用于增加植物对胁迫条件耐受性的方法和手段

摘要

提供了通过降低植物中内源PARG蛋白的活性来提高植物对非生物胁迫或不利生长条件的耐受性的方法和手段，所述的非生物胁迫或不利生长条件包括干旱、高光照强度、高温、营养限制等。

说明书

发明领域

本发明涉及聚ADP核糖糖基水解酶在植物中的用途，用于增加植物对不利的生长条件包括干旱、高光照强度、高温、营养限制等的耐受性。提供了方法和手段来产生对非生物胁迫条件耐受的植物。

发明背景

通常非生物胁迫条件将直接或间接地导致暴露于不利条件的植物细胞的DNA损伤。如果基因组损伤任其不修复，可导致细胞死亡。植物表现的对胁迫条件的耐受性是暴露于不利条件的植物细胞能减少和/或修复损伤并存活的能力的结果。

像其它真核细胞一样，植物细胞已经进化产生精细的DNA修复系统。由DNA链的断裂激活聚ADP-核糖聚合酶(PARP)常常是对DNA损伤的第一细胞反应之一。PARP通过连续地加入由烟酰胺二核苷酸(NAD)转化得到的ADP-核糖分子来催化蛋白质的翻译后修饰以形成包含多达200个ADP-核糖残基(植物中约40个残基)的多支链聚合物。聚ADP-核糖合成对DNA链断裂的依赖，以及进一步包含DNA修复、复制和转录反应的关键效应物的多蛋白复合物中PARP的存在，强烈地暗示这种翻译后修饰参与核酸的代谢及DNA修复。也有迹象表明聚ADP-核糖合成参与细胞周期和细胞死亡的调控。

蛋白的聚ADP-核糖基化在活细胞中是暂时的。聚ADP-核糖聚合物快速的周转，通过聚ADP-核糖糖基水解酶(PARG：EC 321143)的外切糖苷酶和内切糖苷酶活性转化为游离的ADP-核糖。ADP-核糖在蛋白受体上最接近的部分通过另一种酶(ADP-核糖基蛋白裂解酶)的作用水解。

除了PARP在细胞存活上的这种正(DNA-修复相关的)效应，PARP也存在负效应。当DNA损伤时，激活PARP的过程与NAD+水平迅速降低相关，因为PARP每转移一个ADP-核糖单位就消耗一分子NAD+。NAD+的消耗接下来导致ATP的消耗，因为NAD+再合成需要至少(取决于生物合成途径)三分子的ATP每分子NAD+。而且，NAD+消耗阻碍甘油醛-3-磷酸脱氢酶活性，在糖酵解过程中需要该酶来再合成ATP。最后，NAD+是通过电子转移和氧化磷酸化产生ATP所需的关键电子载体。

NAD+和ATP消耗的生理学后果已经确定与DNA-损伤诱导的细胞死亡相关。已经表明，程序性细胞死亡的完成绝对依赖于ATP的存在，并且缺少该核苷酸时，细胞死亡的类型由程序性细胞死亡转变为坏死。由于与坏死相关的细胞溶解对邻近细胞产生进一步损伤，所以多细胞生物体更优先倾向于细胞程序性细胞死亡而不是坏死。

因而考虑聚ADP核糖基化对在DNA损伤下细胞存活潜能的正作用和负作用之间的微妙平衡是非常重要的。

WO 00/04173描述了一种在真核细胞和生物体中，特别是植物细胞和植物体中，通过导入“PCD调控嵌合基因”影响内源的聚ADP-核糖聚合酶(PARP)基因的表达和/或表观活性来调节程序化细胞死亡(PCD)的方法。可以抑制或激活程序化细胞死亡。本发明特别涉及编码具有PARP活性的蛋白的核苷酸序列的用途，用于调控PCD、提高生长速率或产生胁迫耐受性细胞和生物体。

PARG编码基因在一些动物如大鼠(Rattus norvegicus)(基因登录号：NM_031339、NW_043030、AB019366)、小鼠(Mus musculus)(基因登录号：NT_039598、NM_003631、AF079557)、现代智人(Homo sapiens)(基因登录号：NT_017696、NM_003631、AF079557)、牛(Bos taurus)(基因登录号：NM_031339、NW_043030、AB019366)、果蝇(Drosophilamelanogaster)(基因登录号：AF079556)中得以鉴定。

在植物中，聚ADP-核糖糖基水解酶通过野生型基因的图位克隆得以鉴定，其中所述基因在突变体中受到拟南芥的生物钟控制的基因转录和光周期依赖的从营养生长至开花的转换影响而失活(tej)。基因的核苷酸序列可以从核苷酸数据库基因登录号AF394690(Panda等，2002 Dev.Cell.第3期，51-61页)获得。

发明概述

本发明提供一种方法来产生对胁迫条件耐受的植物，其中所述方法包括的步骤是给植物细胞提供嵌合基因以产生转基因植物细胞，其中该嵌合基因包含下面的有效连接的DNA片段：可在植物表达的启动子；当转录时产生ParG抑制性RNA分子的DNA区；以及参与转录终止和多聚腺苷酸化的3’末端区。由转基因植物细胞再生转基因植物品系群体；并在转基因植物品系群体中鉴定胁迫条件耐受植物品系。ParG抑制性RNA分子可以包含这样的至少20个连续核苷酸的核苷酸序列，其中所述的至少20个连续核苷酸来自存在于植物细胞的ParG基因(内源ParG基因)的核苷酸序列。ParG抑制性RNA分子也可以包含这样的至少20个连续核苷酸的核苷酸序列，其中所述的连续核苷酸来自存在于植物细胞的ParG基因(内源ParG基因)的核苷酸序列的互补序列。另外在另一实施方案中，ParG抑制性RNA可以包含这样的有义区及反义区，所述有义区包含至少20个连续核苷酸的核苷酸序列，其中所述的连续核苷酸来自存在于植物细胞的ParG基因的核苷酸序列，所述反义区包含至少20个连续核苷酸的核苷酸序列，其中所述的连续核苷酸来自存在于植物细胞的ParG基因的核苷酸序列的互补序列，其中有义区和反义区能形成包含上述至少20个连续核苷酸的双链RNA区。嵌合基因可进一步包含在所述编码parG抑制性RNA分子的DNA区和3’末端区之间编码自剪接核酶的DNA区。胁迫条件可选自热、干旱、营养耗竭、氧化胁迫或强光照条件。

在本发明的另一个实施方案中，提供了一种方法以产生对胁迫条件耐受的植物，其中所述方法包括的步骤是：分离至少100bp的包含目的植物部分parG编码基因的DNA片段；通过有效地将可在植物表达的启动子区以与启动子相同的方向连接经分离的包含植物部分parG编码基因的DNA片段；以及以与启动子区相反的方向连接经分离的包含所述植物部分parG编码基因的DNA片段，和参与转录终止和多聚腺苷酸化的3’末端区来产生嵌合基因。然后将这些嵌合基因提供给植物细胞以产生转基因植物细胞。由转基因植物细胞再生转基因植物品系群体；并在转基因植物品系群体中鉴定胁迫耐受植物品系。本发明也涉及通过此方法获得的胁迫耐受植物细胞和胁迫耐受植物。

又在本发明另一实施方案中，也提供了一种方法来产生对胁迫条件耐受的植物，其中所述的方法包括的步骤是给植物细胞提供嵌合基因以产生转基因植物细胞，该嵌合基因包含转录时产生ParG抑制性RNA分子的DNA区，其中该DNA区包含编码下述蛋白质的核苷酸序列中的至少21-100个核苷酸的核苷酸序列，其中所述的蛋白质包含氨基酸序列SEQ IDNo 1、2或16，或包含SEQ ID 3、4、15或23的核苷酸序列的至少21-100个核苷酸，这些DNA区有效地连接至可在植物表达的启动子及参与转录终止和多聚腺苷酸化的3’末端区上；从所述转基因细胞再生转基因植物品系群体；并在转基因植物品系群体中鉴定胁迫耐受性植物。

本发明也提供了这样的DNA分子，该DNA分子包含可在植物表达的启动子，该启动子有效地连接至转录时产生ParG抑制性RNA分子的DNA区，并连接有参与转录终止和多聚腺苷酸化的3’末端区上。ParG抑制性RNA分子可以包含这样的至少20个连续核苷酸的核苷酸序列，其中所述的连续核苷酸来自存在于植物细胞的ParG基因(内源ParG基因)的核苷酸序列。ParG抑制性RNA分子也可以包含这样的至少20个连续核苷酸的核苷酸序列，其中所述的连续核苷酸来自存在于植物细胞的ParG基因(内源ParG基因)的核苷酸序列的互补序列。又在另一实施方案中，ParG抑制性RNA可以包含这样的有义区和反义区，所述有义区包含至少20个连续核苷酸的核苷酸序列，其中所述的连续核苷酸来自存在于植物细胞的ParG基因的核苷酸序列，所述反义区包含至少20个连续核苷酸的核苷酸序列，其中所述的连续核苷酸来自存在于植物细胞的ParG基因的核苷酸序列的互补序列，其中该有义和反义区能形成包含上述至少20连续核苷酸的双链RNA区。嵌合基因可进一步包含在所述编码parG抑制性RNA分子的DNA区和3’末端区之间编码自剪接核酶的DNA区。嵌合基因也可以包含编码下述蛋白质的核苷酸序列中的至少21-100个核苷酸的核苷酸序列，其中所述的蛋白质包含SEQ ID No 1、2或16的氨基酸序列，或嵌合基因包含SEQ ID 3、4、15或23的核苷酸序列的至少21-100个核苷酸。

又在另一实施方案中，本发明涉及包含本发明DNA分子的植物细胞和基本由这些植物细胞组成的植物，也涉及产生胁迫耐受植物的方法，该方法包括进一步将这种植物与另一植物杂交的步骤。也提供这种包含本发明嵌合基因的植物的种子和繁殖材料。

本发明也涉及用于获得胁迫耐受植物的方法，该方法包括的步骤是让植物细胞系或植物或植物品系接受诱变；鉴定具有内源ParG基因突变的那些植物细胞或植物；让已鉴定的植物细胞或植物受到胁迫条件作用并鉴定耐受所述胁迫条件优于对照植物的植物细胞或植物。备选地，可以通过对ParG抑制剂的抗性选择植物细胞或植物并进一步如该段中描述的那样处理植物细胞或植物。

本发明进一步涉及具有内源ParG基因突变的胁迫耐受植物细胞或植物。

附图简述

图1真核细胞中通过PARP/PARG作用的聚-ADP核糖聚合作用/解聚作用循环的图示。

图2在高光照强度胁迫下拟南芥品系的NAD+和ATP含量的图表。黑框代表相对于在低光照强度下测定的NAD含量值以百分比表示的在高光照强度下的NAD含量。白框代表用相对于低光照强度下测定的ATP含量值以百分比表示的在高光照强度下的ATP含量。

图3在氮耗竭胁迫下玉米品系的NAD+和ATP含量的图表。黑框代表NAD含量而白框代表ATP含量。

优选的实施方案详述

一方面，本发明基于阐述来自胁迫耐受植物品系的包含减少PARP基因表达的嵌合基因的细胞，其在不利条件下较来自未转化植物品系的细胞表现出更高的NAD/ATP含量。另一方面，已经观察到使用基于卫星病毒的瞬时沉默RNA载体在烟草中沉默PARG编码基因的表达得到与使用同样的沉默体系沉默PARP编码基因观察到的相似的表型。而且，在植物如拟南芥和烟草中沉默PARG编码基因的表达得到对胁迫条件如施加高光照强度的条件更具耐受性的植物。

虽然不想将本发明限定为特定的作用模式，因为以下原因预计沉默PARG基因表达与沉默PARP基因表达得到相似的表型。如从图1可看到的，通过PARP催化ADP核糖的聚合反应，消耗NAD，然后由PARG催化的聚ADP核糖的解聚作用。PARP蛋白自身的聚ADP核糖基化导致PARP蛋白的失活。植物细胞中导致NAD消耗并因而消耗ATP的ADP核糖聚合作用/解聚作用的循环速度可以通过降低PARP基因表达或降低PARP的酶活性来减缓或停止。因此，植物细胞以及包含这种细胞的植物对不利条件有更好的耐受性。这里提供的数据显示通过降低PARG基因表达或减少PARG的酶活性来减缓或停止循环可获得相似的效果。

本发明涉及通过在植物中改变ParG基因的表达水平，或通过改变PARG蛋白的活性或表观活性来降低由于不利环境条件引起的植物细胞死亡，并因而涉及增强胁迫耐受性。便利地，ParG基因的表达水平可以通过导入嵌合基因来改变ParG基因的表达，或通过改变内源PARG编码基因包括通过改变表达信号而得以从基因上控制。

在本发明的一个实施方案中，提供一种方法用于产生对胁迫条件或不利生长条件耐受的植物，其中所述方法包括的步骤是：

-给植物细胞提供嵌合基因以产生转基因植物细胞，其中所述嵌合基因包含以下有效连接的DNA片段：

可在植物中表达的启动子，

DNA区，它在转录时产生ParG抑制性RNA分子；

参与转录终止和多聚腺苷酸化的3’末端区；

-从所述转基因植物细胞再生转基因植物品系群体；并且

-在所述的转基因植物品系群体中鉴定胁迫耐受性植物。

这里使用的“胁迫耐受植物”或“对胁迫条件或不利的生长条件耐受的植物”是一种这样的植物(特别是根据本发明方法获得的植物)，该植物当受不利生长条件影响一段时间时，例如但不限于受干旱、高温、营养(特别是氮)供应是受限的、高光照强度影响时，比没有根据本发明方法处理的对照植物生长的更好。这可以通过植物的总体外表显而易见并可以测量，例如通过增加的生物量产量、在不利条件下持续的营养生长或更高的种子产量而测量。胁迫耐受性植物具有更广的生长谱，即它们能经受更广范围的气候和其它非生物变化而没有产量的损失。生化上，胁迫耐受性可以从胁迫条件下胁迫耐受植物比对照植物更高的NAD⁺-NADH/ATP含量和更低的活性氧类的生成显而易见。胁迫耐受性也可以从在胁迫条件下的胁迫耐受植物与在相同条件下的对照植物相比较更高的叶绿素含量、更高的光合作用和更低的叶绿素荧光而显而易见。

显然，也不要求植物因为胁迫耐受性而在不利条件下持续生长是显而易见的。通常，即便在生长过程中只遭遇相对较短周期的不利条件，根据本发明的植物或植物细胞与对照植物或植物细胞之间的胁迫耐受性差异也将是明显的。

如这里使用的，“ParG抑制性RNA分子”是能优选地通过转录后沉默减少植物细胞的内源PARG编码基因表达的RNA分子。显然即便在ParG抑制性RNA分子通过转录后沉默减少PARG编码基因表达时，这种RNA分子也可在细胞中起到其它作用，如指导内源ParG基因的甲基化，最后又一次导致减少PARG编码基因的表达。植物细胞的内源PARG编码基因的表达也可以通过转录沉默得以减少，如通过使用靶向内源ParG基因的启动子区的RNAi或dsRNA。

如这里使用的，“PARG编码基因”或“ParG基因”是能编码PARG(聚ADP核糖糖基水解酶)蛋白的基因，其中PARG蛋白通过内切糖苷作用或外切糖苷作用释放游离ADP核糖单位来催化聚ADP核糖的解聚。

PARG编码基因可以包含编码含有SEQ ID No 1(拟南芥(Arabidopsisthaliana))或SEQ ID No 2(马铃薯(Solanum tuberosum))或SEQ ID No 16(稻(Oryza sativa))或它们的一部分氨基酸序列的蛋白的核苷酸序列，例如包含SEQ ID No.3或SEQ ID 4或SEQ ID No 15或SEQ ID 23(玉米(Zea mays))的核苷酸序列的DNA片段。

然而，显然技术人员能通过用源于上述植物的PARG编码基因的探针，或甚至用源于上述PARG编码基因的探针杂交从其它植物物种或甚至从动物物种中分离出变体DNA序列。为此目的，探针优选地具有包含至少40个连续核苷酸的核苷酸序列，其中所述的连续核苷酸来自那些提到的PARG编码基因序列的编码区，优选来自SEQ ID No 3或SEQ ID No 4的编码区。然而探针可以包含更长的源于ParG基因的核苷酸序列区，如来自任意提到的ParG基因的约50、60、75、100、200或500个连续核苷酸。优选地，探针包含编码催化结构域的其中一个高度保守区的核苷酸序列，该序列通过比对来自动物的不同PARG蛋白而得以鉴定。这些区域也存在于来自拟南芥的经鉴定PARG蛋白中，并且包含氨基酸序列LXVDFANXXXGGG(对应于SEQ ID No 1从位置252的氨基酸到位置264的氨基酸；X可以是任意氨基酸)LXVDFANXXXGGGXXXXGXVQEEIRF(对应于SEQ ID No 1从位置252的氨基酸到位置277的氨基酸)或LXVDFANXXXGGGXXXXGXVQEEIRFXXXPE(对应于SEQ ID No 1从位置252的氨基酸到位置282的氨基酸)、TGXWGCGXFXGD(对应于SEQ ID No 1从位置449的氨基酸到位置460的氨基酸)或TGXWGCGAFXGDXXLKXXXQ(对应于SEQ ID No 1从位置449的氨基酸到位置468的氨基酸)。其它保守区具有氨基酸序列DXXXRXXXXAIDA(对应于SEQ ID No 1从位置335的氨基酸到位置344的氨基酸)或REXXKAXXGF(对应于SEQ ID No 1从位置360的氨基酸到位置369的氨基酸)或GXXXXSXYTGY(对应于SEQ ID No 1从位置303的氨基酸到位置313的氨基酸)。优选地在严格条件下进行杂交。

