对杂草种子萌发生根具抑制作用多肽与分离方法及其应用

摘要

对杂草种子萌发生根具抑制作用多肽与分离方法及其应用，涉及一种多肽，尤其是涉及一种对杂草萌发生根具有抑制作用的对杂草种子萌发生根具抑制作用多肽与分离方法及其对杂草种子萌发生根具抑制作用多肽用于制备杂草种子萌发生抑制剂或除草剂。其氨基酸序列为Ser－Leu－Leu－Pro－Pro－Tyr－Leu－Pro－Ser，分离时收集玉米蛋白粉粉碎后筛下的粉末作为酶解底物，加碱性蛋白酶水解得水解液，水解液经离子交换层析得活性组分后经凝胶层析得高抑制杂草萌发生根玉米蛋白粉多肽活性组分，经两次反相高效液相色谱筛选出具有高抑制活性组分。具有抑制杂草萌发生根活性，用于制备杂草种子萌发生抑制剂或除草剂。

说明书

技术领域

本发明涉及一种多肽，尤其是涉及一种对杂草种子萌发生根具抑制作用多肽与分离方法及其对杂草种子萌发生根具抑制作用多肽在制备杂草种子萌发生抑制剂或除草剂的应用。

背景技术

化学除草剂的广泛使用对于控制杂草对农田和城市草坪的侵入和危害发挥了重要作用。公开号为CN1181184A的发明专利申请公开一种非耕地用高效除草组合物，是一种含有对杂草种子、幼芽、幼草有杀灭作用的嘧黄隆以及对杂草地上绿色部分有杀灭作用的百草枯、茅草粘、环嗪酮等复配而成的系列高效除草组合物。公开号为CN1687086A的发明专利申请公开一种具有杀菌除草活性的取代苯氧乙酰氧基芳杂环基烃次膦酸酯盐及制备方法。公开号为CN1631156的发明专利申请公开了一种除草剂，它由N-(膦羧基甲基)甘氨酸、1，1-二甲基-4，4’-联吡啶阳离5-三嗪-2-基)-N-甲基氨碳酰]氨基磺酰]苯甲酸甲酯、3-异丙基-2，1，3-苯并噻二嗪酮-(4)-理组成。公开号为CN1679396的发明专利申请提供了对禾谷类作物具有选择性的除草组合物。然而传统化学农药的大量使用导致杂草的抗药性并造成环境污染，如土壤、地下水和农产品中的化学除草剂残留逐年增多，危害了人类及动物的安全。因此，研制出天然、无毒副作用、可降解的除草剂有着重要的生态效益和广泛的应用前景。20世纪90年代初，美国Iwoa州立大学的园艺学家N.E Christians(.Liu，D.L.-Y.and N.E.Christians.Isolation and identification of root-inhibiting compounds fromcorn gluten hydrolysate.J.Plant Grown Regul.，1994，13：227-230)发现玉米蛋白粉能抑制植物种子萌发时根系的形成，并开发出玉米蛋白粉萌前除草剂，但玉米蛋白粉为固体粉末，不溶于水，因而它不能象液体除草剂那样能喷施和易于渗入土壤发挥功效，后来N.E.Christans(.Christians，N.E.，J.T.Garbutt and D.Liu.Preemergence weed control using plant proteinhydrolysate.U.S.PatentNo.5,290,749，1994a)等人用碱性蛋白酶水解玉米蛋白粉制备的水解物比玉米蛋白粉有更高的除草活性，并进而分离纯化出除草活性肽单体；在实验室培养皿内的除草活性实验表明，除草活性肽单体比玉米蛋白粉水解粗提物对植物种子萌发生根的抑制作用更为显著。他们从玉米蛋白粉的水解物中分离出5个具有除草活性的的2肽和一个除草活性更强的5肽，并分别申请两项专利。这些多肽的序列分别是：Gln-Gln，Ala-Asa，Ala-Gln，Gly-Ala，Ala-Ala和Leu-Ser-Pro-Ala-Gln。活性多肽的除草机制是通过阻断种子根系分生组织的有丝分裂来抑制种子根系的形成，这种抑制作用不论是双子叶植物杂草还是单子叶植物杂草都有效果，而对萌后的成熟根系则没有影响，且对环境不产生任何的污染作用并可作为草坪植物的肥源。他们的研究还推测，玉米水解物中还可能存在其他具有除草活性的多肽单体。但此后，此研究领域的进展却十分缓慢。

