安氏隐孢子虫PCR检测试剂盒

摘要

本发明提供了一种安氏隐孢子虫PCR检测试剂盒，用于隐孢子虫病的诊断和检测。该试剂盒是根据安氏隐孢子虫ITS－1基因序列设计种特异性引物、建立了PCR检测方法、优化了PCR反应条件而制备得到，本发明还提供了使用该试剂盒检测安氏隐孢子虫的方法。本发明的PCR检测试剂盒可以快速准确地检测安氏隐孢子虫卵囊，对隐孢子虫病作出鉴别诊断，对水源性隐孢子虫病爆发的风险因素作出科学的评估。

说明书

技术领域

本发明涉及隐孢子虫病的诊断和检测技术领域，更具体地说，涉及一种安氏隐孢子虫PCR检测试剂盒及检测方法。

背景技术

隐孢子虫病(Cryptosporidiosis)是一种重要的人畜共患寄生虫病，可引起人和牛的严重腹泻，是艾滋病人的主要致死原因之一。该病主要是由于感染隐孢子虫的动物(主要是奶牛)随粪便排出的卵囊污染水源而引起的。奶牛感染的隐孢子虫主要是安氏隐孢子虫(Cryptosporidium andersoni)和微小隐孢子虫(C.parvum)。有资料表明，在绝大部分地面水(江、河、湖、水库等)、受地面水污染的浅井和防护条件较差的深井水、处理不良的自来水、处理或未处理过的排放污水、经过滤的游泳池水中，均可检出隐孢子虫卵囊(沈玉娟等，2005)。Xiao等(2001)利用PCR-RFLP技术检测从美国几个地区收集的55个天然地表水样本和从威斯康星的Milwaukee收集的49个天然污染水样本。25个天然地表水和几个天然污染水样本中均检测到隐孢子虫卵囊。地表水样本中主要是微小隐孢子虫，由人和家畜污染所致，而污染水样本中主要是安氏隐孢子虫。我国目前的饮用水处理工艺及水源水质和供水水质现状，存在水源性隐孢子虫病爆发流行的极大隐患。

人畜隐孢子虫病主要通过感染动物粪便中的卵囊污染食物、饲料和饮水而传播。宿主感染隐孢子虫后可以排出大量的卵囊。鼠、鸡和牛所排隐孢子虫的克粪便卵囊数分别是10⁴、10⁵和10⁶，并且极少量的卵囊就可以引起感染。就微小隐孢子虫而言，30个卵囊的接种量就可以使20％的健康人发病。卵囊对环境的抵抗力强且耐消毒剂，在4℃下可存活2～6个月，温暖地区可长期存活，对碘酊、煤酚皂液、次氯酸钠和醛基消毒药等有很强的抵抗力。由此可见，该病原对公共卫生和人畜健康可造成严重危害。

迄今已有间接血凝试验(IHA)、免疫荧光试验(IFA)、酶联免疫吸附试验(ELISA)、单克隆抗体(McAb)、聚合酶链式反应(PCR)等技术用于本病的诊断或检测及其相关研究，但尚无一种PCR检测试剂盒对奶牛的安氏隐孢子虫感染进行诊断或检测。而常规的检测方法如饱和蔗糖浮集法，改良抗酸染色法均存在很多不足：当标本量大时可致镜检人员眼疲劳而影响检查结果的准确性；当样本中卵囊含量少时，粪便染色检出率低，易漏检，且常含有较多非特异性染色颗粒与卵囊混淆，非专业镜检人员较难区别。因而迫切需要一种特异性强、检出率高、结果判定方便的检测工具，PCR检测试剂盒已成为人们多年来盼望实现的目标。

