公开/公告号CN1839142A
专利类型发明专利
公开/公告日2006-09-27
原文格式PDF
申请/专利权人 澳新制药公司;
申请/专利号CN200480024155.3
发明设计人 肯尼思·马丁·泰勒;罗宾·史密斯;
申请日2004-08-23
分类号C07F9/54;A61K33/42;
代理机构永新专利商标代理有限公司;
代理人过晓东
地址 美国加利福尼亚
入库时间 2023-12-17 17:46:56
法律状态公告日
法律状态信息
法律状态
2010-06-16
授权
授权
2006-11-15
实质审查的生效
实质审查的生效
2006-09-27
公开
公开
技术领域
本发明涉及具有亲脂性阳离子基团的两亲性抗氧化化合物，以及这些化合物之有利于它们用作例如药物的合成、组合物及理化性质。
背景技术
氧化应激导致许多人类与衰老有关的退化性疾病(degenerativedisease)，如帕金森病、阿尔茨海默病以及亨庭顿氏舞蹈病(Huntington’sChorea)和弗里德赖希氏共济失调(Friedreich’s Ataxia)，且导致随衰老累积的非特异性损害(non-specific damage)。氧化应激还导致中风及心脏病发作时、以及器官移植和手术过程中的炎症和缺血-再灌输组织伤害。已经研发出许多抗氧化疗法(antioxidant therapies)以预防氧化应激导致的损害。然而，这些疗法中的多数并非靶向于细胞内，因而不能达到最佳疗效。此外，许多这种抗氧化剂具有限制例如其生物利用度和其渗透至靶器官以发挥治疗效果的能力的理化性质。
线粒体是负责能量代谢的细胞内细胞器。因此，线粒体缺陷损害特别是能量需求高的神经和肌肉组织。其还是在多数细胞内导致氧化应激的自由基和活性氧类的主要来源。因而，申请人认为将抗氧化剂选择性地递送至线粒体会比应用非靶向抗氧化剂更有效。从而，本发明的目的是提供可靶向于线粒体的抗氧化剂。
亲脂性阳离子因其具有正电荷从而可在线粒体基质内累积(Rottenberg，1979 Methods Enzymol 55，547.Chen，1988 Ann Rev CellBiol 4，155)。倘若这种离子具有足够高的亲脂性以屏蔽(screen)正电荷或使其在较大的表面区域离域(delocalise)，同时倘若不存在有效的流出通道且该阳离子不会被代谢或立即对细胞产生毒性，则它们得以累积。
因此，本发明的中心是一种途径，通过该途径可应用线粒体富集特定亲脂性阳离子而吸收(take up)其连接的抗氧化剂的能力以使抗氧化剂靶向于导致氧化应激的自由基和活性氧类的主要来源。
在体内表现良好的抗氧化剂活性但却对体内目标隔室(targetcompartment)抗氧化剂功能差的抗氧化化合物的实例包括辅酶Q(CoQ)和艾地苯醌。这两种化合物都具有低的生物利用度，要发挥功效必须以非常高的剂量率给药，因此与所给药的剂量率相比，其治疗效能低。
不期望受任何理论所限，我们认为对于抗氧化化合物而言，体外的活性(如抗氧化活性或线粒体累积)决不是体内抗氧化功能和/或效能(如治疗效能)的唯一决定因素。同时，要用作本发明靶向线粒体的抗氧化化合物，抗氧化化合物必须显示适宜的体外抗氧化剂活性；并且，要在体内具有效能，该靶向线粒体的抗氧化化合物必须显示其它理想的理化性质，例如适宜的生物利用度、在目标线粒体内的适当定位和分布、和/或适宜的稳定性。
不期望受任何理论所限，我们认为本发明靶向线粒体的抗氧化化合物之所以显示出有利的抗氧化功能、包括生物利用度和/或体内靶向线粒体和累积，至少部分是由于它们的理化性质，举例而言，它们的两亲性、它们的物理结构和/或大小、和/或低至中等的疏水性和/或分配系数。从而，这些化合物在相对其它抗氧化化合物较低的剂量率下具有治疗效能。
在以化合物线粒体醌醇(mitoquinol)和线粒体醌(mitoquinone)(此处统称为线粒体醌/线粒体醌醇)作为例证的美国专利No.6331532中公开了抗氧化剂依赖共价地结合至抗氧化部分的亲脂性阳离子而靶向于线粒体的前景。其中的示例化合物(不管桥长概括为多少)是具有碳桥长为10(即C10桥)的如下结构式的化合物线粒体醌。
其还原形式线粒体醌醇也是C10桥连的。
尽管线粒体醌/线粒体醌醇在体内及体外具有优异的抗氧化活性和线粒体内靶向及累积，但是我们发现其溴化物盐有些不稳定。我们还发现美国专利No.6,331,532中公开的线粒体醌/线粒体醌醇的理化性质不适用于药物剂型，例如口服给药或胃肠道外给药的药物剂型和/或使化合物靶向内部器官(如脑、心脏、肝脏或其它器官)组织内的线粒体的药物剂型。
本发明化合物的实例适于药物剂型。尽管它们可为晶体和/或固体形式以外的形式，但是可通过与其它物质如载体、赋形剂、复合剂(complexation agent)或其它添加剂等如环糊精混合形成固体形式。有利的是，这些物质是药物学可接受的。
我们已决定期望提供本发明的两亲性靶向线粒体的抗氧化化合物的实例，其正电荷与适宜的阴离子结合以提供总体而言中性的盐形式的化合物，包括固体或晶体产品。然而，在上述盐形式中，我们发现某些成盐阴离子(salt forming anion)应最好避免，因为它们显示出不利于抗氧化化合物的活性，如不利于抗氧化部分、不利于连接部分或不利于亲脂性阳离子部分的活性，和/或可导致抗氧化部分处或抗氧化部分的裂解。其它成盐阴离子被认为是不适于药物学应用的。例如，由于药物学或环境不可接受，制药公司一般认为硝酸盐部分不适用，同时，我们发现通常用于上述化合物成盐的溴化氢具有亲核性质，可导致不利于抗氧化部分的反应性，例如甲基从此处通式II化合物的抗氧化部分裂解、和/或总化合物稳定性的某些整体上的降低。例如，我们已经确定线粒体醌的溴盐有些不稳定。
因此，我们认为靶向线粒体的抗氧化剂的盐形式，包括液体、固体或晶体形式的盐形式，最好与阴离子部分或不亲核的类似部分连接、和/与不显示以下反应性的部分连接，该反应性不利于任何构成抗氧化化合物或复合物的部分。还优选该阴离子是药物学可接受的。
发明目的
因此，本发明的目的是提供药物学可接受的两亲性抗氧化化合物以及依靠所述化合物的、可例如用于治疗与氧化应激相关的疾病或病症的组合物、剂型和方法，或向公众提供一种有益的选择。
发明内容
第一方面，本发明在于一种化合物，其包括由连接部分连接至抗氧化部分的亲脂性阳离子部分以及所述阳离子部分的阴离子补体，其中所述阳离子部分可使抗氧化部分靶向于线粒体，并且该盐形式是化学稳定的和/或所述阴离子补体不显示出不利于抗氧化部分、阳离子部分或连接部分的反应性。
在一个具体实施方案中，抗氧化部分是醌或醌醇。
在另一具体实施方案中，抗氧化部分选自包括以下物质的组中：维生素E和维生素E衍生物、链断裂抗氧化剂(chain breaking antioxidant)包括丁基化的羟基苯甲醚、丁基化的羟基甲苯、常规自由基捕获剂包括衍生化的富勒烯、自旋捕获剂包括5，5-二甲基吡咯啉-N-氧化物、叔丁基亚硝基苯、tert-亚硝基苯、α-苯基叔丁基硝酮和相关化合物的衍生物。
在一个具体实施方案中，亲脂性阳离子部分是取代或未取代的三苯基鏻阳离子。
在一个具体实施方案中，化合物如通式I和/或其醌醇形式所示，
其中R1、R2和R3可相同或不同，选自(任选地被取代的)C1至C5的烷基部分或H，并且其中n是从约2到约20的整数，其中Z是非反应性的阴离子。
优选地，Z选自以下组中：烷基或芳基磺酸根或烷基或芳基硝酸根。
优选地，(C)n桥中的各个C都是饱和的。
在一个优选的具体实施方案中，化合物如下式和/或其醌醇形式所示，
其中Z是非亲核性阴离子。
更优选地，化合物如式III所示
另一方面，本发明提供一种包括以下化合物的药物组合物，该化合物包括由连接部分连接至抗氧化部分的亲脂性阳离子部分以及所述阳离子部分的阴离子补体，其中所述阳离子部分可使抗氧化部分靶向于线粒体，并且该盐形式是化学稳定的和/或所述阴离子补体不显示出不利于抗氧化部分、阳离子部分或连接部分的反应性。
在一个具体实施方案中，抗氧化部分是醌或醌醇。
在另一具体实施方案中，抗氧化部分选自包括以下物质的组中：维生素E和维生素E衍生物、链断裂抗氧化剂包括丁基化的羟基苯甲醚、丁基化的羟基甲苯、常规自由基捕获剂包括衍生化的富勒烯、自旋捕获剂包括5，5-二甲基吡咯啉-N-氧化物、叔丁基亚硝基苯、tert-亚硝基苯、α-苯基叔丁基硝酮和相关化合物的衍生物。
在一个具体实施方案中，亲脂性阳离子部分是取代或未取代的三苯基鏻阳离子。
在一个具体实施方案中，化合物如通式I和/或其醌醇形式所示，
其中R1、R2和R3可相同或不同，选自(任选地被取代的)C1至C5的烷基部分或H，并且其中n是从约2到约20的整数，其中Z是非反应性阴离子。
优选地，Z选自以下组中：烷基或芳基磺酸根或烷基或芳基硝酸根。
优选地，(C)n桥中的各个C都是饱和的。
在另一具体实施方案中，化合物如下式和/或其醌醇形式所示，
其中Z是非亲核性阴离子。
在另一具体实施方案中，组合物包含如式II和/或其醌醇形式所示的化合物，其中Z是非亲核性阴离子，并且其中所述组合物中包含环糊精。
在不同的实施例中，化合物与环糊精的摩尔比是约10∶1到约1∶10、约5∶1到约1∶5、约4∶1到约1∶4、约2∶1到约1∶2或约1∶1，例如化合物与环糊精的摩尔比是约1∶2。
更优选地，组合物包含如式III所示的化合物，
其中环糊精为β-环糊精，更优选地，化合物与环糊精的摩尔比为约1∶2。
在一个具体实施方案中，药物组合物被配制用于口服给药。
在另一具体实施方案中，药物组合物被配制用于胃肠道外给药。
另一方面，本发明提供一种包含以下化合物以及任意的药物学可接受的稀释剂和/或载体和/或赋形剂的剂量单位，该化合物包括由连接部分连接至抗氧化部分的亲脂性阳离子部分以及所述阳离子部分的阴离子补体，其中所述阳离子部分可使抗氧化部分靶向于线粒体，并且该盐形式是化学稳定的和/或所述阴离子补体不显示出不利于抗氧化部分、阳离子部分或连接部分的反应性。
在一个具体实施方案中，抗氧化部分是醌或醌醇。
在另一具体实施方案中，抗氧化部分选自包括以下物质的组中：维生素E和维生素E衍生物、链断裂抗氧化剂包括丁基化的羟基苯甲醚、丁基化的羟基甲苯、常规自由基捕获剂包括衍生化的富勒烯、自旋捕获剂包括5，5-二甲基吡咯啉-N-氧化物、叔丁基亚硝基苯、tert-亚硝基苯、α-苯基叔丁基硝酮和相关化合物的衍生物。
在一个具体实施方案中，亲脂性阳离子部分是取代或未取代的三苯基鏻阳离子。
在一个具体实施方案中，化合物如通式I和/或其醌醇形式所示，
其中R1、R2和R3可相同或不同，选自(任选地被取代的)C1至C5的烷基部分或H，并且其中n是从约2到约20的整数，其中Z是非反应性阴离子。
优选地，Z选自以下组中：烷基或芳基磺酸根或烷基或芳基硝酸根。
优选地，(C)n桥中的各个C都是饱和的。
在另一具体实施方案中，化合物如下式和/或其醌醇形式所示，
其中Z是非亲核性阴离子。
在另一具体实施方案中，剂量单位包含如式II和/或其醌醇形式所示的化合物，其中Z是非亲核性阴离子，并且其中该组合物含有环糊精。
在不同的实施例中，化合物与环糊精的摩尔比是约10∶1到约1∶10、约5∶1到约1∶5、约4∶1到约1∶4、约2∶1到约1∶2或约1∶1，例如化合物与环糊精的摩尔比是约1∶2。
更优选地，该剂量单位包含如式III所示的化合物，
其中环糊精为β-环糊精，更优选地，化合物与环糊精的摩尔比为约1∶2。
在一个具体实施方案中，剂量单位适于口服给药。
在另一具体实施方案中，剂量单位适于胃肠道外给药。
另一发面，本发明提供通过向哺乳动物给药本发明化合物或其盐以用于预防或治疗所述哺乳动物氧化应激的本发明的化合物或其药物学可接受的盐、组合物或剂型。
在一个具体实施方案中，化合物是如式II所示的化合物或其药物学可接受的盐。
在另一具体实施方案中，所述给药在第一天的剂量为日常维持剂量的约1.02到约2.0倍，随后在后续日中以日常维持剂量给药所述化合物或其盐。
优选地，所述盐为甲磺酸盐，且所述化合物与环糊精结合。
更优选地，所述化合物如下式所示
优选地，所述环糊精为β-环糊精，更优选地，所述化合物与环糊精的摩尔比为约1∶2。
另一发面，本发明提供通过向哺乳动物给药本发明化合物或其盐以用于预防或治疗所述哺乳动物衰老症状的本发明化合物或其药物学可接受的盐、组合物或剂型。
在一个具体实施方案中，所述化合物是如式II所示的化合物或其药物学可接受的盐。
在另一具体实施方案中，所述给药在第一天的剂量为日常维持剂量的约1.02到约2.0倍，随后在后续日中以日常维持剂量给药所述化合物或其盐。
优选地，所述盐为甲磺酸盐，且所述化合物与环糊精结合。
更优选地，化合物如下式所示
优选地，所述环糊精为β-环糊精，更优选地，所述化合物与环糊精的摩尔比为约1∶2。
另一方面，本发明在于一种包括由连接部分连接至抗氧化部分的亲脂性阳离子部分和所述阳离子部分的阴离子补体的稳定的化合物，其中
所述阳离子部分可使抗氧化剂靶向于线粒体，且
所述阴离子补体不为卤素离子，且
所述阴离子补体是非亲核性的，和/或
所述阴离子补体不显示不利于阳离子部分、连接部分或抗氧化部分的反应性。
在一个具体实施方案中，所述抗氧化部分是醌或醌醇。
在另一具体实施方案中，抗氧化部分选自包括以下物质的组中：维生素E和维生素E衍生物、链断裂抗氧化剂包括丁基化的羟基苯甲醚、丁基化的羟基甲苯、常规自由基捕获剂包括衍生化的富勒烯、自旋捕获剂包括5，5-二甲基吡咯啉-N-氧化物、叔丁基亚硝基苯、tert-亚硝基苯、α-苯基叔丁基硝酮和相关化合物的衍生物。
在一个具体实施方案中，所述亲脂性阳离子部分是取代或未取代的三苯基鏻阳离子。
在一个具体实施方案中，所述化合物如通式I和/或其醌醇形式所示，
其中R1、R2和R3可相同或不同，选自(任选地被取代的)C1至C5的烷基部分或H，并且其中n是从约2到约20的整数，其中Z是非反应性的阴离子。
优选地，Z选自以下组中：烷基或芳基磺酸根或烷基或芳基硝酸根。
优选(C)n桥中的每个C是饱和的。
在一个优选的具体实施方案中，所述化合物如下式和/或其醌醇形式所示，
其中Z是非亲核性阴离子。
更优选地，所述化合物如式III所示
另一方面，本发明提供包含或包括一种稳定的化合物的药物组合物，该稳定的化合物包括由连接部分连接至抗氧化部分的为亲脂性阳离子部分的阳离子和所述阳离子部分的阴离子补体，其中
所述阳离子部分可使抗氧化部分靶向于线粒体，且
所述阴离子补体不为卤素离子，且
所述阴离子补体是非亲核性的，和/或
所述阴离子补体不显示不利于阳离子部分、连接部分或抗氧化部分的反应性。
在一个具体实施方案中，所述抗氧化部分是醌或醌醇。
在另一具体实施方案中，所述抗氧化部分选自包括以下物质的组中：维生素E和维生素E衍生物、链断裂抗氧化剂包括丁基化的羟基苯甲醚、丁基化的羟基甲苯、常规自由基捕获剂包括衍生化的富勒烯、自旋捕获剂包括5，5-二甲基吡咯啉-N-氧化物、叔丁基亚硝基苯、tert-亚硝基苯、α-苯基叔丁基硝酮和相关化合物的衍生物。
在一个具体实施方案中，所述亲脂性阳离子部分是取代或未取代的三苯基鏻阳离子。
在一个具体实施方案中，所述化合物如通式I和/或其醌醇形式所示，