如这里使用的“严格杂交条件”指如果在探针与靶标序列之间有至少95％并优选至少97％的序列同一性时，杂交一般会发生。严格的杂交条件的实例是在包含50％甲酰胺、5xSSC(150mM NaCl，15mM柠檬酸三钠盐)、50mM磷酸钠(pH7.6)、5x Denhardt’s溶液、10％硫酸葡聚糖和20μg/ml经变性的剪切的载体DNA如鲑鱼精DNA的溶液中过夜孵育，随后于大约65℃在0.1x SSC中洗涤杂交支持物如约10分钟(两次)。其它杂交和洗涤条件是熟知的并在Sambrook等，Molecular Cloning：ALaboratory Manual，第二版，冷泉港，纽约(1989年)，特别是第11章中作为例子给出。

备选地，ParG编码基因或其部分也可以通过基于PCR的技术，使用包含来自所述PARG编码基因的核苷酸序列或它的互补序列的至少20个连续核苷酸的寡核苷酸作为引物得以分离。如上面提到的，这种引物可以包含编码保守区的核苷酸序列，或与这种核苷酸序列互补。可用于此目的的寡核苷酸可包含SEQ ID No.5、SEQ ID No 6、SEQ ID No.7或SEQ IDNo.8的核苷酸序列。可使用的寡核苷酸也可是简并的，如SEQ ID No 17、SEQ ID No 18、SEQ ID No 19；SEQ ID No 20、SEQ ID No 21或SEQ IDNo 22的寡核苷酸引物。

来自ParG基因的特定PCR片段可以例如通过使用具有SEQ ID No.5和SEQ ID No 6的核苷酸序列的寡核苷酸组合物，用例如拟南芥的基因组DNA或cDNA作为模板DNA，或通过使用具有SEQ ID No.7和SEQ IDNo 8的核苷酸序列的寡核苷酸组合物，用例如马铃薯的基因组DNA或cDNA作为模板DNA，在严格退火条件下获得。

分离的序列可以编码功能性PARG蛋白或其部分。优选地，分离的序列包含编码来自如所述PARG蛋白催化结构域的一个或多个高度保守区的核苷酸序列。

然而，为本发明目的不要求分离的序列编码功能性PARG蛋白，也不要求分离全长编码区。当然，本发明必需的是可以基于植物内源ParG基因经鉴定的或经分离的序列而设计或产生的嵌合基因，该嵌合基因能产生ParG抑制性RNA。可提供几个备选的方法来产生这种ParG抑制性RNA分子。

在一个实施方案中，编码ParG抑制性RNA分子的嵌合基因是基于所谓的反义技术。换而言之，嵌合基因的编码区包含至少20个连续核苷酸的核苷酸序列，其中所述的连续核苷酸来自植物细胞或植物内源ParG基因的核苷酸序列的互补序列，目的在于降低内源ParG基因的表达。此种嵌合基因可通过将来自经分离或鉴定的ParG基因或此基因的部分的包含至少20个核苷酸的DNA片段以反向有效连接至可在植物表达的启动子并与参与转录终止和聚腺苷酸化的3’端形成区连接而常规构建。由此可见无需了解来自经分离ParG基因的所述DNA片段的准确核苷酸序列或完整的核苷酸序列。

在另一实施方案中编码ParG抑制性RNA分子的嵌合基因基于所谓的共抑制技术。换而言之，嵌合基因的编码区包含至少20个连续核苷酸的核苷酸序列，其中所述的连续核苷酸来自植物细胞或植物内源ParG基因的核苷酸序列，目的在于降低内源ParG基因的表达。这种嵌合基因可以通过有效地将包含至少20个核苷酸的DNA片段，其中所述的核苷酸来自经分离的或鉴定的ParG基因或这种基因的一部分，以相同的方向，连接至可在植物表达的启动子及参与转录终止和多聚腺苷酸化的3’末端区。再一次，不要求知道使用的DNA片段的确切核苷酸序列，其中所述的DNA片段来自经分离的ParG基因。

上述嵌合基因降低内源ParG基因表达的效率可以通过包含这样的DNA元件而进一步增强，该DNA元件导致异常的、未多聚腺苷酸化的ParG抑制性RNA分子的表达。适合于此目的的一个这类DNA元件是编码自剪接核酶的DNA区，如在WO 00/01133中描述的。

上述嵌合基因降低植物细胞内源ParG基因表达的效率也可以通过同时将如此处描述的编码反义ParG抑制性RNA分子的嵌合基因和如此处描述的编码有义ParG抑制性RNA分子的嵌合基因包括至植物细胞中而得以进一步增强，其中所述的反义和有义ParG抑制性RNA分子能通过上述的至少20个连续核苷酸之间的碱基配对形成双链RNA区，如WO 99/53050中描述。

如WO 99/53050中进一步描述的，能形成双链RNA区的有义和反义ParG抑制性RNA区可以存在于一个RNA分子内，优选通过间隔区分开。该间隔区可包含内含子序列。此种嵌合基因可以通过将来自经分离的或鉴定的内源ParG基因的包含至少20个核苷酸的DNA片段(目的在于降低内源ParG基因表达)以反向重复有效地连接至可在植物表达的启动子及参与转录终止和多聚腺苷酸化的3’末端形成区而常规构建。为了获得这种嵌合基因的构建，可使用如WO 02/059294中描述的载体。

本发明的实施方案因而涉及用于获得胁迫耐受植物品系的方法，其包括的步骤是：

-给植物细胞提供嵌合基因以产生转基因植物细胞，其中所述嵌合基因包含以下有效连接的DNA片段：

可在植物表达的启动子，

DNA区，当转录时该DNA区产生包含至少20个连续核苷酸的核苷酸序列的ParG抑制性RNA分子，其中所述的连续核苷酸来自存在于所述植物细胞中的ParG基因的核苷酸序列；或

DNA区，当转录时该DNA区产生包含至少20个连续核苷酸的核苷酸序列的ParG抑制性RNA分子，其中所述的连续核苷酸来自存在于所述植物细胞中的ParG基因核苷酸序列的互补序列；或

DNA区，当转录时该区产生ParG抑制性RNA分子，其中所述的RNA分子包含这样的有义区和反义区，其中所述有义区包含来自存在于所述植物细胞的ParG基因核苷酸序列的至少20个连续核苷酸的核苷酸序列，所述反义区包含至少20个这样的连续核苷酸的核苷酸序列，所述连续核苷酸来自存在于所述植物细胞的ParG基因的核苷酸序列的互补序列，其中所述的有义和反义区能形成包含所述至少20个连续核苷酸的双链RNA区。

-参与转录终止和多聚腺苷酸化的3’末端区；

-从所述转基因植物细胞再生转基因植物品系群体；并且

在所述的转基因植物品系群体中鉴定胁迫耐受植物品系。

如此处所用“包含”应该理解为是指存在所谈及的特征、整数、步骤或组分，但不排除存在或添加一个或多个特征、整数、步骤或组分或它们的组。因而，例如包含核苷酸序列或氨基酸序列的核酸或蛋白可以包含比实际上引用的核苷酸或氨基酸更多的核苷酸或氨基酸，即这些引用的核苷酸或氨基酸嵌入更大的核酸或蛋白中。包含在功能上或结构上定义了的DNA区的嵌合基因可以包含额外的DNA区等。

因而显然，ParG编码区的约20nt的反义或有义RNA区的最小核苷酸序列可以包含于更大的RNA分子中，大小变化从20nt大小到等于靶标基因的大小。

上述的反义或有义核苷酸区因而可以是从约21nt至约5000nt长，如21nt、40nt、50nt、100nt、200nt、300nt、500nt、1000nt、2000nt或甚至约5000nt或更大长度。

而且，为了本发明的目的不需要所使用的抑制性ParG RNA分子的核苷酸序列或嵌合基因的编码区与目的在于降低其在细胞中表达的内源ParG基因完全相同或互补。序列越长，对全部序列的同一性要求就越不严格。因而，有义或反义区可以与内源ParG基因的核苷酸序列或它的互补序列具有约40％或50％或60％或70％或80％或90％或100％的全部序列同一性。然而，如提到的反义或有义区应该包含具有这样的20个连续核苷酸的核苷酸序列，其中所述的20个连续核苷酸与内源ParG基因的核苷酸序列具有约100％的序列同一性。优选地，约100％序列同一性的一段序列为约50、75或100nt。

为本发明目的，以百分率表示的两个相关的核苷酸序列的“序列同一性”指在两个进行最优化比对的序列中具有相同残基的位置数目(X100)除以比对的位置数目。缺口，即比对中残基存在于一个序列但不存在于另一个序列的位置，可认为是具有非相同残基的位置。通过Needleman和Wunsch算法(Needleman和Wunsch 1970)进行两个序列的比对。使用标准软件程序如GAP可以便利地实施计算机辅助序列比对，其中所述的GAP是Wisconsin程序包10.1版(Genetics Computer Group，Madison，Wisconsin大学，美国)的一部分，使用GAP时采用具有缺口创建罚分为50和缺口延伸罚分为3的默认计分矩阵。

显然，无论何时通过提及相应的DNA分子的核苷酸序列描述RNA分子的核苷酸序列时，核苷酸序列中的胸腺嘧啶(T)应该用尿嘧啶(U)代替。从本申请的内容来看是在谈及RNA或是在谈及DNA分子是显然的。

也显然，能在特定植物品种或植物物种中产生用于特定ParG基因的抑制性ParG基因的嵌合基因也能用于抑制其它植物品种或植物物种中的ParG基因的表达。当然，当ParG抑制性RNA区和ParG基因之间存在足够的同源性，或当ParG基因共有同样的19个核苷酸的一段序列时，那些其它基因的表达也将得以下调。

鉴于核酸代谢中ParG的潜在作用，ParG抑制性RNA不完全抑制内源ParG基因的表达是有利的。通过导入编码ParG抑制性RNA的嵌合基因进行基因沉默来下调特定基因的表达将产生不同的转基因品系群体，该品系群体表现出ParG基因的不同程度的沉默。因此该群体将包含独立的转基因植物品系，其中内源ParG基因得以沉默至需要的沉默程度。本领域技术人员能轻易地鉴别这种植物品系，例如通过将植物品系接受特定的不利条件如高光照强度、氧化胁迫、干旱、热等影响并选择那些表现得令人满意并在该处理下存活得很好的植物。

如此处所用，术语“启动子”表示任何在转录起始期间被DNA-依赖的RNA聚合酶识别并结合(直接或间接地)的DNA。启动子包括转录起始位点以及转录起始因子和RNA聚合酶的结合位点，并可包含多个其它位点(如增强子)，在这些位点可以结合基因表达调控蛋白。

如此处所用的术语“调控区”是指任何涉及驱动转录并控制特定DNA序列如编码蛋白或多肽的DNA转录的时间和水平的DNA。例如，5’调控区(或“启动子区”)是位于编码序列上游(即5′)并包含启动子和5’-非翻译前导序列的DNA。3’调控区是位于编码序列下游(即3’)并包含合适的转录终止(和/或调控)信号，该信号包括一个或多个多聚腺苷酸化信号的DNA序列。

在本发明的一个实施方案中，启动子是组成型启动子。在本发明另一实施方案中，启动子活性可通过外部或内部刺激如但不限于激素、化学化合物、机械刺激、非生物或生物胁迫条件来增强(诱导型启动子)。也可以以时间或空间的方式调节启动子的活性(组织特异性启动子；发育调节的启动子)。

为本发明目的，启动子是可在植物表达的启动子。如此处所用，术语“可在植物表达”表示能在植物细胞中控制(启动)转录的DNA序列。这包括植物源的任何启动子，但也包括任何能在植物细胞中指导转录的非植物源启动子，即某些病毒或细菌源启动子如CaMV35S(Hapster等，1988年)、地下三叶草病毒启动子No 4或No 7(WO9606932)或T-DNA基因启动子，也包括组织特异性或器官特异性启动子，其包括但不限于种子特异性启动子(如，WO89/03887)、器官特异性启动子(An等，1996年)、茎特异性启动子(Keller等，1988年)、叶特异性启动子(Hudspeth等，1989年)、叶肉特异性启动子(如光可诱导的Rubisco启动子)、根特异性启动子(Keller等，1989年)、块茎特异性启动子(Keil等1989年)、维管组织特异性启动子(Peleman等1989年)、雄蕊选择性启动子(WO 89/10396，WO 92/13956)、开裂区特异性启动子(WO 97/13865)等。

用于将嵌合基因导入植物中的方法为本领域熟知并包括农杆菌介导的转化、粒子枪递送、微注射、完整细胞的电穿孔、聚乙二醇介导的原生质体转化、原生质体的电穿孔、脂质体介导的转化、硅须(silicon-whisker)介导的转化等。以这种方式获得的经转化细胞随后可以再生为成熟可繁殖的植物。

根据本发明的转基因植物细胞和细胞系可进一步包含如WO 00/04173中描述的能减少PARP基因表达的嵌合基因。这些其它的嵌合基因可以如通过将本发明的转基因植物品系与包含降低PARP基因表达的嵌合基因的转基因植物杂交而导入。转基因植物或转基因植物品系也可以通过将本发明的嵌合基因导入或转化至包含降低PARP基因表达的嵌合基因的转基因植物细胞内获得，或反之亦然。备选地，PARP和PARG抑制性RNA区可以由一个嵌合基因编码并作为一个RNA分子转录。

本发明的嵌合基因(或与之对应的抑制性RNA分子)也可以以瞬时的方式例如使用病毒载体如像在WO 00/63397或WO 02/13964中描述的病毒RNA载体导入植物细胞中。

如果已经读过该说明书，熟练的技术人员应该立即清楚，可使用PARG活性被降低的突变植物细胞和细胞品系以达到与这里描述的转基因植物细胞和植物品系相同的效果。植物细胞或植物中的ParG基因中的突变可以通过使用本领域已知的筛选方法轻易地鉴定，为此，化学诱变如EMS诱变可与灵敏的检测方法(如变性HPLC)结合。该技术的一个实例是所谓的“定向诱导基因组局部突变”方法，该方法在McCallum等、PlantPhysiology 123 439-442或WO 01/75167中有描述。然而，其它在特定的基因区或等位基因中检测突变的方法也是可用的，并且包括筛选已经存在或新产生的插入突变植物品系的文库，为此将这些突变植物品系的基因组DNA库进行PCR扩增，扩增使用对插入的DNA片段特异的引物或对其中预计有插入的基因组区或等位基因特异的引物(见如Maes等，1999年，Trends in Plant Science，4，pp 90-96)。

植物细胞系和植物品系也可通过选择对ParG抑制剂如没食子鞣质的抗性而进行诱变(Ying等，(2001).Proc.Natl.Acad.Sci.美国98(21)，12227-12232；Ying，W.，Swanson，R.A.(2000).NeuroReport 11(7)，1385-1388。

因此，本领域用于鉴定包含ParG基因突变的植物细胞或植物品系的方法是可用的。这些突变细胞或突变植物品系群体随后能置于不同的非生物胁迫条件之下，并且能很容易地测定它们的表型或存活。而且，能测定受胁迫细胞的NAD和/或ATP含量并且与不受胁迫细胞的这种测定结果相比较。在胁迫耐受细胞中，NAD含量在胁迫条件下的减少量与非胁迫细胞相比较时比相应对照细胞的减少量低。

提供包含本发明嵌合基因或RNA分子的植物细胞和植物也是本发明的目的。通过传统的繁殖方法产生的包含本发明嵌合基因的植物的配子、种子、胚、合子或体细胞、后代或杂种也包含在本发明范围内。

通过这里描述的方法获得的植物可以进一步通过传统的繁殖技术将其与其它植物杂交而获得包含本发明嵌合基因的胁迫耐受子代植物。

认为这里描述的方法和手段适于所有的植物细胞和植物，即双子叶植物和单子叶植物细胞及双子叶植物和单子叶植物，包括但不限于棉花、芸苔类蔬菜、油菜、小麦、谷物或玉米、大麦、紫花苜蓿、花生、向日葵、稻、燕麦、甘蔗、大豆、草坪草、大麦、黑麦、高粱、甘蔗、蔬菜(包括菊苣、莴苣、马铃薯、南瓜、柿子椒、茄子、黄瓜、甜瓜、洋葱、韭葱)、烟草、马铃薯、甜菜、木瓜、菠萝、芒果、拟南芥，还包括用于园艺、花艺或林业(白杨、冷杉、桉树等)的植物。

