一种转糖基α一半乳糖苷酶基因

摘要

本发明公开了一种转糖基α－半乳糖苷酶基因，所述基因由短双歧杆菌(Bifidobacterium breve)基因组DNA借助PCR扩增获得高保守DNA片段，然后进行Southern杂交获得。该基因核苷酸序列全长2226碱基，编码741个氨基酸。由该基因表达的重组酶特征为：酶为双亚基蛋白，聚合体分子量约为160kD，单亚基分子量约为80kD；酶对对硝基苯酚α－D－半乳糖苷的Km为0.17mmol/L，Vmax为4.43μmol/(L·min)；酶最适反应温度为37℃，最适反应pH为5.5～6.0；酶在水解蜜二糖或棉子糖的反应体系中具有转糖基活性，反应中有转糖基产物生成；酶广泛的受糖体底物特异性，可用以合成多种α－半乳糖基寡糖及α－半乳糖苷糖缀合物。酶基因的获得，可用于基因改造获得α－半乳糖苷合成酶，从根本上提高α－半乳糖基寡糖及糖缀合物的合成效率。

说明书

发明领域

本发明涉及一种α-半乳糖苷酶基因，尤其涉及一种转糖基α-半乳糖苷酶基因及其所述转糖基α-半乳糖苷酶基因的应用。

发明背景

寡糖是哺乳动物细胞表面糖蛋白和糖脂以及微生物来源的生理活性物质的要素之一，具有强大的生物信息传递等功能。因而，寡糖用于药物修饰、寡糖结构的分析和寡糖合成技术的发展就引起了人们的极大关注。寡糖作为一种疗法虽然被科学家公认具有相当大的潜能，但是至今其重要的作用还是没有得到充分的体现。其发展缓慢的原因之一是合成足够于临床使用量的寡糖非常困难。糖类化合物上多个可反应的羟基使特异性糖苷键的化学法合成步骤繁琐，不适合大规模生产。酶法催化合成寡糖凭借其简单的步骤、特异的区域选择性和立体选择性，正在成为寡糖和糖缀合物合成的主流。

有两类酶用于催化糖苷键的合成：糖基转移酶和糖苷酶。糖基转移酶已经用于生产某些寡糖，但酶的较难获得和核苷底物的高成本限制了其广泛应用。而糖苷酶催化的糖苷和低聚糖合成反应途径简单，不需要其它辅助因子，底物通常为价格便宜的单糖和双糖。酶较易获得，性质稳定。但是，糖苷酶所进行的合成反应中，转糖基新生成的糖苷和寡糖也可以重新被酶作为底物水解，反应处于水解和合成的动态平衡状态，导致转糖基产物的产量一般较低。为了打破这个平衡，科学家进行了不懈的努力。利用酶反应的热力学及动力学原理加大底物浓度、提高反应温度等可以在一定程度上提高糖苷产物的产量(10-40％)；采用高浓度有机溶剂(80-90％，v/v)或两相反应体系，降低水的浓度和活性，促使反应平衡向糖苷合成的方向进行，进一步提高了糖苷产物的产量(40-60％)。但是反应体系中水的有效浓度的维持和低水环境下水的高活性都在一定程度上限制了产物的产量及这些方法的最终应用。

近年来，分子生物学技术的发展和进步大大推动了糖苷酶合成寡糖领域的研究。1998年，科学家对糖苷酶进行分子改造，在酶催化中心用非亲核氨基酸残基取代亲核催化氨基酸残基，产生了一类新型活性酶，只催化合成反应，因此命名为糖苷合成酶(Glycosynthases)。糖苷合成酶的出现，彻底解决了产物被水解的问题，从根本上提高了糖苷酶的转糖基效率(转糖基效率可达90％以上)。到目前为止，国际上发展的糖苷合成酶共有13种，来源于11种不同的微生物及植物，分别由β-葡萄糖苷酶、β-葡聚糖苷酶、β-半乳糖苷酶、β-甘露糖苷酶、α-葡萄糖苷酶、β-甘露聚糖苷酶等改造获得，α-半乳糖苷合成酶的研究还未见报道。目前寡糖合成领域研究的热点就是寻找不同来源的高效转糖基糖苷酶，并获得酶基因，以便在此基础上进行基因改造获得糖苷合成酶。

α-半乳糖苷酶(EC3.2.1.22)，是一类重要的糖苷水解酶，在人、动物、植物及微生物体内均有发现，可特异性水解α-半乳糖苷键，还可以把α-半乳糖基转移到不同的羟基类衍生物上。其水解活性研究得较多，被广泛应用于加工农产品、人B→O血型改造、清除异种抗原以及治疗遗传性疾病法布莱氏病等；其转半乳糖基活性直到1988年才被日本科学家报道，目前国际上仅报道了十种来源的α-半乳糖苷酶具有转糖基活性，其中，有四种来源的α-半乳糖苷酶与蜜二糖进行了转糖基反应并鉴定了产物结构，均为Galα(1→6)Galα(1→6)Glc。为了获得新的酶法合成α-半乳糖苷键型，需要寻找新的转糖基α-半乳糖苷酶。此外，由于不同来源的α-半乳糖苷酶转半乳糖基反应的糖基受体专一性存在差异，因此寻找不同来源的转糖基α-半乳糖苷酶对酶法合成不同α-半乳糖基寡糖及糖缀合物有着重要意义。

