量子点荧光淬灭基础上的实时荧光定量PCR的检测方法

摘要

一种量子点荧光淬灭基础上的实时荧光定量PCR的检测方法，属于生物工程技术领域。本发明利用量子点优越的荧光特性，且PCR双链产物能与量子点结合并淬灭已结合的量子点的荧光信号，荧光信号淬灭的程度与PCR产物的量成正相关，在常规PCR扩增的反应体系中加入表面带有负电荷的量子点，PCR反应液中量子点的最终浓度控制在0.007mg/mL与1.33mg/mL之间的范围，将PCR反应液管放入荧光定量PCR检测仪中，进行实时荧光定量PCR的扩增，根据荧光信号的强弱检测PCR扩增过程中不同时间点的PCR产物量，建立快速、灵敏、简便、特异性好的定量PCR检测方法。

说明书

技术领域

本发明涉及的是一种生物工程技术领域的方法，具体是一种量子点荧光淬灭基础上的实时荧光定量PCR的检测方法。

背景技术

PCR即聚合酶链反应技术，荧光定量PCR技术是通过荧光染料或荧光标记的特异性的探针，对PCR产物进行标记跟踪，实时在线监控反应过程，结合相应的软件可以对结果进行分析，计算待测样品的初始模板量。荧光定量实时PCR与普通PCR的比较，具有诸多优势，因而获得了广泛的应用。到目前为止，荧光定量PCR标记方法主要有两类：内掺式染料如SYBR Green I与SYBR Gold，序列特异性探针如Taqman探针，分子信标探针(Molecular Beacons)与荧光共振能量转移探针[Dual Probes(FRET)]。但是它们使用的定量PCR方法都是采用有机荧光染料。存在不稳定，高温降解，见光易分解，发射光的光谱宽，光稳定性差，检测本底高等缺点。量子点是半径小于或接近于激子玻尔半径的一类半导体纳米粒子，由于存在显著的量子尺寸效应和表面效应，从而使它具有常规块体材料不具备的光吸收特性，是一类理想的荧光探针。与传统的荧光染料探针相比，量子点荧光信号稳定，受温度与光照的影响非常小，可同时对多种组分进行同步检测，量子点合成制备成本低，因此具有显著的优势。

经对现有技术的文献检索发现，Wickert L等人在《Biochemical andBiophysical Research Communications》[生物化学与生物物理研究交流]杂志2002年第296卷第4期第1035-1039页发表了“Quantitative monitoring of themRNA expression pattern of the TGF-beta-isoforms(beta 1，beta 2，beta 3)during transdifferentiation of hepatic stellate cells using a newly developedreal-time SYBR Green PCR”[利用新建立的实时SYBR Green PCR方法定量检测TGF-β异构体(β1，β2，β3)mRNA的表达水平]文章。检索中还发现，Aldea C等在《Journal of Clinical Microbiology》[临床微生物杂志]杂志2002年第40卷第3期第1060-1062页发表了“Rapid detection of herpes simplex virusDNA in genital ulcers by real-time PCR using SYBR green I dye as the detectionsignal”[利用SYBR green I作为探测信号的实时PCR方法快速检测疱疹病毒DNA]文章。利用SYBR Green染料结合双链DNA并产生荧光特性，随着PCR产物增多，反应液中荧光信号增强，因此，可进行实时定量PCR检测。由于SYBRGreen有机荧光染料，存在不稳定，高温降解，见光易分解，发射光的光谱宽，光稳定性差，检测本底高等缺点，而量子点正好弥补其不足，具有显著优势。

发明内容

本发明针对现有技术的不足和缺陷，提供一种量子点荧光淬灭基础上的实时荧光定量PCR的检测方法，利用量子点结合双链PCR产物，而且PCR双链产物量与量子点荧光淬灭信号的程度成正相关特性，可实现实时定量PCR检测。

本发明是通过以下技术方案实现的：本发明利用PCR双链产物结合量子点并淬灭量子点荧光信号，量子点的荧光信号淬灭程度与PCR双链产物的量成正比，建立实时荧光定量PCR方法。具体实现过程为：在常规PCR扩增的反应体系中加入表面带有负电荷的量子点，PCR反应液中量子点的最终浓度在0.007mg/mL-1.33mg/mL之间，PCR反应液充分混合后，将PCR管放入荧光定量PCR检测仪中，在扩增过程中进行实时荧光检测，根据荧光信号的强弱，结合定量分析软件，可实现实时定量检测PCR扩增产物中PCR产物的量。

所述的量子点是采用带负电荷的表面活性剂或用带正负电荷的双性离子型表面活性剂修饰的量子点，而且量子点表面带有负电荷。

本发明利用带负电荷的量子点加入到PCR反应液中(PCR反应液中量子点浓度在0.007mg/mL与1.33mg/mL之间)，都可以获得很好的荧光淬灭强度与起始模板浓度之间的线性关系，利用量子点的这一特性，可进行PCR产物实时定量检测，与传统方法相比，具有更好的灵敏性与特异性，稳定性与重复性。

附图说明

图1为PCR扩增时不同的循环次数与荧光强度关系的曲线(荧光分光光度计检测)

图2为PCR扩增时随时间的增加荧光强度的变化曲线(实时荧光定量PCR仪中检测)

图3为CT值与起始模板浓度之间的关系曲线(实时荧光定量PCR仪中检测)

具体实施方式

本发明用DNA标准品配制一系列的浓度梯度，加入带负电荷的量子点(浓度在1.33mg/mL-0.007mg/mL之间)到PCR反应液中，PCR反应采用30μl总体积。PCR反应条件是：