下面非限定性实施例描述了增加植物协迫耐受性的本发明方法和手段。

除非在实施例中另外声明，所有的重组DNA技术根据如Sambrook等(1989)分子克隆：A Laboratory Manual，第二版，Cold Spring HarborLaboratory Press，纽约，和Ausubel等的第1和2卷(1994)CurrentProtocols in Molecular Biology(Current Protocols，美国)中描述的标准方法实施。用于植物分子研究的标准材料和方法描述于R.D.D.Croy的Plant Molecular Biology Labfax(1993年)，由BIOS ScientificPublications Ltd(UK)和Blackwell Scientific Publications，UK共同出版。标准分子生物技术的其它参考书包括Sambrook和Russell(2001)Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第三版，Cold Spring HarborLaboratory Press，纽约，Brown(1998年)Molecular Biology LabFax，第二版，第1和2卷，Academic Press(UK)。用于聚合酶链反应的标准材料和方法能在Dieffenbach和Dveksler(1995)PCR Primer实验室手册，冷泉港出版社，及在McPherson等，(2000)PCR-Basics：From Background to Bench，第一版(Springer Verlag，德国)中找到。

在整个说明书和实施例中，提及下列序列：

SEQ ID N°1：来自拟南芥的ParG蛋白的氨基酸序列。

SEQ ID N°2：来自马铃薯部分ParG蛋白的氨基酸序列。

SEQ ID N°3：来自拟南芥的编码ParG蛋白的核苷酸序列。

SEQ ID N°4：来自马铃薯的编码部分ParG蛋白的核苷酸序列。

SEQ ID N°5：寡核苷酸引物的核苷酸序列，该序列适用于编码部分ParG蛋白的DNA片段的PCR扩增。

SEQ ID N°6：寡核苷酸引物的核苷酸序列，该序列适用于编码部分ParG蛋白的DNA片段的PCR扩增。

SEQ ID N°7：寡核苷酸引物的核苷酸序列，该序列适用于编码部分ParG蛋白的DNA片段的PCR扩增。

SEQ ID N°8：寡核苷酸引物的核苷酸序列，该序列适用于编码部分ParG蛋白的DNA片段的PCR扩增。

SEQ ID N°9： T-DNA载体的核苷酸序列，该序列包含基于拟南芥ParG基因序列的降低ParG表达的嵌合基因。

SEQ ID N°10：PARG蛋白的保守序列1的氨基酸序列。

SEQ ID N°11： PARG蛋白的保守序列2的氨基酸序列。

SEQ ID N°12：PARG蛋白的保守序列3的氨基酸序列。

SEQ ID N°13：PARG蛋白的保守序列4的氨基酸序列。

SEQ ID N°14：PARG蛋白的保守序列5的氨基酸序列。

SEQ ID N°15：来自稻的ParG蛋白的核苷酸序列。

SEQ ID N°16：来自稻的ParG蛋白的氨基酸序列。

SEQ ID N°17：寡核苷酸引物PG1的核苷酸序列，该序列适用于编码部分ParG蛋白的DNA片段的PCR扩增。

SEQ ID N°18：寡核苷酸引物PG2的核苷酸序列，该序列适用于编码部分ParG蛋白的DNA片段的PCR扩增。

SEQ ID N°19：寡核苷酸引物PG3的核苷酸序列，该序列适用于编码部分ParG蛋白的DNA片段的PCR扩增。

SEQ ID N°20：寡核苷酸引物PG4的核苷酸序列，该序列适用于编码部分ParG蛋白的DNA片段的PCR扩增。

SEQ ID N°21：寡核苷酸引物PG5的核苷酸序列，该序列适用于编码部分ParG蛋白的DNA片段的PCR扩增。

SEQ ID N°22：寡核苷酸引物PG6的核苷酸序列，该序列适用于编码部分ParG蛋白的DNA片段的PCR扩增。

SEQ ID N°23：来自玉米的编码ParG蛋白的核苷酸序列。

SEQ ID N°24：T-DNA载体的核苷酸序列，该序列包含能够降低PARG表达的嵌合基因。

SEQ ID N°25：T-DNA载体的核苷酸序列，该序列包含能够降低PARG表达的嵌合基因。

实施例

实施例1.胁迫对包含降低PARP基因表达的嵌合基因的转基因胁迫耐受植物品系的能量产生效率的影响分析。

如WO 00/04173中描述，将包含降低PARP基因表达的嵌合基因的转基因欧洲油菜(Brassica napus)植物的下胚轴在生长培养基中培养5天。随后将外植体转移至包含30mg/L阿司匹林或乙酰水杨酸(产生氧化胁迫条件)的液体培养基中一天。在对照实验中，将非转基因欧洲油菜植物N90-740的下胚轴在同样的生长培养基中培养并且随后在包含30mg/L阿司匹林的液体培养基中培养1天。而且，将转基因品系和对照品系的下胚轴都放在同样的没有阿司匹林的生长培养基中培养。

培养期后，每个实验测定125个外植体的ATP含量。而且，测定125个外植体3小时内的耗氧量。结果总结于表1中。平均值的标准误差少于6％。然而，对照植物中ATP摩尔数与毫克耗氧量的比率在施用氧化胁迫时于对照植物中降低，而在胁迫耐受的转基因植物品系中这一比率在施用氧化胁迫时升高，并且相当多地高于对照植物中的比率(约高24％)。因而胁迫耐受性植物品系保持不变的能量产生效率，而对照品系表现出降低的能量产生效率。而且，超氧化物的产生量，其以在没有受到氧化胁迫的对照植物中产生的超氧化物的百分比表示，在受到胁迫条件作用的胁迫耐受植物中没有增加。

表1.胁迫对培养了5天的欧洲油菜下胚轴外植体的能量生产效率的影响。

  植物品系    胁迫条件    每125个外植  体的ATP摩尔  数  125个外植体  三小时消耗的  O₂mg/L  ATP摩尔  数/mg耗氧  量  超氧化  物   N90-740  (对照)   无  12.4×10^-7  2.96  4.19×10^-7  100％  30mg/L  阿司匹林  13.2×10^-7   4.06   3.25×10^-7   167％   转基因品  系   无  9.3×10^-7  2.33  3.99×10^-7  108％  30mg/L  阿司匹林  11.4×10^-7   2.82   4.04×10^-7   100％ 

在另一个实验中，4种不同的转基因拟南芥品系的NAD+和ATP含量在高光照强度或低光强度下得以测定，该4种不同的转基因拟南芥品系包含如WO 00/04173中描述的降低PARP基因表达的嵌合基因，并且与在相同条件下从非转化对照品系中获得的值相比较。这4种不同的品系表现出不同的胁迫耐受程度，由例如通过它们抵抗热和/或干旱条件的能力表现。在高光照强度胁迫下获得的NAD和ATP含量值以相对低光照强度条件下NAD和ATP含量值的百分比表示，并在图2中以图表画出。

结果显示高光照强度胁迫在对照植物细胞和在胁迫耐受性最小的转基因植物品系中引起显著的NAD减少。转基因植物品系的胁迫耐受性越强，在高光照强度胁迫条件下NAD的减少越不明显。

在另一个实验中，分离型群体的NAD+和ATP含量在营养(氮)耗竭条件下得以测定，该分离型群体通过将包含如WO 00/04173中描述的降低PARP基因表达的嵌合基因的转基因玉米品系与非转基因玉米品系杂交得到，并且将该含量与相同条件下从非转化对照品系获得的值相比较。图3是获得的结果的图形表示。半合子品系和单性合子(azygous)品系通过对选择性标记基因的存在加以确认而区分。在半合子胁迫耐受植物中的NAD和ATP含量明显地比在非转化对照植物或单性合子植物中的含量高。

实施例2.降低ParG基因表达的嵌合基因的构建。

为了降低PARG基因如在拟南芥和其相关植物中的表达，构建能表达包含可形成双链RNA的有义区和反义区的dsRNA的嵌合基因。这种dsRNA通过转录后沉默对降低与其具有序列同源性的基因的表达很有效。嵌合基因包含以下DNA片段：

来自花椰菜花叶病毒的启动子区(CaMV 35S)；

相同方向的包含来自拟南芥ParG基因的163bp DNA片段(Genbank登录号AF394690的核苷酸位置973到1135)；

编码来自黄花菊(Flaveria)pdk基因内含子2的DNA片段；

相反方向的包含来自拟南芥ParG基因的163bp DNA片段(Genbank登录号AF394690的核苷酸位置973到1135)；

来自根癌农杆菌的章鱼碱合成酶的3’非翻译端的片段。

将这种嵌合基因与能提供除草剂膦丝菌素抗性的选择性标记基因在T-DNA的左边界序列和右边界序列之间一同导入T-DNA载体。

为了减少PARG基因在如马铃薯及相关植物中的表达，构建能表达包含来自马铃薯cDNA序列的有义区和反义区的dsRNA的嵌合基因，该嵌合基因能编码与拟南芥PARG蛋白的N-端部分有高度序列同一性的蛋白。嵌合基因包含以下DNA片段：

来自花椰菜花叶病毒的启动子区(CaMV 35S)；

相同方向的包含来自马铃薯(Genbank登录号BE340510)ParG同源物的至少100bp序列的DNA片段；

编码来自黄花菊的pdk基因内含子2的DNA片段；

相反方向的包含来自马铃薯(Genbank登录号BE340510)ParG同源物的至少100bp序列的DNA片段；

来自根癌农杆菌的章鱼碱合成酶基因的3’非翻译端的片段。

将这种嵌合基因与能提供除草剂膦丝菌素抗性的选择性标记基因在T-DNA的左边界序列和右边界序列之间一同导入T-DNA载体。

实施例3.分析包含降低ParG基因表达的嵌合基因的转基因植物品系。

通过农杆菌介导的转化，将实施例2的嵌合基因分别导入拟南芥或马铃薯中。

将获得的转基因品系群体与对照植物一起接受如下胁迫条件的影响：

-升温几天(温室)或几小时(体外(in vitro))

-干旱几天

-几天的高光照强度

-营养耗竭

选择在以上所提到的胁迫条件下存活得很好的独立的植物品系。

测定在对照和胁迫条件下上述植物的NAD含量和ATP含量。

实施例4.植物细胞中NAD、ATP和超氧化物自由基的定量测定。

基本上如Rawyler等(1999)，Plant Physiol.120，293-300描述实施植物组织中ATP的定量。该检测法用于测定在A2S3培养基中培养4-5天的下胚轴外植体或体外培养2周大的拟南芥植物的ATP含量。所有的操作都在碎冰块上进行，除非有另外的说明。

ATP的提取

-用液氮冷冻植物材料

100个下胚轴外植体

±700mg拟南芥植物(根+芽)(大约32-37个18天大C24植物)

-将冷冻的下胚轴置于研钵中并且加入6ml 6％的高氯酸。

-在室温下使用杵提取。提取后，迅速地将样品置于冰上。

-在4℃下24,000g(Sorvall、SS34转头，于14,000转/分钟)离心10分钟。

-用5M K₂CO₃中和上清液(加入350μl的5M K₂CO₃至3ml的上清液)。

-如上所述通过离心将KClO₄移除。

ATP的定量生物发光测定

-使用购自Sigma的ATP生物发光检测试剂盒(FL-AA)。

-稀释提取液6000x(从大约6mL提取液中取出100μl，将其稀释1000倍)，用ATP生物发光检测试剂盒的‘ATP检测混合稀释缓冲液(FL-AAB)’进行所述稀释。

-使用Turner Designs(Sunnyvale，美国)的TD-20/20发光计测量所产生的发光量。

-标准曲线：在10ml水中溶解试剂盒的标准品ATP(FL-AAS)(2×10^-6摩尔)。

对植物组织中NAD+和NADH的定量基本上如Karp等(1983)或Filipovic等(1999)的描述在以下植物材料中进行：

欧洲油菜：150个培养了5天的下胚轴外植体/样本

拟南芥：1000mg体外生长了18天大的植物(芽+根)/样本(对应于±60 C24植物)

检测液

(A)用于测量NADH：25mM磷酸钾缓冲液pH7

                 0.1mM DTT

               3μM FMN(Fluka，83810)

               30μM正癸醛(Sigma，D-7384)

(B)用于测量NAD⁺+NADH：

               如仅用于测量NADH，则同上

               +2μg/mL醇脱氢酶(Roche，102717)

提取

-用液氮冷冻

-将冷冻的植物材料放入冷却的研钵中(在-20℃冷却)并加入5mL提取缓冲液

-用杵碾碎材料

-4℃下24,000g(Sorvall公司，SS34转子，14,000转/分钟)离心15分钟

-取出1mL上清液用于分析

检测法

NADH

390μL检测液A

+10μL提取液

+2μL NAD(P)H:FMN氧化还原酶

+100μL荧光素酶溶液

NAD⁺+NADH

390μL检测液B

+10μL提取液

室温下2分钟

+2μL NAD(P)H:FMN氧化还原酶

+100μL荧光素酶溶液

使用Turner Designs(Sunnyvale，美国)的TD-20/20发光计测量所产生的发光量。

NADH-标准品

NADH贮液：1mM(7.1mg/10mL水)

NADH：二钠盐，Roche公司，107 735

10mM磷酸钾缓冲液pH7中系列稀释：(10-2)；5×10^-3；2×10^-3；10^-3；5×10^-4

将10μL稀释液加至390μL检测液A中并进行反应，

绘制标准曲线

如De Block和De Brouwer(2002)Plant Physiol，Biochem，40，845-852中描述通过定量XTT的还原来测量超氧化物自由基的产生量。

欧洲油菜

培养基和反应缓冲液

播种培养基(培养基201)：

        半浓缩的Murashige和Skoog盐

        2％蔗糖

        pH5.8

        0.6％琼脂(Difco Bacto Agar)

        250mg/l triacillin

愈伤组织诱导培养基A2S3：

        MS培养基，0.5g/l Mes(pH 5.8)，3％蔗糖，40mg/l腺

        嘌呤-SO₄，0.5％琼脂糖，1mg/l 2，4-D，0.25mg/l NAA，

        1mg/l BAP，250mg/l triacillin

孵育培养基：

        25mM的pH5.8的磷酸钾缓冲液

        2％蔗糖

        每25ml培养基1滴Tween20

反应缓冲液：

        50mM的pH7.4的磷酸K缓冲液

        1mM钠，3’-{1-[苯基氨基-羰基]-3，4-四唑}-双(4-甲氧基-6-

        硝基)＝XTT(bts，德国，目录号2525)

        每25ml缓冲液1滴Tween20

灭菌种子-种子预萌发-幼苗生长。将种子浸于70％的乙醇中2分钟，随后在包含0.1％Tween20的次氯酸钠溶液(含约6％活性氯)中表面灭菌15分钟。最后，用1升灭菌自来水将种子漂洗。将种子在灭菌自来水中培育至少1小时(以便让可能抑制萌芽的成分从种子扩散)。将种子置于装有50ml灭菌自来水(+250mg/l triacillin)的250ml锥形瓶中。摇动约20小时。将长出胚根的种子置于购自Duchefa的装有约125ml播种培养基的Vitro Vent容器中(10颗种子/容器，不要太多以减少由污染引起的种子损失)。种子在±24℃及10-30Einstein/s^-1m^-2且昼长为16小时萌发。

下胚轴外植体的预培养和胁迫诱导

-播种后12-14天，将下胚轴剪为约7-10mm的节段。

-将下胚轴外植体(25个下胚轴/Optilux Petridish，Falcon S1005，丹麦)于25℃下在培养基A2S3上培养5天(在10-30Einstein/s^-1m^-2下)

XTT-检测

-将150个下胚轴外植体转移至50ml Falcon管中。

-用反应缓冲液(无XTT)洗涤。

-加入20mL反应缓冲液+XTT。(需浸没外植体，但不用真空浸润)

-于26℃下在黑暗中培养约3小时

-于470nm处测定反应培养基的吸光度

拟南芥

培养基和反应缓冲液

植物培养基：

        半浓缩的Murashige和Skoog盐

        B5维生素

        1.5％蔗糖

        pH5.8

        0.7％的Difco琼脂

孵育培养基：

        10mM pH5.8的磷酸钾缓冲液

        2％蔗糖

        每25ml培养基1滴Tween20

反应缓冲液：

        50mM pH7.4的磷酸钾缓冲液

        1mM钠，3’-{1-[苯基氨基-羰基]-3，4-四唑}-双(4-甲氧基-6-硝

        基)＝XTT(bts，德国，目录号2525)