值得注意的是，转糖基α-半乳糖苷酶遵循构型保持糖苷酶的作用机制，催化可逆反应，导致产物产率受到一定限制，因此在糖的大规模合成中存在局限性。这就需要进一步研究酶基因，为分子改造提供基础，以获得α-半乳糖苷合成酶，从根本上提高合成效率。目前国际上仅有五种转糖基α-半乳糖苷酶基因报道，而有关α-半乳糖苷合成酶的研究报道还是空白。所以研究不同来源的转糖基α-半乳糖苷酶基因，可以为糖苷酶的分子改造提供新的酶源，对高效合成不同键型的α-半乳糖基寡糖及糖缀合物有着重要意义。

经检索，目前国际上没有短双歧杆菌(Bifidobacterium breve)转糖基α-半乳糖苷酶基因的报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种新的转糖基α-半乳糖苷酶基因，为α-半乳糖苷合成酶的获得提供新的酶源，并填补国内外短双歧杆菌转糖基α-半乳糖苷酶基因研究的空白。

本发明涉及的转糖基α-半乳糖苷酶基因来源于短双歧杆菌(Bifidobacterium breve)ATCC 15700，特征如下：

(1)具有如SEQ ID No.1所示核苷酸序列，全长2226碱基；

(2)由于遗传密码的简并性，具有不同于SEQ ID No.1所示核苷酸序列但与SEQID No.1所编码的氨基酸序列相同的核苷酸序列；

(3)该基因编码741个氨基酸，序列如SEQ ID No.1所示。

上述转糖基α-半乳糖苷酶基因的应用，其方法是，将该基因克隆到pET-22b质粒表达载体上，转化大肠杆菌BL21(DE3)，诱导表达重组α-半乳糖苷酶，特征如下：

(1)上述基因在大肠杆菌中表达的重组酶为双亚基蛋白，聚合体分子量约为160kD，单亚基分子量约为80kD；酶对对硝基苯酚α-D-半乳糖苷(p-nitrophenyl-α-D-galactopyranoside，pNPG)的K_m为0.17mmol/L，V_max为4.43μmol/(L·min)，对蜜二糖和棉子糖的K_m值分别为0.66mmol/L，2.20mmol/L，V_max分别为0.58μmol/(L·min)，0.65μmol/(L·min)；酶对pNPG适宜反应的温度为37℃～40℃，适宜反应的pH为5.5～6.5；酶于4℃保存时，在pH 5.5～9.5范围内至少稳定保存24小时；Hg²⁺、Cu²⁺、Ag⁺强烈抑制酶的活性，Co²⁺、Mg²⁺、Ca²⁺、Mn²⁺、Zn²⁺、DTT、EDTA对酶的活性没有抑制作用；

(2)上述基因在大肠杆菌中表达的重组酶在水解蜜二糖或棉子糖的反应体系中具有转糖基活性，反应中有转糖基产物生成，其中，酶在蜜二糖反应体系中的主要转糖基产物结构为Galα(1→4)Galα(1→6)Glc，国际上现有的α-半乳糖苷酶的报道中，将半乳糖基转至蜜二糖的键型全部为α(1→6)键；在以pNPG为糖基供体时，能将半乳糖基转移到多种糖、醇化合物上，如半乳糖、木糖、葡萄糖、果糖、甘露糖、山梨糖、鼠李糖、海藻糖、蔗糖、乳糖、纤维二糖、山梨醇、肌醇、甘露醇等；其广泛的受糖体底物特异性，可用以合成多种α-半乳糖基寡糖及糖缀合物。

其中，上述重组酶对pNPG的最适反应温度为37℃。

其中，上述重组酶对pNPG的最适反应pH为5.5～6.0。

在上述pH5.5～9.5的缓冲范围中，pH5.5～8.0范围使用磷酸氢二钾一磷酸二氢钾缓冲液，pH8.0～10.0范围使用硼酸—氢氧化钠缓冲液。

在上述转糖基α-半乳糖苷酶基因的应用中，将该基因克隆到pET-22b质粒表达载体上，不仅可以获得大量重组酶以解决双歧杆菌难以培养的问题，同时还可用于基因改造，即对酶基因进行定点突变，在酶催化中心用非亲核氨基酸残基取代亲核催化氨基酸残基，以获得α-半乳糖苷合成酶，彻底去除水解反应，从根本上提高α-半乳糖基寡糖及糖缀合物的合成效率。