其中R1、R2和R3可相同或不同，选自(任选地被取代的)C1至C5的烷基部分或H，并且其中n是从约2到约20的整数，其中Z是非反应性的阴离子。
优选地，Z选自以下组中：烷基或芳基磺酸根或烷基或芳基硝酸根。
优选地，(C)n桥中的各个C都是饱和的。
在另一具体实施方案中，所述化合物如下式和/或其醌醇形式所示，
其中Z是非亲核性阴离子。
在另一具体实施方案中，所述组合物包含如式II和/或其醌醇形式所示的化合物，其中Z是非亲核性阴离子，且其中所述组合物含有环糊精。
在不同的实施例中，化合物与环糊精的摩尔比是约10∶1到约1∶10、约5∶1到约1∶5、约4∶1到约1∶4、约2∶1到约1∶2或约1∶1，例如化合物与环糊精的摩尔比是约1∶2。
更优选地，所述组合物包含如下式所示的化合物，
其中所述环糊精为β-环糊精，更优选地，所述化合物与环糊精的摩尔比为约1∶2。
在一个具体实施方案中，所述药物组合物被配制用于口服给药。
在另一具体实施方案中，所述药物组合物被配制用于胃肠道外给药。
另一方面，本发明由包含或包括一种稳定的化合物以及药物学可接受的稀释剂和/或载体和/或赋形剂的剂量单位组成，所述稳定的化合物包括由连接部分连接至抗氧化部分的亲脂性阳离子部分以及所述阳离子部分的阴离子补体，其中
所述阳离子部分可使抗氧化部分靶向于线粒体，且
所述阴离子补体不为卤素离子，且
所述阴离子补体是非亲核性的，和/或
所述阴离子补体不显示不利于阳离子部分、连接部分或抗氧化部分的反应性。
在一个具体实施方案中，所述抗氧化部分是醌或醌醇。
在另一具体实施方案中，所述抗氧化部分选自包括以下物质的组中：维生素E和维生素E衍生物、链断裂抗氧化剂包括丁基化的羟基苯甲醚、丁基化的羟基甲苯、常规自由基捕获剂包括衍生化的富勒烯、自旋捕获剂包括5，5-二甲基吡咯啉-N-氧化物、叔丁基亚硝基苯、tert-亚硝基苯、α-苯基叔丁基硝酮以及相关化合物的衍生物。
在一个具体实施方案中，所述亲脂性阳离子部分是取代或未取代的三苯基鏻阳离子。
在一个具体实施方案中，所述化合物如通式I和/或其醌醇形式所示，
其中R1、R2和R3可相同或不同，选自(任选地被取代的)C1至C5的烷基部分或H，并且其中n是从约2到约20的整数，其中Z是非反应性阴离子。
优选地，Z选自以下组中：烷基或芳基磺酸根或烷基或芳基硝酸根。
优选地，(C)n桥中的各个C都是饱和的。
在另一具体实施方案中，所述化合物如下式和/或其醌醇形式所示，
其中Z是非亲核性阴离子。
在另一具体实施方案中，所述剂量单位包含如式II和/或其醌醇形式所示的化合物，其中Z是非亲核性阴离子，且其中所述组合物含有环糊精。
在不同的实施例中，化合物与环糊精的摩尔比是约10∶1到约1∶10、约5∶1到约1∶5、约4∶1到约1∶4、约2∶1到约1∶2或约1∶1，例如化合物与环糊精的摩尔比是约1∶2。
更优选地，所述剂量单位包含如下式所示的化合物，
其中所述环糊精为β-环糊精，更优选地，所述化合物与环糊精的摩尔比为约1∶2。
在一个具体实施方案中，所述剂量单位适于口服给药。
在另一具体实施方案中，所述剂量单位适于胃肠道外给药。
另一方面，本发明在于适于口服给药的剂量单位，其包括本发明化合物作为有效成分，所述化合物为或被配制成晶体形式和/或非液体形式。
另一方面，本发明在于包括本发明化合物作为有效成分的适于胃肠道外给药的剂量单位。
另一方面，本发明提供一种适于治疗可受益于氧化应激减少或衰老症状减少的患者的药物组合物，其包括或包含与一种或多种药物学可接受的载体、赋形剂或稀释剂结合的有效量的本发明化合物。
在一个具体实施方案中，所述化合物是式I的化合物。
在一个实施例中，所述化合物与环糊精复合。
在不同的实施例中，所述化合物与环糊精的摩尔比是约10∶1到约1∶10、约5∶1到约1∶5、约4∶1到约1∶4、约2∶1到约1∶2或约1∶1，例如所述化合物与环糊精的摩尔比是约1∶2。
更优选地，所述化合物是式(III)的化合物且所述环糊精为β-环糊精，更优选地，所述化合物与环糊精的摩尔比为约1∶2。
另一方面，本发明提供减少细胞内氧化应激的方法，其包括使所述细胞接触本发明化合物的步骤。
在一个具体实施方案中，该化合物是式I的化合物。
在一个实施例中，该化合物与环糊精复合。
在不同的实施例中，所述化合物与环糊精的摩尔比是约10∶1到约1∶10、约5∶1到约1∶5、约4∶1到约1∶4、约2∶1到约1∶2或约1∶1，例如化合物与环糊精的摩尔比是约1∶2。
更优选地，所述化合物是如式(III)所示的化合物，且所述环糊精为β-环糊精，更优选地，所述化合物与环糊精的摩尔比为约1∶2。
在一个具体实施方案中，所述药物组合物被配制用于口服给药。
在另一具体实施方案中，药物组合物被配制用于胃肠道外给药。
另一方面，本发明提供一种适于治疗患有或易患帕金森病、阿尔茨海默病、亨庭顿氏舞蹈病或弗里德赖希氏共济失调的患者的药物组合物，其包括或包含与一种或多种药物学可接受的载体、赋形剂或稀释剂结合的有效量的本发明化合物。
优选地，所述治疗是对患有或易患弗里德赖希氏共济失调的患者的治疗。
另一方面，本发明提供治疗或预防可受益于氧化应激减少的患者的方法，其包括或包含向所述患者给药本发明化合物的步骤。
在一个具体实施方案中，该化合物是式I的化合物。
在一个实施例中，该化合物与环糊精复合。
在不同的实施例中，所述化合物与环糊精的摩尔比是约10∶1到约1∶10、约5∶1到约1∶5、约4∶1到约1∶4、约2∶1到约1∶2或约1∶1，例如所述化合物与环糊精的摩尔比是约1∶2。
更优选地，所述化合物是式(III)的化合物，且所述环糊精为β-环糊精，更优选地，所述化合物与环糊精的摩尔比为约1∶2。
在一个具体实施方案中，所述的给药是口服给药。
在另一具体实施方案中，所述的给药是胃肠道外给药。
另一方面，本发明提供治疗或预防可受益于氧化应激减少或衰老症状减少的患者的方法，其包括向患者给药本发明化合物的步骤。
另一方面，本发明提供一种治疗或预防患有或易患帕金森病、阿尔茨海默病、亨庭顿氏舞蹈病或弗里德赖希氏共济失调的患者的方法，其包括或包含向所述患者给药本发明化合物的步骤。
优选地，所述治疗或预防方法是对患有或易患弗里德赖希氏共济失调患者的治疗或预防的方法。
另一方面，本发明提供减少细胞内氧化应激的方法，其包括向所述细胞给药本发明的化合物。
另一方面，本发明提供如前所述的化合物在制备或制造可有效用于减少患者氧化应激的药物、剂量单位或药物组合物中的应用。
另一方面，本发明提供如前所述的化合物在制备或制造可有效用于减少患者衰老症状的药物、剂量单位或药物组合物中的应用。
另一方面，本发明提供本发明化合物在制备或制造可有效用于治疗或预防患有或易患帕金森病、阿尔茨海默病、亨庭顿氏舞蹈病或弗里德赖希氏共济失调的患者的药物、剂量单位或药物组合物中的应用，其包括或包含向所述患者给药本发明化合物的步骤。
优选地，所述药物、剂量单位或药物组合物可有效用于治疗或预防患有或易患弗里德赖希氏共济失调的患者。
另一方面，本发明提供如前所述的化合物在制备或制造可有效用于减少细胞内氧化应激的药物、剂量单位或药物组合物中的应用。
优选地，所述制备或制造采用其它一种或多种物质，更优选地采用药物学可接受的稀释剂、赋形剂和/或载体。
另一方面，本发明在于合成具有式I(和/或其醌形式)的部分的化合物或式I(和/或其醌形式)的部分的方法，
其中R1、R2和R3可相同或不同，选自(任选地被取代的)C1至C5的烷基部分，并且其中n是从约2到约20的整数，所述方法包含或包括与环糊精相混合。
优选地，(C)n桥中的各个C都是饱和的。
另一方面，本发明在于合成如下式所示的化合物的方法，
所述方法包含或包括与环糊精相混合。
另一方面，本发明在于基本上如此处所述的合成具有以下结构式的化合物的方法。
任何对本申请已包括的文献、文字记录(act)、物质、装置、论文(article)等的讨论目的只是为本发明提供背景。但不可因为其在本申请各权利要求优先权日之前存在就理解为承认任何或所有的这些内容构成本发明相关领域的现有技术基础(prior art base)或公知常识的一部分。
贯穿这项申请的词语“包括”，或其单数第三人称或动名词变体可理解为指含有所宣称的要素、整数或步骤、或者要素组、整数组或步骤组，但并非排除任何其它的要素、整数或步骤、或者要素组、整数组或步骤组。
贯穿这项申请的术语“醌”，无论是单独应用还是以其它术语作前缀用以描述化合物的氧化形式，都应理解为将该化合物的还原形式，即醌醇形式包括在其范围内。类似地，例如通过结构描述提及的醌也将醌醇形式包括在其范围内。
贯穿这项申请的术语“醌醇”，无论是单独应用还是以其它术语作前缀用以描述化合物的还原形式，都应理解为将化合物的氧化形式，即醌形式包括在其范围内。类似地，例如通过结构描述提及的醌醇也将醌形式包括在其范围内。
此处所用的术语“和/或”包括作为选择的“和”以及“或”。
此处所用的术语“分配系数”和“分配系数(辛醇∶水)”是指在25℃或37℃测定的辛-1-醇/磷酸盐缓冲盐溶液分配系数(参见Kelso，G.F.，Porteous，C.M.，Coulter，C.V.，Hughes，G.Porteous，W.K.，Ledgerwood，E.C.，Smith，R.A.J.和Murphy，M.P.2001 J Biol Chem 276 4588.Smith，R.A.J.，Porteous，C.M.，Coulter，C.V.和Murphy，M.P.1999 Eu.J Biochem 263，709.Smith，R.A.J.，Porteous，C.M.，Gane，A.M.和Murphy，M.P.2003 Proc NatAcad Sci 100，5407.)，或是如Jauslin，M.L.，Wirth，T.，Meier，T.，和Schoumacher，F.，2002，Hum Mol Genet 11，3055所述采用AdvancedChemistry Development(ACD)Software Solaris V4.67所计算出的辛醇/水分配系数。
本文所用的短语“药物制剂可接受的”其含义不仅包括有关药事管理(phamaceutical administration)方面的可接受性，还涉及剂型的如可接受的稳定性、贮存期限、吸湿性、制备等。
此处所用的“非反应性阴离子”是指不显示不利于抗氧化部分、亲脂性阳离子或连接部分的反应性的阴离子。例如，若某该化合物部分包含亲核进攻的目标，则所述阴离子是非亲核性的。
虽然如上加以概括地定义，但是本发明并不仅限于此，其还包括以下说明书提供了实施例的具体实施方案。
特别地，在参考附图后会更透彻地理解本发明。
附图说明
图1描述线粒体对两亲性抗氧化化合物的吸收，图中所示为线粒体醌-C10被吸收至加以电压的(energised)线粒体内。
图2描述A：线粒体醌-C3、B：线粒体醌-C5、C：线粒体醌-C15的合成途径。
图3描述线粒体醌抗氧化化合物及相关化合物TPMP的结构。以相同比例(the same scale)画出的磷脂与线粒体醌抗氧化化合物排成一列以说明泛醌醇侧链渗透至磷脂双层的单层的潜在最大深度。A：TPMP；B：线粒体醌-C3；C：线粒体醌-C5；D：线粒体醌-C10；E：线粒体醌-C15；F：磷脂。
图4所示图显示了使用离子选择电极测量的线粒体对抗氧化化合物的吸收和结合。A：线粒体醌-C3；B：线粒体醌-C5；C：线粒体醌-C10；D：线粒体醌-C15。在左手边(in the left hand panel)，在鱼藤酮存在下提供线粒体(1mg蛋白/ml)，然后连续5次每次加入1μM(黑箭头)抗氧化化合物以校准电极反应。在右手边，首先通过连续5次每次加入1μM(黑箭头)校准电极，然后加入线粒体(1mg蛋白/ml)。在所有情形下都加入琥珀酸盐以产生膜电位，而加入FCCP消除膜电位。数据是重复至少2-3次的试验的典型描绘图(typical trace)。
图5所示图显示了所述抗氧化化合物的抗氧化效能。A：用琥珀酸盐(黑色柱)加以电压或者用由ATP、磷酸烯醇丙酮酸和丙酮酸激酶组成的ATP再生系统通过温育(白色柱)向线粒体施以电压。在与各种线粒体醌类似物、TPMP或载体预温育30秒后，通过添加50μMFeCl2和300μM H2O2诱导氧化应激。在37℃下温育15分钟后，通过测量TBAR估计脂质过氧化作用。数据为两次独立试验的平均值±极差(range)。线粒体醌-C5在ATP存在下对脂质过氧化作用具有轻微保护作用是因为一些添加自贮备液中的线粒体醌-C5以泛醌醇的形式存在。B：由[3H]TPMP的累积测量由琥珀酸盐或ATP再生系统诱导的线粒体膜电位。数据为对25分钟温育的两次测定的平均值±极差。5分钟温育后的膜电位相同(数据未出示)。C：测量抗氧化化合物抑制TBAR累积的浓度依赖性。所有的温育在如A所述的琥珀酸盐存在下进行。结果表达为TBARS形成的抑制％，取线粒体醌类似物不存在的情况下暴露于FeCl2/H2O2的样品的值为0％抑制，及对照品(未加入FeCl2/H2O2)的值为100％。显示的数据是用各浓度重复测定3次的典型滴定值±SD。D：抑制脂质过氧化作用的IC50浓度。数据为从如C所示的三次独立滴定所估计的平均值±标准误差。应用Student双侧检验确定相对线粒体醌-C3的IC50的统计学显著性：*p＜0.05；**p＜0.005。
图6显示了线粒体醌-C10和线粒体醌-C3对冠状窦血流量的作用。
图7显示了线粒体醌-C10和线粒体醌-C3对左室舒张压的作用。
图8显示了线粒体醌-C10和线粒体醌-C3对心率的作用。
图9显示了左心室的变化率。
图10显示了线粒体醌-C10和线粒体醌-C3对缺血后线粒体呼吸功能的作用。
图11显示了透明玻璃瓶内的纯线粒体醌-C10(批号No.3)在40℃，75％RH；25℃，50％RH和5℃硅石上的稳定性。
图12图示了线粒体醌-C10(批号No.4)在25℃，50％RH的稳定性。
图13图示了线粒体醌-C10与β-环糊精复合物(1∶1)在4℃硅石上；25℃，50％RH和40℃，75％RH的稳定性。
图14图示了线粒体醌-C10与β-环糊精复合物(1∶2)在4℃硅石上；25℃，50％RH和40℃，75％RH的稳定性。
图15图示了线粒体醌-C10与β-环糊精复合物(1∶4)在4℃硅石上；25℃，50％RH和40℃，75％RH的稳定性。
图16显示了线粒体醌-C10甲磺酸盐在水中的稳定性。
图17显示了线粒体醌-C10甲磺酸盐在0.01M HCl中的稳定性。
图18显示了线粒体醌-C10甲磺酸盐在pH 7.4的IPB中的稳定性。
图19显示了线粒体醌-C10甲磺酸盐在50％MeOH中的稳定性。
图20显示了线粒体醌-C10甲磺酸盐在40℃，75％RH；25℃，50％RH和蓝硅胶上4℃的固态稳定性。
图21显示了线粒体醌-C10甲磺酸盐-β-环糊精(1∶2)复合物在水中的稳定性。
图22显示了线粒体醌-C10甲磺酸盐-β-环糊精(1∶2)复合物在0.01MHCl中的稳定性。
图23显示了线粒体醌-C10甲磺酸盐-β-环糊精(1∶2)复合物在pH7.4的IPB中的稳定性。
图24显示了线粒体醌-C10甲磺酸盐-β-环糊精(1∶2)复合物在50％MeOH中的稳定性。