发明内容

本发明的目的在于提供一种对杂草种子萌发生根具抑制作用多肽；本发明的另一目的在于提供一种对杂草种子萌发生根具抑制作用多肽分离方法；本发明的另一目的在于将对杂草种子萌发生根具抑制作用多肽用于制备杂草萌发生根抑制剂或除草剂。

本发明所述的对杂草种子萌发生根具抑制作用多肽其氨基酸序列为：

Ser-Leu-Leu-Pro-Pro-Tyr-Leu-Pro-Ser，

其分子量为986.5822，理论等电点为5.24，为白色粉末，易溶于水，可配成不同浓度来喷施土壤来防除杂草种子萌发。

所述的玉米蛋白粉多肽均不来自于玉米醇溶蛋白，而是来自于其它的蛋白。

本发明所述的对杂草种子萌发生根具抑制作用多肽的分离方法，其步骤为：

1)原料玉米蛋白粉经粉碎后，收集筛下的淡黄色粉末作为酶解底物；

2)在玉米蛋白粉中加入碱性蛋白酶水解得水解液，玉米蛋白粉和碱性蛋白酶的含量为玉米蛋白粉∶碱性蛋白酶＝1g∶(0.03～0.05AU)，pH为7～9，水解温度为50～70℃，水解时间为7～8h；

3)水解液经离子交换层析，分离得到活性组分；

4)将分离得到的活性组分经凝胶层析得高对杂草种子萌发生根具抑制作用多肽活性组分；

5)将分离得到的高对杂草种子萌发生根具抑制作用多肽活性组分经两次反相高效液相色谱，筛选出具有高抑制活性的组分，经过测定，其序列为Ser-Leu-Leu-Pro-Pro-Tyr-Leu-Pro-Ser。

在步骤1)中，原料玉米蛋白粉经粉碎后最好过200目筛。

在步骤2)中，玉米蛋白粉和碱性蛋白酶的含量为玉米蛋白粉∶碱性蛋白酶＝1g∶0.042AU，pH为8.0，水解温度为60℃，水解时间为6h，碱性蛋白酶选自Alacalase 2.4L。

本发明所述的对杂草种子萌发生根具抑制作用多肽具有高抑制杂草萌发生根活性或除草活性，可用于制备杂草萌发生根抑制剂或除草剂。

通过对本发明获得的对杂草种子萌发生根具抑制作用多肽与已报道的玉米醇溶蛋白的氨基酸序列进行比对表明，本发明得到的多肽均不来自于玉米醇溶蛋白，而是来自于其它的蛋白，而且该多肽序列目前尚未见到报道。

具体实施方式

以下实施例将对本发明作进一步的说明。

实施例1

1)以玉米蛋白为原料，其为较大的褐色片状颗粒，为了便于酶解反应时酶与底物能够充分接触，原料按如下方式进行预处理：将原料玉米蛋白粉经粉碎机粉碎后过200目筛，收集筛下的淡黄色粉末作为酶解底物。

2)在玉米蛋白粉中加入碱性蛋白酶水解，玉米蛋白粉和碱性蛋白酶的含量为玉米蛋白粉∶碱性蛋白酶＝1g∶0.042AU，pH为8.0，水解温度为60℃，水解时间为6h，碱性蛋白酶选自Alacalase 2.4L。