附图说明

图1为本发明的α-半乳糖苷酶基因表达的重组酶以蜜二糖为底物的转糖基反应。

其中：Lane 1，蜜二糖与灭活酶液反应；Lane 2，蜜二糖与纯酶反应。

图2为本发明的α-半乳糖苷酶基因表达的重组酶以棉子糖为底物的转糖基反应。

其中：Lane 1，棉子糖与灭活酶液反应；Lane 2，棉子糖与纯酶反应。

具体实施方式

实施例1短双歧杆菌(Bifidobacterium breve)ATCC 15700染色体DNA的提取

将短双歧杆菌(Bifidobacterium breve)ATCC 15700接种于5mL MRS培养基中，37℃厌氧培养24小时，取1.5ml培养物，12,000转/分离心2分钟，所得沉淀悬于565μL的TE缓冲液中，加入溶菌酶至终浓度10mg/ml，37℃温育30分钟；加入30μL10％(质量体积比)的十二烷基硫酸钠(SDS)和5μL 20mg/mL的蛋白酶K，混匀，于37℃温育1小时；加入等体积的酚/氯仿/异戊醇(25∶24∶1，v/v/v)，混匀；12,000转/分离心5分钟，将上清液转入新管中，再加入等体积的酚/氯仿/异戊醇，混匀；12,000转/分离心5分钟，将上清转入新管中，加入2倍体积无水乙醇，轻轻混匀直到DNA沉淀下来；12,000转/分离心5分钟，DNA沉淀用70％乙醇洗涤2次；真空干燥10分钟，重溶于50μL的TE缓冲液。

上述MRS培养基配方为：蛋白胨1g/L；K₂HPO₄0.2g/L；柠檬酸三铵0.2g/L；牛肉浸膏1g/L；NaAc·3H₂O 0.05g/L；MgSO₄·7H₂O 0.02g/L；MnSO₄·4H₂O 0.005g/L；酵母浸膏0.5g/L；葡萄糖2g/L；Tween 800.1g/L；pH 6.0～6.6，115℃灭菌30分钟；

TE缓冲液配方如下：10mmol/L的三羟甲基氨基甲烷(Tris)，1mmol/L的乙二胺四乙酸二钠(EDTA)，调pH为8.0。

实施例2B.breve ATCC 15700α-半乳糖苷酶基因高保守DNA片段克隆

从GenBank中检索到不同菌株的α-半乳糖苷酶基因的DNA序列，用在线软件Clustal W比较序列同源性，利用引物设计软件Primer5.0设计了一对简并PCR引物：

Wtz-F：5’-(TC)TI AA(TC)A(AC)(N)TGG GA(AG)G-3’

Wtz-R：5’-(GA)TC CCA(CT)TT(N)A(CT)(GA)TA(GA)TC-3’

以提取的B.breve ATCC 15700染色体DNA为模板，用上述引物进行PCR。PCR扩增体系总体积为50μL，含超纯水35μL，10×PCR buffer 5μL，dNTP2.4mmol/L，引物各1μmol/L，MgCl₂1.5mmol/L，模板DNA100ng，TaKaRa Taq 2.5U。PCR扩增条件：95℃预变性5分钟；反应28个循环(95℃变性1分钟，52℃退火1分钟，72℃延伸1分钟)；28个循环结束后72℃延伸10分钟。PCR产物约为460bp左右，经琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭染色，紫外分析仪检测，然后回收，所得产物即为B.breve ATCC 15700α-半乳糖苷酶基因高保守DNA片段，测得序列如SEQ ID No.2。

详列如下：

gattatccca ctttatgtag tctatgccga gttcgctcac aagcgcatcc atgcagccgt       60

acacctagcc gtaggcctgt gggttcgtca ggtcgaccac ctgctggttg cggccctgca      120

ttggcaggcg atgcgccgtg gggcgcagca cccagtcggg gtgctctcgg tacatgtccg      180

aatcgggatt caccatctct ggctcgaacc acaagccgaa ctccatgcct ttggcgtgca      240

cgtagtcggc gagcgccttg agtgaatggt cgccgtctgg ccacacgtcc tgagctatgt      300

gccagtcgcc cagcccagcg gtatcgtcgc gccgggcgcc gaaccacccg tcgtccacca      360

cgaagcgttc cacgccgcta gcggcggcct tgtcggcgag cgccttcaac gtgtcgaaat      420

catgctggaa ctacaccgcc tcccatgtgt tcaaatc                               480

上述α-半乳糖苷酶基因保守序列DNA片段与已报道的2株双歧杆菌——青春双歧杆菌(B.adolescentis)和长双歧杆菌(B.longum)的α-半乳糖苷酶基因均有较高的同源性，说明此保守DNA片段非常适合作为探针进行标记，与B.breve ATCC 15700的DNA进行Southern杂交，筛选B.breve ATCC 15700α-半乳糖苷酶基因。

实施例3B.breve ATCC 15700α-半乳糖苷酶全基因克隆

(1)B.breve ATCC 15700部分基因文库的构建

B.breve ATCC 15700染色体DNA提取后，同时进行六组完全酶切，六组酶分别是BamH I-HindIII、BamH I-Nde I、BamH I-Xba I、HindIII-Nde I、HindIII-Xba I、BamH I(TaKaRa)。电泳后转膜，用已克隆的457bp的DNA片段为探针，进行Southern杂交。结果显示B.breve ATCC 15700染色体DNA经BamH I和Nde I双酶切后，可与探针杂交的片段在6kb左右，可用于构建部分基因文库。经实验估测，部分基因文库中81.3％左右的重组菌连有外源片段，文库构建成功。

