领域所属技术人员公知的，尤其根据本文提供的具体公开的指导。除所述活性成分外，这些药物组合物还可含有适合的药物可接受的载体(包括赋形剂和辅料)，其可方便地将所述活性化合物制成用于医药用途的制剂。用于口服给药的制剂可为片剂、糖衣丸、胶囊或溶液的形式。所述药物组合物可采用公知的方式进行制备，例如通过常规混合、溶解、成粒、糖衣丸制作、悬浮、乳化、胶囊封装、捕收(entrap)、冻干法。
可使用公知的方法对本文公开的化合物进行药效和毒性评价。例如，可通过测定对细胞系(如哺乳动物的，优选人的细胞系)的体外毒性来建立具体化合物或共享某些化学部分的化合物子集的毒理学。这类研究的结果可用于预测在动物体内(例如哺乳动物或更具体为人体内)的毒性。可选择地，可使用公知的方法确定具体化合物在诸如小鼠、大鼠、兔子或猴子的动物模型中的毒性。可使用多种本领域公认的方法确定具体化合物的药效，这些方法例如体外方法、动物模型或人体临床试验。基本上对每一类疾病状态都有本领域公认的体外方法，所述疾病状态包括可用本文公开的化合物减轻的疾病状态，包括癌症、心血管疾病及各种真菌感染。类似地，可使用可接受的动物模型来确定治疗这类疾病状态的化学物质的药效。在选择确定药效的模型时，本领域所属技术人员可根据本领域规定的指导选择适当的模型、剂量和给药途径及方案。当然，也可利用人体临床试验来确定化合物对人的药效。
当作为抗癌试剂时或肿瘤生长抑制化合物时，本文公开的化合物可通过口服或非口服途径给药。口服给药时，其可以胶囊、片剂、颗粒剂、喷雾剂、糖浆剂或诸如此类的形式给药。非口服给药时，其可以水性悬浮液、油性制剂及其类似形式、或滴注、栓剂、油膏、软膏等等形式给药，当通过注射或输注给药时，可采用皮下、腹膜内、静脉内、肌肉内、透皮等等方式进行。类似地，可以本领域所属技术人员认为适当的方式进行局部、直肠或阴道给药，使所述化合物与肿瘤良好接触，从而抑制肿瘤生长。也可考虑在肿瘤切除前或后，在肿瘤或其它疾病状态的位置局部给药，或将其作为本领域公认的所述疾病状态的治疗方法的一部分。类似地，也可考虑可控释放剂型、贮存剂型及输注泵输送。
当用作抗癌试剂或抗肿瘤试剂时，可以0.0007mg/天到约7,000mg/天的所述活性成分剂量对人类患者进行口服或非口服给药，更优选约0.07mg/天到约70mg/天所述活性成分，优选每天一次，或次优选每天2到10次。可选择并同样优选地，所述化合物优选通过例如静脉滴注的方式以稳定剂量连续给药。因此，对于体重70公斤的患者，所述活性抗肿瘤成分的优选日剂量为约0.0007mg/kg/天到约35mg/kg/天(包括1.0mg/kg/天和0.5mg/kg/天)，更优选从0.007mg/kg/天到约0.050mg/kg/天(包括0.035mg/kg/天)。然而，本领域所属技术人员可以理解，在某些情况下可能需要给药超过甚至远超上述优选剂量范围的所述抗肿瘤化合物，从而有效地且积极地治疗特定的晚期或致死性肿瘤。
当用作抗真菌剂时，所述对治疗或预防具体真菌病原体有效的脱氢苯基阿夕斯丁或其类似物的优选剂量需部分根据所述真菌的特性和感染的程度，且可由标准的临床技术确定。可选择采用体外或体内分析帮助确定最佳的剂量范围。可从由体外分析或优选由动物模型得到的剂量-反应曲线外推确定有效剂量。确切的剂量水平应该由应用的医师或其它保健人员根据公知的因素确定，这类因素包括给药途径、个体的年龄、体重、性别及全面体质；感染的性质、严重性和临床阶段；使用(或不使用)伴随治疗。
所述脱氢苯基阿夕斯丁或其类似物的有效剂量范围通常在每天约0.01mg/kg到约50mg/kg哺乳动物体重，优选为约0.1mg/kg到约10mg/kg，可一次给药或多次给药。通常，所述化合物可以每个患者每天约1mg到约2000mg的剂量对需要这种治疗的患者进行给药。
为了制备包括本文公开的作为抑制肿瘤生长的化合物的制剂，可使用公知的表面活性剂、赋形剂、平滑剂(smoothing agent)、悬浮试剂和药物可接受的成膜物质和包被辅料及其类似物。优选用醇、酯、硫酸化脂肪醇等等作为表面活性剂；蔗糖、葡萄糖、乳糖、淀粉、结晶纤维素、甘露糖醇、轻度无水硅酸盐、铝酸镁、铝酸甲基硅酸镁(Magnesiummethasilicate aluminate)、合成硅酸铝、碳酸钙、酸式碳酸钠、磷酸氢钙、羧甲基纤维素钙等等作为赋形剂；硬脂酸镁、滑石、硬化油等等作为平滑剂；椰子油、橄榄油、芝麻油、花生油、大豆油作为悬浮试剂或润滑剂；邻苯二甲酸醋酸纤维素(碳水化合物(如纤维素和糖)的衍生物)、或醋酸甲酯-异丁烯酸酯共聚物(聚乙烯衍生物)作为悬浮试剂；及诸如邻苯二甲酸酯等等的增塑剂作为悬浮试剂。除前述优选成分外，增甜剂、香料、着色剂、防腐剂等等也可加入所述化合物的给药制剂中，尤其在所述化合物采用口服给药时。
本文公开的药物组合物中还可包含药物可接受的载体。可为贮存及后续给药目的制备这类组合物。用于医疗的可接受的载体或稀释剂是药物领域公知的，且在例如Remington’s Pharmaceutical Sciences，MackPublishing Co.(A.R.Gennaro edit.1985)中进行了描述。例如，这类组合物可制成或以如下形式使用：用于口服给药的片剂、胶囊或溶液；用于直肠或阴道给药的栓剂；用于注射给药的无菌溶液或悬浮液。注射剂可制成常规的形式，如液体溶液或悬浮液、适用于在注射或输注前溶解或悬浮在液体中的固体形式，或乳剂。适合的赋形剂包括但不限于盐水、葡萄糖、甘露糖醇、乳糖、卵磷脂、白蛋白、谷氨酸钠、半胱氨酸盐酸盐等等。此外，如果需要，所述注射用药物组合物可含有微量的无毒辅助物质，如润湿剂、pH缓冲剂等等。如果需要，可使用吸收增强制剂(例如脂质体)。
所需的所述组合物的药物有效量的剂量依赖于给药途径、被治疗的动物类型和所考虑的具体动物的体质特征。所述剂量可以被调整为达到所需效果，但会依赖于诸如体重、饮食、同时进行的药物治疗的因素及其它医药领域所述技术人员公认的因素。
如上所述的化合物或组合物可单独使用或彼此结合使用，或与其它治疗或诊断试剂结合使用。具体地，所述公开的化合物产物可单独使用或在用于治疗癌症时与其它化疗试剂或生物制剂(包括抗体)结合使用，或在用于治疗真菌感染时与其它抗感染剂结合使用。这些产物或组合物可在体内或体外使用。给药的有用剂量及更有用的方式会根据体重、年龄和所治疗的动物，所使用的具体化合物及使用此组合物或这些组合物的具体用途而变化。在控制或治疗具体疾病时所采用的剂量值需根据待治疗的疾病状态的严重性和给药途径变化，且根据所述疾病状态及其严重性，所述组合物可针对全身或局部进行制剂或给药。可在Remington’sPharmaceutical Sciences，18th ed.，Mack Publishing Co.，Easton，PA(1990)中找到各种制剂和给药的技术。
为了对作为细胞周期抑制剂、肿瘤生长抑制或抗真菌化合物的通式(I)化合物(优选根据本文公开的方法合成制备)进行制剂，可使用公知的表面活性剂、赋形剂、平滑剂、悬浮试剂和药物可接受的成膜物质和包被辅料及其类似物。优选用醇、酯、硫酸化脂肪醇等等作为表面活性剂；蔗糖、葡萄糖、乳糖、淀粉、结晶纤维素、甘露糖醇、轻度无水硅酸盐、铝酸镁、铝酸甲基硅酸镁、合成硅酸铝、碳酸钙、酸式碳酸钠、磷酸氢钙、羧甲基纤维素钙等等作为赋形剂；硬脂酸镁、滑石、硬化油等等作为平滑剂；椰子油、橄榄油、芝麻油、花生油、大豆油作为悬浮试剂或润滑剂；邻苯二甲酸醋酸纤维素(碳水化合物(如纤维素和糖)的衍生物)、或醋酸甲酯-异丁烯酸酯共聚物(聚乙烯衍生物)作为悬浮试剂；及诸如邻苯二甲酸酯等等的增塑剂作为悬浮试剂。除前述优选成分外，增甜剂、香料、着色剂、防腐剂等等也可加入通过所述方法制备的化合物的给药制剂中，尤其在所述化合物采用口服给药时。
可用所述方法制备的细胞周期抑制剂、抗肿瘤试剂及抗真菌剂可通过口服或非口服形式对人类患者给药，所用剂量为约0.001mg/kg/天到约10,000mg/kg/天所述活性成分，更优选约0.1mg/kg/天到约100mg/kg/天所述活性成分，优选以三天一次为一周期、两天一次、每天一次、每天两次，或次优选每天超过2到约10次。可选择地并同样优选地，由所述方法制备的化合物优选通过例如静脉滴注的方式以稳定剂量连续给药。因此，对于例如体重70公斤的患者，所述活性抗肿瘤成分的优选日剂量为约0.07mg/天到约700g/天，更优选从7mg/天到约7g/天。然而，本领域所属技术人员可以理解，在某些情况下可能需要给药超过甚至远超上述优选剂量范围的用所述方法制备的所述抗肿瘤化合物，以有效地且积极地治疗特定的晚期或致死性肿瘤。
当使用通过所述方法制备的细胞周期抑制剂作为生化测试试剂时，通过本发明方法制备的化合物在溶解于有机溶剂或含水有机溶剂时可抑制细胞周期的进行，且可将其直接应用于各种培养的细胞体系。可用的有机溶剂包括，例如甲醇、甲基亚砜等等。所述制剂可为例如粉剂、颗粒剂或其它固体抑制剂，或使用有机溶剂或无水有机溶剂制备的液体抑制剂。尽管通过本发明方法制备的化合物用作细胞周期抑制剂的优选浓度通常在约1μg/ml到约100μg/ml范围，但本领域所属技术人员可以理解，最适当的剂量依赖于使用目的和培养的细胞体系的种类。同时，在某些应用中，本领域所属技术人员可能需要或优选使用超过上述范围的剂量。
从医药角度来看，某些实施方案提供了预防或治疗个体中的真菌感染和/或病原体真菌的方法，包括对所述个体给药包含脱氢苯基阿夕斯丁或其类似物的组合物，例如以可提供所需抗真菌效果的剂量及方式给药所述脱氢苯基阿夕斯丁或其类似物。
其它实施方案包括治疗或预防患者的由诸如上文所罗列的或下文所涉及的病原体真菌引起的感染。
另一实施方案涉及治疗或预防患者的由病原体真菌引起的感染，其中所述病原体真菌可耐一种或多种其它抗真菌剂(特别是不同于脱氢苯基阿夕斯丁或其类似物的试剂)，包括例如两性霉素B或其类似物或衍生物(包括14(s)-羟基两性霉素B甲酯、两性霉素B与1-氨基-4-甲基哌嗪的酰肼及其它衍生物)或其它多烯大环内酯抗生素，包括例如制霉菌素(nystatin)、杀念珠菌素、匹马菌素和那他霉素；氟胞嘧啶；灰黄霉素(griseofulvin)；棘白菌素(echinocandin)或aureobasidin，包括天然的或半合成的类似物；二氢苯并[a]四苯醌(dihydrobenzo[a]naphacenequinone)；核苷肽抗真菌剂，包括多抗霉素(polyoxin)和尼克霉素(nikkomycin)；诸如萘替芬(naftifine)的烯丙胺类和其它角鲨烯环氧酶(epoxidase)抑制剂；以及吡咯、咪唑和三唑，例如克霉唑、咪康唑、酮康唑、益康唑、布康唑(butoconazole)、奥昔康唑(oxiconazole)、特康唑(terconazole)、伊曲康唑(itraconazole)或氟康唑(fluconazole)等等。对其它常规抗真菌剂及正在开发的新试剂参见例如Turner和Rodriguez，1996 Current PharmaceuticalDesign，2：209-224。另一实施方案包括治疗或预防患者的由病原体真菌引起的感染，其中所述患者对一种或多种其它抗真菌剂过敏，或不耐受、或无反应，或者对所述患者禁用其它抗真菌剂。除其它外，这些其它抗菌剂还包括上文或本文其它部分公开的抗菌剂。
在前述治疗或预防方法中，以有效抗菌剂量将脱氢苯基阿夕斯丁或其类似物对个体给药。
其它实施方案涉及治疗或预防患者的由病原体真菌引起的感染，其通过将脱氢苯基阿夕斯丁或其类似物给药，同时结合给药一种或多种其它抗真菌剂(包括例如任意前述试剂或试剂类型，如与使用两性霉素B(优选以类脂或脂质体制剂形式)；例如吡咯或三唑(如氟康唑)；aureobasidin；二氢苯并[a]四苯醌；或棘白菌素的治疗组合)以及不同的脱氢苯基阿夕斯丁或其类似物。
所述脱氢苯基阿夕斯丁或其类似物可在所述其它抗菌剂给药之前、之后或同时给药。在某些实施方案中，所述组合治疗使得一种或全部两种抗菌组分的用量与其单独使用时相比可相对降低。
其它实施方案涉及为治疗或预防由病原体真菌引起的感染而对个体给药脱氢苯基阿夕斯丁或其类似物，其中所述个体是免疫抑制或免疫受损的，例如由以下因素造成的结果：基因缺陷、诸如糖尿病或HIV或其它感染的疾病、对癌症或其它疾病的化疗或放射治疗、或者药物诱导的免疫抑制或与组织或器官移植或自身免疫障碍的治疗相关的诱导的免疫抑制。当所述患者正在接受或将接受免疫抑制剂的治疗(例如与组织或器官移植相关)时，可将脱氢苯基阿夕斯丁或其类似物与所述免疫抑制剂共同给药，以治疗或预防病原体真菌感染。
本发明的另一方面涉及治疗或预防HIV感染(或怀疑感染)患者的由病原体真菌引起的感染，包括将抗真菌脱氢苯基阿夕斯丁或其类似物给药，同时结合给药一种或多种抗-HIV治疗剂(包括例如HIV蛋白酶抑制剂、反转录酶抑制剂或抗病毒剂)。所述脱氢苯基阿夕斯丁或其类似物可在所述抗-HIV试剂给药之前、之后或同时给药。
本发明的另一方面涉及治疗或预防患者的由病原体真菌引起的感染，包括将抗真菌脱氢苯基阿夕斯丁或其类似物给药，同时结合给药一种或多种其它抗生素化合物，特别是一种或多种抗菌剂，优选以治疗或预防细菌感染的有效剂量或方案给药。同样，所述脱氢苯基阿夕斯丁或其类似物可在所述其它试剂给药之前、之后或同时给药。
除其它外，可用本文公开的方法治疗或预防的病原体真菌感染还包括：曲霉病，包括侵入性肺曲霉病；芽生菌病，包括在中枢神经系统中的深度或迅速发展型感染及芽生菌病；念珠菌病，包括泌尿道退行性念珠菌病(如在肾结石、泌尿道梗阻、肾移植或控制不佳的糖尿病患者中)；球孢子菌病，包括对其它化学疗法反应不佳的慢性疾病；隐球菌病；histopolasmosis；毛霉菌病，包括例如颅面毛霉菌病和肺毛霉菌病；巴西芽生菌病；和孢子丝菌病。需要指出的是，将包含抗菌剂量的一种或多种脱氢苯基阿夕斯丁或其类似物的组合物给药特别适用于治疗或预防哺乳动物个体的病原体真菌感染，其中所述真菌耐一种或多种其它抗菌治疗剂或者其中一种或多种抗真菌治疗剂是禁用的(例如上文所述)。
本发明还公开了实践所述公开方法所采用的包含至少一种抗真菌脱氢苯基阿夕斯丁或其类似物的抗真菌药物组合物。这些药物组合物可与适当的包装内插件(除其它外，包括与其抗真菌用途有关的指导和信息)一起进行包装。本发明还公开了含有一种或多种脱氢苯基阿夕斯丁或其类似物以及第二抗真菌剂的药物组合物。
治疗真菌感染的方法
本文公开的某些实施方案涉及治疗或预防病原体真菌感染的方法，所述感染包括，例如曲霉病，包括侵入性肺曲霉病；芽生菌病，包括在中枢神经系统中的深度或迅速发展型感染及芽生菌病；念珠菌病，包括泌尿道退行性念珠菌病(如在肾结石、泌尿道梗阻、肾移植或控制不佳的糖尿病患者中)；球孢子菌病，包括对其它治疗反应不佳的慢性疾病；隐球菌病；histopolasmosis；毛霉菌病，包括例如颅面毛霉菌病和肺毛霉菌病；巴西芽生菌病；和孢子丝菌病。所述方法可包括将至少一种如上所述的抗真菌脱氢苯基阿夕斯丁或其类似物对人类个体给药，从而治疗或预防真菌感染。在某些实施方案中，在将所述脱氢苯基阿夕斯丁或其类似物给药时可结合给药一种或多种非脱氢苯基阿夕斯丁或其类似物的抗真菌试剂，例如两性霉素B或诸如前述的咪唑或三唑试剂。
所述病原体真菌感染可以是局部的(例如除其它生物外，由念珠菌属、发藓菌属、小孢子菌属或Epiderinophyton(表皮癣菌)种引起的)，或粘膜的(例如由白色念珠菌(例如真菌性口炎和阴道念珠菌病)引起的)。所述感染可以是全身性的，例如由白色念珠菌、新型隐球菌、烟曲霉、Coccidiode、Paracocciciode、组织胞浆菌属(Histoplasma)或芽生菌引起的。所述感染还可包括真菌足分支菌病、着色芽生菌病(chromoblastomycosis)、隐球菌性脑膜炎(cryptococcal meningitits)或藻菌病(phycomycosis)。
另一些实施方案涉及治疗或预防病原体真菌感染的方法，其中所述真菌选自：念珠菌属，包括白色念珠菌、热带念珠菌、乳酒念珠菌、克鲁斯氏念珠菌和光滑念珠菌；曲霉属，包括烟曲霉和黄曲霉；新型隐球菌；芽生菌，包括皮炎芽生菌；卡氏肺囊虫；粗球孢子菌；蛙生蛙粪霉；耳霉属；荚膜组织胞浆菌；根霉属菌，例如米根霉和小孢根霉；小克银汉霉属；根粘菌属；巴西芽生菌；波氏足肿菌；西伯氏鼻孢子虫和申克氏孢子丝菌病。同样，所述方法可包括对有需要的个体给药非免疫抑制的抗真菌脱氢苯基阿夕斯丁或其类似物，从而治疗或预防真菌感染而不会诱导负面的免疫抑制作用。
另一些实施方案涉及治疗或预防耐其它抗真菌治疗剂的病原体真菌感染的方法，所述感染包括耐一种或多种本文其它部分所述的抗真菌剂的病原体真菌感染，这些抗真菌剂例如两性霉素B、氟胞嘧啶、一种咪唑或三唑(包括，例如氟康唑、酮康唑、伊曲康唑克和其它前述例子)。所述方法可包括将一种或多种抗真菌脱氢苯基阿夕斯丁或其类似物以可治疗或预防个体的耐其它抗真菌治疗剂的真菌感染的剂量和方案对所述患者给药。
另一些实施方案涉及治疗或预防患者的病原体真菌感染的方法，其中所述患者对其它抗真菌治疗过敏，或不耐受、或无反应，或者对所述患者禁用其它抗真菌剂，所述其它抗真菌剂包括一种或多种本文其它部分提及的其它抗真菌剂，例如两性霉素B、氟胞嘧啶、一种咪唑或三唑(包括，例如氟康唑、酮康唑、伊曲康唑克和其它前述例子)。所述方法可包括将一种或多种抗真菌脱氢苯基阿夕斯丁或其类似物以可治疗或预防真菌感染的剂量对这类患者给药。
包装的脱氢苯基阿夕斯丁或其类似物
某些实施方案涉及包装的脱氢苯基阿夕斯丁或其类似物，优选包装的非免疫抑制性抗真菌脱氢苯基阿夕斯丁或其类似物，该术语的含义是指包括与说明书一起包装的至少一种上述脱氢苯基阿夕斯丁或其类似物，所述说明书指导将所述脱氢苯基阿夕斯丁或其类似物作为抗真菌剂对人类个体给药而不引起负面免疫抑制效果。在某些实施方案中，所述非免疫抑制性抗真菌脱氢苯基阿夕斯丁或其类似物是上述化合物的一个优选子集的成员。所述脱氢苯基阿夕斯丁或其类似物可单独与所述说明书一起包装，或可与其它脱氢苯基阿夕斯丁或其类似物、raparnycin或其它成分或添加剂(例如一种或多种所述药物组合物的成分)一起包装。所述包装可包含一个或多个盛放有一种或多种所述药物组合物成分的容器。任意地在这类容器上标识有管理药物或生物学产品的生产、使用或销售的政府机关规定形式的通知，该通知表明上述机关批准为人类给药目的制造、使用或销售。
以下非限定性的实施方案目的是描述使用某些优选实施方案的优选方法。对所用具体方法及在实践中所得的具体化学组合物的细节进行的改变毫无疑问是本领域所属技术人员显而易见的。
实施例1
A.脱氢苯基阿夕斯丁的合成
如图1中所示，根据如下的基本反应路线通过缩聚反应合成脱氢苯基阿夕斯丁：
N，N’-二乙酰基-2，5-哌嗪二酮
将溶于100mL醋酸酐(Ac2O)的25.0g的2，5-哌嗪二酮1[2，5-哌嗪二酮(Aldrich G640-6)，25.0g，0.218mol]与醋酸钠(NaOAc)(17.96g，0.218mol)混合。用双盘冷凝器(double coiled condenser)在氩气环境下将所述混合物在110℃加热8小时。通过蒸发除去Ac2O后，将残余物用AcOEt溶解，用10％柠檬酸、10％NaHCO3和饱和NaCl洗涤(各三次)，Na2SO4干燥，并在真空下浓缩。残余物与乙醚一起研磨形成固体。用乙醚-己烷将该固体从EtOAc中重结晶出来，得到26.4g(61％)的N，N’-二乙酰基-2，5-哌嗪二酮1。
1-乙酰基-3-{(Z)-1-[5-(1，1-二甲基-2-丙烯基)-1H-4-咪唑基]亚甲基}-2，5-哌嗪二酮2