        每25ml缓冲液1滴Tween20

拟南芥植物

-拟南芥品系：对照品系

        用于试验品系

-拟南芥种子灭菌：

70％乙醇2分钟

10分钟漂白(6％活性氯)+每20ml溶液1滴Tween 20

用无菌自来水洗涤5次

-种子预萌发：

装有12ml无菌自来水的9cm Optilux Petridishes(Falcon)。

低光照过夜24小时。

-拟南芥植物的生长

将种子在Falcon公司的Intergrid组织培养盘中播种(nr，3025)

装有±125ml植物培养基：1粒种子/格。

植物在24℃，30μEinstein s^-1m^-2，16小时光照-8小时黑暗生长约3周(结实之前)

XTT-检测

对照条件(无胁迫)

从琼脂平板收获芽(包括根)并直接将它们置于装有反应缓冲液(无XTT)的50ml Falcon管中

受胁迫的芽

将芽转移至装有反应缓冲液(无XTT)的50ml Falcon管中

用含有XTT的缓冲液(40mL/管)替换反应缓冲液

需要将芽浸没，但是不用真空浸润

黑暗中26℃下培养约3小时 

测量470nm处反应培养基的吸光度

如下通过使用克拉克极谱电极(Cark polarographic electrode)测量耗氧量来定量呼吸作用

植物材料

欧洲油菜

150-200^*下胚轴外植体

25℃培养5天

(参考活力检测法)

^*150个外植体误差＜10％；200个外植体误差＜6％

拟南芥

为获得C24±1000mg^*in vitro植物(芽+根)(对应于约50个18天大的植物)

播种之前将种子预萌发

24℃生长18天

(参考体外生长拟南芥方法)

^*误差＜8％

孵育培养基

欧洲油菜

25mM pH5.8磷酸钾缓冲液

2％蔗糖

Tween20(1滴/25ml)

拟南芥

10mM pH5.8磷酸钾缓冲液

2％蔗糖

Tween20(1滴/25ml)

使用之前，通过搅拌至少几小时而充分使培养基充气(充满氧气)。

检测

将外植体置于装满孵育培养基的100ml玻璃瓶(Schott公司，德国)中。在每个瓶中放入同样重量的芽(±700mg)

装瓶至溢出并盖紧(避免大的气泡)

同样将一个瓶装满不包含外植体的孵育培养基(对照)

于24℃低光强度孵育：3-4小时(欧洲油菜)

                    3小时(拟南芥)

在孵育过程中轻微摇晃(避免外植体周围培养基的氧气消耗)

使用手持溶氧测量仪(Cyberscan DO 310；Eutech Instruments，新加坡)来测量孵育培养基的氧浓度(mg/l)。

mg/l耗氧量＝[氧]对照-[氧]样本。

实施例5.分析包含降低ParG基因表达的嵌合基因的转基因植物品系

通过农杆菌介导的转化将实施例2中的嵌合基因导入拟南芥和一种烟草(Nicotiana tabacum c.v.Petit Havana SR1)中。

让转基因种子在含有MS盐/2；B5维生素；1.5％蔗糖；pH5.8和0.7％Difco琼脂的培养基中萌发。将萌发的种子接受低光照强度(约30μmol m^-1s^-1的光合作用光子通量下14到18天，随后光照强度提高6倍(约190μmol m^-1s^-1的光合作用光子通量))。1天后，用循环酶法(enzymaticcycling method)(Karp等(1983年)Anal，Biochem，128，pp 175-180)测定NAD和NADH含量。将一部分幼苗在高光照条件下进一步培养大约3天到数天，之后评价损伤。损伤由嫩叶和芽尖变暗、较老的叶子的褪色以及生长受阻而看出来。拟南芥的结果总结于表1而烟草的结果总结于表2。

表1.拟南芥(Columbia)的分析。±R表示观察到一些暗色素沉淀。ND：未测定

 高光照耐受性    1克组织 的NAD+ NADH含量(10^-3μM)  相对于对照，  TTC还原能力  的百分数   非转基因对照  S 17.3  100  转基因品系9  R 28.2  ND  转基因品系10  R 31.7  ND  转基因品系11  ±R 26.5  ND  转基因品系12  S 19.4  ND  转基因品系26  R 33.2  55  转基因品系27  S 21.3  100  转基因品系28  ±R 26.5  75  转基因品系29  S 17.7  102  转基因品系30  R 28.3  66

表2.烟草(Nicotiana tabacum c.v.Petit Havana SR1)的分析。±R/S表示对耐受显型不是很清楚。

  高光照耐  受性  相对于对照，TTC还原  能力的百分数  非转基因对照  S  100  转基因品系1  R/S  88  转基因品系2  ±R  79  转基因品系3  R  53

转基因植物对高光照强度胁迫的耐受性和细胞中NAD+NADH含量之间存在正相关。在TTC还原能力和高光照强度耐受性之间存在负相关。

实施例6.构建适用于谷类植物的降低ParG基因表达的嵌合基因的

为了减少例如在谷类植物如稻或玉米及相关植物中PARG基因的表达，构建了能表达包含来自稻核苷酸序列的有义区和反义区的dsRNA的嵌合基因，该嵌合基因能编码与PARG蛋白有高度序列同一性的蛋白。嵌合基因包含以下DNA片段：

来自花椰菜花叶病毒的启动子区(CaMV 35S)；

相同方向的包含来自稻(SEQ ID No 15)ParG同源物的至少100bp序列的DNA片段；

编码来自黄花菊pdk基因内含子2的DNA片段；

相反方向的包含来自稻(SEQ ID No 15)ParG同源物的至少100bp序列的DNA片段；

来自根癌农杆菌的章鱼碱合成酶基因3’非翻译端的片段。

将这种嵌合基因与能提供抗性如除草剂膦丝菌素抗性的选择性标记基因在T-DNA的左边界序列和右边界序列之间一同导入T-DNA载体。

为了减少如在谷类植物如稻或玉米及相关植物中PARG基因的表达，构建了能表达包含来自稻核苷酸序列的有义区和反义区的dsRNA的嵌合基因，该嵌合基因能编码与PARG蛋白编码列有高度序列同一性的蛋白。嵌合基因包含以下DNA片段：

来自花椰菜花叶病毒的启动子区(CaMV 35S)；

相同方向的包含来自玉米(SEQ ID No 23)ParG同源物的至少100bp序列的DNA片段；

编码来自黄花菊pdk基因内含子2的DNA片段；

相反方向的包含来自玉米(SEQ ID No 23)ParG同源物的至少100bp序列的DNA片段；

来自根癌农杆菌的章鱼碱合成酶基因3’非翻译端的片段。

将这种嵌合基因与能提供抗性如除草剂膦丝菌素抗性的选择性标记基因在T-DNA的左边界序列和右边界序列之间一同导入T-DNA载体。这类T-DNA载体的两个实例的核苷酸序列在SEQ ID Nos 24和25中描述，其中这类载体包含如前面段落描述的两种不同嵌合基因。

实施例7.分析包含降低ParG基因表达的嵌合基因的转基因植物品系

通过农杆菌介导的转化将实施例6的嵌合基因分别导入稻或玉米中。

所获得的转基因品系群体与对照植物一起受如下胁迫条件的影响：

-升温几天(温室中)或几小时(体外)

-干旱几天

-几天的高光照强度

-营养耗竭

选择在上述胁迫条件下存活得很好的独立植物品系。

在对照和胁迫条件下测定上述植物的NAD含量和ATP含量。

                          序列表

<110>拜尔生物科学公司

<120>用于增加植物对胁迫条件耐受性的方法和手段

<130>BCS 03 2002 WO1

<150>EP03076044.1

<151>2003-04-09

<150>US 60/496,688

<151>2003-08-21

<160>25

<170>PatentIn版本3.1

<210>1

<211>548

<212>PRT

<213>拟南芥(Arabidopsis thaliana)

<400>1

Met Glu Asn Arg Glu Asp Leu Asn Ser Ile Leu Pro Tyr Leu Pro Leu

1               5                   10                  15

Val Ile Arg Ser Ser Ser Leu Tyr Trp Pro Pro Arg Val Val Glu Ala

            20                  25                   30

Leu Lys Ala Met Ser Glu Gly Pro Ser His Ser Gln Val Asp Ser Gly

        35                  40                  45

Glu Val Leu Arg Gln Ala Ile Phe Asp Met Arg Arg Ser Leu Ser Phe

    50                  55                  60

Ser Thr Leu Glu Pro Ser Ala Ser Asn Gly Tyr Ala Phe Leu Phe Asp

65                  70                  75                  80

Glu Leu Ile Asp Glu Lys Glu Ser Lys Arg Trp Phe Asp Glu Ile Ile

                85                  90                  95

Pro Ala Leu Ala Ser Leu Leu Leu Gln Phe Pro Ser Leu Leu Glu Val

            100                 105                 110

His Phe Gln Asn Ala Asp Asn Ile Val Ser Gly Ile Lys Thr Gly Leu

        115                 120                 125

Arg Leu Leu Asn Ser Gln Gln Ala Gly Ile Val Phe Leu Ser Gln Glu

    130                 135                 140

Leu Ile Gly Ala Leu Leu Ala Cys Ser Phe Phe Cys Leu Phe Pro Asp

145                 150                 155                 160

Asp Asn Arg Gly Ala Lys His Leu Pro Val Ile Asn Phe Asp His Leu

                165                 170                 175

Phe Ala Ser Leu Tyr Ile Ser Tyr Ser Gln Ser Gln Glu Ser Lys Ile

            180                 185                 190

Arg Cys Ile Met His Tyr Phe Glu Arg Phe Cys Ser Cys Val Pro Ile

        195                 200                 205

Gly Ile Val Ser Phe Glu Arg Lys Ile Thr Ala Ala Pro Asp Ala Asp

    210                 215                 220

Phe Trp Ser Lys Ser Asp Val Ser Leu Cys Ala Phe Lys Val His Ser

225                 230                 235                 240

Phe Gly Leu Ile Glu Asp Gln Pro Asp Asn Ala Leu Glu Val Asp Phe

                245                 250                 255

Ala Asn Lys Tyr Leu Gly Gly Gly Ser Leu Ser Arg Gly Cys Val Gln

            260                 265                 270

Glu Glu Ile Arg Phe Met Ile Asn Pro Glu Leu Ile Ala Gly Met Leu

        275                 280                 285

Phe Leu Pro Arg Met Asp Asp Asn Glu Ala Ile Glu Ile Val Gly Ala

    290                 295                 300

Glu Arg Phe Ser Cys Tyr Thr Gly Tyr Ala Ser Ser Phe Arg Phe Ala

305                 310                 315                 320

Gly Glu Tyr Ile Asp Lys Lys Ala Met Asp Pro Phe Lys Arg Arg Arg

                325                 330             335

Thr Arg Ile Val Ala Ile Asp Ala Leu Cys Thr Pro Lys Met Arg His

            340                 345                 350

Phe Lys Asp Ile Cys Leu Leu Arg Glu Ile Asn Lys Ala Leu Cys Gly

        355                 360                 365

Phe Leu Asn Cys Ser Lys Ala Trp Glu His Gln Asn Ile Phe Met Asp

    370                 375                 380

Glu Gly Asp Asn Glu Ile Gln Leu Val Arg Asn Gly Arg Asp Ser Gly

385                 390                 395                 400

Leu Leu Arg Thr Glu Thr Thr Ala Ser His Arg Thr Pro Leu Asn Asp

                405                 4l0                 415

Val Glu Met Asn Arg Glu Lys Pro Ala Asn Asn Leu Ile Arg Asp Phe

            420                 425                 430

Tyr Val Glu Gly Val Asp Asn Glu Asp His Glu Asp Asp Gly Val Ala

        435                 440                 445

Thr Gly Asn Trp Gly Cys Gly Val Phe Gly Gly Asp Pro Glu Leu Lys

    450                 455                 460

Ala Thr Ile Gln Trp Leu Ala Ala Ser Gln Thr Arg Arg Pro Phe Ile

465                 470                 475                 480

Ser Tyr Tyr Thr Phe Gly Val Glu Ala Leu Arg Asn Leu Asp Gln Val

                485                 490                 495

Thr Lys Trp Ile Leu Ser His Lys Trp Thr Val Gly Asp Leu Trp Asn

            500                 505                 5l0

Met Met Leu Glu Tyr Ser Ala Gln Arg Leu Tyr Lys Gln Thr Ser Val

        515                 520                 525

Gly Phe Phe Ser Trp Leu Leu Pro Ser Leu Ala Thr Thr Asn Lys Ala

    530                 535                 540

Ile Gln Pro Pro

545

<210>2

<211>169

<212>PRT

<213>马铃薯(Solanum tuberosum)

<400>2

Met Glu Asn Arg Glu Asp Val Lys Ser Ile Leu Pro Phe Leu Pro Val

1               5                   10                  15

Cys Leu Arg Ser Ser Ser Leu Phe Trp Pro Pro Leu Val Val Glu Ala

            20                  25                  30

Leu Lys Ala Leu Ser Glu Gly Pro His Tyr Ser Asn Val Asn Ser Gly

        35                  40                  45

Gln Val Leu Phe Leu Ala Ile Ser Asp Ile Arg Asn Ser Leu Ser Leu

    50                  55                  60

Pro Asp Ser Ser Ile Ser Ser Ser Ala Ser Asp Gly Phe Ser Leu Leu

65                  70                  75                  80

Phe Asp Asp Leu Ile Pro Arg Asp Glu Ala Val Lys Trp Phe Lys Glu

                85                  90                  95

Val Val Pro Lys Met Ala Asp Leu Leu Leu Arg Leu Pro Ser Leu Leu

            100                 105                 110

Glu Ala His Tyr Glu Lys Ala Asp Gly Gly Ile Val Lys Gly Val Asn

        115                 120                 125

Thr Gly Leu Arg Leu Leu Glu Ser Gln Gln Pro Gly Ile Val Phe Leu

    130                 135                 140

Ser Gln Glu Leu Val Gly Ala Leu Leu Ala Cys Ser Phe Phe Cys Tyr

145                 150                 155                 160

Ser Leu Pro Met Ile Glu Val Ser Val

                165

<210>3

<211>1647

<212>DNA

<213>拟南芥

<400>3

atggagaatc gcgaagatct taactcaatt cttccgtacc ttccacttgt aattcgttcg     60

tcgtcgctgt attggccgcc gcgtgtggtg gaggcgttaa aggcaatgtc tgaaggacca    120

tctcacagcc aagttgactc aggagaggtt ctacggcaag ctattttcga tatgagacga    180

tccttatctt tctctactct cgagccatct gcttctaatg gctacgcatt tctctttgac    240

gaattgattg atgagaaaga atcaaagaga tggttcgatg agattatccc agcattggcg    300

agcttacttc tacagtttcc atctctgtta gaagtgcatt tccaaaatgc tgataatatt    360

gttagtggaa tcaaaaccgg tcttcgtttg ttaaattccc aacaagctgg cattgttttc    420

ctcagccagg agttgattgg agctcttctt gcatgctctt tcttttgttt gtttccggat    480

gataatagag gtgcaaaaca ccttccagtc atcaactttg atcatttgtt tgcaagcctt    540

tatataagtt atagtcaaag tcaagaaagc aagataagat gtattatgca ttactttgaa    600

aggttttgct cctgcgtgcc tattggtatt gtttcatttg aacgcaagat taccgctgct    660

cctgatgctg atttctggag caagtctgac gtttctcttt gtgcatttaa ggttcactct    720

tttgggttaa ttgaagatca acctgacaat gctctcgaag tggactttgc aaacaagtat    780

ctcggaggtg gttccctaag tagagggtgc gtgcaggaag agatacgctt catgattaac    840

cctgaattaa tcgctggcat gcttttcttg cctcggatgg atgacaatga agctatagaa    900

atagttggtg cggaaagatt ttcatgttac acagggtatg catcttcgtt tcggtttgct    960

ggtgagtaca ttgacaaaaa ggcaatggat cctttcaaaa ggcgaagaac cagaattgtt   1020

gcaattgatg cattatgtac accgaagatg agacacttta aagatatatg tcttttaagg   1080

gaaattaata aggcactatg tggcttttta aattgtagca aggcttggga gcaccagaat   1140

atattcatgg atgaaggaga taatgaaatt cagcttgtcc gaaacggcag agattctggt   1200

cttctgcgta cagaaactac tgcgtcacac cgaactccac taaatgatgt tgagatgaat   1260

agagaaaagc ctgctaacaa tcttatcaga gatttttatg tggaaggagt tgataacgag   1320

gatcatgaag atgatggtgt cgcgacaggg aattggggat gtggtgtttt tggaggagac   1380

ccagagctaa aggctacgat acaatggctt gctgcttccc agactcgaag accatttata   1440

tcatattaca cctttggagt agaggcactc cgaaacctag atcaggtgac gaagtggatt   1500

ctttcccata aatggactgt tggagatctg tggaacatga tgttagaata ttctgctcaa   1560

aggctctaca agcaaaccag tgttggcttc ttttcttggc tacttccatc tctagctacc   1620

accaacaaag ctatccagcc gccttga                                       1647

<210>4

<211>598

<212>DNA

<213>马铃薯

<400>4

gcaatggaga atagagaaga cgtgaagtca atccttccct ttttgccggt gtgtctccga     60

tcatcttctc ttttctggcc gccgctagtt gttgaagcac tgaaagccct ctctgaaggc    120

cctcattaca gcaatgttaa ctccggccaa gtcctcttcc tcgcaatctc cgacattcgg    180

aattcccttt cactacctga ttcttcaatt tcctcttctg cttcagacgg attttctctc    240

ttatttgatg atttaattcc tagggatgaa gctgttaaat ggttcaaaga agtggtgccg    300

aaaatggcgg atttgctatt gcggttgcct tccttattgg aggctcacta tgagaaggct    360

gatggtggaa ttgttaaagg agtcaacact ggtcttcgct tattggaatc acaacagcct    420

ggcattgttt tcctcagtca ggaattagtc ggtgctcttc ttgcatgttc cttcttttgc    480

tattccctac caatgataga ggtatctgta tgatcagtat gacgagaaat ttgaaaataa    540

attgaagtgc attcttcact attttgagag gattggctca ttgatacctg cgggctac      598

<210>5

<211>37

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>寡核苷酸引物ParGAtl

<400>5

ggatcccctg caggacaaaa aggcaatgga tcctttc                              37

<210>6

<211>39

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>寡核苷酸引物ParGAt2

<400>6

gcacgaattc gcggccgcgg tgctcccaag ccttgctac                            39

<210>7

<211>39

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>寡核苷酸引物ParGStl

<400>7

ggatcccctg caggctcact atgagaaggc tgatggtgg                            39

<210>8

<211>43

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>寡核苷酸引物ParGSt2

<400>8

gcacgaattc gcggccgcgt catactgatc atacagatac ctc                       43

<210>9

<211>13466

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>pTVE428的核苷酸序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(198)..(222)