(2)含α-半乳糖苷酶基因重组质粒的筛选、验证及序列测定

挑选重组菌单菌落接种到5ml LB液体氨苄(100μg/mL)培养基中，37℃过夜摇床培养，离心收集菌细胞，测定酶活，筛选到有α-半乳糖苷酶水解活性的重组菌(编号为51)，提取质粒分别进行BamH I单酶切及BamH I-HindIII双酶切验证，结果显示，单酶切得到11.5kb左右的一条带，而双酶切得到5.5kb左右和6kb左右的两条带，分别符合载体和外源片段的大小。将该重组菌质粒进行测序，测序由上海博亚生物技术有限公司完成。

上述LB培养基配方为：蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，氯化钠7g/L，pH 7.0～7.5，121℃灭菌20分钟。

上述α-半乳糖苷酶水解活性测定：

取菌细胞30mg，加150μL 50mmol/L醋酸钠缓冲液(pH5.5)配制的2mmol/LpNPG，37℃反应10分钟后，加入1.05ml、0.2mol/L、pH 10.5硼酸缓冲液终止反应，12000转/分离心2分钟，上清液于400nm比色。活力单位规定：每分钟从对硝基苯酚糖苷底物中水解释放1μmol硝基苯酚的糖苷酶量为1个酶活单位(U)。

(3)B.breve ATCC 15700α-半乳糖苷酶基因序列的确定

对上述测序得到的序列进行分析，显示有一个开放阅读框架，由2226个核苷酸组成，编码741个氨基酸，与已发表的青春双歧杆菌、长双歧杆菌的α-半乳糖苷酶氨基酸序列同源性均超过70％，并且具有α-半乳糖苷酶的保守序列模式，因而确定该核苷酸序列为B.breve ATCC 15700α-半乳糖苷酶全基因序列，如SEQ ID No.1所示。

实施例4 B.breve ATCC 15700α-半乳糖苷酶基因的亚克隆及其在大肠杆菌中的表达

设计引物，引入能插入pET-22b质粒(Novagen)的Nde I和BamH I酶切位点(pET-22b质粒载体具有C端6His标记，便于表达蛋白的纯化)，序列如下：

22b-F：5’-CTCTCATATGATGGCAATCATGGATTTCCACGGGAG-3’

22b-R：5’-ATATGGATCCGCTCTC ACGCGCGTGGCGCTGAAC-3’

将重组菌51接种于5ml LB液体氨苄培养基中，37℃过夜摇床培养，提取质粒DNA作为模板，采用上述引物进行PCR扩增。PCR扩增体系总体积为50μL，含超纯水35μL，10×PCR buffer 5μL，dNTP2.4mmol/L，引物各1μmol/L，MgCl₂1.5mmol/L，模板DNA100ng，TaKaRa LA Taq 2.5U。PCR扩增条件：95℃预变性5分钟；反应28个循环(95℃变性1分钟，52℃退火1分钟，72℃延伸2分钟)；28个循环结束后72℃延伸10分钟。PCR产物约为2.2kb左右，经琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭染色，紫外分析仪检测，然后回收，所得产物即为B.breve ATCC 15700α-半乳糖苷酶全基因片段。依次加Nde I和BamH I于37℃酶切3小时，进行琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭染色，紫外分析仪检测，回收目的片段，同时采用同样酶切方法处理pET-22b质粒载体。将制备好的酶基因片段与pET-22b载体按一定比例混合，采用连接试剂盒(TaKaRa DNA LigationKitVer.2.0)于16℃连接8小时。然后采用CaCl₂转化法转化宿主菌E.coli BL21(DE3)，转化菌液涂布氨苄青霉素平板，37℃过夜培养。提取阳性菌落质粒，酶切验证，对质粒酶切正确的重组菌进行表达实验，即重组菌经IPTG诱导培养后，离心收集菌细胞，测α-半乳糖苷酶水解活性和转糖基活性，将完全符合要求的重组菌作为菌种保存。

上述α-半乳糖苷酶水解活性测定方法同实施例3。

上述α-半乳糖苷酶转糖基活性测定方法：

取50mg菌细胞，悬浮于1mL pH7.0、10mmol/L的磷酸钾缓冲液中，于冰水浴用玻璃珠破碎细胞，悬液于10000转/分钟离心20分钟，所得上清液即为粗酶液。取20μL粗酶液，加入100μL pH7.0磷酸钾缓冲液配制的100mmol/L蜜二糖或棉子糖溶液，于37℃反应2小时，12,000转/分离心5分钟，上清液即为反应产物。

将反应产物进行薄层层析(Thin-Layer Chromatography，TLC)分析，确定转糖基活性。TLC薄板(Silica gel60，No.553，Merck)点样后，在展层剂(正丁醇∶乙醇∶水＝5∶3∶2，v/v/v)中展层，雾喷显色剂(20％硫酸溶液+0.5％的3，5-二羟基甲苯)，于120℃烘烤10分钟，糖斑点显色，如果底物糖斑点以下生成了新的大分子寡糖斑点，则α-半乳糖苷酶有转糖基活性。