向5-(1，1-二甲基-2-丙烯基)咪唑-4-甲醛(100mg，0.609mmol)的DMF(2mL)溶液中加入化合物1(241mg，1.22mmol)，在短时间内对所得溶液进行重复排空以除去氧气并充入Ar，随后加入Cs2CO3(198mg，0.609mmol)，并再次重复排空-充气的过程。将所得混合物在室温下搅拌5h。通过蒸发除去溶剂后，将该残余物溶解在EtOAc与10％Na2CO3的混合物中，所得有机相再次用10％Na2CO3洗涤并用饱和NaCl洗涤三次，用Na2SO4干燥，并在真空下浓缩。所残留的油状物以CHCl3-MeOH(100∶0到50∶1)为洗脱剂用硅胶柱层析纯化，得到60mg(33％)淡黄色固体2。
脱氢苯基阿夕斯丁
向化合物2(30mg，0.099mmol)的DMF(0.8mL)溶液中加入苯甲醛(51mL，0.496mol，5eq)，在短时间内对所得溶液进行重复排空以除去氧气并充入Ar，随后加入Cs2CO3(53mg，0.149mmol，1.5eq)，并再次重复排空-充气的过程。将所得混合物在80℃加热2.5h(温度必须缓慢提升。迅速升温会导致在亚苄基部位的E-异构体生成量的增加)。通过蒸发除去溶剂后，将所述残余物溶解在EtOAc中，水洗两次并用饱和NaCl洗涤三次，用Na2SO4干燥，并在真空下浓缩。在TLC上使用CHCl3-MeOH(10∶1)，在365nm UV下可观察到亮黄绿色发光点。HPLC分析得知该粗产物的纯度超过75％。将所得残余物溶解在90％的MeOH水溶液中并加入反相HPLC柱(YMC-Pack，ODS-AM，20×250mm)中，并用从70％到74％的线性梯度的MeOH水溶液以12mL/分钟的流动速率洗脱约16分钟，收集所需的部分并通过蒸发浓缩，得到19.7mg(60％)的黄色脱氢苯基阿夕斯丁。所合成的粗脱氢苯基阿夕斯丁的HPLC谱图如图2所示。
在纯化的脱氢苯基阿夕斯丁中(如图4所示)，主要的峰为所需的脱氢苯基阿夕斯丁的Z-形式化合物。观察到形成的E-异构体为次要组分(约10％)，其洗脱成极性比Z-异构体更大的峰。还观察到另一次要的峰，其代表脱氢苯基阿夕斯丁的二甲基烯丙基部分被还原的Z-和E-化合物的还原产物。所述还原化合物的形成是因为所述醛2含有还原的杂质，其在用DIBAL-H进行还原的过程中产生且在后续过程中未被分离。
这些次要化合物可通过制备HPLC纯化除去，得到在所述亚苄基部位具有Z-构象的脱氢苯基阿夕斯丁，收率60％(在两步中的收率为20％)，纯度超过95％。在该HPLC谱图中未观测到在所述哌嗪二酮环的咪唑侧具有E-构象的化合物，表明图1所示的从化合物1到3的第一反应是Z-选择性的。
B.化学性质
上述脱氢苯基阿夕斯丁化合物是淡黄色固体。通过标准NMR分析确认了其结构。
实施例2
叔丁基-脱氢苯基阿夕斯丁衍生物的合成和物理性质
根据如下制备叔丁基-脱氢苯基阿夕斯丁的反应路线合成了脱氢苯基阿夕斯丁的结构衍生物。通过路线A的合成(见图1)在某些方面与实施例1中脱氢苯基阿夕斯丁的合成类似。
路线A：
按照实施例1中所述方法制备N，N’-二乙酰基-2，5-哌嗪二酮1。
1)1-乙酰基-3-{(Z)-1-[5-叔丁基-1H-4-咪唑基]亚甲基}-2，5-哌啶二酮(16)
向5-叔丁基咪唑-4-甲醛15(3.02g，19.8mmol)的DMF(30mL)溶液中加入化合物1(5.89g，29.72mmol)，在短时间内对所得溶液进行重复排空以除去氧气并充入Ar，随后加入Cs2CO3(9.7g，29.72mmol)，并再次重复排空-充气的过程。将所得混合物在室温下搅拌5h。通过蒸发除去溶剂后，将所述残余物溶解在EtOAc与10％NaHCO3的混合物中，所得有机相再次用10％Na2CO3洗涤并用饱和NaCl洗涤三次，用Na2SO4干燥，并在真空下浓缩。所残留的油状物以CHCl3-MeOH(100∶0到50∶1)为洗脱剂用硅胶柱层析纯化，得到1.90g(33％)淡黄色固体16。1H NMR(270MHz，CDCl3)，12.14(d，br-s，1H)，9.22(br-s，1H)，7.57(s，1H)，7.18(s，1H)，4.47(s，2H)，2.65(s，3H)，1.47(s，9H)。
2)叔丁基-脱氢苯基阿夕斯丁
向1-乙酰基-3-{(Z)-1-[5-叔丁基-1H-4-咪唑基]亚甲基}-2，5-哌啶二酮(16)(11mg，0.038mmol)的DMF(1.0mL)溶液中加入苯甲醛(19□L，0.19mmol，5eq)，在短时间内对所得溶液进行重复排空以除去氧气并充入Ar，随后加入Cs2CO3(43mg，0.132mmol，3.5eq)，并再次重复排空-充气的过程。将所得混合物在80℃加热2.5h。通过蒸发除去溶剂后，将所述残余物溶解在EtOAc中，水洗两次并用饱和NaCl洗涤三次，用Na2SO4干燥，并在真空下浓缩。将所得残余物溶解在90％的MeOH水溶液中并加入反相HPLC柱(YMC-Pack，ODS-AM，20×250mm)中，并用从70％到74％的线性梯度的MeOH水溶液以12mL/分钟的流速洗脱约16分钟，收集所需的部分并通过蒸发浓缩，得到6.4mg(50％)的黄色叔丁基脱氢苯基阿夕斯丁。1H NMR(270MHz，CDCl3)，12.34(br-s，1H)，9.18(br-s，1H)，8.09(s，1H)，7.59(s，1H)，7.31-7.49(m，5H)，7.01(s，2H)，1.46(s，9H)。
制备叔丁基-脱氢苯基阿夕斯丁的脱氢苯基阿夕斯丁反应与实施例1中相同。
回收的叔丁基-脱氢苯基阿夕斯丁的总收率为16.5％。
路线B：
按照实施例1中所述方法制备N，N’-二乙酰基-2，5-哌嗪二酮1。
1)1-乙酰基-3-[(Z)-亚苄基-1]-2，5-哌啶二酮(17)
向苯甲醛4(0.54g，5.05mmol)的DMF(5mL)溶液中加入化合物1(2.0g，10.1mmol)，在短时间内对所得溶液进行重复排空以除去氧气并充入Ar，随后加入Cs2CO3(1.65g，5.05mmol)，并再次重复排空-充气的过程。将所得混合物在室温下搅拌3.5h。通过蒸发除去溶剂后，将所述残余物溶解在EtOAc与10％Na2CO3的混合物中，所得有机相再次用10％Na2CO3洗涤并用饱和NaCl洗涤三次，用Na2SO4干燥，并在真空下浓缩。所得残余物用MeOH-乙醚重结晶得到17的黄白色固体；产物1.95g(79％)。
2)叔丁基-脱氢苯基阿夕斯丁
向1-乙酰基-3-[(Z)-亚苄基-1]-2，5-哌啶二酮(17)(48mg，0.197mmol)的DMF(1.0mL)溶液中加入5-叔丁基咪唑-4-甲醛15(30mL，0.197mmol)，在短时间内对所得溶液进行重复排空以除去氧气并充入Ar，随后加入Cs2CO3(96mg，0.296mmol)，并再次重复排空-充气的过程。将所得混合物在80℃加热14h。通过蒸发除去溶剂后，将所述残余物溶解在EtOAc中，水洗两次并用饱和NaCl洗涤三次，用Na2SO4干燥，并在真空下浓缩。将所得残余物溶解在90％的MeOH水溶液中并加入反相HPLC柱(YMC-Pack，ODS-AM，20×250mm)中，并用从70％到74％的线性梯度的MeOH水溶液以12mL/分钟的流速洗脱约16分钟，收集所需的部分并通过蒸发浓缩，得到0.8mg(1.2％)的黄色叔丁基脱氢苯基阿夕斯丁。
回收的叔丁基-脱氢苯基阿夕斯丁的总收率为0.9％。
通过路线A和路线B合成的粗叔丁基-脱氢苯基阿夕斯丁的HPLC谱图如图4所示。
根据路线A的方法合成了另两种叔丁基-脱氢苯基阿夕斯丁衍生物。在上述其它叔丁基-脱氢苯基阿夕斯丁衍生物的合成中，对所述苯甲醛化合物4进行了改变。
图4显示了实施例1合成的脱氢苯基阿夕斯丁(图2)和上述通过路线A制备的代表性的叔丁基-脱氢苯基阿夕斯丁的HPLC谱图的相似性(色谱柱：YMC-Pack ODS-AM(20×250mm)；梯度：65％-75％的甲醇-水体系洗脱20分钟，随后用100％的甲醇体系洗脱10分钟；流动速率：12mL/分钟；O.D.230nm)。
所述醛的加入顺序对收率有影响，从而也是合成的一个方面。作为对照或模型，合成了脱氢苯基阿夕斯丁的类似物，其中所述二甲基烯丙基集团转变成在所述咪唑环的5-位具有类似空间位阻的叔丁基基团。
如上所述使用“路线A”合成了这种“叔丁基(tBu)-脱氢苯基阿夕斯丁”。特别地，完全遵循脱氢苯基阿夕斯丁合成的醛加入顺序得到了16.5％的tBu-脱氢苯基阿夕斯丁总收率。这一收率与脱氢苯基阿夕斯丁的收率(20％)类似。使用“路线B”，其中所述醛的加入顺序与“路线A”中合成脱氢苯基阿夕斯丁的顺序相反，只得到总收率0.9％的痕量的所需tBu-脱氢苯基阿夕斯丁，尽管加入第一苯甲醛4时得到76％收率的中间体化合物17。这种结果表明可能难以在中间体化合物17上引入在咪唑环上相邻的5-位连有季碳取代基的较大体积的咪唑-4-甲醛15，说明醛的加入顺序对使用本文公开方法合成高收率的脱氢苯基阿夕斯丁或脱氢苯基阿夕斯丁类似物是一个重要的方面。
如图4所示，从对所得最终粗产物的HPLC分析中可见，在所述路线A(左)的粗样品中观测到高含量的tBu-脱氢苯基阿夕斯丁和少量的副产物。然而，在通过路线B(右)获得的样品中观测到相对少量的所需tBu-脱氢苯基阿夕斯丁和多种其它副产物。
实施例3
脱氢苯基阿夕斯丁及类似物的其它大规模合成
3-Z-亚苄基-6-[5”-(1，1-二甲基烯丙基)-1H-咪唑-4”-Z-基亚甲基]-哌嗪-2，5-二酮[脱氢苯基阿夕斯丁](1)的合成
试剂：a)LDA，CH3CHO；b)Tos-Cl，吡啶；c)DBU；d)NaOH；e)C2Cl2O2；f)KOOCCH2COOEt，BuLi；g)SO2Cl2；h)H2NCHO，H2O；i)LiAlH4；j)MnO2；k)1，4-二乙酰基-哌嗪-2，5-二酮，Cs2CO3；l)苯甲醛，Cs2CO3
3-羟基-2，2-二甲基-丁酸甲酯
在氩气环境下，于-60℃将LDA的己烷/THF/乙苯(2M，196ml，0.39mol)溶液加入异丁酸甲酯(45ml，0.39mol)的THF(270ml)溶液中，将所得混合物搅拌30分钟。缓慢加入预冷至-60℃的乙醛(27ml，0.48mol)的THF(45ml)溶液，使所得溶液继续搅拌30分钟。加入饱和氯化铵(50ml)并使所得溶液升温至室温。反应混合物用乙酸乙酯萃取，萃取物先后用HCl(2M)、碳酸氢钠和盐水洗涤。有机层用硫酸镁干燥、过滤、然后蒸发得到澄清的油状物(52.6g)。在76-82°/30mmHg蒸馏得到纯净的3-羟基-2，2-二甲基-丁酸甲酯(42.3g，74％)。(Burk et al.，J.Am.Chem.Soc.，117：4423-4424(1995))。
1H NMR(400MHz，CDCl3)δ1.15(d，J＝6.2Hz，3H)；1.17(s，6H)；2.66(d，J＝6.2Hz，1H，-OH)；3.71(s，3H，-OMe)；3.87(app五重峰，J＝6.4Hz，1H，H3)。
2，2-二甲基-3-(甲苯-4-磺酰氧基)-丁酸甲酯
向冷却(0℃)的3-羟基-2，2-二甲基丁酸甲酯(52.0g，0.36mol)的吡啶(100ml)溶液中逐渐加入对甲基苯磺酰氯(69.0g，0.36mol)。使所得混合物升温至室温并搅拌60h。在冰中将反应物再次冷却并通过加入HCl(2M)进行酸化。所得溶液用乙酸乙酯萃取，所得萃取物先后用HCl和盐水洗涤，干燥、蒸发得到油状物，静置后产生白色沉淀。用最少量的乙酸乙酯将该混合物溶解，随后加入石油醚得到白色沉淀，收集沉淀并用更多石油醚洗涤。滤液进行部分蒸发，再次收集得到的结晶并将其加入第一次收集的结晶中，得到2，2-二甲基-3-(甲苯-4-磺酰氧基)丁酸甲酯(81.2g，76％)。
1H NMR(400NMz，CDCl3)δ1.12(s，3H)；1.13(s，3H)；1.24(d，J＝6.4Hz，3H)；2.45(s，3H，-PhMe)；3.58(s，3H，-OMe)；4.94(四重峰，J＝6.4Hz，1H，H3)，7.33(d，J＝8.0Hz，2H)，7.78(d，J＝8.0Hz，2H)。
蒸发剩余的滤液得到额外的粗2，2-二甲基-3-(甲苯-4-磺酰氧基)丁酸甲酯(19.0g，18％)。
2，2-二甲基-3-丁烯酸甲酯
将2，2-二甲基-3-(甲苯-4-磺酰氧基)丁酸甲酯(18.06g，0.06mol)的DBU(15ml)溶液在140-160°加热3.5h。使所得混合物冷却至室温，随后用乙醚稀释。所得混合物先后用HCl(1M)、碳酸氢钠和盐水洗涤。将所得醚层干燥并部分蒸发得到浓缩的2，2-二甲基-3-丁烯酸甲酯溶液(10g)。(Savu and katzenellenbogen，J.Org.Chem，46：239-250(1981))。因为所得产物(bp 102°)的挥发性，应避免进一步的蒸发。(Tsaconas et al.，Aust.J.Chem.，53：435-437(2000))。
1H NMR(400MHz，CDCl3)δ1.31(s，6H)；3.68(s，3H)；5.06(d，J＝17.1Hz，1H，-CH＝CH2)；5.11(d，J＝10.7Hz，1H，-CH＝CH2)；6.03(dd，J＝17.1，10.7Hz，1H，-CH＝CH2)。
2，2-二甲基-3-丁烯酸
将上述2，2-二甲基-3-丁烯酸甲酯(10g)的醚溶液用乙醇稀释(25ml)，加入氢氧化钠(4M，22ml)并将所得混合物搅拌过夜。将所得溶液部分蒸发除去乙醇，并将所得混合物加入HCl(1M，100ml)中。所得产物用乙酸乙酯萃取，将萃取液干燥并蒸发得到2，2-二甲基-3-丁烯酸(6.01g，88％两步)。(Hayashi et al.，J.Org.Chem.，65：8402-8405(2000))。
1H NMR(400MHz，CDCl3)δ1.33(s，6H)；5.11(d，J＝10.8Hz，1H，-CH＝CH2)；5.15(d，J＝17.2Hz，1H，-CH＝CH2)；6.05(dd，J＝17.2，10.8Hz，1H，-CH＝CH2)。
丙二酸单乙酯(Wierenga and Skulnick，″Aliphatic and Aromatic β-ketoEsters from Monoethyl Malonate：Ethyl 2-Butyrylacetate，″Organic SynthesesCollective Volume 7，213)。
将丙二酸单乙酯的钾盐(25.0g，0.15mol)悬浮在水(15.6ml)中并在冰浴中冷却。30分钟内滴加浓盐酸(12.5ml)，然后将所得混合物继续搅拌10分钟。过滤所得沉淀并用乙醚洗涤两次。分离出滤液，水相用乙醚萃取。将合并的醚溶液干燥(MgSO4)并蒸发，得到油状的丙二酸单乙酯(19.2g，99％)，使用前将其在真空下干燥过夜(或50°/1mm下1h)。
4，4-二甲基-3-氧-5-己烯酸乙酯
将乙二酰氯(3.83ml，43.9mmol)滴加入冷却(0℃)的2，2-二甲基-3-丁烯酸(5.0g，43.9mmol)与DMF(1滴)的无水二氯甲烷(25ml)溶液中。将所得混合物在0℃搅拌1h，然后在室温下搅拌16h。分馏(121°/760mmHg)得到2，2-二甲基-3-丁烯酰氯(4.1g，71％)。
将丙二酸单乙酯(7.2g，0.05mol)和联吡啶(几毫克)溶解在THF(90ml)中，并在所得体系中充入氮气。将所得溶液冷却至-70℃，随后加入BuLi(2.5M在己烷中，37ml，0.09mol)。在加入约10ml BuLi后，所述溶液变为粉红色，同时为维持磁力搅拌需再加入THF(15ml)。移去冷却浴并加入剩余的BuLi，使温度达至-10°，此时反应溶液变为无色。将混合物再次冷却至-60℃，并滴加2，2-二甲基-3-丁烯酰氯(4.1g，0.03mol)的THF(12ml)溶液。滴加完成后，使所得混合物升温至0°并搅拌3h，随后在0°将其加入1∶1的乙醚/1M HCl(260ml)混合物中并继续搅拌1.5h。分离有机层，先后用HCl(1M)、碳酸氢钠溶液、盐水洗涤，然后干燥并蒸发，得到4，4-二甲基-3-氧-5-己烯酸乙酯(5.6g，98％)。(Hayashi et al.，J.Org.Chem.，65：8402-8405(2000))。用Kugelrohr炉蒸馏(160°/1mmHg)得到纯的材料。
1H NMR(400MHz，CDCl3)δ1.26(s，6H)；1.27(t，J＝6.9Hz，3H，-CH2CH3)；3.51(s，2H)；4.18(q，J＝6.9Hz，2H，-CH2CH3)；5.20(d，J＝17.7Hz，1H，-CH＝CH2)；5.21(d，J＝9.6Hz，1H，-CH＝CH2)；5.89(dd，J＝17.7，9.6HZ，1H，-CH＝CH2)。
2-氯-4，4-二甲基-3-氧-5-己烯酸乙酯
将磺酰氯(0.84ml，10.4mmol)加入冷却(0°)的4，4-二甲基-3-氧-5-己烯酸乙酯(18.3g，9.93mmol)的氯仿(7ml)溶液中。使所得混合物升温至室温并搅拌30分钟，随后将其加热回流2h。冷却至室温后，将所得反应混合物用氯仿稀释，随后依次用碳酸氢钠、水和盐水洗涤。将有机相干燥并蒸发得到褐色油状的2-氯-4，4-二甲基-3-氧-5-己烯酸乙酯(2.01g，93％)。(Hayashi et al.，J.Org.Chem.，65：8402-8405(2000))。
1H NMR(400MHz，CDCl3)δ1.28(t，J＝7.0Hz，3H，-CH2CH3)；1.33(s，3H)；1.34(s，3H)；4.24(q，J＝7.0Hz，2H，-CH2CH3)；5.19(s，1H)；5.28(d，J＝16.9Hz，1H，-CH＝CH2)；5.29(d，J＝10.9Hz，1H，-CH-CH2)；5.96(dd，J＝16.9，10.9Hz，1H，-CH＝CH2)。
LC/MS tR＝8.45(219.3[M(Cl37)+H]+)min。
使用该材料直接进行反应无需进一步纯化。
5-(1，1-二甲基-烯丙基)-3H-咪唑-4-羧酸乙酯
将悬浮在甲酰胺(36.8ml)中的2-氯-4，4-二甲基-3-氧-5-己烯酸乙酯(19.4g，0.09mol)和水(1.94ml，0.11mol)的悬浮液轻微摇动，然后装入15×18ml的小瓶中。将小瓶密封并在150°加热5h。待冷却至室温后，将所述各小瓶中的成分混合并用氯仿彻底萃取。将萃取物干燥并蒸发得到浓缩的甲酰胺溶液(14.7g)。将其加入浸泡于1％MeOH/1％Et3N的氯仿溶液中的二氧化硅层析柱(7cm直径，11cm高)中。用2L这种混合物对所述层析柱进行洗脱，然后使用2L的2％MeOH/1％Et3N的氯仿溶液洗脱，在较早洗脱的部分中，得到怀疑为5-(1，1-二甲基烯丙基)-噁唑-4-羧酸乙酯(1.23g，7％)的化合物。
HPLC(214nm)tR＝8.68(50.4％)min。
1H NMR(400MHz，CDCl3)δ1.40(t，J＝7.2Hz，3H，-CH2CH3)；1.54(s，6H)；4.38(t，J＝7.2Hz，2H，-CH2CH3)；5.03(d，J＝17.4Hz，1H，-CH＝CH2)；5.02(d，J＝10.4Hz，1H，-CH＝CH2)；6.26(dd，J＝17.4，10.4Hz，1H，-CH＝CH2)；7.83(s，1H)。
LCMS tR＝8.00(210.1[M+H]+，361.1[2M+H]+)min。