图25显示了线粒体醌-C10甲磺酸盐-β-环糊精(1∶2)复合物在40℃，75％RH；在25℃，50％RH和蓝硅胶上4℃的固态稳定性。
图26显示了线粒体醌-C10甲磺酸盐-β-环糊精(1∶1)复合物在水中的稳定性。
图27显示了线粒体醌-C10甲磺酸盐-β-环糊精(1∶1)复合物在0.01MHCl中的稳定性。
图28显示了线粒体醌-C10甲磺酸盐-β-环糊精(1∶1)复合物在pH7.4的IPB中的稳定性。
图29显示了线粒体醌-C10甲磺酸盐-β-环糊精(1∶1)复合物在50％MeOH中的稳定性。
图30显示了线粒体醌-C10甲磺酸盐-β-环糊精(1∶1)复合物在40℃，75％RH；25℃，50％RH和蓝硅胶上4℃的固态稳定性。
图31图示了在向大鼠单次静脉注射(A)(10mg/kg)和口服(B)(50mg/ml)给药线粒体醌-C10甲磺酸盐-β-环糊精(1∶2)复合物中的线粒体醌-C10甲磺酸盐后，线粒体醌-C10的大鼠血浆浓度-时间曲线。
具体实施方式
如上所述，本发明的中心是主要用于治疗和/或预防目的以减少氧化应激的靶向线粒体的化合物。
横跨其内膜，线粒体具有最高达180mV的高的(substantial)膜电位(内部为负)。由于这种电位，透膜体(membrane permeant)亲脂性阳离子在线粒体基质内累积数百倍。
申请人已发现，通过将亲脂性阳离子(如亲脂性三苯基鏻阳离子)偶联至抗氧化部分，所得的两亲性化合物可被递送至完整细胞内的线粒体基质。抗氧化剂从而得以靶向于细胞内自由基和活性氧类的主要产生部位，而不是随机分散。
目前申请人还确定了所述抗氧化化合物的性质，如抗氧化部分的特性、连接部分的物理和化学特征如连接部分的长度和亲脂性、和/或亲脂性阳离子的特性有利于抗氧化化合物在体内的功效，并有利于所述化合物的抗氧化功能。对本发明抗氧化化合物而言，体内功效可部分地包括适宜的生物利用度、适宜的稳定性、适宜的药动学、适宜的抗氧化活性、和/或适宜的线粒体靶向性和/或累积性。
原则上，能够被转运至和/或通过线粒体膜、并在完整细胞的线粒体处或之内累积的任何亲脂性阳离子以及任何抗氧化剂都能够用于形成本发明化合物。
然而，优选的亲脂性阳离子是本文作为实例的三苯基鏻阳离子。可共价地偶联至本发明的抗氧化剂的其它亲脂性阳离子包括三苄基铵和鏻阳离子。在本发明抗氧化化合物的一些实施例中，所述亲脂性阳离子通过具有1到约30个碳原子如2到约20个、约2到约15个、约3到约10个或约5到约10个碳原子的饱和直链碳链偶联至抗氧化部分。在一个特别优选的实施例中，所述直链碳链含有10个碳原子。
虽然碳链优选地是亚烷基(例如，C1-C20或C1-C15)，但是任选地包括一个或多个双键或三键的碳链也在本发明范围内。还包括在内的是含一个或多个取代基(如羟基、羧酸或酰胺基)、和/或含一个或多个侧链或支链的碳链，如那些选自未被取代或被取代的烷基、烯基或炔基的碳链。还包括含有超过约30个碳原子、但其长度相当于具有1到约30个碳原子的直链饱和碳链的碳链。
本领域技术人员将理解，除直亚烷基外的部分例如被取代的或支链的烷基、肽键等可用于将抗氧化部分共价地偶联至亲脂性阳离子。
在一些具体实施方案中，亲脂性阳离子通过具有1至10个碳原子的直链亚烷基如亚乙基、亚丙基、亚丁基、亚戊基或亚癸基连接至抗氧化部分。
可用于本发明的抗氧化部分包括那些需要与还原剂相互作用以获得起始抗氧化活性或抗氧化活性的再生或这两者的抗氧化剂。例如，本发明包含醌醇部分作为活性抗氧化部分的抗氧化化合物可以醌的形式给药。要起抗氧化剂的作用，即具有抗氧化活性，该醌必须通过与还原剂线粒体还原剂如复合物II相互作用从而还原为醌醇以获得起始抗氧化活性。被氧化的醌形式与还原剂在之后的相互作用可导致抗氧化活性的再生。
可用于本发明的抗氧化部分的其它实例包括那些原本就以还原形式存在且不需与还原剂相互作用以获得起始抗氧化活性的抗氧化剂。尽管如此，但是该抗氧化部分的氧化形式与线粒体还原剂在之后的相互作用可导致抗氧化活性的再生。举例而言，抗氧化部分维生素E可以还原形式给药，所以不需要与还原剂相互作用以获得起始抗氧化活性，但是可随后与还原剂如内源性的醌池(quinone pool)相互作用以使抗氧化活性再生。
可用于本发明的抗氧化部分的其它实例包括那些不通过与线粒体还原剂相互作用而再生的抗氧化剂。
可用于本发明的抗氧化剂的实例包括维生素E和维生素E衍生物、链断裂抗氧化剂如丁基化的羟基苯甲醚、丁基化的羟基甲苯、醌醇以及常规自由基捕获剂如衍生化的富勒烯。此外，还可应用可与自由基反应以产生稳定的自由基的自旋捕获剂。这些包括5，5-二甲基吡咯啉-N-氧化物、叔丁基亚硝基苯、tert-亚硝基苯、α-苯基叔丁基硝酮和相关化合物的衍生物。
可容易地通过下列反应制备包括此处通式I和II化合物的那些优选的抗氧化化合物：
总合成方案是在氩气下将含有适宜离去基团的前体，优选为烷基磺酰基、溴或碘前体与大于1当量的三苯基膦加热数天。然后将磷鎓以其盐的形式分离。为此，将产物用二乙醚反复研磨直至只剩下米黄色(off-white)固体。然后将其溶于氯仿或二氯甲烷，用二乙醚沉淀以除去过量的三苯基膦。重复此步骤直至固体不再溶于氯仿。此刻，将该产物从适宜的溶剂如氯仿、丙酮、乙酸乙酯或高级醇中重结晶数次。
此处实施例1中建立了可用于制备优选的式III的靶向线粒体的抗氧化化合物的稳定形式(此处还称作线粒体-C10甲磺酸盐或线粒体-C10甲基磺酸盐)的优选的合成方法。
还应理解的是，若需要或必须的话，可应用离子交换或其它本领域公知的技术容易地以其它药物学或药理学可接受的阴离子交换由此制备的抗氧化化合物的阴离子。
申请人已确定当阴离子不显示与抗氧化部分、连接部分或亲脂性阳离子部分的反应性时可增强抗氧化化合物盐形式的稳定性。例如，在本发明抗氧化化合物优选的实例的情况下，所述阴离子是非亲核性的。同样有利的是所述阴离子是药物学可接受的阴离子。对于药物组合物而言，还优选该阴离子不对任何其它构成该组合物的物质显示反应性。
非亲核性阴离子的实例包括六氟锑酸根、六氟砷酸根或六氟磷酸根，或者四苯基硼酸根、四(全氟苯基)硼酸根或其它四氟硼酸根、三氟甲基磺酸根、芳基磺酸根和烷基磺酸根如甲基磺酸根以及对-甲苯磺酸根以及磷酸根。
药物学可接受的阴离子的实例包括卤离子如氟离子、氯离子、溴离子和碘离子；无机酸盐阴离子如硝酸根、高氯酸根、硫酸根、磷酸根和碳酸根；低级烷基磺酸盐如甲基磺酸盐和乙基磺酸盐的药物学可接受的阴离子；芳基磺酸盐如苯磺酸盐、2-萘磺酸盐和对-甲苯磺酸盐的药物学可接受的阴离子；有机酸盐如三氯乙酸盐、三氟乙酸盐、羟基乙酸盐、苯甲酸盐、苦杏仁酸盐、丁酸盐、丙酸盐、甲酸盐、延胡索酸盐、琥珀酸盐、柠檬酸盐、酒石酸盐、草酸盐、马来酸盐、乙酸盐、苹果酸盐、乳酸盐和抗坏血酸盐的药物学可接受的阴离子；以及酸性氨基酸盐如谷氨酸盐和天冬氨酸盐的药物学可接受的阴离子。
在本发明抗氧化化合物优选的实例的情况下，卤素阴离子前体被交换为芳基或烷基磺酸根阴离子。实例包括但不限于苯磺酸根、对-甲苯磺酸根、2-萘磺酸根、甲基磺酸根、乙基磺酸根和丙基磺酸根。特别优选的阴离子是甲基磺酸根阴离子。如上所述，其中阴离子是甲基磺酸根的本发明抗氧化化合物实例是特别优选的式III抗氧化化合物，此处称作线粒体醌-C10甲基磺酸盐或线粒体醌-C10甲磺酸盐。
该相同的总工艺可用于制备具有不同的抗氧化部分R连接至一个或多个三苯基鏻(或其它亲脂性阳离子)部分的许多不同的靶向线粒体的化合物。这些包括一系列维生素E衍生物，其中将维生素E官能团与三苯基鏻(或其它亲脂性阳离子)部分偶联的桥长是变化的。其它可用作R的抗氧化剂包括链断裂抗氧化剂如丁基化的羟基苯甲醚、丁基化的羟基甲苯、醌醇、以及常规的自由基捕获剂如衍生化的富勒烯。此外，还可合成可与自由基反应以产生稳定的自由基的自旋捕获剂。这些包括5，5-二甲基吡咯啉-N-氧化物、叔丁基亚硝基苯、tert-亚硝基苯、α-苯基叔丁基硝酮以及相关化合物的衍生物。
应理解的是，就本发明抗氧化化合物而言，正如就任何药物而言，体外活性决不是体内功能或功效的唯一决定因素。本发明抗氧化化合物的抗氧化活性可通过如此处所述的那些采用如离体线粒体和/或离体细胞的方法测定。同时事实上，要用作本发明的靶向线粒体的抗氧化化合物，则抗氧化化合物必须在这种试验中显示适宜的高的抗氧化活性，而要在体内有效，该靶向线粒体的抗氧化化合物必须显示其它所需的理化性质，如适宜的生物利用度、稳定性或抗氧化功能。
具有良好的抗氧化活性而对于体内目标隔室却显示出差的抗氧化功能的抗氧化化合物的实例包括辅酶Q(CoQ)和艾地苯醌。即使要在人类患者中获得极低的临床效果，都必须以非常高的剂量率(如0.5-1.2g)给药这两种化合物。
本发明靶向线粒体的抗氧化化合物的实例显示良好的抗氧化活性和生物利用度，并从而在低剂量率下于体内有效。此处实施例11给出对本发明优选的两亲性靶向线粒体的抗氧化化合物线粒体醌-C10甲磺酸盐和其环糊精复合物的生物利用度的测定。我们认为本发明的抗氧化化合物可有效地将抗氧化活性靶向于线粒体，并同时显示出一种或多种额外的益处：可以晶体或固体形式应用或可配制成固体形式、稳定性更高、生物利用度更高和/或抗氧化功能更高。仍不受任何理论所限，我们认为，本发明抗氧化化合物的物理和化学特征赋予本发明抗氧化化合物优选的特征，从而使它们可用于现有抗氧化化合物因其化学和物理性质而不适用的组合物、剂型和方法以及其它应用中。
在本发明的一些具体实施方案中，所述抗氧化化合物是如上所定义的式II的醌醇衍生物。举例而言，本发明的醌醇衍生物是如上所定义的化合物线粒体醌-C10(式III化合物是其的特定盐形式)。本发明化合物的另一实例是其中(C)n是(CH2)5、且醌醇部分与线粒体醌-C10的相同的式I化合物，此处称作线粒体醌-C5(见图3C)。本发明化合物的另一实例是其中(C)n是(CH2)3、且醌醇部分与线粒体醌-C10的相同的式I化合物，此处称作线粒体醌-C3(见图3B)。本发明化合物的另一实例是其中(C)n是(CH2)15、且醌醇部分与线粒体醌-C10的相同的式I化合物，此处称作线粒体醌-C15(见图3E)。
一旦得以制备，被制备成任何药物学适宜的形式且任选地包含药物学可接受的载体、赋形剂、稀释剂、复合剂或添加剂的本发明化合物即可向需要治疗和/或预防的患者给药。一旦被给药，该化合物即将抗氧化活性靶向于患者细胞内的线粒体。
本发明抗氧化化合物可通过口服和/或胃肠道外途径向患者给药。
所述抗氧化化合物必须被配制成稳定、安全的药物组合物向患者给药。该组合物可根据传统方法、通过将一定量的抗氧化化合物成分溶解或悬浮于稀释剂中制备。该量介于每ml稀释剂含0.1mg至1000mg抗氧化化合物。可添加乙酸盐、磷酸盐、柠檬酸盐或谷氨酸盐缓冲液使最终组合物的pH为5.0到9.5；还可任选地添加糖类或多元醇等渗剂(tonicifier)和选自由间甲酚、苄醇、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸丙酯及对羟基苯甲酸丁酯以及苯酚组成的组中的防腐剂。使用足量的注射用水以获得所需的溶液浓度。若需要，也可使用其它的等渗调节剂(tonicifying agent)如氯化钠以及其它赋形剂。然而，这些赋形剂必须维持抗氧化化合物的总渗透压。
当涉及氢离子浓度或pH时应用术语缓冲剂、缓冲溶液和缓冲的溶液，是指系统、特别是水溶液系统抵抗添加酸或碱或者用溶剂稀释时pH发生变化的能力。当在添加酸或碱时经历pH微小变化的缓冲的溶液的特征是存在弱酸和弱酸盐，或者弱碱和弱碱盐。前述系统的实例是乙酸和乙酸钠。只要添加的氢氧根离子的量不超过缓冲系统中和它的容量，pH的变化就是微小的。
通过维持组合物的pH在约5.0到9.5范围内可增强本发明胃肠道外剂型的稳定性。其它的pH范围如包括5.5到9.0、或6.0到8.5、或6.5到8.0、或7.0到7.5。
用于实施本发明的缓冲液任选自下列缓冲液，如乙酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲液或谷氨酸盐缓冲液，最优选的缓冲液是磷酸盐缓冲液。
还可应用载体或赋形剂以促进该化合物的给药。载体或赋形剂的实例包括碳酸钙、磷酸钙、各种糖如乳糖、葡萄糖、或蔗糖，或各种淀粉、纤维素衍生物、明胶、聚乙二醇和生理学相容的溶剂。
本发明可包括稳定剂，但重要的是这不是必需的。然而，若包括的话，可用于实施本发明的稳定剂是糖类或多元醇。所述多元醇包括如山梨醇、甘露醇、甘油和聚乙二醇(PEG)的化合物。糖类包括如甘露糖、核糖、海藻糖、麦芽糖、肌醇、乳糖、半乳糖、阿拉伯糖或乳糖。
适宜的稳定剂包括例如多元醇，如山梨醇、甘露醇、肌醇、甘油、木糖醇和聚丙二醇/聚乙二醇共聚物，以及各种分子重量为200、400、1450、3350、4000、6000和8000的聚乙二醇(PEG)。
美国药典(USP)规定，多剂量容器内的制剂中必须添加抑制细菌或抑制真菌浓度的抗微生物剂。在用皮下注射针和注射器抽出部分内容物、或使用其它侵入式(invasive)方式如笔式注射器(pen injector)传递时可能无意中将微生物引入制剂中，上述抗微生物剂在用以抑制这些微生物的繁殖时必须存在足够的浓度。应评价抗微生物剂以确保其与配方中的其它成分相容，并评价它们在总配方中的活性以确保在一种剂型中有效的特定物质在另一剂型中也有效。在一种剂型中有效而在另一剂型中无效的特定物质并非罕见。
就常规药物学意义而言，防腐剂是预防或抑制微生物生长、且可被添加至药物组合物中用于该目的以避免随后微生物对组合物的酸败。虽然防腐剂的量不大，但却可能影响抗氧化化合物的总体稳定性。因此，甚至对防腐剂进行选择也可是困难的。
虽然用于实施本发明的防腐剂可在0.005到1.0％(w/v)的范围内，但是各种防腐剂单独或与其它防腐剂组合的优选的范围是：苄醇(0.1-1.0％)、或间甲酚(0.1-0.6％)、或苯酚(0.1-0.8％)、或者对羟基苯甲酸甲酯(0.05-0.25％)与对羟基苯甲酸乙酯或对羟基苯甲酸丙酯或对羟基苯甲酸丁酯(0.005-0.03％)的组合。对羟基苯甲酸酯类是对-羟基苯甲酸的低级烷基酯。
“Remimgton’s Pharmaceutical Sciences”以及Pharmaceutical DosageForms：Parenteral Medications，卷1，1992，Avis等记载了各种防腐剂的详细说明。用于这些目的时，晶体曲恩汀二盐酸盐可以在包含常规的无毒的药物学可接受的载体、佐剂和赋形剂的剂量单位剂型中经胃肠道外给药(包括皮下注射、静脉内、肌内、皮内注射或输注技术)或通过喷雾吸入给药。
还可能需要根据所选择的等渗剂加入氯化钠或其它盐以调整所述药物剂型的渗透压。然而这是任选的，且取决于所选择的特定剂型。胃肠道外剂型必须等渗或基本上等渗，否则给药部位会出现明显的刺激和疼痛。
所需的等渗性可应用氯化钠或其它药物学可接受的物质如葡萄糖、硼酸、酒石酸钠、丙二醇、多元醇(如甘露醇和山梨醇)、或者其它无机或有机溶质获得。通常，所述组合物与个体的血液等渗。