实施例5 B.breve ATCC 15700α-半乳糖苷酶基因在大肠杆菌中的表达与纯化

将实施例4所保存的E.coli BL21(DE3)重组菌接种于200mL LB氨苄培养液，37℃培养12小时，转接于2L LB氨苄培养液，37℃培养，测定培养液在600nm下的吸光度变化。当吸光值达0.5～0.8时，加入IPTG至终浓度1mmol/L，再继续培养3～5小时，于12000转/分离心3分钟，获得细胞沉淀，悬浮于80mL pH7.0，10mmol/L的磷酸钾缓冲液。在冰水浴中超声波破碎细胞，破碎液于4℃以12000转/分离心20分钟，所得上清即为粗酶液。

粗酶液用Ni-NTA Agarose(QIAGEN)亲合柱层析除去不带6His标记的杂蛋白，然后用DEAE Sepharose Fast Flow柱层析得到了电泳纯α-半乳糖苷酶。

实施例6B.breve ATCC 15700重组α-半乳糖苷酶的基本酶学特性

(1)酶的分子量

酶蛋白分子量的测定采用聚丙烯酰胺凝胶电泳(polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE)。根据样品和标准蛋白的PAGE图，测定样品和标准蛋白的相对迁移值R_f，用标准蛋白的R_f值对分子量的对数作标准曲线。再根据纯酶样品的R_f值，就可求得其分子量。SDS-PAGE采用垂直板式不连续系统电泳方式，电泳分离胶浓度为12％，浓缩胶为4％；Native gradient PAGE(非解离梯度聚丙稀酰胺凝胶电泳)采用5～20％线形梯度垂直板状聚丙烯酰胺凝胶，4℃电泳。

Native gradient PAGE显示酶蛋白的分子量约为160kD，SDS-PAGE显示酶蛋白单亚基分子量约为80kD，表明该酶为一个双亚基蛋白。

(2)酶的动力学参数

酶的动力学参数的测定采用双倒数法。

将30μL纯酶(1.42U/mL)与150μL不同浓度(浓度范围0.24～1.75mmol/L)的pNPG溶液混合，于37℃反应3分钟，加1.05mL 0.2mol/L、pH 10.5硼酸缓冲液终止反应，测定OD₄₀₀，计算水解速率，用双倒数作图法测得酶对pNPG的K_m值为0.17mmol/L，V_max为4.43μmol/(L·min)。

将30μL纯酶(2.5U/mL)与150μL不同浓度(浓度范围0.072～0.35mol/L)的蜜二糖溶液混合，于37℃反应30分钟，用葡萄糖试剂盒(上海丰汇医学科技有限公司)测定水解的葡萄糖含量，计算水解速率，用双倒数作图法测得酶对蜜二糖的K_m值为0.66mmol/L，V_max为0.58μmol/(L·min)。

将30μL纯酶(2.5U/mL)与150μL不同浓度(浓度范围0.072～0.35mol/L)的棉子糖溶液混合，于37℃反应30分钟，用3，5-二硝基水杨酸比色定糖法测定水解反应产物中的还原糖含量，计算水解速率，用双倒数作图法测得酶对棉子糖的K_m值为2.20mmol/L，V_max为0.65μmol/(L·min)。

(3)温度和pH对酶活性的影响

在适当的温度范围(20℃～70℃)内，每5℃为一个梯度测定酶在该温度下的相对酶活。结果表明：酶适宜反应的温度为37℃～40℃，最适反应温度为37℃。将酶在上述温度梯度下保温2小时后测定相对酶活。结果表明：酶在40℃以下比较稳定，60℃以上失活很快，70℃失去所有的酶活。

用不同pH的缓冲液配制酶反应体系，测定相对酶活，结果表明：酶适宜反应的pH为5.5～6.5，最适反应pH为5.5～6.0；酶在不同pH的缓冲液中4℃保存24小时，测定相对酶活，结果表明：酶在pH 5.5～9.5范围内稳定。

上述酶活测定方法为：30μL适当稀释的纯酶与150μL2mmol/L的pNPG溶液混合，于37℃反应10分钟，加1.05mL 0.2mol/L、pH 10.5的硼酸缓冲液终止反应，测定OD₄₀₀。

上述不同pH缓冲液分别为：醋酸—醋酸钠缓冲液pH3.5～6.0；磷酸氢二钾—磷酸二氢钾缓冲液pH5.5～8.0；硼酸—氢氧化钠缓冲液pH8.0～10.0。

(4)部分金属离子和化合物对酶活性的影响

以pNPG为底物，在酶活测定反应体系中分别加入终浓度为1mmol/L的各种金属离子、10mmol/L的EDTA、DTT，测定相对酶活。结果显示，Hg²⁺、Cu²⁺、Ag⁺强烈抑制酶的活性，Co²⁺、Mg²⁺、Ca²⁺、Mn²⁺、Zn²⁺、DTT、EDTA对酶的活性没有抑制作用。