<223>右T-DNA边界

<220>

<221>misc_feature

<222>(983)..(273)

<223>3’ocs(章鱼碱合成酶基因的3’非翻译端)

<220>

<221>misc_feature

<222>(995)..(1155)

<223>聚ADP核糖糖基水解酶的一部分

<220>

<221>misc_feature

<222>(1929)..(1188)

<223>来自黄花菊(Flaveria)pdk基因的内含子2

<220>

<221>misc_feature

<222>(2122)..(1962)

<223>聚ADP核糖糖基水解酶的一部分

<220>

<221>misc_feature

<222>(3476)..(2131)

<223>来自花椰菜花叶病毒的35S启动子区

<220>

<221>misc_feature

<222>(3948)..(3737)

<223>根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)基因7的3’非翻译末端

<220>

<221>misc_feature

<222>(4521)..(3970)

<223>bar编码区

<220>

<221>misc_feature

<222>(6247)..(4522)

<223>PSSuAra启动子区

<220>

<221>misc_feature

<222>(6415)..(6439)

<223>根癌农杆菌的T-DNA左边界区

<400>9

agattcgaag ctcggtcccg tgggtgttct gtcgtctcgt tgtacaacga aatccattcc     60

cattccgcgc tcaagatggc ttcccctcgg cagttcatca gggctaaatc aatctagccg    120

acttgtccgg tgaaatgggc tgcactccaa cagaaacaat caaacaaaca tacacagcga    180

cttattcaca cgcgacaaat tacaacggta tatatcctgc cagtactcgg ccgtcgaccg    240

cggtaccccg gaattaagct tgcatgcctg caggtcctgc tgagcctcga catgttgtcg    300

caaaattcgc cctggacccg cccaacgatt tgtcgtcact gtcaaggttt gacctgcact    360

tcatttgggg cccacataca ccaaaaaaat gctgcataat tctcggggca gcaagtcggt    420

tacccggccg ccgtgctgga ccgggttgaa tggtgcccgt aactttcggt agagcggacg    480

gccaatactc aacttcaagg aatctcaccc atgcgcgccg gcggggaacc ggagttccct    540

tcagtgaacg ttattagttc gccgctcggt gtgtcgtaga tactagcccc tggggccttt    600

tgaaatttga ataagattta tgtaatcagt cttttaggtt tgaccggttc tgccgctttt    660

tttaaaattg gatttgtaat aataaaacgc aattgtttgt tattgtggcg ctctatcata    720

gatgtcgcta taaacctatt cagcacaata tattgttttc attttaatat tgtacatata    780

agtagtaggg tacaatcagt aaattgaacg gagaatatta ttcataaaaa tacgatagta    840

acgggtgata tattcattag aatgaaccga aaccggcggt aaggatctga gctacacatg    900

ctcaggtttt ttacaacgtg cacaacagaa ttgaaagcaa atatcatgcg atcataggcg    960

tctcgcatat ctcattaaag caggactcta gagacaaaaa ggcaatggat cctttcaaaa   1020

ggcgaagaac cagaattgtt gcaattgatg cattatgtac accgaagatg agacacttta   1080

aagatatatg tcttttaagg gaaattaata aggcactatg tggcttttta aattgtagca   1140

aggcttggga gcaccatcga tttcgaaccc agcttcccaa ctgtaatcaa tccaaatgta   1200

agatcaatga taacacaatg acatgatcta tcatgttacc ttgtttattc atgttcgact   1260

aattcattta attaatagtc aatccattta gaagttaata aaactacaag tattatttag   1320

aaattaataa gaatgttgat tgaaaataat actatataaa atgatagatc ttgcgctttg   1380

ttatattagc attagattat gttttgttac attagattac tgtttctatt agtttgatat    1440

tatttgttac tttagcttgt tatttaatat tttgtttatt gataaattac aagcagattg    1500

gaatttctaa caaaatattt attaactttt aaactaaaat atttagtaat ggtatagata    1560

tttaattata taataaacta ttaatcataa aaaaatatta ttttaattta tttattctta    1620

tttttactat agtattttat cattgatatt taattcatca aaccagctag aattactatt    1680

atgattaaaa caaatattaa tgctagtata tcatcttaca tgttcgatca aattcattaa    1740

aaataatata cttactctca acttttatct tcttcgtctt acacatcact tgtcatattt    1800

ttttacatta ctatgttgtt tatgtaaaca atatatttat aaattatttt ttcacaatta    1860

taacaactat attattataa tcatactaat taacatcact taactatttt atactaaaag    1920

gaaaaaagaa aataattatt tccttaccaa gctggggtac cggtgctccc aagccttgct    1980

acaatttaaa aagccacata gtgccttatt aatttccctt aaaagacata tatctttaaa    2040

gtgtctcatc ttcggtgtac ataatgcatc aattgcaaca attctggttc ttcgcctttt    2100

gaaaggatcc attgcctttt tgtcctcgag cgtgtcctct ccaaatgaaa tgaacttcct    2160

tatatagagg aagggtcttg cgaaggatag tgggattgtg cgtcatccct tacgtcagtg    2220

gagatgtcac atcaatccac ttgctttgaa gacgtggttg gaacgtcttc tttttccacg    2280

atgctcctcg tgggtggggg tccatctttg ggaccactgt cggcagagag atcttgaatg    2340

atagcctttc ctttatcgca atgatggcat ttgtaggagc caccttcctt ttctactgtc    2400

ctttcgatga agtgacagat agctgggcaa tggaatccga ggaggtttcc cgaaattatc    2460

ctttgttgaa aagtctcaat agccctttgg tcttctgaga ctgtatcttt gacatttttg    2520

gagtagacca gagtgtcgtg ctccaccatg ttgacgaaga ttttcttctt gtcattgagt    2580

cgtaaaagac tctgtatgaa ctgttcgcca gtcttcacgg cgagttctgt tagatcctcg    2640

atttgaatct tagactccat gcatggcctt agattcagta ggaactacct ttttagagac    2700

tccaatctct attacttgcc ttggtttatg aagcaagcct tgaatcgtcc atactggaat    2760

agtacttctg atcttgagaa atatgtcttt ctctgtgttc ttgatgcaat tagtcctgaa    2820

tcttttgact gcatctttaa ccttcttggg aaggtatttg atctcctgga gattgttact    2880

cgggtagatc gtcttgatga gacctgctgc gtaggcctct ctaaccatct gtgggtcagc    2940

attctttctg aaattgaaga ggctaacctt ctcattatca gtggtgaaca tagtgtcgtc    3000

accttcacct tcgaacttcc ttcctagatc gtaaagatag aggaaatcgt ccattgtaat    3060

ctccggggca aaggagatct cttttggggc tggatcactg ctgggccttt tggttcctag    3120

cgtgagccag tgggcttttt gctttggtgg gcttgttagg gccttagcaa agctcttggg    3180

cttgagttga gcttctcctt tggggatgaa gttcaacctg tctgtttgct gacttgttgt    3240

gtacgcgtca gctgctgctc ttgcctctgt aatagtggca aatttcttgt gtgcaactcc    3300

gggaacgccg tttgttgccg cctttgtaca accccagtca tcgtatatac cggcatgtgg    3360

accgttatac acaacgtagt agttgatatg agggtgttga atacccgatt ctgctctgag    3420

aggagcaact gtgctgttaa gctcagattt ttgtgggatt ggaattaatt cgtcgagcgg    3480

ccgctcgacg agcgcgccga tatcgcgatc gcccgggccg gccatttaaa tgaattcgag    3540

ctcggtaccc aaacgcggcc gcaagctata acttcgtata gcatacatta tacgaagtta    3600

ttcgactcta gaggatccca attcccatgc atggagtcaa agattcaaat agaggacact    3660

tctcgaactc ggccgtcgaa ctcggccgtc gagtacatgg tcgataagaa aaggcaattt    3720

gtagatgtta attcccatct tgaaagaaat atagtttaaa tatttattga taaaataaca    3780

agtcaggtat tatagtccaa gcaaaaacat aaatttattg atgcaagttt aaattcagaa    3840

atatttcaat aactgattat atcagctggt acattgccgt agatgaaaga ctgagtgcga    3900

tattatgtgt aatacataaa ttgatgatat agctagctta gctcatcggg ggatcctaga    3960

cgcgtgagat cagatctcgg tgacgggcag gaccggacgg ggcggtaccg gcaggctgaa    4020

gtccagctgc cagaaaccca cgtcatgcca gttcccgtgc ttgaagccgg ccgcccgcag    4080

catgccgcgg ggggcatatc cgagcgcctc gtgcatgcgc acgctcgggt cgttgggcag    4140

cccgatgaca gcgaccacgc tcttgaagcc ctgtgcctcc agggacttca gcaggtgggt    4200

gtagagcgtg gagcccagtc ccgtccgctg gtggcggggg gagacgtaca cggtcgactc    4260

ggccgtccag tcgtaggcgt tgcgtgcctt ccaggggccc gcgtaggcga tgccggcgac    4320

ctcgccgtcc acctcggcga cgagccaggg atagcgctcc cgcagacgga cgaggtcgtc    4380

cgtccactcc tgcggttcct gcggctcggt acggaagttg accgtgcttg tctcgatgta    4440

gtggttgacg atggtgcaga ccgccggcat gtccgcctcg gtggcacggc ggatgtcggc    4500

cgggcgtcgt tctgggtcca ttgttcttct ttactctttg tgtgactgag gtttggtcta    4560

gtgctttggt catctatata taatgataac aacaatgaga acaagctttg gagtgatcgg    4620

agggtctagg atacatgaga ttcaagtgga ctaggatcta caccgttgga ttttgagtgt    4680

ggatatgtgt gaggttaatt ttacttggta acggccacaa aggcctaagg agaggtgttg    4740

agacccttat cggcttgaac cgctggaata atgccacgtg gaagataatt ccatgaatct    4800

tatcgttatc tatgagtgaa attgtgtgat ggtggagtgg tgcttgctca ttttacttgc    4860

ctggtggact tggccctttc cttatgggga atttatattt tacttactat agagctttca    4920

tacctttttt ttaccttgga tttagttaat atataatggt atgattcatg aataaaaatg    4980

ggaaattttt gaatttgtac tgctaaatgc ataagattag gtgaaactgt ggaatatata    5040

tttttttcat ttaaaagcaa aatttgcctt ttactagaat tataaatata gaaaaatata    5100

taacattcaa ataaaaatga aaataagaac tttcaaaaaa cagaactatg tttaatgtgt    5160

aaagattagt cgcacatcaa gtcatctgtt acaatatgtt acaacaagtc ataagcccaa    5220

caaagttagc acgtctaaat aaactaaaga gtccacgaaa atattacaaa tcataagccc    5280

aacaaagtta ttgatcaaaa aaaaaaaacg cccaacaaag ctaaacaaag tccaaaaaaa    5340

acttctcaag tctccatctt cctttatgaa cattgaaaac tatacacaaa acaagtcaga    5400

taaatctctt tctgggcctg tcttcccaac ctcctacatc acttccctat cggattgaat    5460

gttttacttg taccttttcc gttgcaatga tattgatagt atgtttgtga aaactaatag    5520

ggttaacaat cgaagtcatg gaatatggat ttggtccaag attttccgag agctttctag    5580

tagaaagccc atcaccagaa atttactagt aaaataaatc accaattagg tttcttatta    5640

tgtgccaaat tcaatataat tatagaggat atttcaaatg aaaacgtatg aatgttatta    5700

gtaaatggtc aggtaagaca ttaaaaaaat cctacgtcag atattcaact ttaaaaattc    5760

gatcagtgtg gaattgtaca aaaatttggg atctactata tatatataat gctttacaac    5820

acttggattt ttttttggag gctggaattt ttaatctaca tatttgtttt ggccatgcac    5880

caactcattg tttagtgtaa tactttgatt ttgtcaaata tatgtgttcg tgtatatttg    5940

tataagaatt tctttgacca tatacacaca cacatatata tatatatata tatattatat    6000

atcatgcact tttaattgaa aaaataatat atatatatat agtgcatttt ttctaacaac    6060

catatatgtt gcgattgatc tgcaaaaata ctgctagagt aatgaaaaat ataatctatt    6120

gctgaaatta tctcagatgt taagattttc ttaaagtaaa ttctttcaaa ttttagctaa    6180

aagtcttgta ataactaaag aataatacac aatctcgacc acggaaaaaa aacacataat    6240

aaatttgaat ttcgaccgcg gtacccggaa ttgggttata attacctcag gtcgaggaat    6300

taattcggta cgtacctaat aacttcgtat agcatacatt atacgaagtt atatggatct    6360

cgaggcatta cggcattacg gcactcgcga gggtcccaat tcgagcatgg agccatttac    6420

aattgaatat atcctgccgc cgctgccgct ttgcacccgg tggagcttgc atgttggttt    6480

ctacgcagaa ctgagccggt taggcagata atttccattg agaactgagc catgtgcacc    6540

ttccccccaa cacggtgagc gacggggcaa cggagtgatc cacatgggac ttttaaacat    6600

catccgtcgg atggcgttgc gagagaagca gtcgatccgt gagatcagcc gacgcaccgg    6660

gcaggcgcgc aacacgatcg caaagtattt gaacgcaggt acaatcgagc cgacgttcac    6720

ggtaccggaa cgaccaagca agctagctta gtaaagccct cgctagattt taatgcggat    6780

gttgcgatta cttcgccaac tattgcgata acaagaaaaa gccagccttt catgatatat    6840

ctcccaattt gtgtagggct tattatgcac gcttaaaaat aataaaagca gacttgacct    6900

gatagtttgg ctgtgagcaa ttatgtgctt agtgcatcta acgcttgagt taagccgcgc    6960

cgcgaagcgg cgtcggcttg aacgaattgt tagacattat ttgccgacta ccttggtgat    7020

ctcgcctttc acgtagtgga caaattcttc caactgatct gcgcgcgagg ccaagcgatc    7080

ttcttcttgt ccaagataag cctgtctagc ttcaagtatg acgggctgat actgggccgg    7140

caggcgctcc attgcccagt cggcagcgac atccttcggc gcgattttgc cggttactgc    7200

gctgtaccaa atgcgggaca acgtaagcac tacatttcgc tcatcgccag cccagtcggg    7260

cggcgagttc catagcgtta aggtttcatt tagcgcctca aatagatcct gttcaggaac    7320

cggatcaaag agttcctccg ccgctggacc taccaaggca acgctatgtt ctcttgcttt    7380

tgtcagcaag atagccagat caatgtcgat cgtggctggc tcgaagatac ctgcaagaat    7440