发明内容

(一)要解决的技术问题

本发明的目的旨在提供一种安氏隐孢子虫PCR检测试剂盒，用于隐孢子虫病的鉴别诊断和分子流行病学调查以及水源性隐孢子虫病爆发的风险评估。

(二)技术方案

安氏隐孢子虫GD株和HN株ITS-1基因序列完全一致，其序列组成如下：

TTCTTACGTA TTTGTTTATT AAACAAAAAA TCTTATAATT GAACCTGAAC  50

TTGCCTAATT TTCTTAAAGA TTATACTTAA GTTGAGTATC TTTTTTAAAA  100

TTAGGCCCTG TTCTTAAGAA TTAATCCCTA CTAGCTTTGT ATAATTTTTG  150

TATCTTTTCT TTATACCTTG AGAGGGTTCC CTTTTAAGGA CTTTGCAACT  200

AAAATATTCA TTTTAGGGGA AAGATCCAGA TATTCTTATA CTTAATTTTT  250

AGGGGTTTTC TTATTTTTTT AAAATACTTT TTTGTTATTT GCCGACTTTT  300

TTATTAGTCG TTTATAATCT C                                 321

以上序列曾被发明人首次报道，已在GenBank上登记注册，安氏隐孢子虫GD株和HN株登录号分别为AY881990和AY881991。

发明人根据安氏隐孢子虫ITS-1基因序列设计种特异性引物如下：

ZRQF：5’-TGAATATGCATCGTGATGG-3’

ZR：5’-GAATATCTGGATCTTTCCCC-3’

其作用是特异性地扩增模板中安氏隐孢子虫的ITS-1片段。

根据安氏隐孢子虫种特异性引物配制的安氏隐孢子虫PCR检测试剂盒，包括以下组成：

(1)DNA裂解液：含不同浓度的NaCl、Tris-HCl、EDTA、SDS和蛋白酶K的混合溶液。其浓度优选为：NaCl 100mM，Tris-HCl(pH8.0)10mM，EDTA(pH8.0)25mM，SDS 1％(w/v)和蛋白酶K4μg/μl。DNA裂解液的作用是将卵囊裂解并消化其中的蛋白质，释放出基因组DNA。

(2)PCR反应液：终浓度各50～400μM的4种dNTPs，终浓度各10～100pmol/μL的引物ZRQF和ZR，1.5～5.0mM的Mg²⁺浓度。Taq酶按每个PCR反应(25μl)含1.0U加入，反应液中不含Taq酶。

(3)阳性对照：本发明试剂盒所用阳性对照为安氏隐孢子虫基因组DNA，其作用是比较PCR产物以及监测PCR操作过程是否正确。

此外，本发明的试剂盒还可以含有琼脂糖(Agarose)、溴酚蓝点样缓冲液和Taq酶，其浓度优选为溴化乙锭10μg/μl；溴酚蓝点样缓冲液0.25％；Taq酶5U/μl。还可以含有PCR反应管。

本发明试剂盒PCR反应条件的优化过程为：

(1)、引物浓度的优化：

设置引物浓度范围为10～100pmol/μL，用不同浓度梯度的引物进行PCR扩增试验，结果表明此浓度范围内的引物都能扩增出目的条带，并且当每条引物量以20pmol/μL，即0.2μM时效果最佳。

(2)、Mg²⁺浓度的优化：

设置Mg²⁺浓度范围为1.5～5.0mM，结果表明此浓度范围内的Mg²⁺都能扩增出目的条带，并且当Mg²⁺浓度为3.0mM时，扩增效果最好，不仅无非特异性，而且扩增条带也很明亮清晰。

(3)、dNTPs浓度的优化：

四种dNTPs等当量混合，设置每种dNTPs浓度范围为50～400μM，结果表明此浓度范围内的dNTPs均能扩增出目的条带，并且每种dNTPs以50μM，即总dNTPs浓度为200μM时为最佳。

(4)、最适退火温度的筛选：

根据所采用的PCR引物，运用公式T＝2(A+T)+4(G+C)计算退火温度，再按照实际情况，确定PCR反应的中限温度是54℃，温度范围是50～60℃，结果表明该范围温度下均能扩增出目的条带，当退火温度为55.6℃时，PCR扩增出的条带观察效果最佳。因此，选择55.6℃作为PCR敏感性和特异性试验的退火温度。