实施例7B.breve ATCC 15700重组酶以蜜二糖及棉子糖为底物的转糖基反应

将20μL pH7.0磷酸钾缓冲液配制的100mmol/L蜜二糖和棉子糖溶液，分别与4μL纯酶于37℃反应2小时，100℃煮沸5分钟灭活酶液，然后进行薄层层析(Thin-LayerChromatography，TLC)分析。TLC薄板(Silica gel60，No.553，Merck)点样后，在展层剂(正丁醇∶乙醇∶水＝5∶3∶2，v/v/v)中展层，雾喷显色剂(20％硫酸溶液+0.5％的3，5-二羟基甲苯)，于120℃烘烤10分钟，糖斑点显色。如图1、图2，底物糖斑点以下生成了新的大分子寡糖斑点，是转糖基产物。该酶在蜜二糖反应体系中的主要转糖基产物结构为Galα(1→4)Galα(1→6)Glc，而国际上现有的α-半乳糖苷酶的报道中，将半乳糖基转至蜜二糖的键型全部为α(1→6)键。

实施例8B. breve ATCC 15700重组酶广泛的受糖体底物特异性

B.breve ATCC 15700重组酶具有广泛的受糖体底物特异性，能以pNPG为糖基供体，将半乳糖基转移到多种糖、醇化合物上，如半乳糖、木糖、葡萄糖、果糖、甘露糖、山梨糖、鼠李糖、海藻糖、蔗糖、乳糖、纤维二糖、山梨醇、肌醇、甘露醇等。

17μL 10mmol/L pH7.0磷酸钾缓冲液配制的100mmol/L糖或醇受体溶液、3μL100mmol/L pNPG和5μL纯酶，于37℃进行反应，在5小时取样。同时做对照实验，不加糖基供体pNPG，0小时、5小时取样。然后进行TLC分析，结果表明，pNPG为糖基供体时，原有的糖受体(醇因不能显色除外)和水解产生的半乳糖斑点以下出现了新的糖斑点，是转糖基生成的α-半乳糖基寡糖及糖缀合物。在对照实验中，未生成新的糖斑点，说明上述受体分子不能在酶的作用下发生自转。重组酶广泛的受糖体底物特异性，可用以合成多种α-半乳糖基寡糖及糖缀合物。

                            序列表

SEQ ID No.1

<110>山东大学

<120>一种转糖基α-半乳糖苷酶基因

<141>2005-9-26

<160>2

<210>1

<211>2226

<212>DNA

<213>短双歧杆菌(Bifidobacterium breve)ATCC 15700

<221>短双歧杆菌(Bifidobacterium breve)ATCC 15700转糖基α-半乳糖苷酶基因

<222>(1)…(2226)

<400>1

atg gct ata atg gat ttc cac ggg agt tcg agc cgg ggc gaa gat ata cac gtg gtg tag      60

Met Ala Ile Met Asp Phe His Gly Ser Ser Ser Arg Gly Glu Asp Ile His Val Val Tyr

1               5                   10                  15                  20

gtc gag cag cgg gac gcg cgg tcc gcg ttc gct ttc gcg att gtg gat cgc gag ctg cca     120

Val Glu Gln Arg Asp Ala Arg Ser Ala Phe Ala Phe Ala Ile Val Asp Arg Glu Leu Pro

                25                  30                  35                  40

cgc ata gtg cat tgg ggc cgg cca ctc tcc gac cca cgc aca ctc gtg gct gcg gtg gat     180

Arg Ile Val His Trp Gly Arg Pro Leu Ser Asp Pro Arg Thr Leu Val Ala Ala Val Asp

                45                  50                  55                  60

gcg ctg cgc cca cag cgg gtg tcc ggc gcg ctc gac gag acg gcc tgg cca agc ata ctg     240

Ala Leu Arg Pro Gln Arg Val Ser Gly Ala Leu Asp Glu Thr Ala Trp Pro Ser Ile Leu

                65                  70                  75                  80

ccc acg cag gcc gaa gct tgg acc ggc gcg cca cgc ttc gtg gtg cgc gcc ggc ggc gtg     300

Pro Thr Gln Ala Glu Ala Trp Thr Gly Ala Pro Arg Phe Val Val Arg Ala Gly Gly Val

                85                  90                  95                  100

gag ctg ttc tgc cgc ttc acc gtg acc gat gtg cgc ata gac gat ggc ggc gct acg gtg     360

Glu Leu Phe Cys Arg Phe Thr Val Thr Asp Val Arg Ile Asp Asp Gly Gly Ala Thr Val

                105                 110                 115                 120

agc gcc gag gac gcc gag cag ggc gtg cgc gtg ctg tgg cgg tgc gaa ctg cgg gaa agc     420

Ser Ala Glu Asp Ala Glu Gln Gly Val Arg Val Leu Trp Arg Cys Glu Leu Arg Glu Ser

                125                 130                 135                 140

ggc ctc gtg cgc caa cgc atg tcg gtt gtg aac atg cgc gcc gag gaa ctg gaa ata ggc     480

Gly Leu Val Arg Gln Arg Met Ser Val Val Asn Met Arg Ala Glu Glu Leu Glu Ile Gly

                145                 150                 155                 160

acg gtg gag ctc gct ttc ccc gtg ccc gcg gac atg acc gag ata ctc acg acg acc ggc     540