3)水解液经离子交换层析，离子交换填料为QAE-A25，工艺步骤为：填料预处理→装柱→上样→梯度洗脱，工艺条件为：(1)填料预处理：称取7g QAE-A25阴离子交换树脂粉末于烧杯中，加入一定体积的洗脱液A，于沸水浴中溶胀2h，冷却后倒掉液面上漂浮的细小颗粒，用洗脱液A反复清洗几次，配成75％的悬浮液，然后在真空箱中抽真空赶掉悬浮液中的气泡备用。(2)装柱：将层析柱(C16/40，内径16mm，长40cm)用去离子水清洗干净后垂直放于铁架台上，加入一定量的洗脱液A，打开出水口以赶走底部的气泡，当柱底部的缓冲液约有2cm高时关闭层析柱底部出水口。将溶胀好的、搅拌均匀的凝胶悬浮液一次性的倒入层析柱中，然后迅速的接上蠕动泵，打开出水口，以2mL/min的流速将洗脱液A泵入层析柱中使填料迅速沉降，待填料全部沉降完全后再用5mL/min的流速挤压填料，待柱床高度不再变化后停泵，迅速将Adaptor接上并适当压紧，使床表面无多余空间和洗脱液，此时床体积高度约为13cm。用洗脱液A平衡2个床体积后即可使用。(3)上样：蠕动泵上样，上样量为300mg，上样速度为0.5mL/min。(4)梯度洗脱：洗脱液A为30mmol/LpH8.0Tris-HCl，洗脱液B的离子强度为2mol/LNaCl，离子强度梯度(NaCl)为0.024mol/L.min、洗脱流速为0.9mL/min、。

4)由步骤3)分离得到的高对杂草种子萌发生根具抑制作用多肽活性组分经凝胶层析，填料为Superdex 30p.g.。工艺步骤为：填料预处理→装柱→上样→洗脱。工艺条件为：(1)填料预处理：填料已经在20％乙醇中预溶胀好，因此在使用时只需要先将乙醇除去即可使用。用经0.45μm滤膜滤过的去离子水反复清洗填料，直至将乙醇完全除去，然后放入真空干燥箱中抽真空即可装柱。(2)装柱：将水去离子水清洗干净的层析柱(XK16/70，内径16mm，长70cm)垂直放置于铁架台上。先向柱内加入一定量的洗脱液，将柱底端的气泡排出，然后关闭柱出口，并在柱的顶端接上Revisior。将已经处理好的填料用去离子水调至体积约475mL的均匀的悬浊液，然后沿玻璃棒一次性倒入层析柱中，迅速将蠕动泵连上，用洗脱液以1mL/min的速度冲洗柱子2h，以加速填料的沉降并使填料均匀沉降。待填料沉降完全后小心取下Revisior，接上Adaptor，再以4mL/min的速度冲压柱子，待柱高不再发生变化时即可停泵。将Adaptor向下稍微用力压紧，使之与床表面紧密接触不留空隙。再用缓冲液平衡两个床体积即可使用。用该法装柱有很好的重复性。(3)上样：蠕动泵上样，上样量为床体积的2％，上样速度为0.5mL/min。(4)洗脱：洗脱液为pH6.050mol/Lm乙酸-乙酸铵缓冲溶液，洗脱流速为0.9mL/min。

5)由步骤4)所分离得到的高对杂草种子萌发生根具抑制作用多肽活性组分经两次反相高效液相色谱，色谱柱为Everest C18反相柱(4.6mm×250mm，238TP54)，采用梯度洗脱，流动相A为为5％乙腈+0.1％三氟乙酸，B相为纯乙腈+0.1％三氟乙酸。色谱分离条件为见表1。筛选出具有高抑制活性的组分，经过测定，其序列为Ser-Leu-Leu-Pro-Pro-Tyr-Leu-Pro-Ser。

                                表1色谱分离条件

  时间(min)  A(％)  B(％)  流速(mL/min)  温度(℃)  0.00  2.00  35.00  75.0  70.0  55.0  25.0  30.0  45.0  0.800  0.800  0.800  30  30  30

实施例2

与实施例1类似，其区别在于玉米蛋白粉和碱性蛋白酶的含量为玉米蛋白粉∶碱性蛋白酶＝1g∶0.05AU，pH为7～9，水解温度为50℃，水解时间为8h，碱性蛋白酶选自Alacalase2.4L。

实施例3

与实施例1类似，其区别在于玉米蛋白粉和碱性蛋白酶的含量为玉米蛋白粉∶碱性蛋白酶＝1g∶0.03AU，pH为7～9，水解温度为70℃，水解时间为7h，碱性蛋白酶选自Alacalase2.4L。