从较后的部分中回收得到所需的5-(1，1-二甲基-烯丙基)-3H-咪唑-4-羧酸乙酯(3.13g，17％)。(Hayashi et al.，J.Org.Chem.，65：8402-8405(2000))。
HPLC(214nm)tR＝5.52(96.0％)min。
1H NMR(400MHz，CDCl3)δ1.38(t，J＝7.0Hz，3H)；1.57(s，6H)；4.35(q，J＝7.0Hz，2H)；5.04-5.14(m，2H，-CH＝CH2)；6.28(dd，J＝18.0，10.4Hz，1H，-CH＝CH2)；7.52(s，1H)。
LC/MS tR＝5.30(209.1[M+H]+，417.2[2M+H]+)min。
也可从所述层析柱中回收更多的5-(1，1-二甲基-烯丙基)-3H-咪唑-4-羧酸乙酯(3.59g，19％)，虽然其纯度较低但仍满足后续反应的需要。
在类似反应(较小规模)中，通过用溶于氯仿的5％MeOH/1％Et3N对所述层析柱进行进一步洗脱分离得到其它副产物，怀疑其为5-(1，1-二甲基-烯丙基)-3H-咪唑-4-羧酸(0.27g，9％)。
HPLC(245nm)tR＝5.14(68.9％)min。
1H NMR(400MHz，CD3OD)δ1.45(s，6H)；4.97(d，J＝10.6Hz，1H，-CH＝CH2)；5.01(d，J＝17.7Hz，1H，-CH＝CH2)；6.28(dd，J＝17.7，10.6Hz，1H，-CH＝CH2)；7.68(s，1H)。
LCMS tR＝4.72(181.0[M+H]+，361.1[2M+H]+)min。
[5-(1，1-二甲基-烯丙基)-3H-咪唑-4-基]-甲醇
将5-(1，1-二甲基-烯丙基)-3H-咪唑-4-羧酸乙酯(3.13g，15.0mmol)的THF(60ml)溶液滴加入氢化铝锂(95％悬浮，1.00g，25.0mmol)悬浮在THF(40ml)中所得的悬浮液中，并将所得混合物在室温下搅拌4h。加水直至不再产生气体为止，将反应混合物搅拌10分钟，随后用烧结(sintered)漏斗过滤。沉淀先后用THF及甲醇洗涤，将滤液和洗涤液合并、蒸发、然后冻干，得到[5-(1，1-二甲基-烯丙基)-3H-咪唑-4-基]甲醇(2.56g，102％)。在后续反应前通过与氯仿共沸除去残余的水。(参见，Hayashi等，J.Org.Chem.，65：8402-8405(2000))。
HPLC(240nm)tR＝3.94(56.8％)min。
1H NMR(400MHz，CD3OD)δ1.43(s，6H)；4.57(s，2H)；5.01(d，J＝10.5Hz，1H，-CH＝CH2)；5.03(d，J＝17.7Hz，1H，-CH＝CH2)；6.10(dd，J＝17.7，10.5Hz，1H，-CH＝CH2)；7.46(s，1H)。
LC/MS tR＝3.77(167.3[M+H]+)min。
5-(1，1-二甲基-烯丙基)-3H-咪唑-4-甲醛
将二氧化锰(20g，0.23mol)加入[5-(1，1-二甲基烯丙基)-3H-咪唑-4-基]甲醇(2.56g，0.02mol)的丙酮(300ml)溶液中，将所得混合物在室温下搅拌5h。将反应混合物用滤纸过滤，残余物用丙酮洗涤。将滤液与洗涤液合并并蒸发，得到5-(1，1-二甲基烯丙基)-3H-咪唑-4-甲醛(1.82g，51％)。(Hayashi et al.，J.Org.Chem.，65：8402-8405(2000))。
HPLC(240nm)tR＝4.08(91.5％)min。
1H NMR(400MHz，CDCl3)δ1.56(s，6H)；5.16(d，J＝10.6Hz，1H，-CH＝CH2)；5.19(d，J＝17.3Hz，1H，-CH＝CH2)；6.22(dd，J＝17.3，10.6Hz，1H，-CH＝CH2)；7.75(s，1H)，10.02(s，1H，HCO)。
LC/MS tR＝3.75(165.2[M+H]+)min。
1-乙酰基-3-[5’-(1，1-二甲基烯丙基)-1H-咪唑-4’-Z-基亚甲基]哌嗪-2，5-二酮
向5-(1，1-二甲基烯丙基)-3H-咪唑-4-甲醛(1.78g，0.01mol)的DMF(35ml)溶液中加入1，4-二乙酰基哌嗪-2，5-二酮(8.59g，0.04mol)，对所述混合物进行排空，随后充入氩气。将排空-充气过程再重复两次，随后加入碳酸铯(3.53g，0.01mol)。将排空-充气过程再重复三次，随后将反应混合物在45°加热5h。将反应混合物部分蒸发(在高真空下加热)直到剩余少量体积，将所得溶液滴加入冰水(50ml)中。收集产生的黄色沉淀，用水洗涤然后冻干，得到1-乙酰基-3-[5’-(1，1-二甲基烯丙基)-1H-咪唑-4’-Z-基亚甲基]哌嗪-2，5-二酮(1.18g，36％)。(Hayashi，Personal Communication(2001))。
HPLC(214nm)tR＝6.01(72.6％)min。
1H NMR(400MHz，CDCl3)δ1.53(s，6H)；2.64(s，3H)；4.47(s，2H)；5.19(d，J＝17.3Hz，1H，-CH＝CH2)；5.23(d，J＝10.7Hz，1H，-CH＝CH2)；6.06(dd，J＝17.3，10.7Hz，1H，-CH＝CH2)；7.16(s，1H)，7.59(s，1H)，9.47(bs，1H)；12.11(bs，1H)[观测到的～2％1，4-二乙酰基哌嗪-2，5-二酮杂质δ2.59(s，6H)；4.60(s，4H)。]
LC/MS tR＝6.65(303.3[M+H ]+，605.5[2M+H]+)min。(n.b.使用不同体系)。
3-Z-亚苄基-6-[5”-(1，1-二甲基烯丙基)-1H-咪唑-4”-Z-基亚甲基]哌嗪-2，5-二酮
向1-乙酰基-3-[5’-(1，1-二甲基烯丙基)-1H-咪唑-4’-基亚甲基]哌嗪-2，5-二酮(2.91g，9.62mmol)的DMF(70ml)溶液中加入苯甲醛(4.89ml，48.1mmol)，对所述溶液进行排空，随后充入氩气。将排空-充气过程再重复两次，随后加入碳酸铯(4.70g，14.4mmol)。将排空-充气过程再重复三次，随后将反应混合物在如下的温度梯度下进行加热。
反应共进行5小时后，使反应物冷却至室温，并将反应混合物加入冰水中(500ml)。收集产生的沉淀，用水(300ml)洗涤然后冻干，得到黄色固体(2.80g)。将该材料溶于氯仿(250ml)中，用滤纸过滤并蒸发以共沸除去残留的水。将残留的黄色沉淀(2.70g，HPLC(214nm)tR＝7.26(93.6％)min。)部分溶解于氯仿(20ml)，将所得悬浮液用超声处理5分钟，随后收集所得固体并用空气干燥，得到3-Z-亚苄基-6-[5”-(1，1-二甲基烯丙基)-1H-咪唑-4”-Z-基亚甲基]哌嗪-2，5-二酮(1.82g，54％)(Hayashi，Personal Communication(2001))，m.p.239-240°(dec.)。
HPLC(214nm)tR＝6.80(1.92)min，7.33(95.01％)。
1H NMR(400MHz，CDCl3)δ1.53(s，6H)；5.18(d，J＝17.6Hz，1H，-CH＝CH2)；5.21(d，J＝11.0Hz，1H，-CH＝CH2)；6.06(dd，J＝17.6，11.0Hz，1H，-CH＝CH2)；6.99(s，1H，-C-C＝CH)；7.00(s，1H，-C-C＝CH)；7.30-7.50(m，5×ArH)；7.60(s，H2″)；8.07(bs，NH)；9.31(bs，NH)；12.30(bs，NH)。
LC/MS tR＝6.22(349.3[M+H]+，E异构体)，6.73(349.5[M+H]+，697.4[2M+H]+，Z异构体)min。
ESMS m/z 349.5[M+H]+，390.3[M+CH4CN]+。
将所得氯仿溶液蒸发得到更多的3-Z-亚苄基-6-[5”-(1，1-二甲基烯丙基)-1H-咪唑-4”-Z-基亚甲基]哌嗪-2，5-二酮(0.76g，29％)。
HPLC(214nm)tR＝7.29(84.5％)min。
3-E-亚苄基-6-[5”-(1，1-二甲基烯丙基)-1H-咪唑-4”-Z-基亚甲基]哌嗪-2，5-二酮
对如上合成的材料的粗样品用制备HPLC色谱纯化，得到几何异构体3-E-亚苄基-6-[5”-(1，1-二甲基烯丙基)-1H-咪唑-4”-Z-基亚甲基]哌嗪-2，5-二酮(1.7mg)。
HPLC(214nm)tR＝6.75(87.79)min。
1H NMR(400MHz，CDCl3)δ1.52(s，6H)；5.19(d，J＝20.8Hz，1H，CH＝CH2)；5.22(d，J＝14.0Hz，1H，CH＝CH2)；6.05(dd，J＝18.0，10.4Hz，1H，CH＝CH2)；6.33(s，1H，C-C＝CH)；6.90-7.65(m，7H)。
ESMS m/z 349.5[M+H]+，390.4[M+CH4CN]+。
3-Z-亚苄基-6-(5”-叔丁基-1H-咪唑-4”-Z-基亚甲基)哌嗪-2，5-二酮(2)的合成
试剂：g)SO2Cl2；h)H2NCHO，H2O；i)LiAlH4；j)MnO2；k)1，4-二乙酰基哌嗪-2，5-二酮，Cs2CO3；l)苯甲醛，Cs2CO3
2-氯-4，4-二甲基-3-氧-戊酸乙酯
将磺酰氯(14.0ml，0.17mol)加入冷却(0°)的三甲基乙酰乙酸乙酯(27.17g，0.16mol)的氯仿(100ml)溶液中。使所得混合物升温至室温并搅拌30分钟，随后将其在回流温度下加热2.5h。冷却至室温后，将所得反应混合物用氯仿稀释，随后按顺序用碳酸氢钠、水和盐水洗涤。
将有机相干燥并蒸发得到澄清油状的2-氯-4，4-二甲基-3-氧-戊酸乙酯(33.1g，102％)。(Durant et al.，“Aminoalkylimidazoles and Process for theirProduction.”专利号GB 1341375(大不列颠，1973))。
HPLC(214nm)tR＝8.80(92.9％)min。
1H NMR(400MHz，CDCl3)δ1.27(s，9H)；1.29(t，J＝7.2Hz，3H)；4.27(q，J＝7.2Hz，2H)；5.22(s，1H)。
13C NMR(100MHz，CDCl3)δ13.8，26.3，45.1，54.5，62.9，165.1，203.6。
5-叔丁基-3H-咪唑-4-羧酸乙酯
将2-氯-4，4-二甲基-3-氧戊酸乙酯(25.0g，0.12mol)的甲酰胺(47.5ml)溶液和水(2.5ml)摇匀，然后装入15×8ml的小瓶中。将小瓶全部密封并在150°加热3.5h。使小瓶冷却至室温，向其中加入水(20ml)并将所得混合物用氯仿彻底萃取。除去氯仿得到浓缩的甲酰胺溶液(22.2g)，将其加入用1％MeOH/1％Et3N的氯仿溶液浸泡的快速二氧化硅层析柱(6cm直径，12cm高)中。用2.5L这种混合物对所述层析柱进行洗脱，然后使用1L的2％MeOH/1％Et3N的氯仿溶液洗脱，在较早洗脱的部分中，得到怀疑为5-叔丁基-噁唑-4-羧酸乙酯(6.3g，26％)的产物。
HPLC(214nm)tR＝8.77min。
1H NMR(400MHz，CDCl3)δ1.41(t，J＝7.2Hz，3H)；1.43(s，9H)；4.40(q，J＝7.2Hz，2H)；7.81(s，1H)。
13C NMR(100MHz，CDCl3)δ14.1，28.8，32.5，61.3，136.9，149.9，156.4，158.3。
ESMS m/z 198.3[M+H]+，239.3[M+CH4CN]+。
LC/MS tR＝7.97(198.1[M+H]+)min。
从后洗脱的部分中回收得到5-叔丁基-3H-咪唑-4-羧酸乙酯(6.20g，26％)。(Durant et al.，“Aminoalkylimidiazoles and Process for theirProduction.”专利号GB 1341375(大不列颠，1973))。
HPLC(214nm)tR＝5.41(93.7％)min。
1H NMR(400MHz，CDCl3)δ1.38(t，J＝7.0Hz，3H)；1.47(s，9H)；4.36(q，J＝7.2Hz，2H)；7.54(s，1H)。
13C NMR(100MHz，CDCl3)δ13.7，28.8，32.0，59.8，124.2，133.3，149.2，162.6。
ESMS m/z 197.3[M+H]+，238.3[M+CH4CN]+。
用1L 5％MeOH/1％Et3N对所述层析柱进一步洗脱得到怀疑为5-叔丁基-3H-咪唑-4-羧酸(0.50g，2％)的化合物。
HPLC(245nm)tR＝4.68(83.1％)min。
1H NMR(400MHz，CD3OD)δ1.36(s，9H)；7.69(s，1H)。
1H NMR(400MHz，CDCl3)δ1.37(s，9H)；7.74(s，1H)。
1H NMR(400MHz，CD3SO)δ1.28(s，9H)；7.68(s，1H)。
ESMS m/z 169.2[M+H]+，210.4[M+CH4CN]+。
(5-叔丁基-3H-咪唑-4-基)-甲醇
将5-叔丁基-3-咪唑-4-羧酸乙酯(3.30g，16.8mmol)的THF(60ml)溶液滴加入氢化铝锂(95％悬浮液，0.89g，22.2mmol)悬浮在THF(40ml)中所得的悬浮液中，并将所得混合物在室温下搅拌3h。加水直至不再产生气体为止，将反应混合物搅拌10分钟，随后用烧结漏斗过滤。沉淀先后用THF及甲醇洗涤，将滤液和洗涤液合并并蒸发。残余物冻干过夜，得到(5-叔丁基-3H-咪唑-4-基)甲醇(2.71g，105％)。(Durant et al.，“Aminoalkylimidazoles and Process for their Production.”专利号GB1341375(大不列颠，1973))。
HPLC(240nm)tR＝3.70(67.4％)min。
1H NMR(400MHz，CD3OD)δ1.36(s，9H)；4.62(s，2H)；7.43(s，1H)。
13C NMR(100MHz，CD3OD)δ31.1，33.0，57.9，131.4，133.9，140.8。
LC/MS tR＝3.41(155.2[M+H]+)min。
该物质使用前无需进一步纯化。
5-叔丁基-3H-咪唑-4-甲醛
将二氧化锰(30g，0.35mol)加入溶于丙酮(700ml)的(5-叔丁基-3H-咪唑-4-基)甲醇(4.97g，0.03mol)的多相溶液中，将所得混合物在室温下搅拌4h。将反应混合物用Celite pad(衬垫)过滤，并将该pad用丙酮洗涤。将滤液与洗涤液合并并蒸发。残余物用乙醚研磨，得到无色固体的5-叔丁基-3H-咪唑-4-甲醛(2.50g，51％)。(Hayashi，Personal Communication(2000))。
HPLC(240nm)tR＝3.71(89.3％)min。
1H NMR(400MHz，CDCl3)δ1.48(s，9H)；7.67(s，1H)；10.06(s，1H)。
LC/MS tR＝3.38(153.2[M+H]+)min。
对研磨后所得的过滤液进行蒸发，得到额外的5-叔丁基-3H-咪唑-4-甲醛(1.88g，38％)。
1-乙酰基-3-(5’-叔丁基-1H-咪唑-4’-Z-基亚甲基)哌嗪-2，5-二酮
向5-叔丁基-3H-咪唑-4-甲醛(2.50g，164.4mol)的DMF(50ml)溶液中加入1，4-二乙酰基哌嗪-2，5-二酮(6.50g，32.8mmol)，对所述溶液进行排空，随后充入氩气。将排空-充气过程再重复两次，随后加入碳酸铯(5.35g，16.4mmol)。将排空-充气过程再重复三次，随后将所得混合物在室温下搅拌5h。将反应混合物部分蒸发(在真空下加热)直到剩余少量体积，将所得溶液滴加入水(100ml)中。收集产生的黄色沉淀然后冻干，得到1-乙酰基-3-[5’-叔丁基-1H-咪唑-4’-Z-基亚甲基]哌嗪-2，5-二酮(2.24g，47％)。(Hayashi，Personal Communication(2000))。
HPLC(214nm)tR＝5.54(94.4％)min。
1H NMR(400MHz，CDCl3)δ1.47(s，9H)；2.65(s，3H)，4.47(s，2H)；7.19(s，1H)；7.57(s，1H)，9.26(s，1H)，12.14(s，1H)。
13C NMR(100MHz，CDCl3+CD3OD)δ27.3，30.8，32.1，46.5，110.0，123.2，131.4，133.2，141.7，160.7，162.8，173.0
LC/MS tR＝5.16(291.2[M+H]+，581.6[2M+H]+)min。
3-Z-亚苄基-6-[5”-叔丁基-1H-咪唑-4”-Z-基亚甲基]哌嗪-2，5-二酮
向1-乙酰基-3-[5’-叔丁基-1H-咪唑-4’-Z-基亚甲基]哌嗪-2，5-二酮(2.43g，8.37mmol)的DMF(55ml)溶液中加入苯甲醛(4.26ml，41.9mmol)，对所述溶液进行排空，随后充入氮气。将排空-充气过程再重复两次，随后加入碳酸铯(4.09g，12.6mmol)。将排空-充气过程再重复三次，随后将反应混合物在如下的温度梯度下进行加热。反应共进行5小时后，使反应物冷却至室温，并将反应混合物加入冰水(400ml)中。收集产生的沉淀，用水洗涤然后冻干，得到黄色固体(2.57g，HPLC(214nm)tR＝6.83(83.1％)min.)。将该物质溶于氯仿(100ml)中，蒸发以共沸除去残留的水，得到褐色的油状物。将其溶于氯仿(20ml)并用冰冷却。90分钟后收集产生的黄色沉淀，空气干燥，得到3-Z-亚苄基-6-[5”-叔丁基-1H-咪唑-4”-Z-基亚甲基]哌嗪-2，5-二酮(1.59g，56％)(Hayashi，Personal Communication(2000))。
HPLC(214nm)tR＝6.38(2.1％)，6.80(95.2)min。
1H NMR(400MHz，CDCl3)δ1.46(s，9H)；7.01(s，1H，-C-C＝CH)；7.03(s，1H，-C-C＝CH)；7.30-7.50(m，5H，Ar)；7.60(s，1H)；8.09(bs，NH)；9.51(bs，NH)；12.40(bs，NH)。
LC/MS tR＝5.84(337.4[M+H]+，E异构体)，6.25(337.4[M+H]+，673.4[2M+H]+，Z异构体)min。
ESMS m/z 337.3[M+H]+，378.1[M+CH4CN]+。
蒸发所述氯仿溶液得到额外的3-Z-亚苄基-6-[5”-叔丁基-1H-咪唑-4”-Z-基亚甲基]哌嗪-2，5-二酮(0.82g，29％)。HPLC(214nm)tR＝6.82(70.6％)min。
一般实验条件
碳酸氢钠指5％的溶液。
除非特别声明，有机溶剂用硫酸钠干燥。
分析条件
NMR条件
1H NMR(400MHz)分析是在Varian Inova Unity 400MHz NMR设备上进行的。样品用含0.1％TMS的氘代氯仿输送(除非特别声明)。化学位移(ppm)以相对TMS(0.00ppm)为基准或对CD3OD输送的样品以CH3OH(3.30ppm)为基准。耦合(coupling)常数用赫兹(Hz)表示。
分析HPLC条件
体系6条件：