本发明的安氏隐孢子虫PCR检测试剂盒的使用方法如下：

1、样本的预处理：

取样本用PBS-0.1％Tween稀释到，旋涡振荡，用60目尼龙筛过滤，滤液离心，反复洗涤三次，离心，取沉淀备用。

2、样本DNA的提取：

(1)将上述沉淀在液氮中反复冻融，然后加入DNA裂解液，混匀后37～55℃水浴。

(2)Tris饱和酚-氯仿抽提DNA。

3、PCR扩增：

(1)按照扩增样品数n(n＝样品数+2)取PCR反应液、Taq酶混于一离心管中，于旋涡振荡器上振荡，按每管分装，盖上管盖备用。

(2)先将阴性对照液加入一个分装管中，取各样本的DNA加入对应反应管中；最后取出阳性对照加入另一反应管中，各反应管标记后离心，取出置PCR仪上。

(3)PCR扩增条件：94℃预变性5～10min，按以下参数循环30～40次：94℃变性30sec、50～60℃复性30sec、72℃延伸30～60sec、最后72℃延伸5～10min。

4、PCR产物观察：

取扩增后的产物加样于1.0～1.5％的琼脂糖凝胶上，电泳后，如果在紫外灯下观察到一条与阳性对照同一位置出现的504bp的片段，即为阳性。

(三)有益效果

本发明的积极效果在于：试剂盒配制合理、制备简单、PCR反应条件优化、特异性强、敏感性高、结果判定客观准确，对隐孢子虫病具有鉴别诊断作用。

具体实施方式

下列实施例旨在进一步举例描述本发明，而不是以任何方式限制本发明，在不背离本发明的精神和原则的前提下，对本发明所作的本领域普通技术人员容易实现的任何改动或改变都将落入本发明的待批权利要求范围之内。

实施例1试剂盒的组成

试剂盒内含DNA裂解液15ml，其中含有NaCl 100mM，Tris-HCl(pH8.0)10mM，EDTA(pH8.0)25mM，SDS 1％(w/v)和蛋白酶K4μg/μl；PCR反应液5管(25μl/反应×20)，其中的dATP、dTTP、dGTP和dCTP终浓度为各200μM、引物ZRQF和ZR终浓度各为0.2μM，Mg²⁺终浓度为3.0mM；2.0g琼脂糖；100μl溴化乙锭(10μg/μl)；0.25％溴酚蓝点样缓冲液100μl；5μlTaq酶(5U/μl)；1支安氏隐孢子虫基因组DNA阳性对照。

实施例2试剂盒的组成

试剂盒内含DNA裂解液15ml，其中含有NaCl 100mM，Tris-HCl(pH8.0)10mM，EDTA(pH8.0)25mM，SDS 1％(w/v)和蛋白酶K4μg/μl；PCR反应液5管(25μl/反应×20)，其中的dATP、dTTP、dGTP和dCTP终浓度为各400μM、引物ZRQF和ZR终浓度各为1.0μM，Mg²⁺终浓度为5.0mM；1支安氏隐孢子虫基因组DNA阳性对照。

实施例3试剂盒的特异性试验

取安氏隐孢子虫及微小隐孢子虫，贝氏隐孢子虫，牛艾美耳球虫，刚第弓形虫，猪艾美耳球虫，猪蛔虫，环孢子虫，大肠杆菌等8个对照样本的DNA各1μL为模板进行试剂盒的特异PCR扩增，同时设空白对照。

PCR扩增条件：

94℃预变性              5min

72℃后延伸              7min

扩增产物用1.0％的琼脂糖凝胶进行电泳分析，以确定其特异性。

电泳结果显示仅安氏隐孢子虫样本的DNA扩增出504bp的特定片段，而作为对照样本的微小隐孢子虫，贝氏隐孢子虫，牛艾美耳球虫，刚第弓形虫，猪艾美耳球虫，猪蛔虫，环孢子虫，大肠杆菌的DNA均无此扩增条带出现。

实施例4试剂盒的敏感性试验

将计数后的安氏隐孢子虫卵囊(2.54×10⁶)分别按1∶10¹，1∶10²，1∶10³，1∶10⁴，1∶10⁵进行系列稀释，抽提DNA。从每个梯度DNA中各取1μl模板用PCR试剂盒进行检测。扩增条件同上，同时设空白对照。扩增产物用1.0％的琼脂糖凝胶进行电泳分析，以确定其敏感性。通过6个浓度梯度的安氏隐孢子虫DNA的PCR反应，结果表明当样本中含有2.54×10²个隐孢子虫卵囊时，即可扩增产生清晰可辩的条带。