若需要，胃肠道外剂型可用增稠剂如甲基纤维素增稠。所述剂型可制备成油包水或水包油的乳化的形式。可应用多种多样的药物学可接受的乳化剂中的任意乳化剂，包括例如金合欢粉(acacia powder)、非离子型表面活性剂或离子型表面活性剂。
还可能需要向药物剂型中添加适宜的分散剂或助悬剂，举例而言，这些可包括含水悬浮液如合成和天然的树胶，即黄蓍胶、阿拉伯胶、海藻酸盐、葡聚糖、羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮或明胶。
胃肠道外产品最重要的载体是水。用于胃肠道外给药的适宜质量的水必须通过蒸馏或通过反渗透制备。唯有如此才可能从水中充分地分离各种液体、气体和固体杂质。注射用水是用于本发明药物剂型的优选的水性载体。可用氮气吹洗水而从水中除去所有氧气或氧自由基。
其它成分可存在于本发明胃肠道外药物剂型中。这些额外的成分可包括润湿剂、油(例如植物油如芝麻油、花生油或橄榄油)、镇痛剂、乳化剂、抗氧化剂、填充剂、渗透压调节剂、金属离子、油质载体、蛋白质(如人血清白蛋白、明胶或蛋白质)和两性离子(例如氨基酸如甜菜碱、牛磺酸、精氨酸、甘氨酸、赖氨酸和组氨酸)。当然，这些额外的成分不应对本发明药物剂型的总稳定性产生不利的影响。
由于不存在完全不溶或完全不在某些方面影响其所容纳的液体、特别是水性液体的容器，因此容器也是注射剂剂型不可缺少的部分并且可视为一种成分。因此，为特定注射剂选择容器必须基于对容器以及溶液的组成、以及容器将接受的处理的考虑。
为允许皮下注射器针头进入多剂量瓶，并且在注射针一抽出就重新密封，每个瓶子用被铝带固定位置的橡胶盖密封。
玻璃瓶塞如West 4416/50、4416/50(表面涂覆特氟隆)和4406/40、Abbott 5139或任何相当的塞子都可用作剂量瓶的盖子。这些塞子通过了采用患者使用的方式进行的完整性检验，如塞子可耐受至少约100次注射。
上述药物剂型的各种成分都为本领域技术人员所周知且记载于Pharmaceutical Dosage Forms：Parenteral Medications，卷1，2nd ed.，Avis等Ed.，Mercel Dekker，New York，N.Y.1992中，其全文并入此处作为参考。
上述剂型的生产过程包括混合、无菌过滤和填充步骤。混合工艺可例如包括以特定顺序溶解成分，如首先溶解防腐剂，随后是稳定剂/等渗剂、缓冲液，然后是抗氧化化合物，或者同时溶解组成胃肠道外剂型的所有成分。一种制备胃肠道外给药剂型的方法的实例是将抗氧化化合物形式如线粒体醌-C10甲磺酸盐-β-环糊精(1∶2)溶解于水中，并于磷酸盐缓冲溶液中稀释所得混合物。
或者，本发明胃肠道外剂型可通过根据公认的工艺将各成分混合而制备。例如，所选择的化合物可用搅拌器或其它标准装置混合以产生浓混合物，然后通过添加水、增稠剂、缓冲液、5％人血清白蛋白或其它控制等渗的溶质至最终的浓度和粘度。
或者，可将抗氧化化合物作为干燥固体和/或粉末包装，该干燥固体和/或粉末可用溶剂复原(reconstitute)以得到可在复原时应用的本发明胃肠道外剂型。
此外，生产过程可包括任何形成本发明胃肠道外剂型时适宜的灭菌过程。典型的灭菌过程包括过滤、蒸汽(湿热)、干热、气体(如环氧乙烷、甲醛、二氧化氯、环氧丙烷、β-丙内酯(propiolacctone)、臭氧、三氯硝基甲烷、过乙酸、甲基溴等)、暴露于辐射和无菌处理。
胃肠道外给药的适宜途径包括静脉内、肌内、皮下、皮内、皮肤下(sub dermal)、关节内、鞘内、腹腔内等。优选静脉内给药途径。还允许粘膜递药。剂量和剂量方案将取决于受试者的体重和健康状况。
可选择药物学可接受的载体、赋形剂、稀释剂、复合剂或添加剂，从而例如提高抗氧化化合物的稳定性、便于合成或配制成药物剂型、和/或提高抗氧化化合物的生物利用度。
本领域技术人员公知，载体分子如环糊精及其衍生物具有可用作能够改变药物分子理化属性的复合剂的潜力。举例而言，环糊精可稳定(就热力学和氧化性质而言)其复合的活性物质、降低该活性物质的挥发性、并改变该活性物质的溶解度。环糊精是由形成环形结构的吡喃型葡萄糖组成的环状分子。环糊精分子内部疏水而外部亲水，使环糊精分子可溶于水。可通过取代环糊精外部的羟基而改变可溶性的程度。类似地，虽然内部的疏水特性通常允许相对疏水的客体容于腔内，但是也可通过取代改变内部的疏水性。一个分子容于另一分子内称作复合，并且所得产物称为包合复合物。环糊精衍生物的实例包括磺基丁基环糊精、麦芽糖基环糊精(maltosylcyclodexin)、羟丙基环糊精和它们的盐。
本文实施例1和实施例7公开了形成包括靶向线粒体的抗氧化化合物、在此为β-环糊精与线粒体醌-C10复合的包合复合物的药物学可接受的组合物的方法。本文实施例9和实施例10公开了形成包括优选的靶向线粒体的抗氧化化合物线粒体醌-C10甲磺酸盐与β-环糊精相复合的包合复合物的药物学可接受的组合物的方法。
抗氧化化合物-环糊精复合物的理化性质，包括例如药物学性质，可因抗氧化化合物与环糊精的摩尔比的变化或环糊精自身的变化而变化。例如，对优选的通式I抗氧化化合物而言，抗氧化化合物与环糊精的摩尔比(抗氧化化合物：环糊精)可为约10∶1到约1∶10、约5∶1到约1∶5、约4∶1到约1∶4、约2∶1到约1∶2、或约1∶1。在另一实施例中，优选的抗氧化化合物实例线粒体醌-C10与环糊精的摩尔比是1∶2，且环糊精是β-环糊精。
或者，可将抗氧化化合物配制成适合的药物制剂形式以提高该抗氧化化合物的稳定性和生物利用度。例如，片剂可包有肠衣以防止抗氧化化合物在胃内释放，从而可减少不良的副作用的风险、或维持否则会因暴露于胃环境而被降解的抗氧化化合物的稳定性。许多用于此目的聚合物是多酸，它们通过其在水性介质中的溶解度是pH依赖性的，并且它们需要高于通常在胃里遇到的pH值条件的事实起作用。
一种优选的口服控释结构是固体剂型的肠溶包衣。肠溶包衣有助于化合物在暴露于胃液时在特定时期内保持物理地结合于剂型内，但肠溶包衣被设计为在肠液里崩解以迅速吸收。吸收的延迟取决于通过胃肠道的转运速率，因此胃排空速率是重要的因素。对一些给药而言，多单位型(mutiple-unit type)剂型如颗粒剂可能优于单一单位型(single-unittype)。因此，在一个具体实施方案中，本发明的抗氧化化合物可包含于包有肠溶衣的多单位剂型中。在一个更优选的具体实施方案中，通过生成具有存在于惰性核心材料之上的抗氧化化合物-肠溶包衣剂固体的颗粒从而制备抗氧化化合物的剂型。这些颗粒可使抗氧化化合物的吸收延长，并具有良好的生物利用度。
典型的肠溶包衣剂包括但不限于羟丙基甲基纤维素邻苯二甲酸酯、甲基丙烯酸-甲基丙烯酸酯共聚物、聚乙烯乙酸酯-邻苯二甲酸酯和乙酸纤维素邻苯二甲酸酯。
本发明抗氧化化合物和/或其剂型和/或复合物的优选的实例显示出有利的药物学性质。例如，它们易于配制、化学和物理稳定、易溶于水、具有低的吸湿性和具有适宜的贮存期。
现在将参考下列非限制性的试验部分对本发明进行更详细的说明。
实施例
实施例1.线粒体醌-C10的合成
下文描述靶向线粒体的抗氧化化合物线粒体醌-C10的实例——线粒体醌-C10甲磺酸盐和其环糊精复合物的优选的稳定盐形式的优选的合成方法。
阶段1
路线图：
步骤：
1.将艾地苯醌(A1，0.25kg，0.74mol)溶于2.5L反应级(reactiongrade)DCM中，然后将该混合物在惰性气氛下冷却至10±3℃。
2.在环境温度下一次性加入三乙胺(0.152kg，1.5mol)，并且允许该混合物再平衡至10±3℃。
3.然后以能够维持内部温度为约10-15℃的速度逐渐加入甲磺酰氯(0.094kg，0.82mol)在0.5L DCM中的溶液(在此规模下，添加在75分钟后结束)。
4.进一步将反应混合物搅拌15-30分钟，
5.通过TLC检查IPC而确定反应完全(Rf 0.65 5％乙醇/二氯甲烷)。
6.然后用水(0.85L)和饱和碳酸氢钠水溶液(0.85L)洗涤该混合物。
7.在40-45℃减压蒸发有机层至成为红色液体。在环境温度下于高真空干燥额外2-4小时后，直接将由此所获得的粗品A2用于下一步骤。因溶剂截留于液体内，因此产率未知。
阶段2
路线图：
步骤：
1.将艾地苯醌甲磺酸酯(A2，假定自最后一步的产率为100％，0.31kg，0.74mol)溶于2L甲醇中，并随后在惰性气氛下将该混合物冷却至0-5℃。
2.以能够确保内部温度不超过15℃的速度逐份加入硼氢化钠(0.03kg，0.79mol)。反应完全会伴随颜色变化：红色→黄色(在此规模下，添加在20分钟后结束)。
3.进一步将该反应混合物搅拌10-30分钟，
4.通过TLC检查IPC以确定反应完全(A3 Rf0.60 5％乙醇/二氯甲烷，A2 Rf0.65)。
5.然后用2L 2M的盐酸溶液使混合物淬灭并用1.2L的二氯甲烷萃取三次。
6.然后用1.2L的水将合并的有机相洗涤一次，并用无水硫酸镁(0.24kg)干燥。
7.在40-45℃下减压蒸发有机相至成为黄/棕色浆液(syrup)。环境温度下于高真空下干燥额外的2-8小时后，得到0.304kg的粗产品A3，产率为98％，直接将由此所获得的产物用于下一步骤。
阶段3
路线图：
步骤：
1.将三苯基鏻厚块(0.383kg，1.46mol)加入置于适宜大小的圆底烧瓶中的艾地苯醌甲磺酸酯内。
2.然后将烧瓶与旋转式汽化器连接，并在真空下以80-85℃的浴温加热内容物。
3.在此温度下混合物应形成均匀的熔化物。一旦熔化物已形成而且脱气不再明显，就用惰性气氛替代真空，并将混合物在设为80-85℃的浴中温和地旋转约3天。
4.通过1H和31P NMR检查IPC以确定反应完全。在纯化前转化率最少应为95％。
5.然后将混合物冷却至近室温，并溶于0.8L的二氯甲烷。
6.温和加热下逐份地加入3.2L乙酸乙酯，以将所需的产物从过量的三苯基膦中沉淀出来。
7.减压蒸发除去少量的溶剂(以除去DCM)，然后将剩余的混合物冷却至近环境温度并慢慢倾析。
8.然后将剩余的浆状残余物用相同的洗涤方法再洗涤2次，并且最后在高真空下干燥至恒重以获得0.441kg的褐色泡沫，产率89％(注：产物仍含有某些溶剂，见NMR)。将如此获得的A4直接用于下一步。
阶段4
路线图：
步骤：
1.将粗品线粒体醌甲磺酸盐(0.44kg，假定为0.65mol)溶于6L无水DCM中，并用氧气吹洗烧瓶。
2.氧气氛下剧烈搅拌烧瓶内容物30分钟以确保溶剂中的气体饱和。
3.快速一次性加入0.65M NO2在无水DCM中的0.1L的溶液(2mol％NO2)，并于环境温度下于氧气氛下剧烈搅拌混合物4-8小时。
4.然后实施IPC检查以确定反应完全(通过1H和任选地31P NMR)
5.若氧化作用不完全则进一步加入2mol％NO2在DCM中的溶液。其应促使反应完全。进行如上所述的IPC检查。在此规模下，需要8mol％NO2在DCM中的溶液以使反应完全。
6.然后减压蒸发除去溶剂以获得红色的浆状残余物。将该残余物在40-45℃下溶于2L的二氯甲烷中。
7.温和加热下逐份加入3.2L的乙酸乙酯以沉淀所需产物。减压蒸发除去少量溶剂(以除去DCM)，随后将剩余的混合物冷却至近环境温度并倾析。
8.最后将油状残余物在高真空下干燥至恒重以获得红色玻璃状产物(419g，产率94％)。将如此获得的A5直接用于下一步。
阶段5
路线图：
步骤：
1.于40-43℃温和加热下，将粗品线粒体醌甲磺酸盐(A5 0.419kg)溶于6L的水中。
2.于60℃加热下，将β-环糊精1.24kg单独地溶于20L水中。
3.将这两份溶液冷却至近室温，并合并成均匀的混合物。该溶液应在＜5℃贮藏。
4.然后将此橙黄色溶液于-20℃下冷冻，并分批冻干至恒重(至少48小时)。
5.将所得固体轻轻压碎而形成均匀的自由流动的黄色/橙黄色粉末(1.433kg)。
还实施了一种可供选择的方法，其中上述合成方法阶段4的氧化步骤3通过氧气形成气泡穿过溶液实现，显示可通过用NO2氧化之外的氧化方式而促使该氧化反应基本反应完全。
实施例2.靶向线粒体的抗氧化化合物的合成
图2为线粒体醌-C3、线粒体醌-C5和线粒体醌-C15的化学合成方法的略图，以下加以说明。使用Varian 300 MHz仪器获得核磁共振波谱。1H-NMR中CDCl3内的四甲基硅烷为内标。31P NMR中85％磷酸为外标。化学位移(δ)表示为相对于基准的ppm。元素分析由Otago大学Campbell微量分析实验室完成。使用Shimadzu LCMS-QP800X液相色谱质谱联用仪完成电喷雾质谱测定(electrospray mass spectrometry)。在无水乙醇中制备贮备液并于-20℃下避光(in the dark)保存。
线粒体醌-C3(6).图2A显示线粒体醌-C3的合成路径。通过将2，3-二甲氧基-5-甲基-1，4-苯醌(CoQ0)还原成醌醇(Carpino，L.A.，Triolo，S.A.和Berglund，R.A.(1989)J.Org.Chem.54，3303-3310)，然后甲基化以获得1(Lipshutz，B.H.，Kim，S.-k.，Mollard，P.和Stevens，K.L.(1998)Tetrahedron54，1241-1253)而制备起始物质2，3，4，5-四甲氧基甲苯(1)(Lipshutz，B.H.，Kim，S.-k.，Mollard，P.和Stevens，K.L.(1998)Tetrahedron 54，1241-1253)。氮气下将1(6.35g，29.9mmol)在无水己烷(80ml)和N，N，N’，N’-四甲基乙二胺(8.6ml)中的溶液用烘干的(flame-dried)搅拌棒置于烘干的Schlenk管中。室温下缓慢加入正丁基锂的己烷溶液(1.6M，26.2mL)，并将混合物冷却并在0℃下搅拌1小时。冷却至-78℃后，加入无水四氢呋喃(THF；250mL)并取出少量等分反应混合物，用D2O淬灭，并用1H NMR检查以确保完成金属化。然后将黄色的混悬液在氮气、-78℃下转移至另一烘干的含有CuCN(0.54g，6.03mmol)的Schlenk管中。将混合物加热到0℃10分钟，然后冷却至-78℃并加入烯丙基溴(3.62mL)，搅拌反应过夜(19小时)并使温度升至室温。用10％的NH4Cl水溶液(75mL)淬灭反应，并用醚(2×200mL)萃取。用水(2×150mL)、10％的NH4OH水溶液(200mL)和饱和的NaCl水溶液(200mL)洗涤合并的醚萃取液。用MgSO4干燥有机溶剂，过滤并在真空下旋转蒸发除去溶剂而获得粗产物(7.25g)。用硅胶柱色谱采用20％乙醚/己烷洗脱得到1，2，3，4-四甲氧基-5-甲基-6-(2-丙烯基)苯(2)(Yoshioka，T.，Nishi，T.，Kanai，T.，Aizawa，Y.，Wada，K.，Fujita，T.和Horikoshi，H.(1993)，Eur.Pat.Appl.EP549366 A1)(6.05g，83.5％)。1H NMRδ5.84-5.98(1H，m，-CH＝C)，4.88-5.03(2H，m，＝CH2)，3.78，3.80，3.90，3.92(12H，s，OMe)，3.38(2H，d，J＝7.0Hz，Ar-CH2)，2.14(3H，s，Ar-Me)ppm。