在Rainin Microsorb-MV C18(5μm，100)50×4.6mm柱上进行RP-HPLC。
缓冲液A：0.1％含水TFA
缓冲液B：溶于90％含水MeCN的0.1％TFA
梯度：11分钟内0-100％缓冲液B
流动速率：1.5mL/分钟
LCMS条件
在Perkin-Elmer Sciex API-100装置上进行LCMS。
LC条件：
反相HPLC分析
柱：Monitor 5μm C18 50×4.6mm
溶剂A：0.1％TFA的水溶液
溶剂B：溶于90％含水MeCN的0.085％TFA
梯度：11.0分钟内0-100％缓冲液B
流动速率：1.5mL/分钟
波长：214nm
MS条件：
离子源：离子喷射器
检测器：离子计数器
到质谱的流动速率：从柱分离(1.5mL/分钟)后300μL/分钟
ESMS条件
在Perkin Elmer/Sciex-API III LC/MS/MS上用电子喷射输入器进行ESMS。
溶剂：溶于60％含水MeCN的0.1％AcOH
流动速率：25μL/分钟
离子喷射器：5000V
孔板(orifice plate)：55V
取数时间(acquisition time)：2.30分钟
扫描范围：100-1000amu/z
扫描步长：0.2amu/z
制备RP-HPLC纯化条件
采用Nebula用Waters XterraMS柱(19×50mm，5μm，C18)在如下条件下进行反相HPLC纯化：
溶液A：0.1％含水TFA
溶液B：溶于90％含水MeCN的0.1％TFA
梯度：4分钟内5-95％B
流动速率：20mL/分钟
波长：214nm
各简写含义如下：brs：宽的单峰；BuLi：正丁基锂；d：双峰；DBU：1，8-二氮杂双环[5.4.0]十一碳-7-烯；ESMS：电子喷雾质谱；HCl：盐酸；HPLC：高效液相色谱；LCMS：液相色谱质谱；LD：二异丙基氨基锂；M+：分子离子；m：多峰；MeCN：乙腈；M：质谱；MW：分子量；NMR：核磁共振；q：四重峰；s：单峰；：三峰；tR：保留时间；TFA：三氟乙酸；THF：四氢呋喃
合成脱氢苯基阿夕斯丁的具体步骤
1-乙酰基-3-{(Z)-1-[5-(1，1-二甲基-2-丙烯基)-1H-4-咪唑基]亚甲基}-2，5-哌嗪二酮(2)
向5-(1，1-二甲基-2-丙烯基)咪唑-4-甲醛(100mg，0.609mmol)的DMF(2mL)溶液中加入化合物1(241mg，1.22mmol)，在短时间内对所得溶液进行重复排空以除去氧气并充入Ar，随后加入Cs2CO3(198mg，0.609mmol)，并再次重复排空-充气的过程。优选除去氧气，因为这样被认为可以减少所述哌嗪二酮环6位的α-碳的氧化。将所得混合物在室温下搅拌5h。通过蒸发除去溶剂后，将所述残余物溶解在EtOAc与10％Na2CO3的混合物中，所得有机相再次用10％Na2CO3洗涤并用饱和NaCl洗涤三次，用Na2CO3干燥，并在真空下浓缩。所残留的油状物以CHCl3-MeOH(100∶0到50∶1)为洗脱剂用二氧化硅柱层析纯化，得到60mg(33％)淡黄色固体2。
脱氢苯基阿夕斯丁
向化合物2(30mg，0.099mmol)的DMF(0.8mL)溶液中加入苯甲醛(51μL，0.496mol，5eq)，在短时间内对所得溶液进行重复排空以除去氧气并充入Ar，随后加入Cs2CO3(53mg，0.149mmol，1.5eq)，并再次重复排空-充气的过程。将所得混合物在80℃加热2.5h(温度必须缓慢提升。迅速升温会导致在亚苄基部位E-异构体生成量的增加)。通过蒸发除去溶剂后，将所得残余物溶解在EtOAc中，水洗两次并用饱和NaCl洗涤三次，用Na2SO4干燥，并在真空下浓缩。在TLC上使用CHCl3-MeOH(10∶1)，在365nm UV下可观察到亮黄绿色发光点。HPLC分析得知该粗产物的纯度超过75％。将所得残余物溶解在90％的MeOH水溶液中并加入反相HPLC柱(YMC-Pack，ODS-AM，20×250mm)中，并用从70％到74％的线性梯度的MeOH水溶液以12mL/分钟的流动速率洗脱约16分钟，收集所需的部分并通过蒸发浓缩，得到19.7mg(60％)(尽管没有对每一步的收率进行优化)的黄色脱氢苯基阿夕斯丁。
实施例4
脱氢苯基阿夕斯丁和脱氢苯基阿夕斯丁类似物的生物学特性
A.生物学评价
在HT29人克隆细胞和PC-3前列腺癌细胞中对合成的tBu-脱氢苯基阿夕斯丁和脱氢苯基阿夕斯丁的生物学特性进行评价。
将HT-29(ATCC HTB-38)人结肠癌细胞维持在McCoy’s全培养基(添加了10％FBS的含L-谷酰胺和25mM HEPES的McCoy’s 5A培养基，1mM丙酮酸钠，1×NEAA，2mM L-谷酰胺，和分别为100IU/ml和100□g/ml的Pen/Strep)中。将PC-3(ATCC CRL-1435)人类前列腺癌细胞维持在F12K全培养基(添加了10％FBS的F12K培养基；2mM谷酰胺；1％HEPES；和分别为100IU/ml和100□g/ml的Pen/Strep)中。将细胞系在37℃、5％CO2、湿度95％的恒温箱中培养。
对肿瘤细胞进行毒性分析，将HT-29或PC-3细胞以5,000细胞/孔(在90□l全培养基中)接种在Corning 3904黑壁透明底(black-walledclear-bottom)组织培养板上，并将该培养板孵育过夜使细胞生长并进入对数生长期。在100％DMSO中制备20mM的脱氢苯基阿夕斯丁和tBu-脱氢苯基阿夕斯丁储备溶液，并储存在-20℃。在适当的培养基中制备所述两种化合物的10X浓缩的连续稀释液，达到最终浓度范围为20×10-5M到20×10-10M。将10□l体积的10X连续稀释液加入所述测试孔中(共三次)，并将所述培养板放回恒温箱中48小时。在所有样品中的最终DMSO浓度为0.25％。
暴露于药物48小时后，在每孔中加入10□l溶于无Mg2+、Ca2+的PBS的0.2mg/ml刃天青(resazurin)(从Sigma-Aldrich Chemical Co.获得)，将所述培养板放回恒温箱中3-4小时。移除培养板，并在Fusion荧光计(PackardInstruments)中用530nm激发及590nm发射滤光片检测刃天青的荧光。用不含细胞的刃天青染料测定背景，将其从所有试验孔的数据中扣除。用Prism软件(GraphPad Software)分析数据。将上述数据对只用基质处理的细胞(100％细胞生长)的平均值进行归一化，并用标准的sigmoidal(S型)剂量响应曲线拟合算法确定EC50值。
如以下的表1所示，与脱氢苯基阿夕斯丁相比tBu-脱氢苯基阿夕斯丁显示出约大4倍的细胞毒性活性。
表1 脱氢苯基阿夕斯丁和衍生物的细胞毒性作用
脱氢苯基阿夕斯丁 tBu-脱氢苯基阿夕斯丁
也参见图41所示的在HT-29、PC-3和P-388细胞中的另外数据。
B.脱氢苯基阿夕斯丁衍生物的结构和活性研究
在P388的小鼠白血病细胞、HT-29人克隆细胞和PC-3前列腺癌细胞中检验了苯基阿夕斯丁、脱氢苯基阿夕斯丁和各种脱氢苯基阿夕斯丁衍生物的细胞毒性作用。
如上所述，将HT-29人结肠癌细胞维持在McCoy’s全培养基(添加了10％FBS的含L-谷酰胺和25mM HEPES的McCoy’s 5A培养基，1mM丙酮酸钠，1X NEAA，2mM L-谷酰胺，和分别为100IU/ml和100□g/ml的Pen/Strep)中。将PC-3人类前列腺癌细胞维持在F12K全培养基(添加了10％FBS的F12K培养基；2mM谷酰胺；1％HEPES；和分别为100IU/ml和100□g/ml的Pen/Strep)中。将细胞系在37℃、5％CO2、湿度95％的恒温箱中培养。
对肿瘤细胞毒性进行分析，将HT-29或PC-3细胞以5,000细胞/孔(在90μl全培养基中)接种在Corning 3904黑色壁透明底(black-walledclear-bottom)组织培养板上，并将该培养板孵育过夜使细胞生长并进入对数生长期。在100％DMSO中制备20mM的脱氢苯基阿夕斯丁和tBu-脱氢苯基阿夕斯丁储备溶液，并储存在-20℃。在适当的培养基中制备所述两种化合物的10X浓缩的连续稀释液，达到最终浓度范围为20×10-5M到20×10-10M。将10μl体积的10X连续稀释液加入所述测试孔中(共三次)，并将所述培养板放回恒温箱中48小时。在所有样品中的最终DMSO浓度为0.25％。
暴露于药物48小时后，在每孔中加入10□l溶于无Mg2+、Ca2+的PBS的0.2mg/ml刃天青(从Sigma-Aldrich Chemical Co.获得)，将所述培养板放回恒温箱中3-4小时。移除培养板，并在Fusion荧光计(PackardInstruments)中用530nm激发及590nm发射滤光片检测刃天青的荧光。用不含细胞的刃天青染料测定背景，将其从所有试验孔的数据中扣除。用Prism软件(GraphPad Software)分析数据。将上述数据对只用基质处理的细胞(100％细胞生长)的平均值进行归一化，并用标准的sigmoidal剂量响应曲线拟合算法确定EC50值。
下表2中总结了苯基阿夕斯丁、脱氢苯基阿夕斯丁和脱氢苯基阿夕斯丁衍生物的EC50和IC50值。
表2.苯基阿夕斯丁或脱氢苯基阿夕斯丁及脱氢苯基阿夕斯丁衍生物的SAR研究
对苯环的修饰对细胞毒性活性有显著的影响。与tBu-脱氢苯基阿夕斯丁(#6)的活性相比，间位具有甲氧基基团(KPU-9)的化合物表现出比其它衍生物都高的活性，其在P388细胞中的IC50值为20.8±3.3nM。所述KPU-9衍生物在HT-29细胞中也表现出细胞毒性(EC5031nM)。脱氢苯基阿夕斯丁、tBu-脱氢苯基阿夕斯丁(KPU-2)和KPU-9衍生物都在P388细胞中表现出细胞毒性。
C.其它脱氢苯基阿夕斯丁衍生物的结构和活性研究
使用上述的方法，在HT-29人克隆细胞和PC-3前列腺癌细胞中对苯基阿夕斯丁、脱氢苯基阿夕斯丁和各种其它脱氢苯基阿夕斯丁衍生物的细胞毒性作用进行了检验。
表3.苯基阿夕斯丁或脱氢苯基阿夕斯丁及其它脱氢苯基阿夕斯丁衍生物的SAR研究
应用作为细胞存活力指示剂的刃天青荧光，在此实施例中采用上述的方法，进行另外的细胞毒性分析。所述结果显示在以下表3.1中。
表3.1苯基阿夕斯丁、脱氢苯基阿夕斯丁及其它脱氢苯基阿夕斯丁衍生物的研究
实施例5
其它脱氢苯基阿夕斯丁类似物
A.对脱氢苯基阿夕斯丁衍生物合成的改进
单独使用前述技术或结合其它公知的有机合成技术合成其它的脱氢苯基阿夕斯丁衍生物。
根据待制备的目标衍生物，可改变所述合成方法中采用的二酰基哌嗪二酮和所述第一和第二醛。合成的衍生物为：
A)对所述苯环进行修饰和/或引入其它芳香环系，
B)改变所述芳香环的位置，
C)改变所述咪唑芳香环系，和/或
D)对所述咪唑环上的5位进行修饰。
下图显示了在脱氢苯基阿夕斯丁化合物上为制备脱氢苯基阿夕斯丁衍生物而进行修饰的区域。本文公开了修饰的非限定性的例子，且在该公开的基础上本领域所属技术人员可充分理解。
A1)以公知的抗微管素化合物的结构为基础对所述苯环进行修饰烷基、卤素、烷氧基、乙酰基、磺胺、氨基、羟基、硝基等等。
2)引入其它芳香环系
等等
B所述芳香环的位置
C变为其它环系
等等
D对所述咪唑环的5位进行进一步修饰
等等
对上述的对脱氢苯基阿夕斯丁化合物的修饰进行扩展，所述化合物的衍生物在其苯环(A)上可包括如下取代基：-CF3、-SO2NH2(-SO2NR1R2)、-SO3H、-CONH2(-CONR1R2)、-COOH等等。其它环系(C)也可包括下列基团：
B.合成的脱氢苯基阿夕斯丁衍生物的例子
表4中公开了合成的脱氢苯基阿夕斯丁衍生物的其它例子。
表4.其它合成的脱氢苯基阿夕斯丁衍生物
C.脱氢苯基阿夕斯丁衍生物的评价
根据实施例3中所述的方法对上述衍生物进行评价。对所述衍生物的其它评价扩展至评价特定活性，例如测定对细胞增殖的抑制作用、对特定细胞机理(即微管功能)的作用、对细胞周期进程的作用、评价对癌症细胞系的体外抗肿瘤活性等等。下面给出了一些评价方法的方案。
1)脱氢苯基阿夕斯丁及其类似物的细胞增殖抑制作用
在96-孔微滴定板的每个孔中，加入100μl在培养基中被制备成105细胞/ml的源自人肺癌的A-549细胞，其中所述培养基是通过在EMEM培养基(Nissui Seiyaku Co.，Ltd.)中加入10％的胎牛血清得到的，而其中所述培养基对源自人肺癌的A-549细胞具有抗肿瘤作用。将通过上述所列例子得到的衍生物的甲醇溶液加入最上排的孔中，使用半对数稀释方法对样品进行稀释并加入，并将所述微滴定板在二氧化碳气体恒温箱中于37℃孵育48小时。将所得培养物加入多个含10μl MTT试剂(3-(4，5-二甲基-2-噻唑)-2，5-联苯基-2H-四溴化物)(1mg/ml·PBS)中，随后在二氧化碳气体恒温箱中于37℃孵育6小时。弃去培养基并将所述细胞中产生的晶体溶解在100μl/孔的二甲基亚砜中。随后用酶标仪(microplate reader)检测595nm的光吸收。通过比较未处理细胞与用已知浓度样品处理过的细胞的光吸收，可计算抑制50％细胞增殖的所述样品的浓度(IC50)。
2)脱氢苯基阿夕斯丁及其类似物的细胞周期抑制活性
细胞株A431源自人肺癌。用含10％胎牛血清和1％MEM非必需氨基酸溶液(SIGMA M2025)的EMEM培养基在用5％二氧化碳气体和水蒸汽饱和的恒温箱中于37℃对A431细胞进行孵育。将通过上述方法获得的脱氢苯基阿夕斯丁的提纯样品加入处于对数生长期的上述细胞中，并通过流式细胞术和显微镜观测分析细胞周期的进程。
实施例6
合成的脱氢苯基阿夕斯丁(脱氢PLH)衍生物的结构-活性关系
1)衍生物合成中的概述
本文公开的脱氢PLH衍生物中许多(但不是全部)在其苯环上具有一、二或三个修饰基团(见以下图5)。所述衍生物是通过上述方法合成的。如表5中所示，某些化合物显示出比脱氢PLH和tBu-脱氢PLH更高的细胞毒性活性。活性最高的，EC50值为3nM的化合物是KPU-90。上述值分别比脱氢PLH和tBu-脱氢PLH的数值高16倍和4倍。这些衍生物在所述苯环的邻位或间位具有单取代，取代基为卤原子(如氟和氯原子)或甲基、乙烯基或甲氧基基团。在诸如萘、噻吩和呋喃环的杂芳基结构上具有取代基的衍生物也具有有效的活性。KPU-35、42、69、80和81也表现出高于tBu-脱氢PLH的活性。
表5.合成有效的脱氢PLH衍生物
2)在所述苯环上引入甲氧基基团
秋水仙碱与PLH可识别β-微管素上相同的结合位点。秋水仙碱在其A和B环上具有4个特征甲氧基基团。进行了一系列单甲氧基或多甲氧基的取代，其细胞毒性活性结果如表6所示。
表6.甲氧基取代对HT-29细胞增殖的作用
上述结果证明在间位或邻位的取代使对HT-29细胞的细胞毒性活性上升。KPU-9和16显示出高活性。具有三取代的甲氧基衍生物(KPU-11、17和45)也显示出活性。KPU-24的结构是通过质谱分析确定的。
3)用吸电子基进行修饰
为研究更广泛的所述苯环上的结构-活性关系，引入了一系列不同的官能团，包括吸电子基和给电子基。对HT-29细胞的细胞毒性结果分别如表7和8所示。
在邻位或间位的取代可有效增强活性。这些结果与甲氧基的情况非常一致。
表7.吸电子基团对HT-29细胞增殖的作用
表8.给电子基团对HT-29细胞增殖的作用
本公开并不被界定或限制于任何具体的科学理论。然而，应当理解本领域所属技术人员可以认同本文呈现出的结论即认为相对较小的官能团(造成的空间位阻较小)可有利于显示更强的活性，而诸如乙氧基(当与甲氧基相比)或Br原子(当与Cl原子相比)的稍大的基团可造成不利于与例如微管素结合位点反应的空间位阻。此外，因为这些取代基的电子特性并不影响活性，因此认为这些相对较小的基团并不与所述β-微管素的结合位点直接反应，而是限制了适合于上述结合的脱氢PLH的构象。或者，作为另一可能的假设，因为引入亲水性的羟基基团(其可作为氢给体而形成氢键)使活性大幅降低，因此疏水特性在对所述β-微管素上的邻位或对位的结合位点可能是更重要的因素。
如表9所示，可对邻位取代基对细胞毒性活性的作用进行整理，而对间位取代基的情况如表10所示。还可对具有有效官能团的化合物(其显示出比tBu-脱氢PLH更高活性)进行进一步修饰。并且因为观测到在可见光照射下的从Z到E的立体化学转变，因此可降低所述共轭双键的电子密度的取代基可降低由光引起的Z到E的转变，从而产生物理化学上更稳定的结构。温度也可影响这种转变。
在所述环的两个部分进行修饰可有利于开发有效且生物学稳定的化合物。所述苯基阿夕斯丁的苯环可被细胞色素P-450氧化。因此，可降低所述苯环的电子密度的两重修饰可有效地避免P-450的氧化。因此，将所述小吸电子基团(如氟原子)与可增强活性的单元(如-OMe、-Me、-Cl、-F和Br)结合起来，可产生更有效且生物学稳定的药物化合物。
表9.邻位修饰的概括
表10.间位修饰的概括
4)用芳基-杂环取代所述苯环
所述苯环也可被杂芳基基团替代。这类替换的细胞毒性活性结果如表11所示。因为所述芳环的氮原子可与所述哌嗪二酮环的NH基团形成氢键，并限制所述吡啶和哌嗪二酮环间的分子构象为单平面结构，因此脱氢PLH的活性构象需要所述哌嗪环的酰胺的氢原子与所述苯环的邻位氢原子之间通过空间排斥形成一定大小的二面角。
表11.用杂芳基环进行替换对HT-29细胞增殖的作用
用较小的呋喃或噻吩环替代所述苯环(例如KPU-29或42)可表现出活性。在保持较强活性的条件下可将所述苯环转变为其它芳香结构。
5)苯基阿夕斯丁的代谢
在近期的研究中，用大鼠肝脏微粒体或人肝脏P450s对(±)-苯基阿夕斯丁进行处理。在人的情况中，至少检测到七种代谢产物，且其中两种(即P1和P3)是主要的代谢产物，占所述回收代谢产物的超过60％。
因为在tBu-脱氢PLH中没有外-烯烃结构，所以当前合成的衍生物没有象P1和P4的氧化形式。但是，在肝脏代谢过程中形成诸如P3和P5的氧化形式。各种可阻止这类代谢的衍生物可有效地避免在所述苯环上的P450氧化。也可对所述咪唑环进行修饰以避免不利的氧化。
6)脱氢PLH的物理化学稳定性
脱氢PLH的物理化学稳定性是不利的问题之一。在苯基阿夕斯丁中，因为在所述苄基部分没有其它烯烃结构，因此不存在这类问题。然而，在脱氢PLH中，所述亚苄基部分可很容易被活化(可能被可见光活化)，且因为存在双键的较长的共轭，因此经常发生Z到E的转变。这种转变甚至在正常的室内光线下也会发生。在所述细胞毒性分析中，一些化合物在孵育过程中转变为E-型，尽管对脱氢PLH这种转变可能达到1∶1比例的平衡。这种转变是可控的。已知在combretastatin A4(微管素抑制剂的相似类型)中也存在这种Z到E的转变，且报道了一些改进这种问题的研究。
7)前药合成
E-型也可用作脱氢PLH或一种或多种其类似物(包括本文所述的那些类似物)的前药。尽管抗微管素药物属于分子靶向治疗方法之一，但这些药物的不利特性之一包括其对肿瘤和健康组织的较低的选择性。这导致了不利的副作用。然而，如果所述化合物只选择性地在肿瘤组织中发挥功能，则可降低抗微管药物的不利副作用。由于所述脱氢PLH(Z-型)可由其E-异构体通过可见光照射产生，因此可将所述E-型给药且只对肿瘤位置进行光照射，这样只有肿瘤被光产生的Z-型所损伤，而降低了对健康组织的负面效果。
通过引入大体积但生物可降解的酰基基团可对所述E-型进行化学保护，而所述酰基基团可作为前药引入所述哌嗪二酮环上。这类酰基基团可被体内的蛋白酶降解。因此，在给药前保持酰基化的E-化合物，给药后其变为真正的E-型，通过局部光照射可将其转变为生物活性的Z-型。