gtcattgcgc tgccattctc caaattgcag ttcgcgctta gctggataac gccacggaat    7500

gatgtcgtcg tgcacaacaa tggtgacttc tacagcgcgg agaatctcgc tctctccagg    7560

ggaagccgaa gtttccaaaa ggtcgttgat caaagctcgc cgcgttgttt catcaagcct    7620

tacggtcacc gtaaccagca aatcaatatc actgtgtggc ttcaggccgc catccactgc    7680

ggagccgtac aaatgtacgg ccagcaacgt cggttcgaga tggcgctcga tgacgccaac    7740

tacctctgat agttgagtcg atacttcggc gatcaccgct tccctcatga tgtttaactt    7800

tgttttaggg cgactgccct gctgcgtaac atcgttgctg ctccataaca tcaaacatcg    7860

acccacggcg taacgcgctt gctgcttgga tgcccgaggc atagactgta ccccaaaaaa    7920

acagtcataa caagccatga aaaccgccac tgcgccgtta ccaccgctgc gttcggtcaa    7980

ggttctggac cagttgcgtg agcgcatacg ctacttgcat tacagcttac gaaccgaaca    8040

ggcttatgtc cactgggttc gtgccttcat ccgtttccac ggtgtgcgtc acccggcaac    8100

cttgggcagc agcgaagtcg aggcatttct gtcctggctg gcgaacgagc gcaaggtttc    8160

ggtctccacg catcgtcagg cattggcggc cttgctgttc ttctacggca agtgctgtgc    8220

acggatctgc cctggcttca ggagatcgga agacctcggc cgtccgggcg cttgccggtg    8280

gtgctgaccc cggatgaagt ctctagagct ctagagggtt cgcatcctcg gttttctgga    8340

aggcgagcat cgtttgttcg cccagcttct gtatggaacg ggcatgcgga tcagtgaggg    8400

tttgcaactg cgggtcaagg atctggattt cgatcacggc acgatcatcg tgcgggaggg    8460

caagggctcc aaggatcggg ccttgatgtt acccgagagc ttggcaccca gcctgcgcga    8520

gcagggatcg atccaacccc tccgctgcta tagtgcagtc ggcttctgac gttcagtgca    8580

gccgtcttct gaaaacgaca tgtcgcacaa gtcctaagtt acgcgacagg ctgccgccct    8640

gcccttttcc tggcgttttc ttgtcgcgtg ttttagtcgc ataaagtaga atacttgcga    8700

ctagaaccgg agacattacg ccatgaacaa gagcgccgcc gctggcctgc tgggctatgc    8760

ccgcgtcagc accgacgacc aggacttgac caaccaacgg gccgaactgc acgcggccgg    8820

ctgcaccaag ctgttttccg agaagatcac cggcaccagg cgcgaccgcc cggagctggc    8880

caggatgctt gaccacctac gccctggcga cgttgtgaca gtgaccaggc tagaccgcct    8940

ggcccgcagc acccgcgacc tactggacat tgccgagcgc atccaggagg ccggcgcggg    9000

cctgcgtagc ctggcagagc cgtgggccga caccaccacg ccggccggcc gcatggtgtt    9060

gaccgtgttc gccggcattg ccgagttcga gcgttcccta atcatcgacc gcacccggag    9120

cgggcgcgag gccgccaagg cccgaggcgt gaagtttggc ccccgcccta ccctcacccc    9180

ggcacagatc gcgcacgccc gcgagctgat cgaccaggaa ggccgcaccg tgaaagaggc    9240

ggctgcactg cttggcgtgc atcgctcgac cctgtaccgc gcacttgagc gcagcgagga    9300

agtgacgccc accgaggcca ggcggcgcgg tgccttccgt gaggacgcat tgaccgaggc    9360

cgacgccctg gcggccgccg agaatgaacg ccaagaggaa caagcatgaa accgcaccag    9420

gacggccagg acgaaccgtt tttcattacc gaagagatcg aggcggagat gatcgcggcc    9480

gggtacgtgt tcgagccgcc cgcgcacgtc tcaaccgtgc ggctgcatga aatcctggcc    9540

ggtttgtctg atgccaagct ggcggcctgg ccggccagct tggccgctga agaaaccgag    9600

cgccgccgtc taaaaaggtg atgtgtattt gagtaaaaca gcttgcgtca tgcggtcgct    9660

gcgtatatga tgcgatgagt aaataaacaa atacgcaagg ggaacgcatg aaggttatcg    9720

ctgtacttaa ccagaaaggc gggtcaggca agacgaccat cgcaacccat ctagcccgcg    9780

ccctgcaact cgccggggcc gatgttctgt tagtcgattc cgatccccag ggcagtgccc    9840

gcgattgggc ggccgtgcgg gaagatcaac cgctaaccgt tgtcggcatc gaccgcccga    9900

cgattgaccg cgacgtgaag gccatcggcc ggcgcgactt cgtagtgatc gacggagcgc    9960

cccaggcggc ggacttggct gtgtccgcga tcaaggcagc cgacttcgtg ctgattccgg   10020

tgcagccaag cccttacgac atatgggcca ccgccgacct ggtggagctg gttaagcagc   10080

gcattgaggt cacggatgga aggctacaag cggcctttgt cgtgtcgcgg gcgatcaaag   10140

gcacgcgcat cggcggtgag gttgccgagg cgctggccgg gtacgagctg cccattcttg   10200

agtcccgtat cacgcagcgc gtgagctacc caggcactgc cgccgccggc acaaccgttc   10260

ttgaatcaga acccgagggc gacgctgccc gcgaggtcca ggcgctggcc gctgaaatta   10320

aatcaaaact catttgagtt aatgaggtaa agagaaaatg agcaaaagca caaacacgct   10380

aagtgccggc cgtccgagcg cacgcagcag caaggctgca acgttggcca gcctggcaga   10440

cacgccagcc atgaagcggg tcaactttca gttgccggcg gaggatcaca ccaagctgaa   10500

gatgtacgcg gtacgccaag gcaagaccat taccgagctg ctatctgaat acatcgcgca   10560

gctaccagag taaatgagca aatgaataaa tgagtagatg aattttagcg gctaaaggag   10620

gcggcatgga aaatcaagaa caaccaggca ccgacgccgt ggaatgcccc atgtgtggag  10680

gaacgggcgg ttggccaggc gtaagcggct gggttgtctg ccggccctgc aatggcactg  10740

gaacccccaa gcccgaggaa tcggcgtgac ggtcgcaaac catccggccc ggtacaaatc  10800

ggcgcggcgc tgggtgatga cctggtggag aagttgaagg ccgcgcaggc cgcccagcgg  10860

caacgcatcg aggcagaagc acgccccggt gaatcgtggc aagcggccgc tgatcgaatc  10920

cgcaaagaat cccggcaacc gccggcagcc ggtgcgccgt cgattaggaa gccgcccaag  10980

ggcgacgagc aaccagattt tttcgttccg atgctctatg acgtgggcac ccgcgatagt  11040

cgcagcatca tggacgtggc cgttttccgt ctgtcgaagc gtgaccgacg agctggcgag  11100

gtgatccgct acgagcttcc agacgggcac gtagaggttt ccgcagggcc ggccggcatg  11160

gccagtgtgt gggattacga cctggtactg atggcggttt cccatctaac cgaatccatg  11220

aaccgatacc gggaagggaa gggagacaag cccggccgcg tgttccgtcc acacgttgcg  11280

gacgtactca agttctgccg gcgagccgat ggcggaaagc agaaagacga cctggtagaa  11340

acctgcattc ggttaaacac cacgcacgtt gccatgcagc gtacgaagaa ggccaagaac  11400

ggccgcctgg tgacggtatc cgagggtgaa gccttgatta gccgctacaa gatcgtaaag  11460

agcgaaaccg ggcggccgga gtacatcgag atcgagctag ctgattggat gtaccgcgag  11520

atcacagaag gcaagaaccc ggacgtgctg acggttcacc ccgattactt tttgatcgat  11580

cccggcatcg gccgttttct ctaccgcctg gcacgccgcg ccgcaggcaa ggcagaagcc  11640

agatggttgt tcaagacgat ctacgaacgc agtggcagcg ccggagagtt caagaagttc  11700

tgtttcaccg tgcgcaagct gatcgggtca aatgacctgc cggagtacga tttgaaggag  11760

gaggcggggc aggctggccc gatcctagtc atgcgctacc gcaacctgat cgagggcgaa  11820

gcatccgccg gttcctaatg tacggagcag atgctagggc aaattgccct agcaggggaa  11880

aaaggtcgaa aaggtctctt tcctgtggat agcacgtaca ttgggaaccc aaagccgtac  11940

attgggaacc ggaacccgta cattgggaac ccaaagccgt acattgggaa ccggtcacac  12000

atgtaagtga ctgatataaa agagaaaaaa ggcgattttt ccgcctaaaa ctctttaaaa  12060

cttattaaaa ctcttaaaac ccgcctggcc tgtgcataac tgtctggcca gcgcacagcc  12120

gaagagctgc aaaaagcgcc tacccttcgg tcgctgcgct ccctacgccc cgccgcttcg  12180

cgtcggccta tcgcggccgc tggccgctca aaaatggctg gcctacggcc aggcaatcta  12240

ccagggcgcg gacaagccgc gccgtcgcca ctcgaccgcc ggcgcccaca tcaaggcacc  12300

ctgcctcgcg cgtttcggtg atgacggtga aaacctctga cacatgcagc tcccggagac  12360

ggtcacagct tgtctgtaag cggatgccgg gagcagacaa gcccgtcagg gcgcgtcagc  12420

gggtgttggc gggtgtcggg gcgcagccat gacccagtca cgtagcgata gcggagtgta  12480

tactggctta actatgcggc atcagagcag attgtactga gagtgcacca tatgcggtgt  12540

gaaataccgc acagatgcgt aaggagaaaa taccgcatca ggcgctcttc cgcttcctcg  12600

ctcactgact cgctgcgctc ggtcgttcgg ctgcggcgag cggtatcagc tcactcaaag  12660

gcggtaatac ggttatccac agaatcaggg gataacgcag gaaagaacat gtgagcaaaa  12720

ggccagcaaa aggccaggaa ccgtaaaaag gccgcgttgc tggcgttttt ccataggctc  12780

cgcccccctg acgagcatca caaaaatcga cgctcaagtc agaggtggcg aaacccgaca  12840

ggactataaa gataccaggc gtttccccct ggaagctccc tcgtgcgctc tcctgttccg  12900

accctgccgc ttaccggata cctgtccgcc tttctccctt cgggaagcgt ggcgctttct  12960

catagctcac gctgtaggta tctcagttcg gtgtaggtcg ttcgctccaa gctgggctgt  13020

gtgcacgaac cccccgttca gcccgaccgc tgcgccttat ccggtaacta tcgtcttgag  13080

tccaacccgg taagacacga cttatcgcca ctggcagcag ccactggtaa caggattagc  13140

agagcgaggt atgtaggcgg tgctacagag ttcttgaagt ggtggcctaa ctacggctac  13200

actagaagga cagtatttgg tatctgcgct ctgctgaagc cagttacctt cggaaaaaga  13260

gttggtagct cttgatccgg caaacaaacc accgctggta gcggtggttt ttttgtttgc  13320

aagcagcaga ttacgcgcag aaaaaaagga tctcaagaag atccggaaaa cgcaagcgca  13380

aagagaaagc aggtagcttg cagtgggctt acatggcgat agctagactg ggcggtttta  13440

tggacagcaa gcgaaccgga attgcc                                       13466

<210>10

<211>31

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>PARG蛋白的共有序列1

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(2)..(2)

<223>X代表任意氨基酸

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(8)..(10)

<223>X代表任意氨基酸

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(14)..(17)

<223>X代表任意氨基酸

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(19)..(19)

<223>X代表任意氨基酸

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(27)..(29)

<223>X代表任意氨基酸

<400>10

Leu Xaa Val Asp Phe Ala Asn Xaa Xaa Xaa Gly Gly Gly Xaa Xaa Xaa

1               5                   10                  15

Xaa Gly Xaa Val Gln Glu Glu Ile Arg Phe Xaa Xaa Xaa Pro Glu

            20                  25                  30

<210>11

<211>20

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>PARG蛋白的共有序列2

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(3)..(3)

<223>X代表任意氨基酸

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(10)..(10)

<223>X代表任意氨基酸

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(13)..(14)

<223>X代表任意氨基酸

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(17)..(19)

<223>X代表任意氨基酸

<400>11

Thr Gly Xaa Trp Gly Cys Gly Ala Phe Xaa Gly Asp Xaa Xaa Leu Lys

1               5                   10                  15

Xaa Xaa Xaa Gln

            20

<210>12

<211>13

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>PARG蛋白的共有序列3

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(2)..(4)

<223>X代表任意氨基酸

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(6)..(9)

<223>X代表任意氨基酸

<400>12

Asp Xaa Xaa Xaa Arg Xaa Xaa Xaa Xaa Ala Ile Asp Ala

1               5                   10

<210>13

<211>10

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>PARG蛋白的共有序列4

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(3)..(4)

<223>X代表任意氨基酸

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(7)..(8)

<223>X代表任意氨基酸

<400>13

Arg Glu Xaa Xaa Lys Ala Xaa Xaa Gly Phe

1               5                   10

<210>14

<211>11

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>保守的PARG区

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(2)..(5)

<223>X代表任意氨基酸

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(7)..(7)

<223>X代表任意氨基酸

<400>14

Gly Xaa Xaa Xaa Xaa Ser Xaa Tyr Thr Gly Tyr

1               5                   10

<210>15

<211>1530

<212>DNA

<213>0ryza sativa

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(1530)