Thr Val Glu Leu Ala Phe Pro Val Pro Ala Asp Met Thr Glu Ile Leu Thr Thr Thr Gly

                165                 170                 175                 180

cac cac ctg cgc gaa cgc tcg cca cag cgc cag cca ttc acg ata ggc cgg ttc cag aag     600

His His Leu Arg Glu Arg Ser Pro Gln Arg Gln Pro Phe Thr Ile Gly Arg Phe Gln Lys

                185                 190                 195                 200

gcg agc ctc gtg gga cgc ccc gat ttc gat tcg tcg ctg ctg ctg aac gtg ggc cgc ccc     660

Ala Ser Leu Val Gly Arg Pro Asp Phe Asp Ser Ser Leu Leu Leu Asn Val Gly Arg Pro

                205                 210                 215                 220

ggc ttc ggt ttc acg cac ggc gac gtg tac tcc gtg cat gtg gcc tgg agc ggc aac tca     720

Gly Phe Gly Phe Thr His Gly Asp Val Tyr Ser Val His Val Ala Trp Ser Gly Asn Ser

                225                 230                 235                 240

ctc atg gcc gcg gaa cgg ctg cca tac acc tcc ggc ctg ata ggc ggc gcg gaa gcg ctt     780

Leu Met Ala Ala Glu Arg Leu Pro Tyr Thr Ser Gly Leu Ile Gly Gly Ala Glu Ala Leu

                245                 250                 255                 260

tcc ggc ggg gaa gtg acg ttg tgt gcg gac ggg gac gat aac cgc tac acg aca cca tgg     840

Ser Gly Gly Glu Val Thr Leu Cys Ala Asp Gly Asp Asp Ash Arg Tyr Thr Thr Pro Trp

                265                 270                 275                 280

ctg tac ggc tcg tac ggc gaa ggg ttc aac gag gtg gct tca cgc ttc cac aac gaa ctg     900

Leu Tyr Gly Ser Tyr Gly Glu Gly Phe Asn Glu Val Ala Ser Arg Phe His Asn Glu Leu

                285                 290                 295                 300

cgc gcg acg cac gcg cag tgg cgc gcc gaa ctc ggt gtg gcc gaa aaa cca cgc ccc gtg     960

Arg Ala Thr His Ala Gln Trp Arg Ala Glu Leu Gly Val Ala Glu Lys Pro Arg Pro Val

                305                 310                 315                 320

atc ctc aac aca tgg gag gcg gtg tag ttc cag cat gat ttc gac acg ttg aag gcg ctc    1020

Ile Leu Asn Thr Trp Glu Ala Val Tyr Phe Gln His Asp Phe Asp Thr Leu Lys Ala Leu

                325                 330                 335                 340

gcc gac aag gcc gcc gct agc ggc gtg gaa cgc ttc gtg gtg gac gac ggg tgg ttc ggc    1080

Ala Asp Lys Ala Ala Ala Ser Gly Val Glu Arg Phe Val Val Asp Asp Gly Trp Phe Gly

                345                 350                 355                 360

gcc cgg cgc gac gat acc gct ggg ctg ggc gac tgg cac ata gct cag gac gtg tgg cca    1140

Ala Arg Arg Asp Asp Thr Ala Gly Leu Gly Asp Trp His Ile Ala Gln Asp Val Trp Pro

                365                 370                 375                 380

gac ggc gac cat tca ctc aag gcg ctc gcc gac tac gtg cac gcc aaa ggc atg gag ttc    1200

Asp Gly Asp His Ser Leu Lys Ala Leu Ala Asp Tyr Val His Ala Lys Gly Met Glu Phe

                385                 390                 395                 400

ggc ttg tgg ttc gag cca gag atg gtg aat ccc gat tcg gac atg tac cga gag cac ccc    1260

Gly Leu Trp Phe Glu Pro Glu Met Val Asn Pro Asp Ser Asp Met Tyr Arg Glu His Pro

                405                 410                 415                 420

gac tgg gtg ctg cgc ccc acg gcg cat cgc ctg cca atg cag ggc cgc aac cag cag gtg    1320

Asp Trp Val Leu Arg Pro Thr Ala His Arg Leu Pro Met Gln Gly Arg Asn Gln Gln Val

                425                 430                 435                 440

gtc gac ctg acg aac cca cag gcc tac ggc tag gtg tac ggc tgc atg gat gcg ctt gtg    1380

Val Asp Leu Thr Asn Pro Gln Ala Tyr Gly Tyr Val Tyr Gly Cys Met Asp Ala Leu Val

                445                 450                 455                 460

agc gaa ctc ggc ata gac tac ata aag tgg gac cac aac aaa tag gtg acc gaa gcg gtg    1440

Ser Glu Leu Gly Ile Asp Tyr Ile Lys Trp Asp His Asn Lys Tyr Val Thr Glu Ala Val

                465                 470                 475                 480

tcg cca cgc acc ggc cga cca gcc gtg cat ggg cag aca ctc gcc gtg tac cgc ata ttc    1500