这类酰基-E-型的tBu-脱氢PLH的合成路线如图9所示。
实施例7
合成的脱氢苯基阿夕斯丁的药物制剂
1)用于静脉内滴注、注射、输注或类似形式给药的制剂
向含有5g葡萄糖粉末的每一小瓶中无菌加入10mg的用本发明方法合成的化合物并密封。充入氮气、氦或其它惰性气体后，将所述小瓶保存在低温黑暗处。使用前将所述成分用乙醇溶解，并将其加入100ml的0.85％生理盐水溶液中。作为抑制确诊患有癌性肿瘤的人体内的肿瘤生长的方法，将所得溶液以约10ml/天到约1000ml/天进行静脉内给药，其给药方式可为本领域所属技术人员认为适当方式，如滴注或皮下注射或腹膜内注射。
2)用于口服给药或类似形式的制剂
通过任意常规方法，将由1g用本发明方法合成的化合物、98g乳糖和1g羟丙基纤维素充分混合得到的混合物制成颗粒。将所得颗粒充分干燥并过筛，得到适合于包装在瓶中或热封装的颗粒制剂。根据症状，所得颗粒制剂可按人癌性肿瘤治疗领域所属技术人员认为适当的方式以约100ml/天到约1000ml/天进行口服给药。
3)用于局部给药的制剂
也可通过对个体皮肤的染病区域直接给药所述化合物来实现局部给药所述个体有效剂量的所述化合物。为此目的，所述化合物以包括药物可接受的局部载体的药物组合物的形式进行给药或应用，例如凝胶、软膏、洗液或乳膏，，其中所述局部载体包括但不限于诸如水、甘油、酒精、丙二醇、脂肪醇、甘油三酯、脂肪酸酯或矿物油的载体。其它局部载体包括煤油、棕榈酸异丙基酯、聚乙二醇、乙醇(95％)、聚氧化乙烯单月桂酸酯的水溶液(5％)、或月桂基磺酸钠的水溶液(5％)。如果需要可加入其它材料，例如抗氧化剂、湿润剂、粘度稳定剂和类似的试剂。也可包括诸如Azone的经皮渗透增强剂。此外，在某些例子中，所述化合物可布置在位于皮肤上、皮肤内或皮肤下的装置中。这类装置包括可通过被动或主动释放机理向皮肤中释放所述化合物的贴片、植入物和注射物。
实施例8
KPU-2、KPU-35和叔丁基苯基阿夕斯丁的体外药理学
用KPU-2、KPU-35和叔丁基苯基阿夕斯丁进行的体外效力研究包括：A)六种肿瘤细胞系的组，B)在耐多种药物的肿瘤细胞中进行研究，及C)研究确定作用的机理。
A)在六种肿瘤细胞系的组中对KPU-2、KPU-35和叔丁基苯基阿夕斯丁的研究
使用如下细胞系(括号中为来源)：HT29(人克隆肿瘤；ATCC；HTB-38)、PC3(人前列腺肿瘤；ATCC；CRL-1435)、MDA-MB-231(人乳房肿瘤；ATCC；HTB-26)、NCI-H292(人非小细胞肺肿瘤；ATCC；CRL-1848)、OVCAR-3(人卵巢肿瘤；ATCC；HTB-161)、B16-F10(小鼠黑瘤；ATCC；CRL-6475)和CCD-27sk(正常人成纤维细胞；ATCC；CRL-1475)。将细胞在其各自的培养基质中维持在亚融合(subconfluent)密度。
按照上文实施例4中所述进行细胞毒性分析，使用刃天青荧光作为细胞活力的指标。
所述公开的化合物是抗各种不同和明显差别的肿瘤细胞系的有效试剂。特别地，例如KPU-2和KPU-35在强度(在低纳摩尔范围内有活性)及效力(对最大细胞毒性作用方面效果最强)上对所述HT-29肿瘤细胞系都是最有效的；叔丁基苯基阿夕斯丁对所述PC-3肿瘤细胞系显示出最大的强度，而对所述HT-29细胞系显示出最大的效力；KPU-2和KPU-35强度通常比叔丁基阿夕斯丁高10-40倍，而所有三种化合物在所述不同肿瘤细胞系中的效力相当；所述HT-29、PC-3、MDA-MB-231和NCI-H292肿瘤细胞系对NPI化合物的反应类似，而所述B16-F10则表现出某种程度的不敏感。叔丁基-苯基阿夕斯丁在正常成纤维细胞和所述肿瘤细胞系之间表现出明显的差别，除对OVCAR-3细胞系外，比例范围从＞20到＞100。
表12.KPU-2、KPU-35和叔丁基苯基阿夕斯丁在肿瘤培养板筛选中的活性
B)耐药性细胞系的研究
在临床肿瘤学中使用化疗试剂的一个主要挑战是肿瘤细胞对所述药物作用发展的耐药性。耐药性的发展有多种机理，其中每一种对化疗药物都有不同的效果。这些机理包括ATP依赖的外排泵(efflux pump)的表达上升，所述外排泵例如MDR1编码的P-糖蛋白或MRP1编码的多种药物耐药性相关蛋白1。药物摄取降低、药物靶标改变、药物诱导的DNA损伤的加速修复、凋亡途径的改变及细胞色素P450酶的活化作用是癌症细胞对抗癌药物产生耐药性的机理的其它例子。在表现两种不同耐药性机理(P-糖蛋白的过表达和拓扑异构酶II活性的改变)的三种不同细胞系中对所选化合物进行研究。
1)人子宫肉瘤肿瘤细胞系对：MES-SA(紫杉醇敏感)和MES-SA DX(耐紫杉醇)
这种细胞系表达上调的mdr-1 mRNA和P-糖蛋白(排出泵机理)。对由P-糖蛋白上调引起耐药性的化合物，用环孢菌素-A(CsA)预处理可阻断P-糖蛋白并恢复那些化合物在所述耐药性细胞系中的活性。
如表13中所示，KPU-2和KPU-35在所述耐药性细胞系中和所述敏感系中具有相同的强度，而叔丁基苯基阿夕斯丁的强度只是轻微下降。环孢菌素-A(CsA)预处理不能改变所选化合物的强度。与之不同，紫杉醇在所述MES-SA DX耐药性细胞系中实际上是无活性的，而该化合物在所述敏感细胞系中是很强效的。CsA处理恢复了所述MES-SA DX细胞系对紫杉醇的敏感性。所述MES-SA DX细胞系对依托泊甙(etoposide)(60倍)、阿霉素(34倍)和米托蒽醌(mitoxantrone)(20倍)也显示出降低的敏感性。
这些数据表明，在所述细胞系中KPU-2、KPU-35和叔丁基苯基阿夕斯丁的效果不受这种所述紫杉醇相关耐药性机理(p-糖蛋白)的影响，同时表明该模型中紫杉醇对这些所选化合物不存在交叉耐药性。
表13.KPU-2、KPU-35、叔丁基苯基阿夕斯丁和紫杉醇在MES-SA紫杉醇敏感和MES-SA DX5耐紫杉醇的人子宫肉瘤肿瘤细胞系中的活性
还参见图43中所示的另外的数据。
2)人急性前髓细胞白血病细胞系对：HL-60(米托蒽醌-敏感)和HL-60/MX-2(耐米托蒽醌)
该细胞系被认为具有非典型的耐药性，具有改变的拓扑异构酶II催化活性而无P-糖蛋白的过表达。
如表14所示，这些结果表明所选新化合物的强度在所述敏感和耐药性HL-60细胞系中很类似。与之不同，米托蒽醌在耐药性HL-60/MX-2细胞系中效力下降了24倍。
因此，在该细胞系中KPU-2、KPU-35和叔丁基苯基阿夕斯丁对米托蒽醌的耐药性机理不敏感，同时表明在该模型中米托蒽醌对这些所选新化合物没有交叉耐药性。
表14.KPU-2、KPU-35、叔丁基苯基阿夕斯丁和米托蒽醌在HL-60人急性前髓细胞白血病肿瘤敏感和耐药性细胞系对中的活性
3)人乳腺癌细胞系对：MCF-7(紫杉醇敏感)和MCF-7/ADR(耐紫杉醇)
该研究将KPU-2与紫杉醇进行对比。KPU-2证明在该细胞系对的敏感和耐药性成员中具有类似的强度。与之不同，紫杉醇在所述耐药性细胞系中实际上无活性，而在所述敏感细胞系中具有低纳摩尔强度(表15)。
这些研究在不同人肿瘤细胞中确认对紫杉醇的耐药性不会转移至KPU-2。
表15.KPU-2和紫杉醇在MCF-7人乳腺癌敏感和耐药性细胞系对中的活性
C)作用机理的研究
1).对微管功能的作用
在本研究中使用人脐静脉内皮细胞(来自Cambrex的HuVEC)，通过对α-微管素进行染色，对比秋水仙碱和紫杉醇评价了KPU-2和叔丁基苯基阿夕斯丁对微管素的效果。
在所述HuVEC细胞中，暴露于KPU-2、叔丁基苯基阿夕斯丁或秋水仙碱(均为2μM)30分钟诱导了与DMSO对照中观测结果相对的微管解聚作用(表现为缺乏完整的微管结构)和细胞膜起疱(blebbing)(细胞凋亡的明显标志)，而紫杉醇在这些条件下不能诱导微管解聚作用。秋水仙碱是已知的微管解聚试剂而紫杉醇是微管素稳定剂。将CCD-27sk细胞暴露于KPU-2或秋水仙碱可观察到类似的结果。
2).诱导细胞凋亡
细胞凋亡及其调节障碍在肿瘤学中起重要作用；在肿瘤细胞中选择性诱导程序化的细胞死亡循环是许多化疗药物开发项目的目标。通过不同方法可证明对细胞凋亡的这种诱导作用，上述方法包括特征性的细胞膜起疱、DNA断裂、抗凋亡因子Bcl-2的过磷酸化、caspase(凋亡蛋白酶)级联反应的活化及多(ADP核糖)聚合酶(PARP)的降解。
与坏死细胞的死亡明显不同，凋亡细胞死亡的特征信号包括细胞膜起疱、核分解、细胞收缩和凝聚及最终的细胞死亡。KPU-2在人前列腺肿瘤细胞中诱导与细胞凋亡早期阶段相关的典型形态变化。用KPU-2处理HuVEC细胞时可以清楚发现类似的现象。
3).DNA断裂
细胞凋亡的晚期阶段特征是核小体间DNA断裂，其导致可被凝胶电泳显现的明显的梯形图案。将这种方法用于研究Jurkat细胞(人T细胞白血病系)中与halimide和脱氢苯基阿夕斯丁(KPU-1)相比KPU-2对DNA梯形化(laddering)的作用。KPU-2在1nM浓度诱导DNA梯形化，而halimide和KPU-1的强度低得多。
4).Caspase级联反应的活化
在凋亡过程中，caspase级联反应中包括Caspase-3、-8和-9在内的多种酶被活化。在Jurkat细胞中，在用KPU-2、KPU-35和叔丁基苯基阿夕斯丁处理后对Caspase-3活性进行了监测。
结果表明，通过以与halimide类似的方式用所有三种化合物进行处理使caspase-3以剂量依赖的方式被活化。在所述Jurkat细胞系中，在与表示细胞毒性的IC50类似的浓度范围内发生所述caspase-3的活化(表16)。
表16.KPU-2、KPU-35和叔丁基苯基阿夕斯丁在Jurkat细胞中的细胞毒性
5).Jurkat细胞中的多(ADP核糖)聚合酶(PARP)降解
为了评估这些化合物在Jurkat细胞中诱导凋亡的能力，对多(ADP核糖)聚合酶(PARP)的降解进行了监测。PARP是116kDa的核蛋白，其为Caspase-3主要的细胞内靶标之一。PARP的降解产生稳定的89kDa产物，而这一过程可很容易地通过western印记(blotting)监测。PARP被caspase降解是细胞凋亡的标志之一，且其本身可作为这一过程的良好标志。将所述细胞暴露于所述化合物10小时后，100nM的KPU-2可在Jurkat细胞中诱导PARP的降解。KPU-2显示出比halimide或KPU-1更高的活性。
6).在HuVEC细胞中增强的血管渗透性
解聚微管的化合物(例如combretastatin A-4-磷酸酯，ZD6126)曾显示出可在体内诱导肿瘤内的血管萎缩。在血管萎缩前，迅速诱导血管细胞的渗透性(最初是对电解质之后迅速发展到大分子)。用HuVEC细胞对荧光标记的葡聚糖的渗透性的增强作为对血管萎缩的间接分析。
KPU-2、KPU-35和叔丁基苯基阿夕斯丁均迅速(1小时内)诱导明显的HuVEC单层渗透性，其程度与秋水仙碱类似。在本分析中微管稳定剂紫杉醇无活性(图12)。
7).大范围激酶筛查概况
最初，在一组60种不同激酶中以10μM的浓度对KPU-2进行筛查；ATP的浓度为10μM。在初级筛查中四种激酶被抑制超过50％，而次级筛查中确定的IC50值如表17所示。所有的IC50值均属于低微摩尔范围，表明对这些激酶的抑制与对肿瘤细胞毒性观察到的低纳摩尔活性无关。
表17.KPU-2抗所选激酶的活性
实施例9
体内药理学
在小鼠中，使用MX-1(乳房)和HT-29(克隆)异种移植物模型以及P-388小鼠白血病肿瘤模型对KPU-2进行了初步研究。根据活性，在所述体外肿瘤列表中选取的其它肿瘤模型是DU-145(前列腺)、MCF-7(乳房)和A549(肺)细胞系。还包括人胰腺肿瘤(MiaPaCa-2)。将所述新化合物作为单独治疗剂或与临床使用的化疗试剂组合进行研究。通过急性耐受性测试(最大耐受剂量，MTD)确定所选新化合物的剂量，且如果需要可在每一研究中进行调整。所述临床使用的化疗试剂的剂量是在以往研究的基础上选择的。
KPU-2是在这五个肿瘤模型中研究的第一个化合物。根据该研究的初步结果，将所有三种化合物在HT-29人克隆肿瘤、DU-145人前列腺和MCF-7人乳房肿瘤异种移植物模型中进行了比较。
上述模型均采用皮下异种移植物的移植技术，且潜在地受到化合物对皮下脉管系统的选择性作用的影响产生放大(或明显)的抗肿瘤活性。为了避免这种可能性，本研究中还采用了两种其它肿瘤模型。其中之一是在静脉内注射B16-F10小鼠黑瘤肿瘤细胞后观测肺的转移瘤。另一模型是在小鼠乳房的颊脂垫中移植MDA-231人乳房肿瘤细胞。尽管后一模型是异种移植物模型，所述皮下脉管系统并不起作用。
方法
1).异种移植物模型
使用的动物为(例外情况在各研究中声明)：5-6周龄(～20g，Harlan)的雌性裸鼠(nu/nu)；除非特别声明，组大小为每组9～10只小鼠。
肿瘤移植使用的细胞系为：HT-29人克隆肿瘤；MCF-7人乳房肿瘤；A549人非小细胞肺肿瘤；MiaPaCa-2人胰腺肿瘤；DU-145人前列腺肿瘤。
将所选新化合物作为单一治疗剂通过腹膜内途径以各研究给定的剂量进行给药；对于组合研究，在给药所述化合物前15～30分钟注射所选参考化疗试剂。
这些研究中使用的载体为：12.5％DMSO、5％Cremaphor和82.5％花生油用于所选新化合物；(1∶3)聚山梨醇酯80∶13％乙醇用于泰索帝；(1∶1)Cremaphor∶乙醇用于太平洋紫杉醇；对CPT-11每mL溶液含有20mg的盐酸依立替康、45mg山梨醇NF粉末和0.9mg乳酸，使用NaOH或HCl将其pH值调至7.4。用生理盐水稀释来得到所述参考化合物的注射浓度。
HT-29人克隆肿瘤模型
用套针将取自裸鼠宿主皮下生长的肿瘤的HT-29肿瘤碎片皮下(s.c.)移植入动物体中。当肿瘤尺寸达到5mm×5mm(约10-17天)时，将所述动物分入治疗组和对照组。从第一天开始，小鼠一周称重两次，且每周使用测径规(caliper)测量肿瘤尺寸两次。用公式(W2×L)/2将所述肿瘤尺寸转化为估计肿瘤的重量mg。当对照组的估计肿瘤重量平均值达到1000mg时，将小鼠称重、处死并切除肿瘤。将肿瘤称重并计算每组的平均肿瘤重量，并确定每组的肿瘤生长抑制率(TGI)(100％减去治疗组肿瘤平均重量的变化/对照组肿瘤平均重量的变化×100)。
除非对单独的研究有特别声明，在该模型中，将所选新化合物每三天一次进行腹膜内注射15天[第1、4、8、11和15天(q3dx5)]；在第1、8和15天(qwx3)将CPT-11腹膜内给药。
MF-7人乳房肿瘤模型
在皮下移植MCF-7肿瘤碎片(取自裸鼠宿主的皮下肿瘤)之前24小时，对雌性裸鼠(～20g)皮下移植21天释放雌激素(0.25mg)的药丸。然后按照HT-29模型中所述进行研究，使用泰索帝作为标准化疗试剂。
除非对单独的研究有特别声明，在该模型中，将新化合物在第1-5天通过腹膜内途径每日注射，包括(qdx5)；在第1、3和5天(qodx3)将泰索帝腹膜内给药。
A549人肺肿瘤模型
用套针将取自裸鼠宿主皮下生长的肿瘤的A549肿瘤碎片皮下移植入动物体中。当肿瘤尺寸达到5mm×5mm(约10-17天)时，将所述动物分入治疗组和对照组。研究的余下部分按照HT-29模型中所述进行，用泰索帝和CPT-11作为标准化疗试剂。
除非对单独的研究有特别声明，在该模型中，使用CPT-11组合以q3dx5剂量方案，或与泰索帝组合以qdx5剂量方案将所述测试化合物通过腹膜内途径给药；通过腹膜内途径以qwx3方案给药CPT-11；以qodx3剂量方案将泰索帝腹膜内给药。
MiaPaCa-2人胰腺肿瘤模型
用套针将取自裸鼠宿主皮下生长的肿瘤的MiaPaCa-2肿瘤碎片皮下移植入动物体中。当肿瘤尺寸达到5mm×5mm(约10-17天)时，将所述动物分入治疗组和对照组。研究的余下部分按照HT-29模型中所述进行，用吉西他滨(gemcitabine)作为标准化疗试剂。
除非对单独的研究有特别声明，在该模型中，将测试化合物在第1、4、7、10和15天(q3dx5)每三天一次通过腹膜内途径给药；在第1、4、7和10天(q3dx4)将吉西他滨通过腹膜内途径给药。
DU-145人前列腺肿瘤模型
用套针将取自裸鼠宿主皮下生长的肿瘤的DU-145肿瘤碎片皮下移植入雄性小鼠中。当肿瘤尺寸达到～5mm×5mm(约在13-17天)时，将所述动物分入治疗组和对照组。研究的余下部分按照HT-29模型中所述进行，用泰索帝作为标准化疗试剂。
除非对单独的研究有特别声明，在该模型中，将测试化合物在第1、3、5、8和11天(q3dx5)通过腹膜内途径给药；在第1、3和5天(q2dx3)将泰索帝腹膜内给药。
2).非皮下移植肿瘤模型
所用动物为：5-6周龄(～20g，Harlan)的雌性裸鼠(nu/nu)(MDA-231研究)或B6D2F1(B16-F10研究)小鼠；除非特别声明，组的大小为每组10只小鼠。
所用细胞系为：MDA-MB-231人乳房肿瘤和B16-F10小鼠黑瘤细胞。
将NPI化合物作为单一治疗剂通过腹膜内途径以各研究给定的剂量进行给药；对于组合研究，在将NPI化合物给药前15～30分钟注射所选参考化疗试剂。
MDA-231人乳房肿瘤
在雌性裸鼠的乳房颊脂垫中注射取自体外细胞培植的2×106MDA-231细胞。当肿瘤尺寸达到5mm×5mm(约14-28天)时，将所述动物分入治疗组和对照组。研究的余下部分按照HT-29模型中所述进行，用太平洋紫杉醇作为标准化疗试剂。
除非对单独的研究有特别声明，在该模型中，将测试化合物在第1、4、8、11和15天(q3dx5)通过腹膜内途径给药；在第1-5天(qdx5)将太平洋紫杉醇通过腹膜内途径给药。
B16-F10转移性小鼠黑瘤模型
在第0天小鼠通过iv途径接受B16-F10细胞(取自B16-F10细胞的体外细胞培养)。在第一天将小鼠随机分配到治疗组和对照组中，并开始治疗。从第一天开始，对小鼠每周称重两次。在第16天将所有小鼠处死，切除肺、称重并对表面克隆计数。结果表示为治疗组小鼠的平均克隆数/对照组小鼠的平均克隆数(T/C)×100％。转移生长抑制率(MGI)是从100％中扣除上述数值。本研究中使用的标准化疗试剂是太平洋紫杉醇。
除非对单独的研究有特别声明，在该模型中，将所述测试化合物在第1-5天(qdx5)通过腹膜内途径给药；在第1-5天(qdx5)将太平洋紫杉醇腹膜内给药。
适当时(n≥3)，结果表示为平均值±SEM。除非特别声明，使用ANOVA和Neuman-Keuls后检验(post test)对研究结果(用多组进行的研究)进行统计学分析。基于所述化合物或药物或所述组合可降低肿瘤生长这一假设，还使用了单尾t检验(one-tailed t-test)。
结果
在HT-29人克隆肿瘤异种皮抑制模型中的研究
1.KPU-2+/-CPT-11在HT-29人克隆肿瘤异种移植物模型中的体内评价
该研究在HT-29模型中对单独使用KPU-2或与相关化疗剂CPT-11结合使用时的剂量强度和剂量方案的变化进行了评估。
以每天一次7.5mg/kg ip共五天(qdx5)、一日两次3.75mg/kg ip共五天、每两天一次7.5mg/kg ip共10天(qodx5)及每三天一次7.5mg/kg ip共15天(q3dx5)的剂量将KPU-2给药。将CTP-11与NPI-2358结合以7.5mg/kg ip q3dx5的剂量给药可产生明显大于任一化合物单独使用时的效果，其在整个研究过程中都始终保持(图13)。本研究的活体部分得到的这些观测结果被尸检时的组平均最终肿瘤重量所证实，其中只有结合组与对照组相比表现出统计学显著的较低的肿瘤重量。此外，所述结合治疗组与CPT-11单独治疗组的平均肿瘤重量差异是统计学显著的(图14)。当尸检时对个体最终肿瘤重量进行检验后，可清楚看到组合治疗的更大的效果(图14)。组合治疗的TGI为78％而相对地单独CPT-11为38.9％。结合治疗组的TGI超过了阳性效果的NCI标准(58％)。