实施例5试剂盒的稳定性和重复性试验

除Taq酶，PCR反应液，阳性模板-20℃贮存外，裂解液及其余试剂均在4℃条件下保存。在贮存时间为30，60，90，120，150，180d时取出，用已知PCR阳性样本检测试剂盒的稳定性。此外，20份PCR阳性样本用本试剂盒进行重复性实验3次；20份PCR阴性样品重复试验3次。扩增条件同上。扩增产物用1.0％的琼脂糖凝胶进行电泳分析，并记录结果。结果表明在30，60，90，120，150，180d各时段分别取出试剂盒，用安氏隐孢子虫阳性DNA进行PCR检测，均能扩增出明亮的条带，且无非特异性条带，空白对照均为阴性。20份PCR阳性样本用本试剂盒重复试验三次，结果均能扩增出明亮的条带，且无非特异性条带。20份PCR阴性样本重复试验三次，结果均为阴性。

实施例6试剂盒的保存期试验

将在室温、4℃和-20℃保存1个月、3个月、6个月，9个月的试剂盒(Taq酶始终是-20℃保存)对已知样品进行检测。扩增条件同上。扩增产物用1.0％的琼脂糖凝胶进行电泳分析。结果表明本试剂盒(除Taq酶外)均可以在室温、4℃和-20℃下长期保存，在试验的9个月内均能扩增出明亮的条带，且无非特异性条带，空白对照均为阴性。

实施例7

采集了广东省4个奶牛场和河南省1个奶牛场共计234头奶牛的新鲜粪便，编号，然后放入4℃冰箱待检。

(一)常规检测方法

1、饱和蔗糖漂浮法

每个粪样取15g，加5倍自来水搅匀，60目尼龙筛过滤，将滤液以2000×g离心10min，弃上清，按粪便量的10倍体积加饱和蔗糖液(蔗糖500g，蒸馏水320ml，石炭酸9ml)，搅匀后以1500×g离心15min，然后用小铁丝环蘸取漂浮液表层涂片，以10×100倍油镜镜检。

2、改良抗酸染色法

每个粪样取15g，加5倍自来水搅匀，60目尼龙筛过滤，将滤液涂片，自然干燥，以改良抗酸染色法染色，10×100倍油镜镜检。

改良抗酸染色法的步骤：滴加改良抗酸染色液第一液(碱性复红4g，95％酒精20ml，石炭酸8ml，蒸馏水100ml)于经固定的滤液膜上，5～10min后水洗，滴加第二液(98％浓硫酸10ml，蒸馏水90ml)5～10min后水洗，滴加第三液(0.2g孔雀绿，蒸馏水100ml)2min后水洗，自然干燥后以油镜观察。

(二)PCR检测

1、样本的预处理

参照Kostrzynska等的方法(Kostrzynska M，et al.[J].J Microbiol Methods，1999，35：65-71)进行。每个样本取15g，用PBS-0.1％Tween稀释到10ml，旋涡振荡，用60目尼龙筛过滤，滤液14000×g离心10min，反复洗涤3次，离心，取沉淀备用。