<223>

<400>15

atg gag gcg cgc ggc gac ctg cgc tcg atc ctg ccc tac ctc ccc gtc     48

Met Glu Ala Arg Gly Asp Leu Arg Ser Ile Leu Pro Tyr Leu Pro Val

1               5                   10                  15

gtg ctc cgc ggc ggc gcg ctc ttc tgg ccg ccg gcg gcg cag gag gcg     96

Val Leu Arg Gly Gly Ala Leu Phe Trp Pro Pro Ala Ala Gln Glu Ala

            20                  25                  30

ctc aag gcg ctg gcg ctg ggc ccc gac gtg agc cgc gtc tcc tcc ggc    144

Leu Lys Ala Leu Ala Leu Gly Pro Asp Val Ser Arg Val Ser Ser Gly

        35                  40                  45

gac gtc ctc gcc gac gcc ctc acc gac ctc cgc ctc gcg ctc aac ctc    192

Asp Val Leu Ala Asp Ala Leu Thr Asp Leu Arg Leu Ala Leu Asn Leu

    50                  55                  60

gac cca ctc ccg cgc  cgc gcc gcc gag ggc ttc gcg ctc ttc ttc gac   240

Asp Pro Leu Pro Arg Arg Ala Ala Glu Gly Phe Ala Leu Phe Phe Asp

65                  70                  75                  80

gac ctc ctg tcg cgg gcg cag gcg cgg gac tgg ttc gac cac gtc gcc    288

Asp Leu Leu Ser Arg Ala Gln Ala Arg Asp Trp Phe Asp His Val Ala

                85                  90                  95

ccc tcc ctc gcc cgc ctc ctc ctc cgc ctc ccc acg ctg ctc gag ggc    336

Pro Ser Leu Ala Arg Leu Leu Leu Arg Leu Pro Thr Leu Leu Glu Gly

            100                 105                 110

cac tac cgc gcc gcc ggc gac gag gct cgc ggg ctc cgc atc ctg agc    384

His Tyr Arg Ala Ala Gly Asp Glu Ala Arg Gly Leu Arg Ile Leu Ser

        115                 120                 125

tcg cag gat gcc ggg ctc gtg ctc ctc agc cag gag ctc gcc gcc gcg    432

Ser Gln Asp Ala Gly Leu Val Leu Leu Ser Gln Glu Leu Ala Ala Ala

    130                 135                 140

ctg ctc gcc tgc gcg ctc ttc tgc ctg ttc ccc acc gcc gat agg gcc    480

Leu Leu Ala Cys Ala Leu Phe Cys Leu Phe Pro Thr Ala Asp Arg Ala

145                 150                 155                 160

gag gcg tgc ctc ccg gcg atc aat ttc gat agc cta ttt gcg gca ctg    528

Glu Ala Cys Leu Pro Ala Ile Asn Phe Asp Ser Leu Phe Ala Ala Leu

                165                 170                 175

tgt tat aat tcg agg caa agc cag gag cag aag gtg agg tgc ctt gtt    576

Cys Tyr Asn Ser Arg Gln Ser Gln Glu Gln Lys Val Arg Cys Leu Val

            180                 185                 190

cac tat ttt gac agg gtg acc gct tct aca cct act ggt tcc gtt tcg    624

His Tyr Phe Asp Arg Val Thr Ala Ser Thr Pro Thr Gly Ser Val Ser

        195                 200                 205

ttt gag cgt aag gtt ctt cct cgc cgt cct gaa tct gat ggc att acg    672

Phe Glu Arg Lys Val Leu Pro Arg Arg Pro Glu Ser Asp Gly Ile Thr

    210                 215                 220

tac cct gac atg gat act tgg atg aaa tct ggt gtt ccc ctt tgc aca    720

Tyr Pro Asp Met Asp Thr Trp Met Lys Ser Gly Val Pro Leu Cys Thr

225                230                 235                 240

ttc cgg gta ttt tcc tca ggc ttg ata gaa gat gag gaa caa gaa gcc    768

Phe Arg Val Phe Ser Ser Gly Leu Ile Glu Asp Glu Glu Gln Glu Ala

                245                 250                 255

ctt gaa gtt gac ttt gca aat aga tat ttg gga ggt ggc gca ctt tcc     816

Leu Glu Val Asp Phe Ala Asn Arg Tyr Leu Gly Gly Gly Ala Leu Ser

            260                 265                 270

aga ggc tgc gtg cag gaa gaa atc cgg ttc atg ata aac cca gaa ttg     864

Arg Gly Cys Val Gln Glu Glu Ile Arg Phe Met Ile Asn Pro Glu Leu

        275                 280                 285

atc gtg ggc atg ctc ttc atg gtt tca atg gaa gat aat gaa gct ata     912

Ile Val Gly Met Leu Phe Met Val Ser Met Glu Asp Asn Glu Ala Ile

    290                 295                 300

gaa att gtt ggt gca gaa agg ttc tca cag tac atg ggg tat ggt tcc     960

Glu Ile Val Gly Ala Glu Arg Phe Ser Gln Tyr Met Gly Tyr Gly Ser

305                 310                 315                 320

tca ttc cgt ttt act ggt gac tac tta gat agc aaa ccc ttt gat gcg    1008

Ser Phe Arg Phe Thr Gly Asp Tyr Leu Asp Ser Lys Pro Phe Asp Ala

                325                 330                 335

atg ggt aga cgg aaa act agg ata gtg gca att gat gct ttg gac tgt    1056

Met Gly Arg Arg Lys Thr Arg Ile Val Ala Ile Asp Ala Leu Asp Cys

            340                 345                 350

cca act agg tta cag ttt gaa tct agt ggt ctt cta agg gaa gtg aac    1104

Pro Thr Arg Leu Gln Phe Glu Ser Ser Gly Leu Leu Arg Glu Val Asn

        355                 360                 365

aag gct ttt tgt gga ttt ttg gat caa tca aat cat cag ctc tgt gca    1152

Lys Ala Phe Cys Gly Phe Leu Asp Gln Ser Asn His Gln Leu Cys Ala

    370                 375                 380

aag ctt gtc cag gat tta aat aca aag gat aac tgt cca agt gtc att    1200

Lys Leu Val Gln Asp Leu Asn Thr Lys Asp Asn Cys Pro Ser Val Ile

385                 390                 395                 400

cct gat gaa tgc ata gga gtt tca act gga aac tgg ggt tgc ggg gct    1248

Pro Asp Glu Cys Ile Gly Val Ser Thr Gly Asn Trp Gly Cys Gly Ala

                405                 410                 415

ttt ggt gga aac cct gaa atc aag agc atg att caa tgg att gct gca    1296

Phe Gly Gly Asn Pro Glu Ile Lys Ser Met Ile Gln Trp Ile Ala Ala

            420                 425                 430

tca cag gca ctc cga tct ttt att aac tac tac act ttt gag tcc gaa    1344

Ser Gln Ala Leu Arg Ser Phe Ile Asn Tyr Tyr Thr Phe Glu Ser Glu

        435                 440                 445

tca ctg aaa aga tta gaa gag gtg acc cag tgg ata ttg cgc cat agg    1392

Ser Leu Lys Arg Leu Glu Glu Val Thr Gln Trp Ile Leu Arg His Arg

    450                 455                 460

tgg acg gtt ggc gag ttg tgg gac atg ctt gtg gag tat tca tcc cag    1440

Trp Thr Val Gly Glu Leu Trp Asp Met Leu Val Glu Tyr Ser Ser Gln

465                 470                 475                 480

agg cta aga gga gac acc aat gag ggc ttt tta aca tgg cta ctt ccc    1488

Arg Leu Arg Gly Asp Thr Asn Glu Gly Phe Leu Thr Trp Leu Leu Pro

                485                 490             495

aag gac atc ccc aat ggt gat gta gat tac atg tgt gaa tag    1530

Lys Asp Ile Pro Asn Gly Asp Val Asp Tyr Met Cys Glu

            500                 505

<210>16

<211>509

<212>PRT

<213>0ryza saiva

<400>16

Met Glu Ala Arg Gly Asp Leu Arg Ser Ile Leu Pro Tyr Leu Pro Val

1               5                   10                  15

Val Leu Arg Gly Gly Ala Leu Phe Trp Pro Pro Ala Ala Gln Glu Ala

            20                  25                  30

Leu Lys Ala Leu Ala Leu Gly Pro Asp Val Ser Arg Val Ser Ser Gly

        35                  40                  45

Asp Val Leu Ala Asp Ala Leu Thr Asp Leu Arg Leu Ala Leu Asn Leu

    50                  55                  60

Asp Pro Leu Pro Arg Arg Ala Ala Glu Gly Phe Ala Leu Phe Phe Asp

65                  70                  75                  80

Asp Leu Leu Ser Arg Ala Gln Ala Arg Asp Trp Phe Asp His Val Ala

                85                  90                  95

Pro Ser Leu Ala Arg Leu Leu Leu Arg Leu Pro Thr Leu Leu Glu Gly

            100                 105                 110

His Tyr Arg Ala Ala Gly Asp Glu Ala Arg Gly Leu Arg Ile Leu Ser

        115                 120                125

Ser Gln Asp Ala Gly Leu Val Leu Leu Ser Gln Glu Leu Ala Ala Ala

    130                 135                 140

Leu Leu Ala Cys Ala Leu Phe Cys Leu Phe Pro Thr Ala Asp Arg Ala

145                 150                 155                 160

Glu Ala Cys Leu Pro Ala Ile Asn Phe Asp Ser Leu Phe Ala Ala Leu

                165                 170                 175

Cys Tyr Asn Ser Arg Gln Ser Gln Glu Gln Lys Val Arg Cys Leu Val

            180                 185                 190

His Tyr Phe Asp Arg Val Thr Ala Ser Thr Pro Thr Gly Ser Val Ser

        195                 200                 205

Phe Glu Arg Lys Val Leu Pro Arg Arg Pro Glu Ser Asp Gly Ile Thr

    210                 215                 220

Tyr Pro Asp Met Asp Thr Trp Met Lys Ser Gly Val Pro Leu Cys Thr

225                  230                235                 240

Phe Arg Val Phe Ser Ser Gly Leu Ile Glu Asp Glu Glu Gln Glu Ala

                245                 250                 255

Leu Glu Val Asp Phe Ala Asn Arg Tyr Leu Gly Gly Gly Ala Leu Ser

            260                 265                 270

Arg Gly Cys Val Gln Glu Glu Ile Arg Phe Met Ile Asn Pro Glu Leu

        275                 280                 285

Ile Val Gly Met Leu Phe Met Val Ser Met Glu Asp Asn Glu Ala Ile

290                 295                 300

Glu Ile Val Gly Ala Glu Arg Phe Ser Gln Tyr Met Gly Tyr Gly Ser

305                 310                 315                 320

Ser Phe Arg Phe Thr Gly Asp Tyr Leu Asp Ser Lys Pro Phe Asp Ala

                325                 330                 335

Met Gly Arg Arg Lys Thr Arg Ile Val Ala Ile Asp Ala Leu Asp Cys

            340                 345                 350

Pro Thr Arg Leu Gln Phe Glu Ser Ser Gly Leu Leu Arg Glu Val Asn

        355                 360                 365

Lys Ala Phe Cys Gly Phe Leu Asp Gln Ser Asn His Gln Leu Cys Ala

    370                 375                 380

Lys Leu Val Gln Asp Leu Asn Thr Lys Asp Asn Cys Pro Ser Val Ile

385                 390                 395                 400

Pro Asp Glu Cys Ile Gly Val Ser Thr Gly Asn Trp Gly Cys Gly Ala

                405                 410                 415

Phe Gly Gly Asn Pro Glu Ile Lys Ser Met Ile Gln Trp Ile Ala Ala

            420                 425                 430

Ser Gln Ala Leu Arg Ser Phe Ile Asn Tyr Tyr Thr Phe Glu Ser Glu

        435                 440                 445

Ser Leu Lys Arg Leu Glu Glu Val Thr Gln Trp Ile Leu Arg His Arg

    450                 455                 460

Trp Thr Val Gly Glu Leu Trp Asp Met Leu Val Glu Tyr Ser Ser Gln

465                 470                 475                 480

Arg Leu Arg Gly Asp Thr Asn Glu Gly Phe Leu Thr Trp Leu Leu Pro

                485                 490                 495

Lys Asp Ile Pro Asn Gly Asp Val Asp Tyr Met Cys Glu

            500                 505

<210>17

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>简并寡核苷酸引物PG1

<400>17

atgtbccaca rmtckccrac mgtcc                                    25

<210>18

<211>28

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>简并寡核苷酸引物PG2

<400>18

gggtytccwc caaaarcmcc rcawcccc                                 28

<210>19

<211>26

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>简并寡核苷酸引物PG3

<400>19

gctatagaaa twgtyggtgy rgaaag                                   26

<210>20

<211>26

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>简并寡核苷酸引物PG4

<400>20

agrggstgyg trcaggarga ratmcg                                   26

<210>21

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>简并寡核苷酸引物PG5

<220>

<221>misc_feature

<222>(18)..(18)

<223>n＝任意核苷酸

<400>21

atggargaya aygargcnat hga                                      23

<210>22

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>简并寡核苷酸引物PG6

<400>22

ccaytgdagc atrctyttda gytc                                            24

<210>23

<211>603

<212>DNA

<213>玉米(zea mays)

<400>23

tagggctgtg tgcaggagga aatccgcttc atgataaacc ccgaattgat tgtgggtatg     60

ctattcttgt cttgtatgga agataacgag gctatagaaa tctttggtgc agaacggttc    120

tcacagtata tgggttatgg ttcctccttt cgctttgttg gtgactattt agataccaaa    180

ccctttgatt cgatgggcag acggagaact aggattgtgg ctatcgatgc tttggactgt    240

ccagctaggt tacactatga atctggctgt ctcctaaggg aagtgaacaa ggcattttgt    300

ggatttttcg atcaatcgaa acaccatctc tatgcgaagc ttttccagga tttgcacaac    360

aaggatgact tttcaagcat caattccagt gagtacgtag gagtttcaac aggaaactgg    420

ggttgtggtg cttttggtgg aaaccctgaa atcaagagca tgattcagtg gattgctgca    480

tcacaggctc ttcgcccttt tgttaattac tacacttttg agaacgtgtc tctgcaaaga    540

ttagaggagg tgatccagtg gatacggctt catggctgga ctgtcggcga gctgtggaac    600

ata                                                                  603

<210>24

<211>12987

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>包含降低ParG表达的嵌合基因的T-DNA载体

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(25)

<223>左T-DNA边界的互补序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(58)..(318)

<223>3’nos的互补序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(337)..(888)

<223>bar编码区

<220>

<221>misc_feature

<222>(889)..(1721)

<223>35S启动子

<220>

<221>misc_feature

<222>(1728)..(3123)

<223>35S启动子

<220>

<221>misc_feature

<222>(3133)..(3311)

<223>玉米的ParG同源物的一部分

<220>

<221>misc_feature

<222>(3344)..(4085)

<223>Pdk内含子

<220>

<221>misc_feature

<222>(4119)..(4297)

<223>玉米的ParG同源物的一部分(反向)

<220>

<221>misc_feature

<222>(4310)..(5020)

<223>3’0CS

<220>

<221>mis_feature

<222>(5066)..(5042)