在25℃、氩气下将2(8.0g，33.05mmol)的无水THF(45mL)溶液于20分钟内逐滴加入搅拌下的9-硼二环[3.3.1]壬烷(79mL，39.67mmol，0.5M)在THF中的混悬液内。将所得溶液在室温下搅拌过夜，并在65℃、氩气下进一步搅拌2小时。然后将混合物冷却至0℃，并在逐滴加入3M NaOH(53mL)后加入30％的H2O2水溶液(53mL)。室温下搅拌30分钟后，水相用NaCl饱和并用THF萃取3次。用饱和的NaCl水溶液洗涤、干燥(Na2SO4)、过滤和蒸发合并的有机部分得到油状残余物(11.5g)，通过硅胶(200g，以乙醚/己烷1∶9填充)柱色谱纯化。用乙醚/己烷1∶4洗脱得到纯3-(2，3，4，5-四甲氧基-6-甲基-苯基)-丙-1-醇(3)(6.85g，80％)，为粘稠的无色油状物。1H NMRδ3.91，3.90，3.84，3.79(12H，s，OMe)，3.56(2H，t，J＝7.0Hz，-CH2-OH)，2.72(2H，t，J＝7.0Hz，Ar-CH2)，2.17(3H，s，Ar-Me)，1.74(2H，五重峰，J＝7.0Hz，-CH2-)ppm。C14H22O5分析计算：C，62.2；H，8.2。实测：C，62.2；H，8.4％。
室温下搅拌3(3.88g，15mmol)和三乙胺(3.0g，30mmol，4.2mL)在CH2Cl2(50mL)中的溶液10分钟。20分钟内逐滴加入在CH2Cl2(50mL)中的甲磺酰氯(1.8g，1.20mL，15.75mmol)，并于室温下搅拌反应混合物1小时。然后用CH2Cl2(50mL)稀释该混合物并将有机层用水(5×100mL)、10％的NaHCO3水溶液(100mL)洗涤、干燥(MgSO4)、、过滤，并且在真空下通过旋转蒸发除去溶剂获得液体1-(3-甲磺酰基氧基丙基)-2-甲基-3，4，5，6-四甲氧基苯(4)(4.8g，95％)。1H NMRδ4.27(2H，t，J＝7.0Hz，-CH2-O-SO2-Me)，3.91，3.89，3.82，3.78(12H，s，OMe)，3.03(3H，s，-O-SO2-Me)，2.70(2H，t，J＝7.0Hz，Ar-CH2-)，2.17(3H，s，Ar-Me)，1.9(2H，m，-CH2-)ppm。
通过与置于Kimax管并在氩气下密封的三苯基膦(4.08g，15.6mmol)和NaI(7.78g，51.9mmol)的新研磨的混合物相混合，将粗品甲磺酸酯4(3.30g，9.8mmol)直接用于随后的反应。然后将混合物维持在70-74℃下，磁力搅拌3小时，期间混合物从软化的粘稠液体变成玻璃态固体。将试管冷却至室温并用CH2Cl2(30mL)搅拌残余物。然后过滤混悬液并真空蒸发滤液。将残余物溶于极少量CH2Cl2并用过量的乙醚(250mL)研磨以沉淀出白色固体。将该固体过滤并用乙醚洗涤、真空干燥，得到纯[3-(2，3，4，5-四甲氧基-6-甲基-苯基)-丙基]三苯基碘化鏻(5)(5.69g，90％)。1H NMRδ7.82-7.65(15H，m，Ar-H)，3.88，3.86，3.74，3.73(12H，s，OMe)，3.76-3.88(2H，m，CH2-P+)，2.98(2H，t，J＝7.0Hz，CH2-Ar)，2.13(3H，s，Ar-Me)，1.92-1.78(2H，m，-CH2-)ppm。31P NMR(121.4MHz)δ25.32ppm。C32H36IO5P分析计算：C，59.8；H，5.7；P，4.8；实测：C，59.8；H，5.8；P，4.5％。
在分液漏斗内将5的碘化物形式(4.963g，7.8mmol)在CH2Cl2(80mL)中的溶液与10％的NaNO3水溶液(50mL)振摇5分钟。将有机层分离、干燥(Na2SO4)、过滤并真空蒸发，得到5的硝酸盐(4.5g，7.8mmol，100％)，将其溶于CH3CN和H2O的混合物(7：3，38mL)并在0℃、于冰浴下搅拌。然后加入吡啶-2，6-二甲酸(6.4g，39mmol)，随后在5分钟内逐滴加入硝酸高铈铵(21.0g，39mmol)在CH3CN/H2O(1∶1，77mL)中的溶液。0℃下搅拌反应混合物20分钟，然后室温下再搅拌10分钟。然后将混合物倒入水中(200mL)并用CH2Cl2(200mL)萃取、干燥(Na2SO4)、过滤和真空蒸发，得到粗品[3-(4，5-二甲氧基-2-甲基-3，6-二氧代-1，4-环己二烯-1-基)丙基]三苯基硝酸鏻(6)。将总产物溶于CH2Cl2(100mL)并与20％的KBr水溶液(50mL)振摇10分钟。将有机层分离、干燥以及真空蒸发，得到6的溴盐(4.1g，93.6％)。1H NMRδ7.90-7.65(15H，m，Ar-H)，4.15-4.05(2H，m，CH2-P+)，3.96，3.95，(6H，s，OMe)，2.93(2H，t，J＝7.0Hz，CH2-Ar)，2.15(3H，s，Ar-Me)，1.85-1.70(2H，m，-CH2-)ppm。31P NMRδ25.29ppm。
在分液漏斗内将6的溴化物(3.65g，6.5mmol)在CH2Cl2(75mL)中的溶液与10％w/v的甲基磺酸钠水溶液(100mL)振摇5分钟。将CH2Cl2层分离、干燥(Na2SO4)、过滤和真空蒸发，得到[3-(4，5-二甲氧基-2-甲基-3，6-二氧代-1，4-环己二烯-1-基)丙基]三苯基鏻甲基磺酸盐(6)(3.7g，98％)。1H NMRδ7.88-7.60(15H，m，Ar-H)，3.93，3.92，(6H，s，OMe)，3.90-3.78(2H，m，CH2-P+)，2.85(2H，t，J＝7.0Hz，CH2-Ar)，2.70(3H，s，OSO2CH3)，2.09(3H，s，Ar-Me)，1.82-1.68(2H，m，-CH2-)ppm。31P NMR(121.4MHz)δ25.26ppm。C31H33O7PS分析计算：C，64.1；H，5.7；P，5.3；S，5.5。实测：C，63.8；H，5.9；S，5.3；P，5.2％。
线粒体醌-C5(14).图2B显示线粒体醌-C5的合成路径。将二氢吡喃(46.83g，0.55mol)加入溶于乙酸(500mL)中的2，3-二甲氧基-5-甲基-1，4-苯醌醇(CoQ0)(50g，0.275mol)中，并在室温下搅拌10分钟。向该溶液中加入BF3.Et2O(38.57g，0.271mol)。将所得溶液在室温下搅拌18小时。之后将粗反应混合物倒至冰水中(500mL)并用氯仿(1000mL)萃取。将有机萃取物用盐水(500mL)洗涤并干燥(MgSO4)。真空除去溶剂得到红色油状粗品2，3-二甲氧基-5-甲基-6-(四氢吡喃-2-基)-4-(四氢吡喃-2-基氧基)苯酚(7)(115g)，其未进一步纯化即经应用。在大气压力及室温下于5％钯/炭(5.42g)上氢化粗品7(110g)在乙酸/高氯酸(97.5∶2.5，500mL)混合液中的溶液直至氢的吸收停止(3天)。然后将反应混合物通过硅藻土垫过滤并用乙醇(500mL)洗涤固体残余物。将合并的滤液分成三等份，将各份加入蒸馏水(1000mL)中并用CH2Cl2(2×200mL)萃取。用盐水(500mL)、饱和的碳酸氢钠(500mL)、盐水(300mL)洗涤、然后干燥(MgSO4)合并的有机萃取物。然后过滤混合物并真空除去溶剂，获得红色油状粗品4-乙酰氧基-3-(5-乙酰氧基-戊基)-5，6-二甲氧基-2-甲基-苯基乙酸酯(8)(110g)，其不经进一步纯化即用于下一步骤。1H NMRδ4.0-4.15(2H，m，-CH2-O)，3.86(6H，s，2×OMe)，2.58(2H，t，J＝7.0Hz，-CH2-Ar)，2.12(3H，s，Ar-Me)，2.06(6H，s，2×CH3-C＝O)，2.02(3H，s，CH3-C＝O)，1.35-1.70(6H，m，-CH2 CH2 CH2-)ppm。
将氢化锂铝(8.0g，0.21mol)加入置于装有磁力搅拌器、回流冷凝器的、并由室温水浴环绕着的1L的圆底烧瓶内的无水THF(500mL)中。在25-30分钟期间内将粗品8(74g)在无水、新蒸馏的THF(100mL)中的溶液逐滴加入THF/LiALH4混合物中。为了便于搅拌加入额外的无水THF(200mL)，并使其在室温下搅拌反应3小时。然后在缓慢加入蒸馏水(70mL)前通过逐滴添加3M HCl(20mL)淬灭反应。然后过滤反应混合物并将滤液用盐水(2×300mL)洗涤、干燥(MgSO4)、过滤以及真空除去溶剂。用15％HCl(500mL)溶解残存在过滤漏斗内的绿色残余物并用CH2Cl2(1×300mL，2×200mL)萃取。合并有机部分并用盐水(400mL)洗涤、干燥(MgSO4)、过滤和真空蒸发。此萃取物与来自滤液纯化的物质合并得到红色油状粗品2-(5-羟基戊基)-5，6-二甲氧基-3-甲基-苯-1，4-二醇(9)(68.3g)。产物9用硅胶(600g，用10％乙醚/CH2Cl2填充)柱色谱纯化。用10％乙醚/CH2Cl2洗脱得到一些未反应的8和2，3-二甲氧基-5-甲基-1，4-苯氢醌起始材料。用20％乙醚/CH2Cl2洗脱得到9和醌10(14.14g，19％自2，3-二甲氧基-5-甲基-1，4-苯醌醇)的混合物。化合物9在空气中放置缓慢转变成醌10，从而不能获得令人满意的元素分析。1H NMRδ5.41(1H，s，Ar-OH)，5.38(1H，s，Ar-OH)，4.88(6H，s，2×Ar-OMe)，3.65(2H，t，J＝6.3Hz，CH2-OH)，2.61(2H，t，J＝6.4Hz，Ar-CH2)，2.14(3H，s，Ar-Me)，1.42-1.68(6H，m，3×-CH2-)ppm。
大气压力下用氧气饱和醌醇9(7.5g，27.7mmol)在CH2Cl2(150mL)中的溶液，并且加入NO2在CH2Cl2中的溶液(1mL，1.32M)。于室温、氧气氛下搅拌反应18小时，至此TLC(40％乙醚/CH2Cl2)显示醌2-(5-羟基戊基)-5，6-二甲氧基-3-甲基-[1，4]苯醌(10)生成完全。然后真空除去溶剂获得红色油状产物10(Yu，C.A.和Yu，L.(1982)Biochemistry 21，4096-4101)(7.40g)。1H NMRδ3.99(6H，s，2×Ar-OMe)，3.65(2H，t，J＝6.3Hz，CH2-OH)，2.47(2H，t，J＝6.3Hz，Ar-CH2)，2.01(3H，s，Ar-Me)，1.52-1.60(2H，m，-CH2-)，1.37-1.43(4H，m，-CH2 CH2-)ppm。
制备10(7.40g，27.3mmol)在CH2Cl2(150mL)和三乙胺(5.46g，5.46mmol)中的溶液，并在搅拌下于30分钟内加入甲磺酰氯(2.48g，30mmol)在CH2Cl2(50mL)中的溶液。室温下额外搅拌1.5小时后用蒸馏水(5×100mL)、饱和碳酸氢钠(150mL)洗涤反应混合物并干燥(MgSO4)。过滤混合物并在真空下除去溶剂得到红色油状粗品甲磺酸盐(9.03g)。1H NMRδ4.19(2H，t，J＝7.5Hz，-CH2-OMs)，3.95(6H，s，2×Ar-OMe)，2.98(3H，s，OSO2CH3)，2.44(2H，t，J＝7.5Hz，Ar-CH2-)，1.98(3H，s，Ar-Me)，1.75(2H，五重峰，J＝7.5Hz，-CH2-)，1.38-1.48(4H，m，-CH2 CH2-)ppm。将甲磺酸酯溶于10％(w/v)的NaI在丙酮内的溶液(100mL)中，并在室温下搅拌44小时。然后真空下浓缩该混合物并向残余物中添加水(100mL)。用CH2Cl2(3×70mL)萃取该混合物并将合并的有机萃取物用盐水洗涤、干燥(MgSO4)、过滤并真空下除去溶剂，获得粗品2-(5-碘代戊基)-5，6-二甲氧基-3-甲基-[1，4]苯醌(11)。通过硅胶(150g)柱色谱纯化该产物。用CH2Cl2和10％乙醚/CH2Cl2洗脱得到红色油状纯11(7.05g，69％)。1H NMRδ3.99(6H，s，2×Ar-OMe)，3.18(2H，t，J＝6.9Hz，CH2-I)，2.47(2H，t，J＝7.2Hz，Ar-CH2)，2.02(3H，s，Ar-Me)，1.85(2H，五重峰，J＝7.5Hz，-CH2-)，1.38-1.48(4H，m，-CH2-CH2-)ppm。C14H19IO4分析计算：C，44.5；H，5.1；I，33.6。实测：C，44.6；H，5.1；I，33.4％。
用NaBH4(0.16g，4.3mmol)处理11(1.14g，2.87mmol)在甲醇(20ml)中的溶液，1分钟内混合物变为无色。5分钟后，室温下加入5％的HCl水溶液(100mL)并用CH2Cl2(2×50mL)萃取该溶液。将有机部分合并、干燥(MgSO4)、过滤并真空除去溶剂，获得对氧敏感的黄色油状12(1.15g，100％)，其被立即使用。1H NMRδ5.36，5.31(2H，s，Ar-OH)，3.89(6H，s，2×Ar-OMe)，3.20(2H，t，J＝7.5Hz，-CH2-I)，2.62(2H，t，J＝7.5Hz，-CH2-Ar)，2.15(3H，s，Me)，1.82-1.92(2H，m，-CH2-)，1.45-1.55(4H，m，-CH2-CH2-)ppm。将12(1.15g，2.87mmol)和三苯基膦(1.2g，4.31mmol)的混合物置于具有搅拌棒的Kimax管中。将试管用氩气充盈，于70℃密封、加热并搅拌14小时。将形成的暗色固体溶于CH2Cl2(10mL)并在乙醚(200mL)中研磨并迅速过滤形成的白色沉淀。将在暴露于空气中时变得粘稠的沉淀物复溶于CH2Cl2并真空蒸发，得到棕色油状粗产物[5-(2，5-二羟基-3，4-二甲氧基-6-甲基-苯基)-戊基]三苯基碘化鏻(13)(2.07g，115％)。该物质长期保存不稳定，因此尽早地用于了下一步反应。1H NMRδ7.84-7.68(15H，m，Ar-H)，5.45(1H，s，Ar-OH)，5.35(1H，s，Ar-OH)，3.89(3H，s，Ar-OMe)，3.87(3H，s，Ar-OMe)，3.65(2H，m，-CH2-+PPh3)，2.54(2H，t，J＝7.0Hz，Ar-CH2)，2.08(3H，s，Ar-Me)，1.65-1.75(2H，m，-CH2-)，1.45-1.55(4H，m，-CH2CH2-)ppm。31P NMRδ25.43ppm。