2、样本的消化

将上述沉淀在液氮中反复冻融3次，然后加入DNA裂解液300μL，混匀后55℃水浴36h，其间混匀6次。

3、样本DNA的抽提

(1)将裂解后的溶液充分摇匀，5000rpm离心2min，取上清液加入到一5ml灭菌离心管中，再加入等体积的Tris饱和酚溶液，缓慢轻柔地将其混匀；

(2)室温下，12000rpm离心1min；

(3)吸取上层水相到一新的离心管；

(4)加入等体积酚/氯仿(1∶1)溶液，重复步骤(2)、(3)；

(5)加入等体积的氯仿溶液，重复步骤(2)、(3)；

(6)加入1/10体积的NaAc溶液，至终浓度为0.3mol/L；

(7)混匀后，加入准确量的2倍体积冰冷的无水乙醇或95％的乙醇，将溶液混匀，置于冰上10-30min，让DNA沉淀；

(8)4℃，12000rpm离心10min；

(9)小心吸出乙醇，不要搅动DNA；

(10)加入70％的乙醇至管中2/3体积，漂洗以除去残余的盐，于4℃，12000rpm离心2min。弃上清，若盐杂质较多，可重复该步骤几次；

(11)不盖管盖，室温中放置10-15min，使乙醇挥发，也可在真空中放置2min，加速乙醇的挥发；

(12)重新悬浮DNA在适当容积的TE(PH7.6-8.0)中，用微量移液枪反复吹打DNA沉淀，使其充分溶解。-20℃冰箱保存待用。

4、PCR扩增反应

(1)按待扩样品数n(n＝样品数+2)取PCR反应液n×22.8μl、Taq酶n×0.2μl混于一离心管中，于旋涡振荡器上振荡10s，按每管23μL分装，盖上管盖备用。

(2)先将阴性对照液2μl加入一个分装管中，取各标本的DNA 2μl加入对应反应管中，最后取出阳性对照，取2μl加入一反应管中，各反应管标记后5000rpm离心20s，取出置PCR仪上。

(3)PCR扩增条件：

94℃预变性                5min

72℃后延伸                7min

5、PCR扩增产物的检测

配制1.0％的琼脂糖凝胶，按0.5μg/ml加入E.B.，用10μl PCR产物点样，80V恒定电压电泳30min，电泳结束后，将胶置于紫外检测分析仪上观察，若在与阳性对照同一位置出现条带，则对应的样本为阳性。

结果：同时用PCR方法，饱和蔗糖漂浮法、改良抗酸染色法对234份奶牛粪样进行检测，结果见表1。

                 表1.PCR检测与常规检测方法对奶牛安氏隐孢子虫检测结果的比较

  组别     改良抗酸染色法       饱和蔗糖漂浮法       PCR试剂盒检测  采样数  阳性数  阳性率  采样数  阳性数  阳性率  采样数  阳性数  阳性率  香满楼  48  2  4％  48  2  4％  48  3  6％  温氏  86  3  3％  86  3  3％  86  5  6％  华美  48  3  3％  48  2  4％  48  4  8％  华农  36  2  5％  36  2  5％  36  3  8％  河南  16  4  25％  16  3  18％  16  5  31％

小结：

隐孢子虫卵囊的常规检测方法有饱和蔗糖浮集法，改良金扬氏抗酸染色法，改良Zielson-Nielson技术和免疫荧光试验等。这些技术在隐孢子虫病的诊断上发挥了一定的作用，但也有各自的不足之处。改良抗酸染色法和改良Zielson-Nielson染色法，两者基本原理相同，只是在石炭酸复红的温度及染色时间、脱色剂及复染液上有差异。通过染色卵囊及卵囊内部结构清晰可见，延长石炭酸复红染色时间能够保证卵囊更好的着色。但延长着色时间可能会使酵母菌或其它的耐酸性弱的物体着色而出现假阳性结果。另外，当样本中卵囊含量少时，粪便染色检出率低，易漏检，且常含有较多非特异性染色颗粒与卵囊混淆，非专业镜检人员较难区别；标本量大时可致镜检人员眼疲劳而影响检查结果的准确性。这些技术更难应用于环境污染中卵囊的检测。因此在敏感性、特异性和快速检测方面均存在很多不足。

本发明的奶牛安氏隐孢子虫的PCR检测试剂盒克服了以上检测方法的不足。并应用该试剂盒对广东省4个奶牛场和河南省1个奶牛场共234份样本进行了安氏隐孢子虫感染的实际检测，并与常规检测方法饱和蔗糖漂浮法和改良抗酸染色法进行了比较，结果表明改良抗酸染色法对234份样本的阳性检出率为4％～25％，饱和蔗糖漂浮法的阳性检出率为4％～18％，PCR检测试剂盒的阳性检出率为6％～31％。三种检测方法的阳性符合率为100％，本试剂盒的检出率比常规检测方法提高了2～13个百分点，显示该试剂盒具有特异性强、检出率高、结果判定方便、直观等优点，适于奶牛安氏隐孢子虫卵囊的检测，对于隐孢子虫病的鉴别诊断和分子流行病学调查以及人畜隐孢子虫病爆发风险的评估具有重要的应用价值。