3μl 10×PCR buffer，3μl 2.5mM dNTPs，3μl 1.5mM MgCl2，各1μl上游与下游PCR引物，2μl DNA模板，1μl Taq enzyme，16μl去离子水，DNA模板采用系列稀释的已知浓度的样品，量子点的量分别为0.5μl，1μl，2μl，3μl，4μl，5μl，6μl，7μl，8μl，9μl，10μl，用去离子水补充到总体积为30μl。PCR反应条件：94℃预变性4分钟，94℃变性35秒，30℃退火42秒，72℃延伸50秒，30个循环，最后在72℃延伸5分钟。

PCR反应结束后，测定每一管PCR产物的荧光强度，把荧光强度作为纵座标，起始模板浓度对数作为横坐标，可描绘出标准曲线，是一个线性关系曲线。同时同时也进行了PCR循环次数与荧光强度的测量。以循环次数作为纵坐标，起始模板浓度对数为横坐标，描绘出标准曲线，也是一个线性关系。

采用不同已知浓度的模板，重复了此实验，结果完全一致。采用SYBR GreenI定量试剂盒作对照，结果相一致。为了进一步验证本发明建立的方法，包含量子点的PCR反应液样品被准备，分别在ABI公司7700型号定量PCR仪与Roch公司LightCycler定量PCR仪上进行了实时定量PCR检测，结果与预期的一样，随着循环次数的增加，荧光信号在降低，在指数增长期，荧光信号降低更显著。

在荧光定量PCR技术中，有一个很重要的概念即Ct值。C代表Cycle，t代表threshold，Ct值的含义是：每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数。PCR循环在到达Ct值所在的循环数时，刚刚进入真正的指数扩增期(对数期)，此时微小误差尚未放大，因此Ct值的重现性极好，即同一模板不同时间扩增或同一时间不同管内扩增，得到的Ct值是恒定的。Ct值与起始模板量的关系如下：logN＝log N0+nlogE n＝Ct，N：扩增物数量；N0：起始模板数量；E：扩增效率。Ct值与起始模板的关系表明，每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，Ct值越小。利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，其中横坐标代表起始拷贝数的对数，纵坐标代表Ct值。因此，只要获得未知样品的Ct值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。本发明中，采用已知浓度的样品，测量了相应数据，计算出Ct值，描绘了Ct值与起始拷贝数的对数关系曲线。

以下结合附图以及本发明的技术方案提供实施例。

实施例一：

氯化镉溶解在含有巯基乙酸的碱性(pH 10)水溶液中，加入离子型碲源NaHTe(由碲粉和硼氢化钠制备成)，100℃反应30～240分钟，反应时间不同得到量子点的粒径不同，溶液颜色由绿色到橙色最终为红色，合成表面带有羧基的CdTe量子点，用此方法可得到1.2nm～2.8nm范围内不同粒径的CdTe量子点。这里选用粒径为2.8左右纳米的量子点，得到的量子点溶液浓度为3.5mg/mL，在小于500纳米的任何波长激发，可得到发射波长为554nm的荧光。

取乳腺癌相关抗原基因(brcaa1基因)为模板DNA 3μL，dNTP 3μL，缓冲液5μL，引物A1μL，引物B1μL，镁离子2μL，Taq DNA聚合酶1μL，上述实验合成得到的量子点2μL，用去离子水补充体积，使反应总体积为30μL。最初变性94℃，2min；35个循环：变性94℃1min，复性55℃ 40sec，延伸72℃50sec；最后的延伸72℃ 8min。随着PCR扩增DNA量不断增加，检测不同循环次数后荧光信号，采用荧光分光光度计检测荧光强度(激发波长450nm，测发射波长为565nm的荧光强度)，采用荧光强度为纵坐标，循环次数为横坐标，得到循环次数与荧光强度的曲线(见附图1)，随着循环次数的增加，DNA的量逐渐增加，荧光信号也随着降低。PCR扩增产物用1％琼脂糖电泳，并用凝胶成像系统仪分析有目标DNA。

实施例二：

氯化镉溶解在含有巯基乙酸的碱性(pH 10)水溶液中，加入离子型碲源NaHTe(由碲粉和硼氢化钠制备成)，100℃反应30～240分钟，反应时间不同得到量子点的粒径不同，溶液颜色由绿色到橙色最终为红色，合成表面带有羧基的CdTe量子点，用此方法可得到1.6nm～3nm范围内不同粒径的CdTe量子点。这里选用粒径为3纳米的量子点，在小于500纳米的任何波长激发，可得到发射波长为560nm的荧光。

取乳腺癌相关抗原基因(brcaa1基因)为模板DNA 3μL，dNTP 3μL，缓冲液5μL，引物A1μL，引物B1μL，镁离子2μL，Taq DNA聚合酶1μL，上合成得到的量子点1μL，用去离子水补充体积，使反应总体积为30μL。最初变性94℃，2min；35个循环：变性94℃1min，复性55℃ 40sec，延伸72℃ 50sec；最后的延伸72℃ 8min。随着PCR扩增DNA量不断增加，在实时荧光定量PCR仪中检测，荧光信号逐渐降低(见附图2)。根据计算，获得量子点荧光定量PCR反应中CT值与起始模板浓度对数值之间的关系曲线(见附图3)。这表明，量子点是一个很好的荧光染料，PCR双链产物引起它的荧光淬灭特性，完全符合目前定量PCR技术的参数要求，能够用于实时定量PCR检测。