Ser Pro Arg Thr Gly Arg Pro Ala Val His Gly Gln Thr Leu Ala Val Tyr Arg Ile Phe

                485                 490                 495                 500

cgc gac ctc aaa acc gcg cac ccc ggc ctg gag ata gaa agc tgc tcg tcc ggc ggc ggc    1560

Arg Asp Leu Lys Thr Ala His Pro Gly Leu Glu Ile Glu Ser Cys Ser Ser Gly Gly Gly

                505                 510                 515                 520

cgc gtg gac ctc gcg ata ctc tcg ctc gcc gac cgc ata tgg gcg tcg gat tgc gtg gat    1620

Arg Val Asp Leu Ala Ile Leu Ser Leu Ala Asp Arg Ile Trp Ala Ser Asp Cys Val Asp

                525                 530                 535                 540

ccg gtg gaa cgc gcg gac ata cag cgc tac acg tcg ctt ctc gtg cca cca gag atg ata    1680

Pro Val Glu Arg Ala Asp Ile Gln Arg Tyr Thr Ser Leu Leu Val Pro Pro Glu Met Ile

                545                 550                 555                 560

ggc gaa cat gtg ggc gcg agc ccc gcg cat tcc acc cac cgg gcg acg agc cag cag atg    1740

Gly Glu His Val Gly Ala Ser Pro Ala His Ser Thr His Arg Ala Thr Ser Gln Gln Met

                565                 570                 575                 580

cgc atg gcg atg gcg ttc ttc ggg cat ctg ggc ata gaa tgg aac ctg ctc aag gaa cca    1800

Arg Met Ala Met Ala Phe Phe Gly His Leu Gly Ile Glu Trp Asn Leu Leu Lys Glu Pro

                585                 590                 595                 600

cag tcg gcg ctc gac gaa ctc ggt gtg tgg gtg gac gcg tac aag cgg cac cgc gcg gac    1860

Gln Ser Ala Leu Asp Glu Leu Gly Val Trp Val Asp Ala Tyr Lys Arg His Arg Ala Asp

                605                 610                 615                 620

ttc gcg cac ggc acc gtg gtg cac ggc gat gcg gcc gat ccc gcg gtg cgc gtg gat ggc    1920

Phe Ala His Gly Thr Val Val His Gly Asp Ala Ala Asp Pro Ala Val Arg Val Asp Gly

                625                 630                 635                 640

gtc gtg agc gcc agc ggc gaa cgc gcc gtg tac cgc ttc acg caa ttg acg aca tcg cag    1980

Val Val Ser Ala Ser Gly Glu Arg Ala Val Tyr Arg Phe Thr Gln Leu Thr Thr Ser Gln

                645                 650                 655                 660

acc tac cca gcg gct cca gtg cgc ctg cca gga ctc gcc cca gac gcc gac tag ctg ata    2040

Thr Tyr Pro Ala Ala Pro Val Arg Leu Pro Gly Leu Ala Pro Asp Ala Asp Tyr Leu Ile

                665                 670                 675                 680

cag cca ctc gct tgc aat ctc gcc agc ggc gag cca ttc aca caa ata ggt aac ggg cag    2100

Gln Pro Leu Ala Cys Asn Leu Ala Ser Gly Glu Pro Phe Thr Gln Ile Gly Asn Gly Gln

                685                 690                 695                 700

agc gaa ctc ggc tgg tgg aac agc caa ggc gtg gtg atg aac ggc ggt gcg ctc gac gcg    2160

Ser Glu Leu Gly Trp Trp Asn Ser Gln Gly Val Val Met Asn Gly Gly Ala Leu Asp Ala

                705                 710                 715                 720

ttc ggc ttg cgc cca cca tgc ata cac cca gcg aac gcc gtg ctg ttc agc gcc acg cgc    2220

Phe Gly Leu Arg Pro Pro Cys Ile His Pro Ala Asn Ala Val Leu Phe Ser Ala Thr Arg

                725                 730                 735                 740

gtg tga                                                                            2280

Val

741

SEQ ID No.2

<210>2

<211>457

<212>DNA

<221>B.breve ATCC 15700α-半乳糖苷酶基因高保守DNA片段

<222>(1)…(457)

<400>2

gattatccca ctttatgtag tctatgccga gttcgctcac aagcgcatcc atgcagccgt       60

acacctagcc gtaggcctgt gggttcgtca ggtcgaccac ctgctggttg cggccctgca      120

ttggcaggcg atgcgccgtg gggcgcagca cccagtcggg gtgctctcgg tacatgtccg      180

aatcgggatt caccatctct ggctcgaacc acaagccgaa ctccatgcct ttggcgtgca      240

cgtagtcggc gagcgccttg agtgaatggt cgccgtctgg ccacacgtcc tgagctatgt      300

gccagtcgcc cagcccagcg gtatcgtcgc gccgggcgcc gaaccacccg tcgtccacca      360

cgaagcgttc cacgccgcta gcggcggcct tgtcggcgag cgccttcaac gtgtcgaaat      420

catgctggaa ctacaccgcc tcccatgtgt tcaaatc                               480