2.KPU-2+/-标准化疗剂对五种人肿瘤异种移植物模型的研究
本研究由五个部分组成，每部分有其各自的方案、时间安排、剂量方案和参考化合物。每一部分均应理解为包含在具体肿瘤模型的描述中。
本研究的HT-29部分的目的是研究在HT-29人克隆肿瘤异种移植物模型中使用与上述研究中所用剂量相比稍高剂量的KPU-2的效果，其中在KPU-2(7.5mg/kg ip q3dx5)和CPT-11(100mg/kg ip qwx3)之间观察到明显的协同作用。
如图15中所示，在该模型中KPU-2和CPT-11结合在抑制肿瘤生长时有明显的协同作用，此时在所述结合治疗组中在第29个治疗日肿瘤生长基本上被完全抑制了。结合治疗具有持续的效力，且该组中估计的肿瘤生长明显低于任一单一治疗组。因此，将KPU-2和CPT-11给药可抑制肿瘤生长，是有效的抗肿瘤疗法。
尸检时切除的肿瘤的重量测量值(图16)支持了本研究活体部分的观测结果(估计的肿瘤生长，图15)。结合组的肿瘤重量明显低于对照组(p＜0.01)，同样也明显低于单独使用CPT-11组的肿瘤重量(p＜0.05)。
当考虑到个体最终肿瘤重量时(图16)，结合组的肿瘤尺寸普遍小于其它治疗组或对照组。结合组的TGI为65.8％，根据NCI标准表现为阳性效果，而单独治疗没有达到TGI＞58％的NCI标准。
3.对HT-29人克隆肿瘤异种移植物研究中的KPU-2、KPU-35和叔丁基苯基阿夕斯丁的活性的研究
本研究的结果如图17和表18所示。结合治疗组的所述新化合物与CPT-11之间均表现出明显的协同作用。个体肿瘤重量证明了结合治疗的有效性(图18)。每种情况下，结合组的TGI均超过了阳性效果的NCI标准，而CPT-11单独治疗的TGI没有达到这种水平。
表18.在HT-29人克隆肿瘤模型中进行的研究的总结
*p＜0.05vs对照；**p＜0.01vs对照；#p＜0.05vs CPT-11单独；##p＜0.01vs CPT-11单独；+＝死亡数目
4.KPU-2、KPU-35和叔丁基苯基阿夕斯丁与CPT-11结合在HT-29人克隆肿瘤异种移植物模型中的作用的总结
当与CPT-11结合时，KPU-2把CPT-11(标准的化疗试剂)的作用增强到远超TGI≥58％的阳性效果NGI标准的水平。上述三项研究所得的结果在活体观测结果(图19)和尸检切除的肿瘤的重量(图20)方面都基本相当。
在DU-145人前列腺肿瘤异种移植物模型中的研究
用此模型完成了两项研究：第一项研究包括单独使用KPU-2以及将其与泰索帝结合使用；第二项研究将单独使用KPU-2、KPU-35和叔丁基苯基阿夕斯丁与结合使用泰索帝进行比较。
1.KPU-2与泰索帝结合在DU-145人前列腺肿瘤异种移植物模型中的作用
从本研究活体部分所得的数据(图21)中可发现，对DU-145人前列腺肿瘤最有效的治疗方法是将KPU-2和泰索帝结合进行治疗。在本研究的开始阶段所述治疗的效果最为显著，但随着研究的进行不断降低。从治疗的第20-27天，所述结合治疗确实显示出超过NCI标准(TGI≥58％)的明显的TGI，而所述结合治疗的估计肿瘤重量也明显低于各单独治疗方法。
2.单独的KPU-2、KPU-35和叔丁基苯基阿夕斯丁或其与泰索帝结合在DU-145人前列腺异种移植物模型中的活性
以上述研究中由KPU-2与泰索帝结合而获得的数据为基础，开展了第二项研究，该研究比较了单独使用KPU-2、KPU-35和叔丁基苯基阿夕斯丁与结合使用泰索帝的差异。
本研究活体部分的观测结果表明无论是KPU-2还是KUP-35，其与泰索帝结合对肿瘤生长的降低作用都远大于单独使用泰索帝(图22)。KPU-35与泰索帝结合基本上完全阻碍了所述肿瘤的生长。
尸检时切除的肿瘤重量证实了本研究活体阶段的观测结果。将KPU-2(图23)或KPU-35(图24)与泰索帝结合在阻碍肿瘤生长时都明显比单独使用泰索帝有效。在使用KPU-35时，十只小鼠中的三只显示出肿瘤萎缩的迹象。肿瘤生长抑制指标显示KPU-2具有显著的肿瘤生长抑制作用(组平均＝74.1％)，而KPU-35则基本上完全阻碍了肿瘤生长(组平均＝92.5％)。单独的泰索帝则没有达到NCI建立的阳性作用标准(TGA≥58％)。
5.在MCF-7人乳房肿瘤异种移植物模型中的研究
本研究比较了KPU-2、KPU-35和叔丁基苯基阿夕斯丁在MCF-7人乳房肿瘤异种移植物模型中的作用。在第1、2、3、4和7天以给定剂量将所述化合物给药；在第1、3和7天将泰索帝给药。
在本模型中，当所选化合物与泰索帝结合使用时具有起效早的、统计学显著的作用，明显基本上完全阻碍了所估计的肿瘤生长(图25)。在上述三种化合物中，KPU-2显示为最有效，而叔丁基苯基阿夕斯丁也显示出明显强过泰索帝的作用。
6.在A549人非小细胞肺肿瘤异种移植物模型中的研究
本研究活体阶段的观测结果(图26)表明，与对照组和任一单一治疗组相比，KPU-2(7.5mg/kg ip，qdx5)与泰索帝的结合使用对肿瘤生长产生了显著的抑制。尸检得到的肿瘤重量证实了上述结果，其中结合治疗组的平均值明显小于单独使用泰索帝的组或对照组的平均值(图27)。所述结合治疗组的肿瘤重量值形成一组低肿瘤重量，表明所述作用的持续性。
当计算肿瘤生长指标时，与对照组相比所述结合治疗组具有74.4％的TGI，远超过阳性作用的NCI标准(TGI≥58％)。单独使用泰索帝具有26.1％的TGI。
7.在MDA-231人乳房肿瘤同位(orthotopic)异种移植物模型中的研究
该模型包括将人肿瘤组织植入小鼠乳房颊脂垫(天然环境的替代者)中。通过这种方式避免了由对皮下血管组织的特异作用而产生的阳性作用。本研究将单独使用KPU-2(7.5mg/kg ip，q3dx5)的作用与结合使用太平洋紫杉醇(16mg/kg ip，qdx5)的作用进行了对比。
本研究进行三周时，在结合治疗组中对肿瘤生长存在显著的抑制(非常明显的作用)。这种作用与单独使用泰索帝相比明显得多(图28)。
8.在小鼠黑瘤B16 F10转移性肿瘤模型中的研究
本研究检验了将B16F 10黑瘤细胞静脉注射入小鼠16天后，单独使用KPU-2、KPU-35和叔丁基苯基阿夕斯丁与结合使用太平洋紫杉醇对肺表面出现的转移瘤数目的作用。该模型不是异种移植物模型；然而其没有在所述肿瘤块中进行高度血管化。
在该模型中，最有效的治疗方法是单独使用KPU-2(图29)，其平均转移瘤数目约比单独使用太平洋紫杉醇少10％(MGI分别为41.6％和35.0％)。尽管本研究本身不能说明结合治疗比单一治疗更有效，其确实表明KPU-2、KPU-35和叔丁基苯基阿夕斯丁在高度血管化的肿瘤中最有效。
实施例10
对抗病原体真菌活性的分析
直接对真菌生物体测量(例如通过Diagn Micro and Infect Diseases21：129-133(1995)中所述NCCLS肉汤大量稀释(macrodilution)法的微滴定板适应作用)脱氢苯基阿夕斯丁或其类似物相对上述已知抗真菌化合物的抗病原体真菌相对活性，将其用于测定所述脱氢苯基阿夕斯丁或其类似物的AF/IS值。也可在真菌感染的全动物模型中测定抗真菌活性。例如，可使用类固醇治疗的肺毛霉菌病小鼠模型(Goldaill，L.Z. & Sugar，A.M.1994 J Antimicrob Chemother 33：369-372)。在这类研究中以说明的方式，在用真菌感染之前、当时或随后开始对大量动物分别给药无脱氢苯基阿夕斯丁或其类似物、各种剂量的脱氢苯基阿夕斯丁或其类似物(和/或结合一种或多种其它抗真菌剂)、或阳性对照(例如两性霉素B)。可每24小时一次，用所选剂量的脱氢苯基阿夕斯丁或其类似物、阳性对照或仅用载体对动物进行治疗。持续治疗预定的天数(如多达10天)。治疗阶段后对动物进行一段时间的观测(例如总共3周)，每天评估死亡率。模型可采用为模拟怀疑被感染的人类个体而设计的，包含或不包含其它治疗(例如用类固醇治疗)的，全身感染、肺感染、阴道感染和其它感染模型。
为了进一步说明，一种用于测定体内治疗效果(ED50，例如表示为mg脱氢苯基阿夕斯丁或其类似物/kg个体)的方法是啮齿动物模型系统。例如，用病原体真菌对小鼠进行感染，例如以约10倍于50％致死剂量的病原体(106C.albicans细胞/小鼠)对通过静脉内注射进行感染。真菌感染后立刻将脱氢苯基阿夕斯丁化合物以预定的剂量对小鼠给药。通过Van derWaerden(Arch Exp Pathol Pharmakol 195：389-412，1940)方法从感染后第20天记录的存活率计算所述ED50值。通常，未治疗的动物在感染后7-13天死亡。
在另一说明性的实施方案中，将在Sabouraud(萨布罗氏)葡萄糖琼脂(SDA)斜面培养(slant)上于28℃生长48h的C.albicans Wisconsin(C43)和C.tropicalis(C112)悬浮在盐水中，并在分光光度计上将550nm处的透过率调节至46％。将所述接种物用血细胞计数器进一步调节并用平板计数器确认达到约1或5×107CFU/ml。通过将1或5×106CFU注射入其尾部血管对CF-1小鼠进行感染。感染后4h及其后3或4天每天一次，将溶于乙醇∶水(10∶90)的抗真菌剂进行静脉内或皮下给药。每天监测存活量。ED50定义为使50％小鼠存活的剂量。
实施例11
评估Antimicotic(抗霉菌)活性
苯并咪唑和灰黄霉素是可与真菌微管结合的抗微管素试剂。一旦结合，这些化合物阻碍敏感生物体的细胞分裂和细胞内运输，导致细胞死亡。商业上，将苯并咪唑用作兽医药物和作物疾病控制中的杀真菌剂。大量真菌物种，包括灰霉(Botrytis cinerea)、白僵菌(Beauveria bassiana)、马铃薯病原菌长孺孢(Helminthosporium solani)、酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)和曲霉属都对这些分子敏感。然而，毒性问题和耐药性上升对其应用造成了负面影响。灰黄霉素在临床上用于治疗由毛癣菌属、小孢子菌属和絮状表皮癣菌(Epidermophyton floccosum)引起的皮肤、头发和指甲的癣感染。然而其抗真菌范围也局限于这类真菌生物。基因毒性也是一个重要的副作用。而另一可选择的一线治疗(first-line treatment)特比萘芬(Terbinafine)则较昂贵。此外，近来在红色毛癣菌(所有皮真菌感染的主要病原体)中观察到临床抗性。
在白色念珠菌中，当细胞暴露于微管抑制剂诺考达唑(nocodazole)和氯苯胺灵(chloropropham)时，微管/微丝形成受到影响。这些结果进一步证实可将细胞支架抑制剂作为有效的抗霉菌试剂。因此，评估了几种本文公开的化合物的抗霉菌活性。
特别地，将公开的化合物与商业销售的微管抑制剂以及公认的抗真菌剂放在一起进行评价。本研究中所用的测试化合物和对照为：(-)-苯基阿夕斯丁、KPU-1、KPU-2、KPU-11和KPU-17、KPU-35、叔丁基苯基阿夕斯丁、秋水仙碱(针对3种念珠菌分离株(isolates)测试的商业销售的微管抑制剂)、苯菌灵(Benomyl)(针对3种念珠菌分离株测试的商业销售的微管抑制剂)、灰黄霉素(用于针对6种皮真菌分离株测试的商业销售的微管抑制剂和抗生素对照)、两性霉素B(用于针对3种念珠菌分离株测试的抗生素对照)、伊曲康唑(用于针对2种Aspergillus分离株测试的抗生素对照)。
用于测试这些化合物的微生物包括：白色念珠菌、光滑念珠菌、烟曲霉、红色毛癣菌、须毛癣菌(Trichophyton mentagrophytes)、絮状表皮癣菌。除光滑念珠菌(一分离株)外，每一物种使用两种分离株进行测试。
根据美国临床实验室标准化委员会(National Committee for ClinicalLaboratoryStandards)提供的方法(M38-A“Reference Method for BrothDilution Antifungal Susceptibility Testing of Conidium-Forming FilamentousFungi；Approved Standard”)完成了抗真菌敏感性测试。其包括在含谷酰胺且不含碳酸氢盐的RPMI-1640中、0.4-5×104的接种体尺寸及30或35℃孵育48小时的条件下进行测试。最低抑制浓度(MIC)定义为与无药物对照管(tube)相比，可使浑浊度降低80％的最低浓度。对所研究的化合物药物浓度为0.03-16μg/ml，对伊曲康唑和灰黄霉素为0.015-8μg/ml。
根据NCCLS方案的修改版估计了最低抑制浓度(MIC)，在该浓度时化合物可阻止目标微生物的生长。当可在无药物对照管中测得生长时，间隔第一个24小时后测定最小抑制浓度(MIC)。所述MIC定义为与生长对照相比显示出浑浊度降低80％的最低浓度。通过从所述MIC浓度和每一高于所述MIC的浓度plating 0.1μl来确定最低致死浓度(MLC)。将第一个显示出5个或更少真菌克隆生长(代表99.95％的杀灭率)的浓度称为MLC。当得到MIC时，确定最低杀真菌浓度(MFC)以估计所述化合物的真菌抑制/杀真菌性能。这一过程需要将药物治疗的细胞样本(取自含有等于或高于所述MIC的化合物的测试孔)稀释到化合物浓度明显低于所述抑制浓度，并将它们放置在琼脂板上。如果所述细胞能够继续生长，则将所述化合物记为真菌抑制，而如果不存在重新生长，则记为杀真菌(因为所述化合物已经将微生物杀死了)。
本文公开的化合物显示出对两种毛癣菌属物种有效。红色毛癣菌是人皮真菌感染的主要病原体，且是开发临床试剂的关键目标微生物。
KPU-2、KPU-11和KPU-17、KPU-35 &叔丁基苯基阿夕斯丁在效力上相当，在某些情况下效力高于灰黄霉素(当前用于治疗皮真菌感染的标准药物试剂)。
当针对红色毛癣菌进行测试时，化合物(-)-苯基阿夕斯丁和KPU-1效力明显低于其它化合物，而针对敏感的须毛癣菌分离株时效力虽然较弱但更接近了。
在那些例子中，当可测定MFC时，结果表明这些化合物具有抑制真菌的特性(参见表19和20)。
表19.脱氢苯基阿夕斯丁及其类似物的抗真菌活性
表20.脱氢苯基阿夕斯丁及其类似物的抗真菌活性
实施例12
血管靶向活性评价
可用本发明公开的化合物治疗肿瘤和肿瘤性疾病状态。用血管靶向试剂(VTAs)闭塞肿瘤中的血液供给，诱导了该肿瘤的退化。本发明公开的化合物(包括NPU-02和KPU-35)，例如可作为VTAs。众多VTAs通过与微管上的秋水仙碱结合位点相互作用而显示其血管作用。该相互作用诱导了该肿瘤中已建立的脉管系统的特征性快速萎缩和闭塞，因此损害了现有血管的完整性，从而导致坏死。
例如，暴露于VTA 30-60分钟内，可发生血管萎缩，并涉及肿瘤中央部分中的未成熟和增殖的，而不是静止和成熟的内皮细胞的形状改变。由于相对于正常血管，在肿瘤血管中存在着较高百分比的增殖的未成熟内皮细胞，所以这种对血管细胞的差别作用为对肿瘤的选择性作用提供了理论基础。可将VTAs分为三种重叠的活性范围：(1)有效的血管和细胞毒性作用，(2)具有微弱细胞毒性作用的有效血管作用，以及(3)具有微弱血管作用的有效细胞毒性作用。
KPU-02和KPU-35在体内的血管靶向活性
对于研究抑制肿瘤诱发血管生成、靶向已建立的肿瘤脉管系统以及抑制肿瘤生长的新疗法，动物模型是必要的。
鼠同基因的“假同位的”乳腺癌模型用于研究这些问题。Torres Filho等人，Microvascular Research(1995)49，212-226，在此将其全部内容引入作为参考。为了创造“假同位环境”，除去背部的皮瓣室(skinflap chamber)的盖玻片，并将来自供体小鼠的小块乳房颊脂垫移植入该室内。在颊脂垫移植物的上部，应用肿瘤球状物，该肿瘤球状物包含用组蛋白(H2B)-绿色荧光蛋白(GFP)转导的N202乳房肿瘤细胞。H2B-GFP转导的细胞的应用允许观测肿瘤生长并监测有丝分裂和细胞凋亡。
荧光视频显微镜技术允许对有意识的小鼠中的肿瘤微循环进行相对的非侵入性研究。该模型可提供关于化合物对肿瘤脉管系统、肿瘤生长、有丝分裂和细胞凋亡的作用的数据，该模型用于检测化合物单独的或者与其它治疗剂结合的活性。利用此模型，在单次静脉注射给药后，KPU-02和KPU-35显示了诱导快速的血管萎缩，这导致中心坏死，以及已建立的肿瘤的退化。
在肿瘤生长第12天时，用5mg/kg的KPU-35静脉输注2分钟，用10mg/kg的KPU-02静脉输注5分钟，或载体团注(水中含有10％solutol(w/w)+2％DMSO)处理小鼠。在第13天时，用10mg/kg的KPU-02、KPU-35或载体输注给药5分钟。KPU-02或KPU-35的处理被良好耐受。另外观察小鼠两天。观测肿瘤内的及肿瘤周围的肿瘤面积、血流速率和血管密度。用静态图片和视频显微镜技术在多个时间点上记录实时观察资料。
该研究证实在单次KPU-02或KPU-35静脉注射处理后，中心脉管系统迅速萎缩。血管功能的改变导致显著的中心肿瘤坏死，而未观察到对颊脂垫或皮肤周围的脉管系统的作用(图30)。这些观察支持了KPU-02和KPU-35的选择性和特异性，KPU-02和KPU-35均可单独地破坏已建立的肿瘤脉管系统。
KPU-02在人肿瘤异种移植物中的体内活性
当KPU-02与CPT-11(依立替康)、泰索帝或太平洋紫杉醇给药时，在人结肠肿瘤(HT-29)、乳腺肿瘤(MCF-7；MDA-MB231)和肺肿瘤(A549)的肿瘤异种移植物模型中，看到显著的抗肿瘤活性(表21)。在三次研究中，KPU-02在该HT-29模型中的作用是强烈的、可重现的，并显示剂量依赖性效应，即7.5mg/kg在统计学上高于2.5mg/kg(图32，33)。
KPU-02和KPU-35在HuVEC细胞中的体外活性
上述的KPU-02和KPU-35对肿瘤脉管系统的体内作用由相同化合物在HuVEC细胞中的体外作用所支持。人脐静脉内皮细胞被认为是良好的肿瘤内皮的体外模型，被认为是“未成熟的”。肿瘤内皮缺乏支持的血管壁细胞以及格外依赖于整合肿瘤脉管系统的微管网。因此，肿瘤微管网的破坏引起血管萎缩。
KPU-02在HuVEC细胞中诱导快速的微管素解聚
将人脐静脉内皮细胞(HuVECs；Cambrex CC2519A)以亚融合密度维持在EGM-2(Cambrex)培养基中。将该细胞在37℃、5％CO2和95％潮湿空气的培养箱中培养。对于微管素染色分析，将HuVEC细胞以EGM-2中3×104细胞/孔的密度接种在组织培养相容的盖玻片(Fisher)上。将该板放回该培养箱中2天。
在100％DMSO中配制测试化合物的储备溶液。在100％DMSO中配制所述化合物的400X浓缩的稀释液。将5μl容积的该稀释液加入各个孔中，得到200nM的终浓度。在所有的样品中DMSO的终浓度为0.25％。将所述培养板放回所述培养箱中30分钟。用200nM的KPU-02或KPU-35处理HuVEC细胞30分钟。