用氧气饱和13(2.07g)在CH2Cl2(50mL)内的溶液，并且加入NO2在CH2Cl2内的溶液(0.5mL，1.32M)。然后于室温、氧气氛下搅拌反应18小时。真空除去溶剂以获得红色油状粗产物[5-(4，5-二甲氧基-2-甲基-3，6-二氧代-1，4-环己烯-1-基)戊基]三苯基碘化鏻(14)。将残余物复溶于CH2Cl2(10mL)并用乙醚(200mL)研磨以得到最初的黄色沉淀，其在数分钟内便凝结成红色油状物。倾析出溶剂并将沉淀溶于CH2Cl2，并真空除去溶剂以得到红色油状产物(14)(1.866g)。将等分试样(0.880g)14用硅胶(20g)柱色谱纯化。用CH2Cl2洗脱得到不明紫色物质。用5％乙醇/CH2Cl2洗脱得到红色油状纯碘化物产品14(0.606g)。1H NMRδ7.84-7.68(15H，m，Ar-H)，3.98(6H，s，2×Ar-OMe)，3.65(2H，m，CH2-P+)，2.40(2H，t，J＝7.5Hz，Ar-CH2)，2.00(3H，s，Ar-Me)，1.71(4H，m，-CH2-)，1.43(2H，m，-CH2-)ppm。31P NMR(121.4MHz)δ25.47ppm。C32H36IO4P分析计算：C，59.8；H，5.7；I，19.8；P，4.8；实测：C，60.0；H，5.3；I，19.7；P，4.7％。
线粒体醌-C15(16).图2C显示线粒体醌-C15的合成路径。于2.5小时内将K2S2O8(0.450g，1.66mmol)在水(25mL)中的溶液逐滴加入搅拌下的、维持于75℃的、AgNO3(0.262g，1.54mmol)、16-羟基十六酸(0.408g，1.50mmol)及2，3-二甲氧基-5-甲基-1，4-苯醌(0.271g，1.49mmol)在H2O∶CH3CN(1∶1，36mL)中的混悬液内。搅拌30分钟后冷却并用乙醚(4×30mL)萃取混合物。用H2O(2×100mL)、NaHCO3(1M，2×50mL)和饱和NaCl(2×50mL)洗涤合并的有机相。将有机相干燥(Na2SO4)、过滤及真空浓缩得到红色油状物(0.444g)。粗品油用柱色谱(硅胶，15g)并用CH2Cl2和乙醚(0％，5％20％)的混合物洗脱得到红色油状2-(15-羟基十五烷基)-5，6-二甲氧基-3-甲基-[1，4]苯醌(15)(0.192g，33％)。1H NMRδ3.99，3.98(6H，s，OMe)，3.64(2H，t，J＝6.5Hz，-CH2OH)，2.45(2H，t，J＝7.5Hz，-CH2-环)，1.4-1.2(26H，m，-(CH2)13-)。C24H40O5分析计算：C，70.6；H，9.9；实测：C，70.5；H，9.8％。
将三苯基膦(0.066g，0.25mmol)、Ph3PHBr(0.086g，0.25mmol)和15(0.101g，0.25mmol)于70℃氩气下在密封的Kimax管内搅拌24小时，至此其变成粘稠的红色油状物。将残余物溶于极少量的CH2Cl2(0.5mL)中并倒至乙醚(10mL)中以产生红色油状沉淀。倾去溶剂，将残余物溶于CH3OH(0.5mL)并用含48％HBr(1滴)的H2O(10mL)稀释。形成红色沉淀，在沉淀沉降后倒出上清液并用H2O(5mL)洗涤残余物。然后将残余物溶于乙醇(5mL)并真空除去溶剂。将残余物复溶于CH2Cl2(0.5mL)，用乙醚(5mL)稀释并倾去溶剂，将残余物置于真空系统(0.1mbar)24小时获得[15-(4，5-二甲氧基-2-甲基-3，6-二氧代-1，4-环己二烯-1-基)十五烷基]三苯基溴化鏻(16)(0.111g，61％)，其为接触空气便变成红色油状物的黄色泡沫。1H NMR(299MHz)δ7.6-8.0(15H，m，Ar-H)，3.89(6H，s，OMe)，3.9(2H，m，-CH2-P)，2.6(2H，m，-CH2-环)，1.7-1.1(26H，m，-(CH2)13-)ppm。31P NMR(121.4MHz)δ25.71ppm。电喷雾质谱仪实测(M+)653，C42H54O4P+计算值653。由于包含溶剂的水平不一致，因此燃烧分析结果不理想。
实施例3.靶向线粒体的抗氧化化合物实例的性质
为了适应多种不同的应用，例如如片剂的剂型的配制，本发明认为能够形成靶向线粒体的抗氧化化合物的晶体或固体形式是有利的。类似地，不期望受任何理论所限，本发明认为本发明化合物的抗氧化功能至少部分取决于其理化性质。
表1所示为各种抗氧化化合物的分配系数。通过将400nmol的化合物加入至2ml PBS-饱和的辛-1-醇中并于37℃下与2ml辛-1-醇饱和的PBS混合30分钟，从而测定辛-1-醇/PBS分配系数。由268nm的紫外吸收测量化合物在两相中的浓度，并通过化合物在辛-1-醇饱和的PBS或PBS-饱和的辛-1-醇中的标准曲线定量(Kelso，G.F.，Porteous，C.M.，Coulter，C.V.，Hughes，G.，Porteous，W.K.，Ledgerwood，E.C.，Smith，R.A.J.，和Murphy，M.P.，2001，J Biol Chem 276，4588；Smith，R.A.J.，Porteous，C.M.，Coulter，C.V.，和Murphy，M.P.，1999，Eur J Biochem 263，709)。在无水乙醇中制备化合物的贮备液并于-20℃下避光保存。[3H]TPMP来自美国Radiolabelled Chemicals Inc，(MO，USA)。
需要特别注意的是，桥连抗氧化部分和鏻的碳原子数量少的化合物的分配系数低。例如，在本发明范围内的化合物，此处是指具有3碳桥的线粒体醌-C3的分配系数比相关化合物线粒体醌-C10所观察到的分配系数低约50倍(表1)。
表1.抗氧化剂和相关化合物的分配系数
数据a-c是如上所述于25℃或37℃测定的辛-1-醇/磷酸盐缓冲液的分配系数，或者是使用如Jauslin，M.L.，Wirth，T.，Meier，T.，和Schoumacher，F.，2002，Hum Mol Genet 11，3055所述的Advanced ChemistryDevelopment(ACD)Software Solaris V4.67计算所得的辛醇/水的分配系数d。
a Kelso，G.F.，Porteous，C.M.，Coulter，C.V.，Hughes，G.，Porteus，W.K.，Ledgerwood，E.C.，Smith，R.A.J.，和Murphy，M.P.，2001，J Biol Chem 276，4588。
b Smith，R.A.J.，Porteous，C.M.，Coulter，C.V.，和Murphy，M.P.1999 Eur JBiochem 263，709。
c Smith，R.A.J.，Porteous，C.M.，Gane，A.M.，和Murphy，M.P.2003 Proc NatAcad Sci 100，9，5407。
从它们的辛-1-醇/PBS分配系数中明显看出，线粒体醌-C3、线粒体醌-C5、线粒体醌-C10和线粒体醌-C15跨越了的疏水性差异很大。线粒体醌-C3的辛-1-醇/PBS分配系数类似于简单的、相对可溶于水的TPMP阳离子，而线粒体醌-C15的辛-1-醇/PBS分配系数显示其具有非常低的水溶性。据报道，烷基三苯基鏻阳离子如线粒体醌被吸附至磷脂双层上，其中阳离子位于羧酸基团水平，而疏水性烷基基团穿透至膜的疏水性核。据信，亚甲基桥越长，则抗氧化泛醌醇穿透至膜的疏水性核越深。图3所示为我们认为这些化合物会穿透至膜单层的最大程度。这个模型显示线粒体醌-C3的泛醌醇部分仅穿透至近膜表面处，而线粒体醌-C10和线粒体醌-C15的泛醌醇部分则穿透至近磷脂双层的核处。
我们已经合成一系列具有不同疏水性和可穿透至磷脂双层不同深度的抗氧化化合物。
实施例4.线粒体对靶向线粒体的化合物的吸收
为了证明靶向线粒体是有效的，测定了线粒体反应膜电位而对抗氧化化合物实例线粒体醌-C3、线粒体醌-C5、线粒体醌-C10和线粒体醌-C15的吸收。
为了测量被施以电压的线粒体对抗氧化化合物的吸收，建立了离子选择电极(Smith，R.A.，Kelso，G.F.，James，A.M.和Murphy，M.P.(2004)Meth.Enzymol.382，45-67；Davey，G.P.，Tipton，K.F.和Murphy，M.P.(1992)Biochem.J.288，439-443；Kamo，N.，Muratsugu，M.，Hongoh，R.和Kobatake，Y.(1979)J.Membr.Biol.49，105-121)。将电极及Ag/AgCl参比电极穿过气密的Perspex盖、于30℃插入搅拌下的、恒温的3ml温育室内，其配有添加底物的注射口。为了测量抗氧化化合物的吸收，在30℃下将大鼠肝脏线粒体(1mg蛋白/ml)在KCl培养基(120mM KCl，10mMHEPES，pH为7.2，1mM EGTA)和尼日利亚菌素(1μg/ml)以及鱼滕酮(8μg/ml)内温育。将琥珀酸盐(10mM)和FCCP(500mM)加入所示部位。离子选择电极的输出经前端的pH放大器被传输入PowerLabData采集器系统，并且使用Chart软件进行分析，所有这些均来自ADInstruments。
通过匀浆化、随后通过在含有250mM蔗糖、5mM Tris-HCl、1mM的EGTA、pH为7.4的冰冷的缓冲液中差速离心制备大鼠肝脏线粒体(Chappell，J.B.和Hansford，R.G.(1972)在：Subcellular components：preparation and fractionation，pp.79-91(Brinie，G.D.，Ed.)Butterworths，London)。通过采用以BSA作为标准的缩二脲试验测定蛋白含量(Gornall，A.G.，Bardawill，C.J.和David，M.M.(1949)J.Biol.Chem.177，751-766)。通过于25℃将补充有50nCi[3H]TPMP的500nM TPMP加至混悬于KCl培养基(120mM KCl，10mM HEPES，pH7.2，1mM EGTA)的线粒体中测量线粒体膜电位(Brand，M.D.(1995)：Bioenergetics-a practicalapproach，pp.39-62(Brown，G.C.和Cooper，C.E.，Eds.)IRL，Oxford)。温育后，线粒体通过离心形成颗粒(pelleted)，用闪烁计数测定上清液和颗粒中[3H]TPMP的量，并且在假定线粒体体积是0.5μl/mg线粒体蛋白和TPMP结合校正值是0.4的情况下计算膜电位(Brown，G.C.和Brand，M.D.(1985)Biochem.J.225，399-405)。
我们建立离子选择电极以测量它们的稳态浓度(Smith，R.A.，Kelso，G.F.，James，A.M.和Murphy，M.P.(2004)Meth.Enzymol.382，45-67；Davey，G.P.，Tipton，K.F.和Murphy，M.P.(1992)Biochem.J.288，439-443；Kamo，N.，Muratsugu，M.，Hongoh，R.和Kobatake，Y.(1979)J.Membr.Biol.49，105-121)。这些电极对简单的三苯基鏻阳离子如TPMP的反应是Nerstian反应，30℃时电极电压对log10[阳离子浓度]的反应呈线性，且斜率为～60mV(Davey，G.P.，Tipton，K.F.和Murphy，M.P.(1992)Biochem.J.288，439-443；Kamo，N.，Muratsugu，M.，Hongoh，R.和Kobatake，Y.(1979)J.Membr.Biol.49，105-121)。最亲水的化合物线粒体醌-C3在高于10μM浓度时也可给出具有接近60mV斜率的Nernstian电极反应。对此，图4A右侧通过在不存在线粒体时电极对连续加入的1pM线粒体醌-C3的反应的对数加以说明。对线粒体醌-C5、线粒体醌-C10和线粒体醌-C15而言，在不存在线粒体时电极都能对该连续的加入快速并稳定地反应(分别为图4B、4C和4D右侧组)。然而，在这些情况下电极反应不是Nernstian反应，我们认为这归因于这些化合物具有更高的疏水性。即使如此，对于全部四种抗氧化化合物而言，离子选择电极能够测量这些化合物的游离浓度，从而能够测量线粒体对它们的实时吸收。
为了测量抗氧化化合物的吸收，在鱼滕酮存在下将线粒体加入电极室以防止膜电位的形成(图4左侧)。然后我们连续5次添加1μM抗氧化化合物以校正电极反应，随后添加呼吸基质琥珀酸盐以产生膜电位。对线粒体施以电压导致线粒体快速吸收所有抗氧化化合物变体(variants)，而接下来添加的解偶联剂FCCP消除了该膜电位并导致它们从线粒体快速释放(图4A-D，左侧)。这些试验清楚地表明，线粒体对线粒体醌-C3、线粒体醌-C5和线粒体醌-C10的吸收是膜电位依赖性。虽然在诱导膜电位时线粒体醌-C15也被线粒体吸收，但是在线粒体存在下电极对线粒体醌-C15的反应很弱、噪音强且更易于漂移。这与不存在线粒体时线粒体醌-C15的电极反应(参见右侧组)相反，且归因于在线粒体存在下其游离浓度低。
然后测定抗氧化化合物结合至未加电的线粒体的程度(图4，右侧)。这些试验中，首先将抗氧化化合物变体加至电极室，然后在鱼滕酮存在下加入线粒体以防止膜电位形成。由于抗氧化化合物结合至未加电的线粒体，因此在添加线粒体时抗氧化化合物的浓度降低。接下来添加琥珀酸盐以产生膜电位表明化合物吸收依赖于膜电位，然后该吸收通过加入FCCP消除膜电位而被逆转。
线粒体醌-C3的游离浓度不受线粒体加入的影响，这表明线粒体醌-C3结合至未加电的线粒体的量可以忽略(图4A，右侧)。用琥珀酸盐施以电压时对FCCP敏感的线粒体醌-C3的吸收是约3.7nmol线粒体醌-C3/mg蛋白，对应于～2×103的累积比率。考虑到线粒体内结合的校正值，这与由Nernst方程以及约为180mV的线粒体膜电位所预期的相一致。
对线粒体醌-C5而言，该化合物与未加电的线粒体存在相当的结合(～0.6nmol/mg蛋白)，然而相对其之后在用琥珀酸盐施以电压时的吸收而言，这是可忽略的，该吸收为约2.8nmol线粒体醌-C5/mg蛋白，对应于～1.4×103的累积比率(图4B，右侧)。
对线粒体醌-C10而言，约2.6nmol线粒体醌-C10与未加电的线粒体大量结合，并且随后在添加琥珀酸盐时进一步吸收约1nmol/mg蛋白(图4C，右侧)。
几乎全部的游离线粒体醌-C15都结合至未加电的线粒体，但是在用琥珀酸盐施以电压时还存在一定的进一步吸收。图4D左侧清楚地表明线粒体醌-C15的吸收是膜电位依赖性，其中当在线粒体的存在下对电极进行校正时电极反应高度灵敏，使得能够测量少量的游离线粒体醌-C15。与此相反，图4D右侧中难以看出线粒体醌-C15的吸收，其中在不存在线粒体时电极反应非常不灵敏，从而不能测得线粒体醌-C15。
这些试验表明，抗氧化化合物的亚甲基桥至少部分决定其吸收至线粒体膜的程度(图4右侧)。吸收从线粒体醌-C3的可忽略到线粒体醌-C15的几乎完全结合不等。在将线粒体醌-C15加至未加电的线粒体时基本上所有化合物都结合，跨越内膜和外膜表面分布。我们认为，当诱导膜电位时将出现化合物从内膜外表面及外膜大量地再分布至朝向基质(matrix-facing)的内膜表面。总之，膜电位驱使所有抗氧化化合物变体都被吸收至线粒体，并且亚甲基桥越长其至磷脂双层的吸收越强。
实施例5.靶向线粒体的化合物的实例的抗氧化效能