实施例4

以下给出对杂草种子萌发生根具抑制作用多肽抑制杂草萌发生根或除草活性的检测方法与结果。

取杂草野菊(Dendranthema indicum)种子用75％酒精杀菌并用蒸馏水冲洗3次后放在双层滤纸上置于6cm的培养皿中，先加入1ml去离子水，盖上上盖培养5天后，对所设置实验处理分别加入1ml相应浓度的多肽液后用Parafilm封口胶封口培养。培养条件：每天光照16h，温度25℃，光照强度1500lx。培养时间共7天。对杂草种子萌发生根具抑制作用多肽各设4个浓度处理，分别为0.5mg/ml，1.0mg/ml，1.5mg/ml，2.0mg/l，以去离子水为对照，各处理和对照选用20粒种子，重复3次。培养时间结束后用数显游标卡尺测量各幼苗根系中最长根的长度作为统计标准。

以下给出实验结果及应用。

抑制率如下式计算：

抑制率(％)＝(对照组根长-处理组根长)/对照组根长×100％所有定量指标均用x±s表示。

实验结果见表1，不同浓度的多肽溶液对野菊种子萌发生根均有明显的抑制作用，多肽Ser-Leu-Leu-Pro-Pro-Tyr-Leu-Pro-Ser浓度在2mg/ml时抑制率约为91％。此外，进一步的实验还表明该多肽还对4种单子叶植物和5种双子叶植物杂草种子萌发时根系的形成也有明显的抑制作用。由于多肽物对杂草萌发时根系形成有抑制作用，而且对植物的成熟根系没有任何影响，因此它可作为一种天然萌前除草剂应用在农田，特别是在有机转换型蔬菜、城市草坪的杂草防治上有着重要的应用，这样可以减少使用化学除草剂对环境产生的污染，具有良好的经济效益、生态效益和社会效益。

表1  不同浓度的多肽溶液对野菊种子萌发生根抑制作用

  浓度(mg/ml)  抑制率(％)  0.5  68.55±6.29  1.0  78.93±4.20  1.5  87.43±3.32  2.0  100.00

实施例5～13

以下给出本发明所述的对杂草种子萌发生根具抑制作用多肽抑制单子叶植物狗牙根(Cynodon dactylon(L.)Pers)、光鳞水蜈蚣(Kyllinga brevifolia Rottb.var.leiolepis(Franch.et Savat.)Hara)、牛筋草(Eleucine indica L.Gaertn)和早熟禾(Poa annu L.)以及双子叶植物绿苋(Amaranthus viridis L.)、一点红(Emilia sonchifolia(L.)DC.)、胜红蓟(Ageratum conyzoides L)、马蹄金(Dichondra repens Fors)和羽芒菊(Tridaxprocumbens L)等杂草种类的实验结果，详见表2。

                  表2  2mg/ml多肽对不同杂草种子生根抑制效果            (％)

  杂草种类  所属门类  抑制率(％)  狗牙根(Cynodon dactylon(L.)Pers)  单子叶植物  93±6.29  光鳞水蜈蚣(Kyllinga brevifolia  Rottb.var.leiolepis(Franch.et Savat.)  Hara)  单子叶植物  100  牛筋草(Eleucine indica L.Gaertn)  单子叶植物  89±5.26  早熟禾(Poa annu L.)  单子叶植物  100  绿苋(Amaranthus viridis L.)  双子叶植物  100  一点红(Emilia sonchifolia(L.)DC.)  双子叶植物  100  胜红蓟(Ageratum conyzoides L)  双子叶植物  100  马蹄金(Dichondra repens Fors)  双子叶植物  98±4.26  羽芒菊(Tridax procumbens L)  双子叶植物  100

由此可见，由于对杂草种子萌发生根具抑制作用多肽对成熟根系不产生任何副作用，而对植物不论是双子叶植物还是单子叶植物杂草的种子萌发生根有抑制作用，因此可开发成无公害、能降解的萌前除草剂。该产品为白色粉末，易溶于水，可配成不同浓度来喷施土壤来防除杂草种子萌发。