在室温下，在10％(v/v)中性缓冲的甲醛中固定10分钟之前，所述细胞在dPBS中冲洗。固定后，通过间接免疫荧光法观测α-微管素。具体地，将所述细胞在0.2％(v/v)triton X-100/dPBS中通透化处理10分钟。在将所述盖玻片转移至潮湿的室之前，洗涤该细胞，该盖玻片在抗体缓冲液(2％(w/v)BSA/0.1％(v/v)Tween20/dPBS)中封闭2小时。在洗涤及在黑暗中用50μl的1μg/ml山羊抗鼠FITC(Jackson免疫研究实验室)孵育1小时之前，所述盖玻片用50μl的抗体缓冲液中的0.1μg/ml鼠α-微管素(Molecular Probes)进行孵育。最后，在H2O中冲洗并用Vectashield(VectorLabs)封固剂封固前，洗涤所述细胞，并用2μg/ml DAPI(Molecular Probes)处理10分钟。在立式显微镜(Olympus BX51)上，用60x油浸物镜将该细胞显像。用CCD照相机和Magnafire 2.0软件(Olympus)数字化捕捉该图像。在Photoshop Elements 2.0(Adobe)和Microsoft Powerpoint中进行图像后处理。
图33显示KPU-02和KPU-35在HuVEC细胞中快速诱导微管素解聚。
KPU-02在HuVEC细胞中诱导剂量依赖性单层渗透性
将人脐静脉内皮细胞(HuVECs；Cambrex CC2519A)以亚融合密度维持在EGM-2(Cambrex)培养基中。将该细胞在37℃、5％CO2和95％潮湿空气的培养箱中培养。对于单层渗透性分析，将HuVEC细胞以1×105细胞/ml的密度接种在24孔板中的纤连蛋白包被的3.0μm Fluoroblok嵌入物(Becton Dickinson)上的EGM-2培养基中。将该培养板放回所述培养箱中4天以允许该细胞达到融合。
在100％DMSO中制备测试化合物的储备溶液。在EGM-2中制备所述化合物的10X浓缩的系列稀释液。将10μl容积的该系列稀释液加入双份的测试嵌入物中，获得2μM-2nM的终浓度。在所有样品中DMSO的终浓度为0.25％。用2nM-2μM的KPU-02处理所述细胞15分钟。
将dPBS(38.2kDa；Sigma)中的FITC-Dextran(异硫氰酸荧光素-葡聚糖)(50mg/ml)在EGM-2中稀释2.5倍，将10μl的FITC-Dextran加入每嵌入物中。FITC-Dextran的终浓度为1mg/ml。将所述板放回所述培养箱中，30分钟后，用具有λex＝485nm和λcm＝530nm的过滤器的Fusion荧光计(Packard Bioscience)测量所述24孔板中的较低室的荧光。
图34显示了KPU-02能够以剂量依赖性方式诱导单层渗透性。图34中显示的结果表示三次独立实验的平均值±S.D.。
具有125I-IAP的P22大鼠肉瘤模型中的血流量
在具有P22大鼠肉瘤的大鼠中，用定量125I-碘安替比林(IAP)技术评定模型中的肿瘤血流量。在给药后1小时时，KPU-02(15mg/kg，IP)显著地并且选择性地将肿瘤血流量减少至载体给药的23％；24小时后血流量仍保持显著减少(为载体给药的59％)。相反，在1小时时，非肿瘤组织中的血流量以小得多的程度影响被影响(见图35)。
如图36所示，与载体相比，对于KPU-02，在给药后24小时时血流量的减少在组织间是可变的。到肿瘤的血流量是最受影响的。其它组织显示较小的血流量减少。在给药后24小时时，骨骼肌的血流量出现增加。
与先前所报导的采用同一技术的CA4P相比，在1小时时观察的KPU-02的作用显示了对于肿瘤血流量的更长的持续性和更大的选择性。
在采用P22大鼠肉瘤模型的实验中，如图37所示，在给药后24小时，7.5和15mg/kg IP(n＝2每剂量)给药的KPU-02产生了剂量依赖性肿瘤坏死，最高的剂量导致肿瘤几乎全部坏死。在所述KPU-02处理的大鼠中，所有的肿瘤显示坏死的迹象，然而在载体处理的大鼠中肿瘤未显示该迹象。进入临床的VTAs(例如CA4P、ZD6126、AVE8062)显示了相似的对肿瘤血液的定性作用，其中采用IAP方法学(或相似的技术)证实了P22大鼠肉瘤肿瘤中血流量的减少，采用dce-MRI技术证实了人体内血流量的减少。参见Stevenson JP，Rosen M，Sun W，Gallagher M，Haller DG，Vaughn D，等人，″“Phase I trial of the antivascular agent combretastatin A4phosphate on a 5-day schedule to patients with cancer：magnetic resonanceimaging evidence for altered tumor blood flow，″(抗血管剂磷酸考布他汀A4对患有癌症患者的5天时间的I期试验：改变的肿瘤血流量的核磁共振图像学证据)J Clin Oncol 2003；21(23)：4428-38；Evelhoch JL，LoRusso PM，He Z，DelProposto Z，Polin L，Corbett TH，等人，″Magneticresonanceimaging measurements of the response of murine and humantumors to the vascular-targeting agentZD6126，(核磁共振图像学测定鼠的和人的肿瘤对血管靶向试剂ZD6126的反应)″Clin Cancer Res 2004；10(11)：3650-7；and Gadgeel SM，LoRusso PM，Wozniak AJ，Wheeler C.″Adose-escalation study of the novel vascular-targeting agent，ZD6126，inpatients with solid tumors，″(在患有实体瘤的患者中，新的血管靶向试剂ZD6126的剂量-增加性研究)Proc Am Soc Clin Oncol 2002；21：abstract438；在此将每一个的全部内容引入作为参考。
与微管靶向试剂的联合治疗
研究者发现相对于外周部分，VTAs选择性地损伤在肿瘤中央部分中的脉管系统，这恢复了功能性，该发现支持了将这些试剂与化学疗法(紫杉醇、长春碱和顺铂)、放射和直接针对VEGF和EGF的血管生成抑制剂联合应用。新VTAs是补充而不是替代这些疗法，并提供更大的抗肿瘤活性。
其它疾病状态的治疗
除了癌以外，还可用本发明公开的VTAs治疗其它疾病。疾病状态包括其它的赘生物、视网膜病和任何其它的依赖于血液供给，优选为依赖于来自新脉管系统的血液供给以便保持存活和/或增殖的疾病状态或疾病。
许多疾病状态与过多的或不适当的脉管系统相关。与过多的脉管系统相关的疾病状态的例子包括炎症性疾病，例如免疫和非免疫性炎症、类风湿性关节炎、慢性关节风湿病和牛皮癣；与不适当的或不合适的血管入侵相关的病症例如为糖尿病性视网膜病、新生血管性青光眼、早产儿视网膜病、黄斑变性、角膜移植排斥、晶状体后纤维组织增生症、虹膜发红、动脉粥样硬化斑块中的毛细血管增生和骨质疏松症；以及与癌相关的病症，例如包括实体瘤、瘤转移、如白血病的血源性肿瘤、血管纤维瘤、卡波西肉瘤、如血管瘤的良性肿瘤、听神经瘤、神经纤维瘤、沙眼和脓性肉芽肿，以及其它需要血管化作用以维持肿瘤生长的癌。脉管系统-依赖性疾病的另外例子包括，例如，Osler-Webber综合征；心肌的血管发生；斑点性新血管形成；毛细血管扩张；血友病性关节和伤口肉芽形成。此外，过多的脉管系统作为部分生物学和机械移植物(组织/器官移植物、支架等等)，也与临床问题相关。本发明所述化合物和组合物可用于靶向脉管系统，相对于非疾病组织的脉管系统，优选地优先靶向疾病组织的脉管系统，因此所述化合物和组合物可用于治疗这种疾病状态。其中血管化起作用并且可采用本发明所述化合物和组合物的其它疾病为本领域技术人员所公知。
视网膜病的例子包括与年龄相关的黄斑变性(ARMD)、糖尿病性视网膜病等等。病理性血管发生是产生众多视网膜疾病的主要因素，该众多的视网膜疾病合起来是发达国家中失明的主要因素。Kahn和Hiller Am JOphthalmol(1974)78，58-67，在此将其全文引入作为参考。例如，在30-50％的患有超过20年糖尿病性视网膜病的患者中发生视网膜新生血管形成和视盘新生血管形成。Yanko等人Retina(2003)23，518-522，在此将其全文引入作为参考。此外，在约10％的患有黄斑变性的患者中，视网膜下新生血管形成是严重的并发症。Ferris等人，Arch Ophthalmol(1984)，102，1640-1642，在此将其全文引入作为参考。
诸如考布他汀A-4(CA-4)的血管靶向试剂显示了引起非肿瘤性组织中的新血管破坏。Griggs等人，Br J Cancer(2001)84，832-835，在此将其全文引入作为参考。另外，CA-4P显示了抑制在增殖性视网膜病过程中发生的视网膜新生血管形成。Griggs等人，Am J Path(2002)160，1097-1103，在此将其全文引入作为参考。最后，磷酸CA-4P显示了抑制VEGF诱导的视网膜新生血管形成的发展并抑制脉络膜新生血管的发展和/或引起脉络膜新生血管的部分消退。Nambu等人InvestOphthalmology & Visual Sci(2003)44，3650-3655，在此将其全文引入作为参考。本发明公开的化合物可用于治疗视网膜病。例如，Griggs(2001和2002)和Nambu的方法学用于治疗视网膜病。此外，本发明公开的化合物和组合物可通过以治疗有效量的化合物和/或组合物应用于靶区域来减少血管密度和/或血管增生，用于治疗这种视网膜病。
表21 KPU-02与化学治疗剂联合时在人的肿瘤异种移植物模型中的作用
实施例13
结构-活性关系
图38中所述数据显示了来自于叔丁基-脱氢PLH的苯环上的多种修饰的活性结果。显而易见的是在间位或邻位的相对疏水的及较小功能基的取代增加或维持了在HY-29细胞中的细胞毒素活性，而在对位的取代降低了活性。不被任何特定理论所束缚，此数据表明了微管素对苯环的严格识别。
3D-QSAR(CoMFA)分析(见图39)也支持了在间位和邻位存在立体有利区域，以及在对位存在立体不利区域。X-射线晶体分析(见图40)指出有效的衍生物的构象需要在苯环和由DKP和咪唑环组成的假三环模板(pseudo-tricyclic cor template)之间具有一定大小的二面角。因此，利用恰当的苯环构象限制性进行的修饰可能产生有效的活性。不被任何特定理论所束缚，PLH衍生物在微管素的秋水仙碱结合位点的结合模式不同于秋水仙碱及其已知类似物。
实施例14
在体外对微管的作用
微管蛋白和微管素的纯化
如前所述制备微管蛋白(MTP)(参见Farrell KW和Wilson L.(1987)Tubulin-colchicine complexes differentially poison opposite microtubuleends(微管素-秋水仙碱复合物差异性地损害相对的微管末端).Biochemistry 23(16)：3741-8，在此将其全文引入作为参考)。通过在PEM100(100mM 1-4哌嗪二乙磺酸(Pipes)，1mM MgSO4，1mM EGTA，pH 6.8)和1mM GTP中进行三次的热聚合和冷解聚循环，从牛脑中分离出由70％的微管素和30％的微管相关蛋白(MAPs)组成的MTP制剂。MTP在液氮中滴-冻且在-70℃中保存直至使用。通过磷酸纤维素色谱(PC-微管素)从微管蛋白中纯化微管素，并在PEM50中保存(50mM Pipes，1mMMgSO4，1mM EGTA，pH 6.8)。应用牛血清蛋白作为标准品(Bradford，1976)，通过Bradford分析(Sigma Chemicals，St.Louis，MO)确定蛋白浓度。
测试试剂
在DMSO中以20mM的浓度制备KPU-02的储备溶液。在DMSO中以5mM的浓度制备考不他汀A4(National Cancer Institute(国立癌症研究所)，Bethesda，MD)(CA4)的储备溶液。在水中以3mM的浓度制备秋水仙碱(Sigma Chemicals，St.Louis，MO)(CLC)的储备溶液。所有试剂用琥珀色的Eppendorf管隔离环境光。在DMSO中和/或PEM50中进行系列稀释，制成所需要的浓度。
稳态的微管聚合体质量的确定
在含有1mM GTP和DMSO终浓度为0.5％的PEM100中存在一系列浓度的药物时，将MTP(2mg/ml)聚合成微管。在37℃下，在350nm用光散射监测样品75分钟。
将聚合反应离心，上清液中的微管蛋白浓度、在稳态时可溶性微管素的测定，以及沉淀物，微管聚合体的测定，用于计算对聚合的抑制作用。孵育后，通过离心从未聚合的MTP中分离并沉淀聚合的微管(150,000xg，45分钟，37℃)。除去上清液，在经由Bradford分析进行蛋白质测定前，在去离子H2O中将所述微管沉淀物解聚(24小时，0℃)。
用两种方法计算抑制百分比，并将得自该两种方法的数值进行比较。在一种方法中，计算含药物时所述沉淀物中的微管蛋白对不含药物时所述沉淀物中的微管蛋白的比例。在另一方法中，还计算含药物时所述沉淀物中的微管蛋白对所述上清液中的微管蛋白的比对不含药物时所述沉淀物中的微管蛋白对所述上清液中的微管蛋白的比的比例。所述数值是接近一致的，因为前面的值具有较少的差异和实验性干扰，所以使用前面的值。
微管的平均长度分布
透射电子显微镜技术用于确定在不存在或存在测试试剂时微管的平均长度分布。在75分钟时和沉淀之前，通过将来自所述聚合体质量实验的10μl等份稀释在290μl的PEM-100缓冲的0.2％戊二醛中来将其固定。将30微升的固定样品在聚乙烯醇缩甲醛包被的150ICG目电子显微镜栅格上放置90秒。过多的样品用Whatman滤纸吸走。应用30微升的细胞色素C(1mg/ml)30秒以加强原丝溶解并使负染色法容易进行。应用醋酸双氧铀(1.5％)20秒，并吸走过多的部分。在Jeol电子显微镜-1200EX11中，在2000X和30,000X放大倍率时观察栅格。Zeiss MOPIII用于确定每个样品中至少100个微管的微管长度分布和平均长度。
CLC竞争性分析
在37℃下，在PEM50中用1mM GTP、1％DMSO、10μM测试试剂和7-25μM[3H]CLC孵育PC-微管素(0.2mg/ml)120分钟。测定[3H]CLC结合，随后进行如先前描述的DEAE纤维素过滤结合分析(Wilson，1970)。此方法依赖于微管素对用DEAE纤维素浸渍的滤纸的吸附。在上样之前，Whatman DE81滤纸用PEM50预湿润。将总的100μl的反应容积应用于在冰上的石蜡膜上的2.5cm滤纸盘。在4℃下，该滤纸盘以每次洗涤5分钟的速度，通过浸入5次连续更换的50ml PEM50中来进行洗涤，以除去所有的未结合的秋水仙碱。然后，在含2ml Beckman Coulter ReadyProtein溶液(Fullerton，CA)的闪烁瓶中直接计数所述带有附着的微管素结合的秋水仙碱的滤纸盘。将全部的滤纸盘一同洗涤。在对照中出现的未结合的CLC对该滤纸盘的结合可忽略，无论在存在或不存在微管素时。
在Microsoft Excel中通过所述实验数据的双倒数图的线性回归计算Ki值。利用x截距等于-1/Km，首先确定在实验条件下微管素对CLC的Km值。用实验方法确定在药物存在下的Km app、Km。用Km app＝αKm的关系及竞争性抑制α＝Km(1+[I]/Ki)确定Ki。
荧光光谱学
用Perkin-Elmer LS50B荧光分光光度计进行荧光测量。在PEM50、2mM GTP、3％DMSO、和0-30μM KPU-02中孵育PC-微管素(0.2mg/ml)。利用395nm的激发波长和487nm的发射波长，由4，4′-二苯胺基-1，1′-二萘基-5，5′-二磺酸，二钾盐(bis-ANS；Molecular Probes，Eugene，OR)荧光报告KPU-02与微管素的相互作用。激发和发射带通(band passes)为10nm。进行两次该实验。
所述bis-ANS荧光基团探测蛋白的疏水表面，并且该bis-ANS荧光信号的强度变化是该蛋白的溶剂可及的表面面积变化的结果。如果在配体结合时存在着一些构象变化，该构象变化改变该微管素-双-ANS的相互作用，则bis-ANS可用于报告结合。
在25℃时，用0-30μM的KPU-02孵育PC-微管素(0.2mg/ml)20分钟。然后加入bis-ANS(25μM)，并于25℃，在15分钟内测量样品的相对荧光强度。收集缓冲液空白谱(Buffer blank spectra)，并显示出KPU-02加bis-ANS在所述实验的波长范围内产生了可忽略的荧光。
通过将实验数据输入Sigmaplot和Microsoft Excel中并采用方程式F＝((-Fmax×L)/(Kd+L))+F0来确定Kd，其中F是在总的配体浓度L的存在下的bis-ANS-微管素的荧光强度，Fmax是完全配位的微管素的bis-ANS荧光强度，以及F0是不存在药物的条件下的bis-ANS荧光。通过将1/(F0-F)对1/L绘图并外推至1/L＝0来确定Fmax。用以下关系确定由KPU-02占据的结合位点B的部分：B＝(F0-F)/(F0-Fmax)。用Lfree＝L-B[C]确定游离的配体浓度，其中假定每个微管素二聚体具有单一的结合位点，[C]为配体结合位点的摩尔浓度。
KPU-02对微管素聚合作用的抑制
在体外无细胞系统中，对KPU-02、CA4和CLC改变富含MAP的微管素(MTP)(2mg/ml)的聚合作用的能力进行分析。最初，用磷酸纤维素纯化的、无微管相关蛋白的微管素分析对聚合作用的抑制(数据未显示)。相对于在与微管素共纯化的MAPs的存在下组装的MTs，KPI-02是对用甘油和DMSO组装的MTs更有效的抑制剂。虽然无稳定化MAP存在时，微管聚合体在2小时内不达到稳态，但是这些分析证实KPU-02直接与纯化的微管素相互作用并且不通过MAP发挥其基本作用。
当通过光散射(图44)和沉淀分析(图45)测定时，KPU-02和CA4比CLC更强烈地抑制MT聚合。存在一系列浓度的药物时，MTP(2mg/ml)聚合为微管，并通过在350nm的光散射监测，其达到了稳态。图41显示了在DMSO药物载体(◇)、1.25μM(□)、2.5μM(-)和5M(○)的NPI-2358(a)，CA4(b)和CLC(c)的存在下，微管蛋白聚合作用的浊度光谱。KPU-02和CA4抑制MT聚合并具有相当的效能。图45显示了在缺乏或存在一系列的KPU-02(○)、CA4(□)和秋水仙碱(◇)浓度时，微管聚合的抑制。通过沉淀来确定组装75分钟后的总聚合体质量。误差棒是来自三次实验的标准偏差值。抑制50％聚合作用的浓度(IC50)对KPU-02为2.4±0.4μM，CA4为2.2±0.3μM和CLC为7.6±2.4μM(表22)。(除非另有所指，通过统计分析获得的偏差报告为标准偏差值)。对于富含MAP的微管素的体内聚合，在药物浓度高于IC50时，MTP显示了聚集动力学，这表明KPU-02和CA4隔离蛋白以阻止微管组装。
表22 微管聚合抑制浓度
如图44所示，所有的三种所述测试试剂在1.25-5μM的范围内，产生微管聚合程度的浓度依赖性抑制作用。在所述光谱中需注意两点重要的区别。首先，吸光率随时间的最初增长率随药物浓度的增加而减少(图44A和44B)。所述光谱表明在KPU-02和CA4的存在下，MT的形成存在着迟滞期。显著地并快速减少可溶的、有组装能力的微管素池的药物减少聚合的最初速率。相反，聚合的最初速率在所有的CLC浓度中都没有改变(图44C)。其次，如随时间而线性增加的吸光值所示，在KPU-02或CA4的存在下，在高药物浓度(5μM以上)时MTP未达到稳态(图44A和44B)。相反，在CLC存在下，MTP在高药物浓度时达到稳态(图44C)。