本发明化合物还可高度有效地对抗氧化应激。为了测量抗氧化效能，通过测量在暴露于亚铁离子和过氧化氢的线粒体内TBARS的累积测量抗氧化化合物抑制线粒体内脂质过氧化反应的能力(图5)。
采用TBARS试验定量脂质过氧化反应。将大鼠肝脏线粒体(2mg蛋白/ml)于37℃在补充有10mM琥珀酸盐及8mg/ml鱼滕酮或包含2.5mM ATP、1mM磷酸烯醇丙酮酸和4U/ml丙酮酸激酶的ATP再生系统的0.8ml含100mM KCl、10mM Tris-HCl、pH为7.6的培养基中温育。然后于37℃通过添加50mM FeCl2/300mM H2O2将线粒体暴露于氧化应激15分钟。温育后，添加64ml 2％(w/v)丁基化的羟基甲苯在乙醇中的溶液，然后添加200ml 35％(v/v)HClO4和200ml 1％(w/v)硫代巴比土酸。然后将样品于100℃下温育15分钟、离心(12,000×g，5分钟)、并将上清液转移至玻璃试管。添加3ml水和3ml丁-1-醇后，涡旋样品并使两相分离。然后用荧光读板器(fluorometric plate reader)(λEx＝515nm；λEm＝553nm)分析有机层的200ml等分试样以测量硫代巴比土酸反应物(TBARS)并与从0.01-5mM 1，1，3，3-四乙氧基丙烷制备的丙二醛(MDA)标准曲线作对比(Kelso，G.F.，Porteous，C.M.，Coulter，C.V.，Hughes，G.，Porteous，W.K.，Ledgerwood，E.C.，Smith，R.A.J.和Murphy，M.P.(2001)J.Biol.Chem.276，4588-4596)。
对于以琥珀酸盐施以电压的线粒体而言，虽然TBARS的背景水平可以忽略，但是在暴露于氧化应激时其增加至约3.75nmol MDA/mg蛋白(图5A；实心柱)。高浓度(5μM)的任何抗氧化化合物很大程度上抑制了TBARS的累积，而简单的阳离子TPMP没有。这证实了是线粒体醌抗氧化化合物的泛醌醇侧链而不是阳离子与线粒体的任何非特异性的相互作用导致了该抗氧化作用。
在这些试验中，琥珀酸盐既维持膜电位以驱使阳离子吸收至线粒体，又将线粒体醌抗氧化化合物的泛醌形式再生成活性抗氧化泛醌醇形式(Kelso，G.F.，Porteous，C.M.，Coulter，C.V.，Hughes，G.，Porteous，W.K.，Ledgerwood，E.C.，Smith，R.A.J.和Murphy，M.P.(2001)J.Biol.Chem.276，4588-4596)。为了观察线粒体醌抗氧化化合物的抗氧化效能是否需要其被呼吸链还原，我们将线粒体在ATP和ATP再生系统存在下温育。ATP水解和线粒体ATP合酶的逆转导致大范围的可建立类似由琥珀酸盐产生的膜电位的质子泵(proton pumping)(图5B)。这将导致与由琥珀酸盐施以电压的线粒体相同的对线粒体醌抗氧化化合物的吸收，但是现在线粒体醌抗氧化化合物却不再通过呼吸链再生成它们的活性泛醌醇形式。与通过琥珀酸盐施以电压的线粒体中所见的惊人的保护作用(图5b，黑色柱)相比，线粒体醌抗氧化化合物对抑制由ATP水解施以电压的线粒体内的脂质氧化反应无效(图5a，白色柱)。因此，线粒体醌抗氧化化合物的抗氧化效能要求呼吸链还原线粒体醌抗氧化化合物并通过线粒体膜电位累积。
用琥珀酸盐适宜电压的线粒体的对照样品所观察到的脂质过氧化反应水平相对用ATP施以电压的那些而言更低(图5A)。这是由于在琥珀酸盐存在时维持被还原的却在ATP存在时为被氧化的内源性线粒体辅酶Q池的保护性抗氧化效应(Jame，A.M.，Smith，R.A.和Murphy，M.P.(2004)Arch.Biochem.Biophy.423，47-56；Ernster，L.，Forsmark，P.和Nordenbrand，K.(1992)Biofactor 3，241-8)。总之，全部线粒体醌抗氧化化合物需要经呼吸链激活为有效的抗氧化剂。
图5A中所有线粒体醌抗氧化化合物都使用单一浓度5pM。为了比较它们的相对抗氧化效能，我们在琥珀酸盐的存在下滴定这些化合物：图5C所示为典型的滴定。这个试验表明，这些化合物的抗氧化效能与亚甲基桥长相关。为了对其定量，我们计算了四种线粒体醌抗氧化化合物实例抑制脂质过氧化反应的IC50值(图4D)。这些测量证实，抗氧化效能的次序为：线粒体醌-C15＞线粒体醌-C10＞线粒体醌-C5＞线粒体醌-C3。
所有的线粒体醌抗氧化化合物都被线粒体膜电位驱使至线粒体内累积。对最疏水的化合物线粒体醌-C15而言，该作用由于其广泛结合至磷脂双层而在很大程度上被掩盖。全部化合物都是有效的抗氧化剂，并且要获得15分钟以上的持久抗氧化活性，它们都需要呼吸链的作用以在已除去脂质过氧化反应中间体的毒性后使线粒体醌抗氧化化合物再生为其活性形式。
实施例6.靶向线粒体的抗氧化化合物对心脏血液动力学和线粒体功能的作用。
使用Langendorf离体心脏灌流模型评价给药靶向线粒体的抗氧化化合物特别是线粒体醌-C10和线粒体醌-C3对心脏功能的作用。将大鼠分成下列四组给药：对照组(安慰剂)、TPMP(甲基三苯基鏻)、线粒体醌-C10和线粒体醌-C3。处理期后人道地处死大鼠并将离体心脏连接至Langendorf离体灌流系统。该系统在测量心脏功能时采用通过主动脉的反向灌流以维持心脏。用左室气囊测量左室压。还测量了冠状血流量。
图6描述左室压为10mmHg时各处理组的冠状血流量。在局部缺血前和诱导局部缺血后的0分钟、20分钟、40分钟和60分钟测量冠状血流量。进行具有Bonferroni事后检验(post hoc test)的单因素ANOVA。相对局部缺血前对照的显著性：*P＜0.01；**P＜0.01；***P＜0.001。各时间组间的显著性：p＜0.05；p＜0.01；p＜0.001。
结果表明，用线粒体醌-C10处理能显著地减轻局部缺血诱导的冠状血流减少。在后来的时间点线粒体醌-C3具有相对差但仍显著的作用。给药TPMP未发生任何作用表明导致所观察到的靶向线粒体的抗氧化化合物的作用的是线粒体醌-C10和线粒体醌-C3的抗氧化部分而不是三苯基鏻阳离子。
图7描述在10mmHg时处理对左室舒张压的作用。在诱导局部出血前测量左室舒张压并于诱导局部缺血后0分钟、20分钟、40分钟和60分钟再次测量。统计分析是具有Dunns事后检验的基于秩的ANOVA。相对局部缺血前对照的显著性：*P＜0.05。代表相对60分钟缺血后对照P＜0.05。结果表明，用线粒体醌-C10处理导致相对未接受处理的大鼠左室舒张压统计学显著性地增加，减轻了局部缺血诱导的左室舒张压降低。给药TPMP未发生任何作用表明造成所观察到的靶向线粒体的抗氧化化合物的作用的是线粒体醌-C10的抗氧化部分而不是三苯基鏻阳离子。
然后测定了给药线粒体醌-C10和线粒体醌-C3对心率的作用。图8描述各处理组局部缺血前以及诱导局部缺血后0分钟、20分钟、40分钟和60分钟的心率。所示的结果是单因素ANOVA以及随后的bonferroni事后检验。***代表相对局部缺血前对照p＜0.001。代表相对各缺血后对照p＜0.05。结果表明相对对照组大鼠，用线粒体醌-C10处理能显著地减轻局部缺血诱导的心率降低。给药TPMP未发生任何作用，表明造成所观察到的靶向线粒体的抗氧化化合物的作用的是线粒体醌-C10的抗氧化部分而不是三苯基鏻阳离子。
还通过测定给靶向药线粒体的抗氧化化合物对心脏收缩和舒张率的作用评价心脏功能。图9A描述四个处理组每组中局部缺血前和诱导局部缺血后0分钟、20分钟、40分钟和60分钟的收缩率(contraction rate)。图9B描述四处理组每组中局部缺血前和诱导局部缺血后0分钟、20分钟、40分钟和60分钟的舒张率(ralaxation rate)。所有情况下，对秩进行具有Dunns事后检验的单因素ANOVA。*代表相对局部缺血前对照P＜0.05。代表相对各缺血后时间对照P＜0.05。代表相对各缺血后时间对照P＜0.01。
结果表明当与对照大鼠相比时，给药线粒体醌-C10具有统计学显著的减轻局部缺血诱导的左室收缩和舒张率降低的作用。
以上数据清晰地表明，给药靶向线粒体的抗氧化化合物对心脏功能具有有利作用。为了确定所观察到的对心脏功能的作用是否归因于靶向线粒体的抗氧化化合物对线粒体功能的作用，因此评价各处理组局部缺血前和局部缺血后的线粒体活性。图10A描述局部缺血前和局部缺血后四组处理组各组的线粒体的NAD+相关的呼吸功能(NAD+linkedrespiratory function)。图10B代表局部缺血前和局部缺血后四组处理组中各组的FAD相关的呼吸功能。***代表相对局部缺血前对照显著性p＜0.001。代表相对缺血后对照的显著性是p＜0.001。
这些数据表明，相对对照大鼠，线粒体醌-C10对局部缺血后的线粒体呼吸功能具有统计学显著的有益作用。这些结果支持给药靶向线粒体的抗氧化化合物对心脏功能的作用归因于对线粒体功能的保护作用的结论。
实施例7.线粒体醌-C10与β-环糊精复合物的稳定性
在处方前研究中发现线粒体醌-C10的溴盐的在固态下于25℃、50％RH和40℃、75％RH保存时随时间降解。本试验的目的是证实线粒体醌-C10的固态稳定性是否因与β-环糊精复合而改善。
Industrial Research Limited(新西兰)提供批号为6的线粒体醌-C10和艾地苯醌。β-环糊精(批号70P225)购自ISP technologies Inc。NaCl、NaH PU和甲醇(HPLC)购自BDH。
纯线粒体醌-C10的固态稳定性
将线粒体醌-C10样品(约5mg)精密称定于透明瓶中并暴露于25℃，50％RH；40℃，75％RH；以及4℃于硅石上。于1、2、4、8、16、32和64天后除去瓶子，并通过经验证的HPLC方法以于硅石上-20℃保存的线粒体醌-C10为对照进行分析。
线粒体醌-C10：β-环糊精复合物的制备
使用批号为6的线粒体醌-C10制备三种具有不同摩尔比的(线粒体醌-C10溴化物：β-环糊精为1∶1、1∶2和1∶4)的复合物。
制备β-环糊精的水溶液
将β-环糊精(1.1397g，水分含量校正后等于1.0361g)精密称重并超声10分钟使其溶于重蒸水中。补水至100ml体积。
线粒体醌-C10：β-环糊精(1∶1摩尔比)复合物的制备
氮气下将线粒体醌-C10溴化物(90mg，相当于59.95mg的线粒体醌-C10)的乙醇溶液置于维持于40-50℃的热板上蒸发8分钟。将β-环糊精溶液(10ml)和重蒸水(30ml)加入烧杯中，然后超声40分钟。
线粒体醌-C10：β-环糊精(1∶2摩尔比)复合物的制备
氮气下将线粒体醌-C10溴化物(89.8mg，相当于59.82mg的线粒体醌-C10)的乙醇溶液置于维持于37-45℃的热板上蒸发10分钟，随后于50℃蒸发3分钟。将β-环糊精溶液(20ml)和重蒸水(20ml)加入烧杯中，然后超声30分钟。
线粒体醌-C10：β-环糊精(1∶4摩尔比)复合物的制备
氮气下将线粒体醌-C10溴化物(90mg，相当于59.95mg的线粒体醌-C10)的乙醇溶液置于维持于37-50℃的热板上蒸发12分钟。将β-环糊精溶液(40ml)加入烧杯中，然后超声20分钟。
通过于-18℃下保存过夜使上述全部溶液冻结。使用LABCONO冷冻干燥器冻干冻结的溶液2天。将冻干的化合物于-20℃下保存。
冻干线粒体醌-C10：β-环糊精复合物的差示扫描量热法测定
使用Perkin Elmer Differential Scanning Calorimeter PYRIS-1对三种冻干的复合物进行差示扫描量热法测定。通过在氮气下于35-50℃蒸发其乙醇溶液10分钟制备线粒体醌-C10样品。
使用铝皿(No.0219-0041，由Perkin-Elmer提供)。分析在氮气吹扫下进行。应用空铝皿设置基线。
扫描温度范围是50-160℃，刚开始在50℃维持1分钟，随后以10℃/min速率增加直至160℃。
HPLC测定
建立线粒体醌-C10的HPLC方法，使用甲醇和0.01M磷酸二氢钠(85∶15)作为流动相，流速为1ml/min并且应用265nm处的UV-VIS检测器。内标物是艾地苯醌。色谱柱是粒径为5μ的Prodigy ODS3100A(Phenomenex)。以后在新柱子来后修改了此方法。在修改后方法中所使用的流动相是甲醇和0.01M磷酸二氢钠(80∶20)。这个方法已经过验证。在测定线粒体醌-C10：β-环糊精复合物前，检查在此HPLC方法中β-环糊精的干扰。结果显示β-环糊精不干扰线粒体醌-C10的HPLC测定。
线粒体醌-C10：β-环糊精复合物的稳定性研究
由于存在三种线粒体醌-C10和β-环糊精的复合物，所以5mg不同复合物的样品中的线粒体醌-C10的量不同。为了在不同的复合物中得到等量的线粒体醌-C10，取了不同重量的复合物：4mg含1.473mg线粒体醌-C10的1∶1复合物、6.5mg含1.469mg线粒体醌-C10的1∶2复合物和11.5mg含1.467mg线粒体醌-C10的1∶4复合物，并依照标准操作规程用于稳定性研究。
向各样品瓶中加入等分试样的HPLC水(1.5ml)以完全溶解线粒体醌-C10：β-环糊精复合物。用水将这些溶液的等分试样(50μl)稀释至1ml。将这些稀释的线粒体醌-C10：β-环糊精复合物的等分试样(100μl)与200μl甲醇中的10μg/ml内标溶液涡旋。然后将这些样品以10000rpm离心10分钟，并将50μl上清液注入HPLC系统。使用浓度范围为2.5到120μg/ml含5mg/ml的β-环糊精的线粒体醌-C10溶液制备标准曲线。
所有的化合物都为浅桔黄色且外观非常蓬松。颜色不均一且朝向冻干瓶的底部更浓。
DSC的结果如下所示：
线粒体醌-C10：当测定纯线粒体醌-C10样品时，120℃以上观察到峰。一种线粒体醌-C10样品可观察到介于130℃和140℃之间的两个主峰。当分析另一种样品时，观察不到这样的主峰但是在120℃以上观察到一些小峰。分析后，剪开皿并检查样品。两种情况下样品颜色都是暗绿至黑色。
β-环糊精：在70℃和85℃间有一宽峰。
线粒体醌-C10：β-环糊精(1∶1)复合物：未观察到明显的峰。分析后剪开皿并检查。样品颜色轻微变化至浅棕色(无明显变化)。
线粒体醌-C10：β-环糊精(1∶2)复合物：未观察到明显的峰。分析后观察到样品颜色无明显变化。
线粒体醌-C10：β-环糊精(1∶4)复合物：未观察到明显的峰，但在120℃观察到一非常小的放热峰。分析后观察到样品颜色无明显变化。
线粒体醌-C10纯样品峰的外观表明样品内正随温度发生变化。然而，由于样品中有许多峰以及样品颜色改变，因此可能由于是降解导致它们的发生。当分析另一份线粒体醌-C10样品时，其给出与第一份样品的不同的热分析图。在复合物情况下，无明显的峰和任何颜色变化。
表2和图11所示为纯线粒体醌-C10(批号：No.3)的固态稳定性研究结果。
表2.线粒体醌-C10(批号No.3)的固态稳定性
线粒体醌-C10(批号No.3)在避光下于40℃，75％RH；25℃，50％RH以及5℃于蓝硅胶上的固态稳定性。数据是表达为最初含量百分比的两个值的平均值。