通过对经离心沉淀的微管聚合体随药物浓度的增加而减少的线性关系进行分析，确定抑制50％聚合作用所需要的药物量(IC50)(图45)。图45的误差棒表示来自至少三次独立实验的标准偏差值。
通过透射电子显微镜技术测定平均微管长度的减少
对试剂-微管聚合反应进行透射电子显微镜技术以描述稳态时形成的所述聚合体并评价由光散射光谱中得出的结论。KPU-02、CA4和CLC均减少在稳态时形成的微管长度。MTs随药物浓度的增加而逐渐变短(图46，47和48)。图46显示了在(A)KPU-02、(B)CA4和(C)CLC的存在下，在稳态时体外的平均微管长度的频率直方图。所述Zeiss MOPIII用于确定微管的长度分布和平均长度。每一种药物浓度至少计数100个微管。图47显示了电子显微镜技术用于记录不存在或存在测试化合物时的微管。在75分钟时，将来自聚合体质量实验的样品固定，染色，并在Jeol电子显微镜-1200EX11中以2000x放大倍率进行观察。在(A)KPU-02、(b)CA4和(C)CLC的存在下，稳态时在体外形成的富含MAP的微管的典型电子显微镜图。标尺条为10μM。图48显示了在KPU-02、CA4和秋水仙碱的存在下，在稳态时MT长度减少的图解概述。黑色方块为1.25μM，以及阴影方块为2.5μM的药物。在KPU-02和CA4的存在下，MTs随药物浓度的增加而逐渐变短，直至药物的浓度为在此浓度下，通过混浊度检测到MTP显示聚集动力学，并且未观察到MTs。误差棒为来自对至少100个微管进行测量的标准偏差值。
KPU-02、CA4和CLC不影响MT成核现象。在所述聚合反应中形成的众多的、较短的微管证明KPU-02、CA4和CLC的存在不影响成核现象。如果影响成核现象，则相对于对照样品，在药物处理的样品中，观察到与众多的较短的微管相反的，较少的较长的微管。
在减少MT平均长度方面，KPU-02和CA4具有可比的有效性。在通过电子显微镜技术分析的最低药物浓度1.25μM时，KPU-02和CA4将MT平均长度减少了约70％，以及CLC减少了约40％(图48)。
对于体外的微管聚合，在药物浓度高于IC50时，对于KPU-02和CA4，通过电子显微镜技术未观察到微管。相反，对于所测定的CLC的所有浓度，通过电子显微镜技术观察到微管。在浓度高于IC50时，在KPU-02和CA4的存在下，微管蛋白显示了聚集动力学，其特征在于吸光率随时间而线性增加(图44A和44B)，而在CLC存在下，光散射聚合体达到稳态(图44C)。尽管观察到在KPU-02或CA4存在下MTP在350nm随时间而增加，但是未观察到药物特异性的蛋白质聚集体。
荧光光谱学
在25℃时，在PEM50和2mM GTP中，用一系列浓度的KPU-02将微管素(0.2mg/ml)孵育20分钟。KPU-02以浓度依赖性方式猝灭bis-ANS的荧光(图49A)。对于通过对在最大发射态时bis-ANS的荧光强度进行非线性回归分析而测定的KPU-02和微管素来说，Kd＝10±1.6μM(标准误差)(图49B)。假定每个微管素二聚体具有对KPU-02的单一的结合位点，所述结合数据的双倒数图产生的解离常数为6.4μM(图49C)。通过非线性和线性回归分析方法获得的两个不同的Kd值是充分接近的，并且认为该数值近似等价。图49A显示了在不断增加的KPU-02的存在下，微管素的荧光发射光谱。药物结合导致bis-ANS荧光的猝灭。图49B显示了荧光发射最大值在487nm，拟合以获得微管素对KPU-02的Kd值，10μM，标准偏差为1.6μM。插图为残数。图49C显示了假定一摩尔药物/摩尔微管素二聚体时所述结合数据的双倒数转换。
CLC结合的竞争性抑制
KPU-02和CA4竞争性地抑制CLC结合微管素(图50)。图50显示了抑制分析的结果，其中在不存在(◇)或存在10μM KPU-02(○)、或10μMCA4(□)时，用多种浓度的[3H]CLC孵育磷酸纤维素纯化的微管素(0.2mg/ml)。微管素-CLC的Km为11±4.4μM，以及抑制常数对于KPU-02为3.2±1.7μM，对于CA4为2.4±0.3μM。从三次独立实验中计算常数。所述秋水仙碱-微管素结合反应是时间和温度依赖性的，并且该结合的解离常数为Kd＝0.1-1μM，这依赖于所述分析的条件(Wilson L和Meza I)(1973)。The mechanism of action of colchicine(秋水仙碱的作用机理)。Colchicinebinding properties of sea urchin sperm tail outer doublet tubulin(海胆精子尾外侧的双微管素的秋水仙碱结合特性)Journal of Cell Biology 58(3)：709-19，在此将其全文引入作为参考。在试验条件下，对于CLC，微管素的Km为11±4.4μM。可以认为Km大体是微管素对CLC的Kd值，但是，由于CLC结合的时间依赖性，Km比Kd所报导的值大。所述Ki值对于KPU-02为3.2±1.7μM，对于CA4为2.4±0.3μM。该Ki定义为抑制50％的CLC结合所需的药物量，并基于结合微管素的放射性CLC的量。该Ki是所述药物的与CLC竞争能力的测量；其不是药物-微管素结合解离的直接测量，因为所述方法中报告亲和力。
结果
在所分析的CLC的所有浓度中，富含MAP的微管素达到稳态。相反，在较高药物浓度的KPU-02或CA4中，富含MAP的微管素不聚合为稳态，并且通过电子显微镜未观察到微管。KPU-02和CA4有效地减少可利用的微管素的浓度。可溶性微管素池的这种减少使得MT的临界浓度增加，并阻止聚合。在体外减少聚合体质量所需的KPU-02和CA4的化学量与在那些浓度以上时微管蛋白未达到稳态的数据结合，表明KPU-02和CA4通过隔离机制起作用，在该隔离机制中，可溶性微管素被结合，阻止聚合。
在所述稳态时通过电子显微镜观察，在所述测试试剂存在下形成的富含MAP的微管与所提出的机理(即KPU-02和CA4隔离微管素)相一致。在KPU-02、CA4和CLC的存在下，微管素的平均长度存在浓度依赖性减少。在KPU-02和CA4存在下，初始的聚合速率存在着药物浓度依赖性减少，这表明这些药物减少可用于延长的微管素。由于其与微管素缓慢结合，所以对于CLC，未见到初始的聚合速率降低。此外，对于聚合作用，在CLC浓度超过其IC50值时形成微管，但是在KPU-02或CA4浓度超过其IC50值时不形成微管。不受任何特定理论束缚，由KPU-02或CA4结合的可溶性微管素的浓度必须在微管素聚合所需的临界浓度以下以继续进行。
结合研究表明相对于CLC，微管素对KPU-02具有更低的亲和力。在20分钟的孵育期内发生KPU-02和CA4抑制CLC结合微管素，这表明KPU-02和CA4与微管素的结合达到平衡比CLC更快(数据未显示)。在与所述CLC-结合位点重叠的位点上，KPU-02竞争性抑制CLC结合微管素，这与表征苯基阿夕斯汀(halimide)的研究一致(Kanoh K，Kohno S，Kataka J，Takahashi J和UnoI.(1999)(-)-Phenylahistin arrests cells inmitosis by inhibiting tubulin polymerization((-)-苯基阿夕斯汀通过抑制微管素聚合来抑制细胞有丝分裂)The Journal of Antibiotics 52(2)：134-141，在此将其全文引入作为参考)。CA4(CLC的结构类似物)也竞争性抑制CLC结合。不受任何特定理论的束缚，显而易见的是尽管与CLC共享微管素结合区，但是KPU-02和CA4通过与CLC截然不同的机理来与微管素相互作用并抑制微管。
实施例15
对微管的体内作用
细胞培养研究
在37℃时，在5％CO2中，将用GFP-α-微管素(Clontech，Palo Alto，加拿大)稳定转染的MCF7人乳腺癌细胞(美国典型菌种收藏所，马纳萨斯，VA)培养在250ml组织培养瓶中的或35-mm-6孔板中的Dulbecco′s改良Eagle′s培养基中，该培养补加有5％胎牛血清、0.1％青霉素/链霉素和非必需氨基酸(Sigma)(时间加倍，29小时)。通过用含有所需浓度的测试试剂或DMSO载体的相等容积的培养基替换最初的培养基，用如实施例14中所述方法制备的KPU-02、CA4或CLC孵育细胞，并在37℃下继续孵育20小时。
有丝分裂进程
在给定的药物浓度下，测定胸腺癌细胞系MCF7中有丝分裂的细胞部分(有丝分裂指数)。以3×104细胞/ml的密度将细胞接种在6孔板中。24小时后，在不存在或存在一系列浓度(1nM-1μM)的药物时，将细胞孵育20小时。收集培养基并用versene(137mM NaCl，2.7mM KCl，1.5mMKH2PO4，8.1mM Na2PO4和0.5mM EDTA)冲洗，用胰蛋白酶分离，并放回到所述培养基中，以确保悬浮的和附着不佳的有丝分裂细胞包括在所述分析中。在37℃下，用PBS中10％甲醛将细胞固定过夜，在甲醇中通透化处理10分钟，并用4，6-二脒基-苯基吲哚(DAPI)染色以显现细胞核。将染色的细胞涂布在Vectashield封固剂(Burlingame，CA)中的盖玻片上，并用指甲油密封在载波片上。荧光显微镜技术用于确定有丝分裂指数。结果是4-7次实验的平均值和标准偏差，在该实验中，对于每种浓度计数300个细胞。IC50是在实验上在20小时时诱导50％最大有丝分裂积聚的药物浓度。
免疫荧光显微镜技术
除了将细胞接种在聚左旋赖氨酸(50μg/ml，Sigma)处理的盖玻片上之外，采用有丝分裂进程中所述方法制备细胞。染色当天，在PBS中冲洗细胞并在37℃时，在10％甲醛中固定过夜。将细胞在PBS中冲洗，于-20℃在甲醇中通透化处理，并用PBS水合。在室温下，用PBS/BSA(1％)中的20％正常山羊血清处理盖玻片1小时。在室温下，将细胞在PBS/BSA中稀释的抗α-微管素和β-微管素的鼠单克隆混合物、DM1A/DM1B中孵育1小时，然后用FITC-偶联的第二抗体和DAPI染色。用Prolong抗衰减介质(Molecular Probes，Eugene OR)封固盖玻片。
用于微管动力学分析的细胞的制备
采用有丝分裂进程中的方法制备细胞，只是为了促进细胞扩展，将细胞接种在玻璃盖玻片上，该玻璃盖玻片经聚左旋赖氨酸(50μg/ml，sigma)预处理2小时，随后在37℃时经层粘连蛋白和纤连蛋白(10μg/ml，sigma)预处理1小时。用药物或DMSO孵育细胞20小时并除去血清。在分析前，将盖玻片转移至记录培养基内(不含酚红和碳酸氢钠，用25mM HEPES缓冲并补加有3.5g/L蔗糖的培养基)。为了防止光漂白，在将细胞密封在双盖玻片-包封的室之前，立即将Oxyrase(30μl/ml，Oxyrase Inc.，曼斯菲尔德，OH)加入该记录培养基内。
慢速显微镜技术和图像采集
用具有平面复消色差的1.4N.A.×100物镜的Nikon Eclipse E800荧光显微镜观察微管。将所述阶段包封在Pyrex盒中并通过强制空气加温系统维持在36±1℃。应用由Metamorph software(Universal Imaging，Media，PA)驱动的，具有300ms曝光时间、增益(gain)为2、和2×2像素组合(binning)以加强亮度的光度计CoolSNAP HQ数码相机(Tucson，AZ)，在10MHz时以4-s的间隔获得每个细胞的三十张图像。
微管动力学的分析
采用输出至Microsoft Excel的Metamorph Track Points应用软件，跟踪微管的正末端随时间的位置，并用Real Time Measurement(实时测量)软件进行分析。各个微管的长度被描记为时间的函数。通过线性回归确定个体生长速率和缩短速率。两点之间的变化≥0.5μm时，被认为是发生增长或缩短。两点之间的变化＜0.5μm时，被认为是动力学衰减或中止时期。对于每种条件，至少分析25个微管。结果为至少三次独立实验的平均值和标准偏差。
通过将每根微管的灾变数(the number of catastrophes)除以增长或衰减中消耗的时间，计算每根微管的基于时间的灾变频率。通过将每根微管的总挽救数(the total number of rescues)除以缩短所消耗的时间，计算每根微管的基于时间的挽救频率。同样地，通过将转变数除以增长的长度或缩短的长度，分别计算基于距离的灾变频率和挽救频率。将可见时间≤2分钟的微管包括在所述频率分析中。将每根微管的动力学计算为增长长度和缩短长度除以由该微管的总寿命。将可见时间≥0.3分钟的微管包括在所述频率分析中。
在前中期时阻断的细胞周期进展。
确定了细胞积聚在有丝分裂期的KPU-02，CA4和CLC浓度范围。在20小时后，将60-70％的细胞抑制在前中期，而在有关诸如长春花碱和2-甲氧基雌二醇的MT解聚物和诸如紫杉醇、埃博霉素B(epothilone B)和discodermolide的MT稳定剂的研究中，有30-40％的细胞在中期(JordanMA(2002)Mechanism of action of antitumor drugs that interact withmicrotubules and tubulin(与微管和微管素相互作用的抗肿瘤药物的作用机理).Current Medicinal Chemistry-Anti-Cancer Agents 2：1-17，在此将其全文引入作为参考)。对1nM-1μM的药物评估了50％最大有丝分裂阻抑(IC50)所需的药物浓度(图51)。图51显示了由KPU-02、CA4和CLC对有丝分裂进程抑制作用的对数[药物]反应曲线。在NPI-2358(○)、CA4(□)和秋水仙碱(◇)存在下，培养MCF7细胞。为了评价有丝分裂指数，以3×104细胞/ml的密度将MCF7细胞接种在6孔板上。24小时后，在不存在或存在一系列浓度(1nM-1μM)的药物时，将细胞孵育20小时。固定细胞，并用DAPI染色以显现细胞核。荧光电子显微镜技术用于确定有丝分裂指数。结果为三或四次实验的平均值和标准偏差，在该实验中，对于每种药物浓度计数300个细胞。有丝分裂阻抑IC50值对于KPU-02为17.4±1.2nM、CA4为5.4±0.7nM和CLC为23.8±3.1nM(表23)。
表23 对有丝分裂进程的抑制作用
大多数以MT靶向试剂在中期向后期的转变中阻断有丝分裂。在中期向后期的转变中阻断有丝分裂与MT动力学的抑制相关。不被任何特定的理论所束缚，更早的前中期阻抑与MT聚合体的损耗共同表明了相对于其它诸如长春碱的在低浓度时稳定MT动力学的MT解聚药物，KPU-02具有截然不同的作用机理。
有丝分裂纺锤体和分裂间期排列的MTs的解聚作用
观察到KPU-02、CA4和CLC在MCF7细胞中是有效的微管解聚物。虽然与分裂间期排列的微管相比，有丝分裂纺锤体微管对解聚和/或聚合的抑制更敏感，但是两种微管群均受影响(图52)。图52显示了MCF7细胞的免疫荧光显微图像。与有丝分裂纺锤体相比，分裂间期排列对KPU-02、CA4和CLC的解聚作用更稳定。制备细胞，并采用有丝分裂进程中所述方法进行接种，对于每种药物，用所述有丝分裂阻抑的IC50值处理细胞20小时。在抗α-微管素和β-微管素的鼠单克隆的混合物、DM1A/DM1B中孵育细胞，随后用FITC-偶联的第二抗体和DAPI进行染色。a-d为在对照(a)中、KPU-02(b)、CA4(c)和CLC(d)处理的细胞中的微管素，以及e-h为对照(e)中、KPU-02(f)、CA4(g)和CLC(h)处理的细胞中的DNA。窄箭头指出有丝分裂纺锤体聚合体和有丝分裂染色体，以及较宽的箭头指出分裂间期的排列和细胞核。
在有丝分裂阻抑的IC25值时，KPU-02显著地改变纺锤体的形态学。图53A-C显示了用KPU-02(A)、CA4(B)和CLC(C)处理20小时的MCF7细胞的免疫荧光电子显微图像。有丝分裂纺锤体随药物浓度的增加而破坏。1-4为在对照中(1)，有丝分裂阻抑IC25的浓度(2)、有丝分裂阻抑IC50的浓度(3)，和两倍的有丝分裂阻抑IC50的浓度(4)中的α-微管素和β-微管素；5-8为邻近插图中的相应的DNA图像。对于KPU-02或CA4，在IC25时没有正常的双极纺锤体(图53A和B)。化合物处理的细胞含有单极的或具有未集合的染色体的双极纺锤体。相反，对于CLC，在IC25时仍存在正常的双极纺锤体(图53C)。对于KPU-02，在IC50时，75％有丝分裂细胞含有微管素的星体或聚集体，并且剩余的细胞不含有可检测到的有丝分裂聚合体。在CLC存在下，一半的细胞是具有未集合染色体的双极细胞，剩余的一半是单极的。在浓度为两倍的有丝分裂阻抑IC50时，在用KPU-02、CA4或CLC处理的有丝分裂细胞中，几乎检测不到MT聚合体。
对于所有检测的化合物，与有丝分裂纺锤体相比，微管的分裂间期排列更抗解聚(图52)。但是，对于所有的三种化合物，观察到了聚合体以剂量-依赖性方式定性减少(图54A-C)。图54A-C显示了用KPU-02(a)、CA4(b)和CLC(c)处理20小时的MCF7细胞的免疫荧光电子显微图像。分裂间期MT解聚作用随药物浓度的增加。1-4为在对照中(1)，有丝分裂阻抑IC25的浓度(2)、有丝分裂阻抑IC50的浓度(3)，和两倍的有丝分裂阻抑IC50的浓度(4)中的α-微管素和β-微管素；5-8为邻近插图中的相应的DNA图像。尽管细胞内存在稳定MAPs，但是微管素可能在这些分裂间期的细胞中是隔离的，这正如富含MAP的微管素在体外的聚合体质量分析中是隔离的。
在活MCF7细胞中缺乏对MT动态不稳定性的抑制或调节
在MCF7细胞中，在影响25％(表24)或50％(表25)的最大有丝分裂阻抑的浓度时，KPU-02和CA4对MT动态不稳定性不具有可测量的作用。不受任何特定理论的束缚，这些数据表明KPU-02(和CA4)的抗增殖的作用机理主要是由于对MT聚合的抑制作用，而不是对微管动态的抑制。
提供上述实施例的目的只是为了帮助理解本发明。因此，本领域所属技术人员可以理解本发明公开的方法和化合物包括或可提供其它脱氢苯基阿夕斯丁的衍生物。
本领域所属技术人员应该很容易理解，本发明很适用于获得例如本文所述的目标和优点以及其它固有特性。本文描述的方法和步骤只是代表优选的实施方案，且是示例性的，不意于限制本发明的范围。本领域所属技术人员对其所作的改变和其它应用均包括在本发明的精神中。
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本文说明性描述的发明可在不具备任何本文未特别公开的要素或限制条件下实现。所用的术语和表达方式均用于说明目的而非限制目的，且没有任何暗示表明，使用这类术语和表达意味着排除其所显示或描述的技术特征或其部分的等同物。公认地，在本发明的范围内可进行各种修改。因此，应该理解虽然本发明是通过优选的实施方案和可选择的技术特征进行具体公开的，本领域所属技术人员可使用本文公开的概念的修改或变换，而这类修改或变换应理解为属于本发明的范围。
机译： 脱氢苯基组蛋白及其类似物以及脱氢苯基组蛋白及其类似物的合成
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