由于与40℃，75％RH相比在25℃，50％RH下时显著不稳定，因此用线粒体醌-C10批号No.4在25℃，50％RH下重复进行稳定性试验。该第二次稳定性试验同时在透明的和琥珀色瓶中进行，并且结果如表3和图12中所示。
表3.线粒体醌-C10(批号No.4)的固态稳定性
避光测量线粒体醌-C10(批号No.4)在25℃，50％RH下的固态稳定性。数据为表达为最初含量的百分比的三个值的平均值。
Chemistry Department提供的两批次(批号No.3和4)的线粒体醌-C10在16天后含量突然下降。然而，与批号No.3相比，批号No.4在32至64天后的降解不如批号No.3强烈。还观察到无论瓶子是透明还是琥珀色都不影响线粒体-C10的稳定性。
将IRL提供的线粒体醌-C10用于制备线粒体醌-C10：β-环糊精复合物。IRL提供的线粒体醌-C10是乙醇溶液中的红-黄色浆。表4和图13、14及15所示为线粒体醌-C10：β-环糊精复合物的稳定性。由于可用于研究的线粒体醌-C10：β-环糊精复合物量少，因而没有第一天和第四天的结果。
表4.线粒体醌-C10：β-环糊精复合物的固态稳定性
线粒体醌-C10：β-环糊精复合物在避光下40℃，75％RH；25℃，50％RH和5℃于蓝硅胶上的固态稳定性。数据为表达为百分比的两个值的平均值。
结果显示线粒体醌-C10可有效地与β-环糊精形成复合物，并且可通过与β-环糊精复合而被稳定化。这些结果表明在1∶1和1∶2的β-环糊精复合物中的线粒体醌-C10在各种条件下均稳定。结果还表明在1∶4复合物中的线粒体醌-C10的稳定性与1∶1和1∶2的β-环糊精复合物中的线粒体醌-C10的稳定性相比有所降低。
实施例8.线粒体醌-C10甲磺酸盐的稳定性研究
线粒体醌-C10甲磺酸盐的溶液稳定性
在两种温度25℃和40℃、两种气氛条件空气和氮气下依照申请人的标准操作规程测定了线粒体醌-C10甲磺酸盐在五种溶剂：水、0.01MHCl、0.01M NaOH、IPB(pH 7.4)和50％MeOH中125天的溶液稳定性。
通过稀释1mg/ml线粒体醌-C10甲磺酸盐水中的贮备液制备五种溶剂中的线粒体醌-C10甲磺酸盐溶液(100μg/ml)。将溶液(5ml)置于玻璃瓶中，用空气或氮气吹扫，密封并放置储藏。于第0、1、2、4、8、16、32、64和125天收集等分试样(0.25ml)并用HPLC测定线粒体醌-C10的浓度。
表5所示为试验结果。因为线粒体醌-C10甲磺酸盐在0.01M NaOH中15分钟内就分解，所以未包括线粒体醌-C10甲磺酸盐在该溶剂中的稳定性。结果表明(a)溶液稳定性与溶液上的气氛无关，以及(b)温度对除HCl外的所有溶剂中线粒体醌-C10的稳定性有显著的影响。
表5.线粒体醌-C10甲磺酸盐在四种不同的溶剂中在不同条件下的溶液稳定性
数据是表达时间为0时的值的百分比的两个值的平均值。
图16、17、18和19中也显示了线粒体醌-C10甲磺酸盐在四种溶剂中的稳定性。
线粒体醌-C10甲磺酸盐的固态稳定性
依照申请人的标准操作规程在避光的三种不同条件下进行线粒体醌-C10甲磺酸盐的固态稳定性研究：40℃，75％RH；25℃，50％RH和4℃于蓝硅胶上。
将已知重量的线粒体醌-C10甲磺酸盐置于透明玻璃瓶中，并在不同条件下保存。于第1、2、4、8、16、32、64和125天取出双份样品并在将样品溶于水后通过HPLC测定线粒体醌-C10甲磺酸盐的浓度。结果如表6和图20所示。
线粒体醌-C10甲磺酸盐在4℃于硅胶上在125天期间且在25℃/50％RH条件下60天期间稳定(＜10％分解)。
表6.线粒体醌-C10甲磺酸盐在40℃，75％RH；25℃，50％RH和蓝硅胶上4℃的固态稳定性。
数据是表达为时间为0时的值的百分比的两个值的平均值。
实施例9.线粒体醌-C10甲磺酸盐-β-环糊精(1∶2)复合物的稳定性研究线粒体醌-C10甲磺酸盐-β-环糊精(1∶2)复合物的溶液稳定性
在两种温度25℃和40℃、两种气氛条件空气和氮气下依照申请人的标准操作规程测定了线粒体醌-C10甲磺酸盐在五种溶剂：水、0.01MHCl、0.01M NaOH、IPB(pH 7.4)和50％MeOH中64天的溶液稳定性。
通过稀释线粒体醌-C10甲磺酸盐-β-环糊精(1∶2)复合物(线粒体醌-C10甲磺酸盐1mg/ml)水中的贮备液制备五种溶剂中的线粒体醌-C10甲磺酸盐-β-环糊精(1∶2)复合物溶液(线粒体醌-C10甲磺酸盐100μg/ml)。将溶液(5ml)置于玻璃瓶中，空气或氮气吹扫，密封并放置储藏。于第0、1、2、4、8、16、32、64和125天收集等分试样(0.25ml)并用HPLC测定浓度。
表7和图21、22、23及24所示为试验结果。因为线粒体醌-C10甲磺酸盐-β-环糊精(1∶2)复合物在0.01M NaOH中15分钟内就分解，所以其中未包括线粒体醌-C10甲磺酸盐-β-环糊精(1∶2)复合物在该溶剂中的稳定性。结果表明：(a)溶液稳定性与溶液上的气氛无关以及(b)温度对除HCl外的所有溶剂中线粒体醌-C10甲磺酸盐在1∶2的β-环糊精复合物中的稳定性有显著的影响。
表7.线粒体醌-C10甲磺酸盐-β-环糊精(1∶2)复合物在不同条件下四种不同溶剂中的溶液稳定性
数据是表达时间为0时的值的百分数的两个值的平均值。线粒体醌-C10甲磺酸盐-β-环糊精(1∶2)复合物的固态稳定性
依照申请人的标准操作规程在避光的以及三种不同条件下对线粒体醌-C10甲磺酸盐-β-环糊精(1∶2)复合物的固态稳定性进行研究：40℃，75％RH；25℃，50％RH和蓝硅胶上4℃。
将已知重量的线粒体醌-C10甲磺酸盐-β-环糊精(1∶2)复合物置于透明玻璃瓶中，并在不同条件下保存。于第1、2、4、8、16、32、64和125天取出双份样品，并在将样品溶于水后通过HPLC测定线粒体醌-C10甲磺酸盐的浓度。结果如表8和图25所示。结果显示，线粒体醌-C10甲磺酸盐在1∶2的β-环糊精复合物中在4℃蓝硅胶上以及25℃/50％RH稳定。在40℃、75％RH下保存64天时线粒体醌-C10甲磺酸盐-β-环糊精(1∶2)复合物中37％线粒体醌-C10甲磺酸盐降解。
表8.线粒体醌-C10甲磺酸盐-β-环糊精(1∶2)复合物在40℃，75％RH；25℃，50％RH和4℃蓝硅胶上的固态稳定性。
数据是表达为时间为0时的值的百分数的两个值的平均值。*代表差异很大的两个值的平均值(71.9和31.1％)。
实施例10.线粒体醌-C10甲磺酸盐-β-环糊精(1∶1)复合物的稳定性研究溶液稳定性
在两种温度25℃和40℃、两种气氛条件空气和氮气下依照申请人的标准操作规程测定线粒体醌-C10甲磺酸盐-β-环糊精(1∶1)复合物在五种溶剂：水、0.01M HCl、0.01M NaOH、IPB(pH 7.4)和50％MeOH中64天的溶液稳定性。
通过稀释线粒体醌-C10甲磺酸盐-β-环糊精(1∶1)复合物(线粒体醌-C10甲磺酸盐1mg/ml)水中的贮备液制备线粒体醌-C10甲磺酸盐-β-环糊精(1∶1)复合物在五种溶剂中的溶液(线粒体醌-C10甲磺酸盐100μg/ml)。将溶液(5ml)置于玻璃瓶中，空气或氮气吹扫，密封并放置储存。于第0、1、2、4、8、16、32、64和125天收集等分试样(0.25ml)并用HPLC测定浓度。
表9和图26、27、28及29所示为试验结果。因为线粒体醌-C10在0.01M NaOH中15分钟内就分解，所以其中未包括线粒体醌-C10甲磺酸盐-β-环糊精(1∶1)复合物在该溶剂中的稳定性。结果表明：(a)溶液稳定性与溶液上的气氛无关以及(b)温度对水和IPB中与β-环糊精的1∶1复合物内的线粒体醌-C10甲磺酸盐的稳定性有显著的影响，但是对HCl或50％MeOH中的没有。
表9.线粒体醌-C10甲磺酸盐-β-环糊精(1∶1)复合物在四种不同的溶剂中在不同条件下的溶液稳定性。
数据是表达为时间0时的值的百分数的两个值的平均值。
固态稳定性
依照申请人的标准操作规程在避光的三种不同条件下对线粒体醌-C10甲磺酸盐-β-环糊精(1∶1)复合物的固态稳定性进行研究：40℃，75％RH；25℃，50％RH和4℃蓝硅胶上。
将已知重量的线粒体醌-C10甲磺酸盐-β-环糊精(1∶1)复合物置于透明玻璃瓶中并在不同条件下保存。于第1、2、4、8、16、32、64和125天取出双份样品，并在将样品溶于水后通过HPLC测定线粒体醌-C10甲磺酸盐的浓度。结果如表10和图30所示。结果显示，线粒体醌-C10甲磺酸盐-β-环糊精(1∶1)复合物在4℃蓝硅胶上以及25℃、50％RH条件下储存125天线粒体醌-C10甲磺酸盐稳定，但是在40℃、75％RH下储存125天37％的线粒体醌-C10甲磺酸盐降解。
表10.线粒体醌-C10甲磺酸盐-β-环糊精(1∶1)复合物在40℃，75％RH；25℃，50％RH和4℃蓝硅胶上的固态稳定性。
数据是表达为时间为0时值的百分数的两个值的平均值。
实施例11.大鼠单次注射和口服给药线粒体醌-C10甲磺酸盐-β-环糊精(1∶2)复合物的药动学研究(P2&P3)
基于之前线粒体醌-C10溴化物的药动学研究以及线粒体醌-C10甲磺酸盐-β-环糊精(1∶2)复合物的急性口服毒性试验的结果，确定用于药动学研究的线粒体醌-C10甲磺酸盐-β-环糊精(1∶2)复合物的剂量是口服给药50mg/kg线粒体醌-C10甲磺酸盐、静脉注射给药10mg/kg线粒体醌-C10甲磺酸盐。
试验前48小时在氟烷麻醉下将硅橡胶管插入雌性Wistar大鼠(均重约236g)的右颈静脉。新鲜制备线粒体醌-C10甲磺酸盐-β-环糊精(1∶2)复合物水溶液(线粒体醌-C10甲磺酸盐10mg/ml)并通过口服(n＝5)或静脉注射(n＝5)途径给药。于静脉注射给药后0、5、10、20、30、45、60、90、120、180、240、360、720和1440(24小时)分钟采集血样(0.2ml)，在口服给药后0、15、30、60、90、120、150、180、240、300、420、540、720和1440(24小时)分钟采集血样(0.2ml)。将血样离心并将血浆样品(0.1ml)于-20℃的制冷器内保存。还采集24小时的尿液和粪便样品。
应用LC/MS通过ESR测定线粒体醌-C10甲磺酸盐的血浆浓度(表12)。
药动学分析
采用MINIM通过迭代的未加权的非线性最小二乘法回归分析线粒体醌-C10的药动学。将静脉注射数据用一、二和三室模型拟合。最适合的模型是根据Akaike信息准则(A.I.C)具有最小值的模型。据发现，可用如下方程所述的三室开放式模型最佳及充分地拟合给药后的血浆药物浓度-时间曲线：
C＝Ae-αt+Be-βt+Ce-γt
其中C是血浆药物浓度，A、B和E是数学系数，α是分布相的速率常数、β是中间相(分布或清除)的速率常数，而γ是终末缓慢消除相的速率常数。终末期的药物清除半衰期(t1/2)经计算为t1//2＝0.693/γ。口服数据(4小时后)经拟合为一室模型。可直接从浓度-时间曲线获得达峰浓度(Cmax)和到达Cmax的时间(tmax)。采用线性梯形法则逼近法(lineartrapezoidal rule)，将最后测量的浓度外推至通过使用终末消除速率常数(γ)确定的无穷大，以估计血浆浓度-时间曲线(AUC)下的面积。静脉(CL)和口服(CL/F)给药后的总血浆清除率用CL＝剂量/AUC估算。分布容积用Vβ＝剂量/(AUC·β)和Vγ＝剂量/(AUC·γ)计算。绝对生物利用度(F)用F＝AUCpo×剂量iv/AUCiv×剂量po计算。平均滞留时间用AUMC/AUC计算。稳态时的表观分布容积(Vss)用剂量iv×AUMC/(AUC)2计算。
结果与讨论
图31所示为IV和口服给药线粒体醌-C10甲磺酸盐-β-环糊精(1∶2)复合物后的线粒体醌-C10甲磺酸盐的平均血浆浓度-时间曲线，表11所列为平均药动学参数。所附为线粒体醌-C10甲磺酸盐血浆水平的原始数据(表12)。
表11.大鼠单次静脉注射(10mg/kg)和口服(50mg/kg)以线粒体醌-C10甲磺酸盐-β-环糊精(1∶2)复合物给药线粒体醌-C10甲磺酸盐的药动学参数
*t1/2值得自时间＞4小时的平均浓度
**t1/2值得自时间＞4小时的平均浓度
表12.用于P2-IV和P3-PO研究的线粒体醌-C10的大鼠血浆浓度
静脉注射给药后，非常快速的分布相后是较慢的分布或者初始消除相，随后在约4小时时是延长的消除相。用三室模型拟合线粒体醌-C10的浓度-时间曲线，终末半衰期是1.8小时，但是基于所谓的“4小时后”剂量的数据的半衰期为14.3小时(表13)。
口服给药后，线粒体醌-C10从大鼠胃肠道快速吸收。口服给药1小时内达到了线粒体醌-C10的峰值血浆浓度，并且随后随时间缓慢降低，基于4小时后数据的清除半衰期约为14小时。F值经估算为12.4％。
表13.线粒体醌-C10甲磺酸盐-β-环糊精(1∶2)复合物的IV(P2)和口服(P3)药动学
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所采用的术语和表达方式均是说明性，而并非对本发明的限制，并且应用这些术语和表达方式并非有意地将所示或所述的特征的等同物或其部分排除在外，而应认为在如所要求保护的本发明范围内的各种变化都是可能的。因此，应理解为尽管本发明通过优选的具体实施方案以及任选的特征而具体地公开，但由于此处所公开的概念的变化或改变可能为本领域技术人员的常规应用，因此理应认为这些变化和改变被涵盖在如所附权利要求书所述的本发明范围之内。
此处宽广并概括地描述了本发明。所有的落入上位公开范围的窄的具体种类或较下位的分类同样构成本发明的一部分。这包括采用限制性条文或负限定(negative limitation)对本发明的概括说明，且与所排除的内容是否在此处具体地列举无关。
其它的具体实施方案在以下权利要求书范围内。此外，当本发明的特征和方面以马库什组的方式加以说明时，本领域技术人员会认识到，本发明同样由此以各马库什组中成员或成员的亚组的形式加以说明。
本发明的化合物可用于人类患者的选择性抗氧化治疗以抑制线粒体损伤。其可用以抑制与特定疾病如帕金森病或与线粒体DNA突变有关的疾病相关的线粒体氧化应激升高。它们还可用于神经退化性疾病的细胞移植疗法，以增加所移植细胞的成活率。
此外，这些化合物可用作预防用药以在移植过程中保护器官或缓解外科手术过程中发生的缺血一再灌注损伤。本发明化合物还可用于缓解中风和心脏病发作后的细胞损伤，或可预防性地向易患脑缺血的早产儿给药。本发明方法与现有的抗氧化物疗法相比主要的优点是它们能够使抗氧化剂选择性地于线粒体内累积。而线粒体是细胞中氧化应激最激烈的部分。该优点将极大地增加抗氧化疗法的有效性。
本领域技术人员将认识到，上述说明书仅是采用举例的方法进行说明，且可采用不同的亲脂性阳离子/抗氧化剂组合而不脱离本发明的范围。
机译： 用作线粒体靶向抗氧化剂的线粒体醌衍生物，其制备方法和包含其的药物组合物
机译： 线粒体靶向抗氧化剂的线粒体醌衍生物
机译： 米托醌衍生物用作线粒体靶向抗氧化剂，