<223>右T-DNA边界

<400>24

cggcaggata tattcaattg taaatggctc catggcgatc gctctagagg atcttcccga     60

tctagtaaca tagatgacac cgcgcgcgat aatttatcct agtttgcgcg ctatattttg    120

ttttctatcg cgtattaaat gtataattgc gggactctaa tcataaaaac ccatctcata    180

aataacgtca tgcattacat gttaattatt acatgcttaa cgtaattcaa cagaaattat    240

atgataatca tcgcaagacc ggcaacagga ttcaatctta agaaacttta ttgccaaatg    300

tttgaacgat ctgcttcgga tcctagacgc gtgagatcag atctcggtga cgggcaggac    360

cggacggggc ggtaccggca ggctgaagtc cagctgccag aaacccacgt catgccagtt    420

cccgtgcttg aagccggccg cccgcagcat gccgcggggg gcatatccga gcgcctcgtg    480

catgcgcacg ctcgggtcgt tgggcagccc gatgacagcg accacgctct tgaagccctg    540

tgcctccagg gacttcagca ggtgggtgta gagcgtggag cccagtcccg tccgctggtg    600

gcggggggag acgtacacgg tcgactcggc cgtccagtcg taggcgttgc gtgccttcca    660

ggggcccgcg taggcgatgc cggcgacctc gccgtccacc tcggcgacga gccagggata    720

gcgctcccgc agacggacga ggtcgtccgt ccactcctgc ggttcctgcg gctcggtacg    780

gaagttgacc gtgcttgtct cgatgtagtg gttgacgatg gtgcagaccg ccggcatgtc    840

cgcctcggtg gcacggcgga tgtcggccgg gcgtcgttct gggtccatgg ttatagagag    900

agagatagat ttatagagag agactggtga tttcagcgtg tcctctccaa atgaaatgaa    960

cttccttata tagaggaagg gtcttgcgaa ggatagtggg attgtgcgtc atcccttacg   1020

tcagtggaga tgtcacatca atccacttgc tttgaagacg tggttggaac gtcttctttt   1080

tccacgatgc tcctcgtggg tgggggtcca tctttgggac cactgtcggc agaggcatct   1140

tgaatgatag cctttccttt atcgcaatga tggcatttgt aggagccacc ttccttttct   1200

actgtccttt cgatgaagtg acagatagct gggcaatgga atccgaggag gtttcccgaa   1260

attatccttt gttgaaaagt ctcaatagcc ctttggtctt ctgagactgt atctttgaca   1320

tttttggagt agaccagagt gtcgtgctcc accatgttga cgaagatttt cttcttgtca   1380

ttgagtcgta aaagactctg tatgaactgt tcgccagtct tcacggcgag ttctgttaga   1440

tcctcgattt gaatcttaga ctccatgcat ggccttagat tcagtaggaa ctaccttttt   1500

agagactcca atctctatta cttgccttgg tttatgaagc aagccttgaa tcgtccatac   1560

tggaatagta cttctgatct tgagaaatat gtctttctct gtgttcttga tgcaattagt   1620

cctgaatctt ttgactgcat ctttaacctt cttgggaagg tatttgatct cctggagatt   1680

gttactcggg tagatcgtct tgatgagacc tgctgcgtag gaacgcggcc gcgtatacgt   1740

atcgatatct tcgaattcga gctcgtcgag cggccgctcg acgaattaat tccaatccca    1800

caaaaatctg agcttaacag cacagttgct cctctcagag cagaatcggg tattcaacac    1860

cctcatatca actactacgt tgtgtataac ggtccacatg ccggtatata cgatgactgg    1920

ggttgtacaa aggcggcaac aaacggcgtt cccggagttg cacacaagaa atttgccact    1980

attacagagg caagagcagc agctgacgcg tacacaacaa gtcagcaaac agacaggttg    2040

aacttcatcc ccaaaggaga agctcaactc aagcccaaga gctttgctaa ggccctaaca    2100

agcccaccaa agcaaaaagc ccactggctc acgctaggaa ccaaaaggcc cagcagtgat    2160

ccagccccaa aagagatctc ctttgccccg gagattacaa tggacgattt cctctatctt    2220

tacgatctag gaaggaagtt cgaaggtgaa ggtgacgaca ctatgttcac cactgataat    2280

gagaaggtta gcctcttcaa tttcagaaag aatgctgacc cacagatggt tagagaggcc    2340

tacgcagcag gtctcatcaa gacgatctac ccgagtaaca atctccagga gatcaaatac    2400

cttcccaaga aggttaaaga tgcagtcaaa agattcagga ctaattgcat caagaacaca    2460

gagaaagaca tatttctcaa gatcagaagt actattccag tatggacgat tcaaggcttg    2520

cttcataaac caaggcaagt aatagagatt ggagtctcta aaaaggtagt tcctactgaa    2580

tctaaggcca tgcatggagt ctaagattca aatcgaggat ctaacagaac tcgccgtgaa    2640

gactggcgaa cagttcatac agagtctttt acgactcaat gacaagaaga aaatcttcgt    2700

caacatggtg gagcacgaca ctctggtcta ctccaaaaat gtcaaagata cagtctcaga    2760

agaccaaagg gctattgaga cttttcaaca aaggataatt tcgggaaacc tcctcggatt    2820

ccattgccca gctatctgtc acttcatcga aaggacagta gaaaaggaag gtggctccta    2880

caaatgccat cattgcgata aaggaaaggc tatcattcaa gatctctctg ccgacagtgg    2940

tcccaaagat ggacccccac ccacgaggag catcgtggaa aaagaagacg ttccaaccac    3000

gtcttcaaag caagtggatt gatgtgacat ctccactgac gtaagggatg acgcacaatc    3060

ccactatcct tcgcaagacc cttcctctat ataaggaagt tcatttcatt tggagaggac    3120

acgctcgagc ccgaattgat tgtgggtatg ctattcttgt cttgtatgga agataacgag    3180

gctatagaaa tctttggtgc agaacggttc tcacagtata tgggttatgg ttcctccttt    3240

cgctttgttg gtgactattt agataccaaa ccctttgatt cgatgggcag acggagaact    3300

aggattgtgg cggtacccca gcttggtaag gaaataatta ttttcttttt tccttttagt    3360

ataaaatagt taagtgatgt taattagtat gattataata atatagttgt tataattgtg    3420

aaaaaataat ttataaatat attgtttaca taaacaacat agtaatgtaa aaaaatatga    3480

caagtgatgt gtaagacgaa gaagataaaa gttgagagta agtatattat ttttaatgaa    3540

tttgatcgaa catgtaagat gatatactag cattaatatt tgttttaatc ataatagtaa    3600

ttctagctgg tttgatgaat taaatatcaa tgataaaata ctatagtaaa aataagaata    3660

aataaattaa aataatattt ttttatgatt aatagtttat tatataatta aatatctata    3720

ccattactaa atattttagt ttaaaagtta ataaatattt tgttagaaat tccaatctgc    3780

ttgtaattta tcaataaaca aaatattaaa taacaagcta aagtaacaaa taatatcaaa    3840

ctaatagaaa cagtaatcta atgtaacaaa acataatcta atgctaatat aacaaagcgc    3900

aagatctatc attttatata gtattatttt caatcaacat tcttattaat ttctaaataa    3960

tacttgtagt tttattaact tctaaatgga ttgactatta attaaatgaa ttagtcgaac    4020

atgaataaac aaggtaacat gatagatcat gtcattgtgt tatcattgat cttacatttg    4080

gattgattac agttgggaag ctgggttcga aatcgatagc cacaatccta gttctccgtc    4140

tgcccatcga atcaaagggt ttggtatcta aatagtcacc aacaaagcga aaggaggaac    4200

cataacccat atactgtgag aaccgttctg caccaaagat ttctatagcc tcgttatctt    4260

ccatacaaga caagaatagc atacccacaa tcaattcggg tctagagtcc tgctttaatg    4320

agatatgcga gacgcctatg atcgcatgat atttgctttc aattctgttg tgcacgttgt    4380

aaaaaacctg agcatgtgta gctcagatcc ttaccgccgg tttcggttca ttctaatgaa    4440

tatatcaccc gttactatcg tatttttatg aataatattc tccgttcaat ttactgattg    4500

taccctacta cttatatgta caatattaaa atgaaaacaa tatattgtgc tgaataggtt    4560

tatagcgaca tctatgatag agcgccacaa taacaaacaa ttgcgtttta ttattacaaa    4620

tccaatttta aaaaaagcgg cagaaccggt caaacctaaa agactgatta cataaatctt    4680

attcaaattt caaaaggccc caggggctag tatctacgac acaccgagcg gcgaactaat    4740

aacgttcact gaagggaact ccggttcccc gccggcgcgc atgggtgaga ttccttgaag    4800

ttgagtattg gccgtccgct ctaccgaaag ttacgggcac cattcaaccc ggtccagcac    4860

ggcggccggg taaccgactt gctgccccga gaattatgca gcattttttt ggtgtatgtg    4920

ggccccaaat gaagtgcagg tcaaaccttg acagtgacga caaatcgttg ggcgggtcca    4980

gggcgaattt tgcgacaaca tgtcgaggct cagcaggacc tgcaggtcga cggccgagta    5040

ctggcaggat atataccgtt gtaatttgtc gcgtgtgaat aagtcgctgt gtatgtttgt    5100

ttgattgttt ctgttggagt gcagcccatt tcaccggaca agtcggctag attgatttag    5160

ccctgatgaa ctgccgaggg gaagccatct tgagcgcgga atgggaatgg atttcgttgt    5220

acaacgagac gacagaacac ccacgggacc gagcttcgat cgagcatcaa atgaaactgc    5280

aatttattca tatcaggatt atcaatacca tatttttgaa aaagccgttt ctgtaatgaa    5340

ggagaaaact caccgaggca gttccatagg atggcaagat cctggtatcg gtctgcgatt    5400

ccgactcgtc caacatcaat acaacctatt aatttcccct cgtcaaaaat aaggttatca    5460

agtgagaaat caccatgagt gacgactgaa tccggtgaga atggcaaaag tttatgcatt    5520

tctttccaga cttgttcaac aggccagcca ttacgctcgt catcaaaatc actcgcatca    5580

accaaaccgt tattcattcg tgattgcgcc tgagcgagac gaaatacgcc gctgttaaaa    5640

ggacaattac aaacaggaat cgaatgcaac cggcgcagga acactgccag cgcatcaaca    5700

atattttcac ctgaatcagg atattcttct aatacctgga atgctgtttt tccggggatc    5760

gcagtggtga gtaaccatgc atcatcagga gtacggataa aatgcttgat ggtcggaaga    5820

ggcataaatt ccgtcagcca gtttagtctg accatctcat ctgtaacatc attggcaacg    5880

ctacctttgc catgtttcag aaacaactct ggcgcatcgg gcttcccata caatcgatag    5940

attgtcgcac ctgattgccc gacattatcc gaatctggca attccggttc gcttgctgtc    6000

cataaaaccg cccagtctag ctatcgccat gtaagcccac tgcaagctac ctgctttctc    6060

tttgcgcttg cgttttccgg atcttcttga gatccttttt ttctgcgcgt aatctgctgc    6120

ttgcaaacaa aaaaaccacc gctaccagcg gtggtttgtt tgccggatca agagctacca    6180

actctttttc cgaaggtaac tggcttcagc agagcgcaga taccaaatac tgtccttcta    6240

gtgtagccgt agttaggcca ccacttcaag aactctgtag caccgcctac atacctcgct    6300

ctgctaatcc tgttaccagt ggctgctgcc agtggcgata agtcgtgtct taccgggttg    6360

gactcaagac gatagttacc ggataaggcg cagcggtcgg gctgaacggg gggttcgtgc    6420

acacagccca gcttggagcg aacgacctac accgaactga gatacctaca gcgtgagcta    6480

tgagaaagcg ccacgcttcc cgaagggaga aaggcggaca ggtatccggt aagcggcagg    6540

gtcggaacag gagagcgcac gagggagctt ccagggggaa acgcctggta tctttatagt    6600

cctgtcgggt ttcgccacct ctgacttgag cgtcgatttt tgtgatgctc gtcagggggg    6660

cggagcctat ggaaaaacgc cagcaacgcg gcctttttac ggttcctggc cttttgctgg    6720

ccttttgctc acatgttctt tcctgcgtta tcccctgatt ctgtggataa ccgtattacc    6780

gcctttgagt gagctgatac cgctcgccgc agccgaacga ccgagcgcag cgagtcagtg    6840

agcgaggaag cggaagagcg cctgatgcgg tattttctcc ttacgcatct gtgcggtatt    6900

tcacaccgca tatggtgcac tctcagtaca atctgctctg atgccgcata gttaagccag    6960

tatacactcc gctatcgcta cgtgactggg tcatggctgc gccccgacac ccgccaacac    7020

ccgctgacgc gccctgacgg gcttgtctgc tcccggcatc cgcttacaga caagctgtga    7080

ccgtctccgg gagctgcatg tgtcagaggt tttcaccgtc atcaccgaaa cgcgcgaggc    7140

agggtgcctt gatgtgggcg ccggcggtcg agtggcgacg gcgcggcttg tccgcgccct    7200

ggtagattgc ctggccgtag gccagccatt tttgagcggc cagcggccgc gataggccga    7260

cgcgaagcgg cggggcgtag ggagcgcagc gaccgaaggg taggcgcttt ttgcagctct    7320

tcggctgtgc gctggccaga cagttatgca caggccaggc gggttttaag agttttaata    7380

agttttaaag agttttaggc ggaaaaatcg ccttttttct cttttatatc agtcacttac    7440

atgtgtgacc ggttcccaat gtacggcttt gggttcccaa tgtacgggtt ccggttccca    7500

atgtacggct ttgggttccc aatgtacgtg ctatccacag gaaagagacc ttttcgacct    7560

ttttcccctg ctagggcaat ttgccctagc atctgctccg tacattagga accggcggat    7620

gcttcgccct cgatcaggtt gcggtagcgc atgactagga tcgggccagc ctgccccgcc    7680

tcctccttca aatcgtactc cggcaggtca tttgacccga tcagcttgcg cacggtgaaa    7740

cagaacttct tgaactctcc ggcgctgcca ctgcgttcgt agatcgtctt gaacaaccat    7800

ctggcttctg ccttgcctgc ggcgcggcgt gccaggcggt agagaaaacg gccgatgccg    7860

ggatcgatca aaaagtaatc ggggtgaacc gtcagcacgt ccgggttctt gccttctgtg    7920

atctcgcggt acatccaatc agctagctcg atctcgatgt actccggccg cccggtttcg    7980

ctctttacga tcttgtagcg gctaatcaag gcttcaccct cggataccgt caccaggcgg    8040

ccgttcttgg ccttcttcgt acgctgcatg gcaacgtgcg tggtgtttaa ccgaatgcag    8100

gtttctacca ggtcgtcttt ctgctttccg ccatcggctc gccggcagaa cttgagtacg    8160

tccgcaacgt gtggacggaa cacgcggccg ggcttgtctc ccttcccttc ccggtatcgg    8220

ttcatggatt cggttagatg ggaaaccgcc atcagtacca ggtcgtaatc ccacacactg    8280

gccatgccgg ccggccctgc ggaaacctct acgtgcccgt ctggaagctc gtagcggatc    8340

acctcgccag ctcgtcggtc acgcttcgac agacggaaaa cggccacgtc catgatgctg    8400

cgactatcgc gggtgcccac gtcatagagc atcggaacga aaaaatctgg ttgctcgtcg    8460

cccttgggcg gcttcctaat cgacggcgca ccggctgccg gcggttgccg ggattctttg    8520

cggattcgat cagcggccgc ttgccacgat tcaccggggc gtgcttctgc ctcgatgcgt    8580

tgccgctggg cggcctgcgc ggccttcaac ttctccacca ggtcatcacc cagcgccgcg    8640

ccgatttgta ccgggccgga tggtttgcga ccgtcacgcc gattcctcgg gcttgggggt    8700

tccagtgcca ttgcagggcc ggcagacaac ccagccgctt acgcctggcc aaccgcccgt    8760

tcctccacac atggggcatt ccacggcgtc ggtgcctggt tgttcttgat tttccatgcc    8820

gcctccttta gccgctaaaa ttcatctact catttattca tttgctcatt tactctggta    8880

gctgcgcgat gtattcagat agcagctcgg taatggtctt gccttggcgt accgcgtaca    8940

tcttcagctt ggtgtgatcc tccgccggca actgaaagtt gacccgcttc atggctggcg    9000

tgtctgccag gctggccaac gttgcagcct tgctgctgcg tgcgctcgga cggccggcac    9060

ttagcgtgtt tgtgcttttg ctcattttct ctttacctca ttaactcaaa tgagttttga    9120

tttaatttca gcggccagcg cctggacctc gcgggcagcg tcgccctcgg gttctgattc    9180

aagaacggtt gtgccggcgg cggcagtgcc tgggtagctc acgcgctgcg tgatacggga    9240

ctcaagaatg ggcagctcgt acccggccag cgcctcggca acctcaccgc cgatgcgcgt    9300

gcctttgatc gcccgcgaca cgacaaaggc cgcttgtagc cttccatccg tgacctcaat    9360

gcgctgctta accagctcca ccaggtcggc ggtggcccat atgtcgtaag ggcttggctg    9420

caccggaatc agcacgaagt cggctgcctt gatcgcggac acagccaagt ccgccgcctg    9480

gggcgctccg tcgatcacta cgaagtcgcg ccggccgatg gccttcacgt cgcggtcaat    9540

cgtcgggcgg tcgatgccga caacggttag cggttgatct tcccgcacgg ccgcccaatc    9600

gcgggcactg ccctggggat cggaatcgac taacagaaca tcggccccgg cgagttgcag    9660

ggcgcgggct agatgggttg cgatggtcgt cttgcctgac ccgcctttct ggttaagtac    9720

agcgataacc ttcatgcgtt ccccttgcgt atttgtttat ttactcatcg catcatatac    9780

gcagcgaccg catgacgcaa gctgttttac tcaaatacac atcacctttt tagacggcgg    9840

cgctcggttt cttcagcggc caagctggcc ggccaggccg ccagcttggc atcagacaaa    9900

ccggccagga tttcatgcag ccgcacggtt gagacgtgcg cgggcggctc gaacacgtac    9960

ccggccgcga tcatctccgc ctcgatctct tcggtaatga aaaacggttc gtcctggccg   10020

tcctggtgcg gtttcatgct tgttcctctt ggcgttcatt ctcggcggcc gccagggcgt   10080

cggcctcggt caatgcgtcc tcacggaagg caccgcgccg cctggcctcg gtgggcgtca   10140

cttcctcgct gcgctcaagt gcgcggtaca gggtcgagcg atgcacgcca agcagtgcag   10200

ccgcctcttt cacggtgcgg ccttcctggt cgatcagctc gcgggcgtgc gcgatctgtg   10260

ccggggtgag ggtagggcgg gggccaaact tcacgcctcg ggccttggcg gcctcgcgcc   10320

cgctccgggt gcggtcgatg attagggaac gctcgaactc ggcaatgccg gcgaacacgg   10380

tcaacaccat gcggccggcc ggcgtggtgg tgtcggccca cggctctgcc aggctacgca   10440

ggcccgcgcc ggcctcctgg atgcgctcgg caatgtccag taggtcgcgg gtgctgcggg   10500

ccaggcggtc tagcctggtc actgtcacaa cgtcgccagg gcgtaggtgg tcaagcatcc   10560

tggccagctc cgggcggtcg cgcctggtgc cggtgatctt ctcggaaaac agcttggtgc   10620

agccggccgc gtgcagttcg gcccgttggt tggtcaagtc ctggtcgtcg gtgctgacgc   10680

gggcatagcc cagcaggcca gcggcggcgc tcttgttcat ggcgtaatgt ctccggttct   10740

agtcgcaagt attctacttt atgcgactaa aacacgcgac aagaaaacgc caggaaaagg   10800

gcagggcggc agcctgtcgc gtaacttagg acttgtgcga catgtcgttt tcagaagacg   10860

gctgcactga acgtcagaag ccgactgcac tatagcagcg gaggggttgg atcgatccct   10920

gctcgcgcag gctgggtgcc aagctctcgg gtaacatcaa ggcccgatcc ttggagccct   10980

tgccctcccg cacgatgatc gtgccgtgat cgaaatccag atccttgacc cgcagttgca  11040

aaccctcact gatccgcatg cccgttccat acagaagctg ggcgaacaaa cgatgctcgc  11100

cttccagaaa accgaggatg cgaaccactt catccggggt cagcaccacc ggcaagcgcc  11160

cggacggccg aggtcttccg atctcctgaa gccagggcag atccgtgcac agcacttgcc  11220

gtagaagaac agcaaggccg ccaatgcctg acgatgcgtg gagaccgaaa ccttgcgctc  11280

gttcgccagc caggacagaa atgcctcgac ttcgctgctg cccaaggttg ccgggtgacg  11340

cacaccgtgg aaacggatga aggcacgaac ccagtggaca taagcctgtt cggttcgtaa  11400

gctgtaatgc aagtagcgta tgcgctcacg caactggtcc agaaccttga ccgaacgcag  11460

cggtggtaac ggcgcagtgg cggttttcat ggcttgttat gactgttttt ttggggtaca  11520

gtctatgcct cgggcatcca agcagcaagc gcgttacgcc gtgggtcgat gtttgatgtt  11580

atggagcagc aacgatgtta cgcagcaggg cagtcgccct aaaacaaagt taaacatcat  11640

gagggaagcg gtgatcgccg aagtatcgac tcaactatca gaggtagttg gcgtcatcga  11700

gcgccatctc gaaccgacgt tgctggccgt acatttgtac ggctccgcag tggatggcgg  11760

cctgaagcca cacagtgata ttgatttgct ggttacggtg accgtaaggc ttgatgaaac  11820

aacgcggcga gctttgatca acgacctttt ggaaacttcg gcttcccctg gagagagcga  11880

gattctccgc gctgtagaag tcaccattgt tgtgcacgac gacatcattc cgtggcgtta  11940

tccagctaag cgcgaactgc aatttggaga atggcagcgc aatgacattc ttgcaggtat  12000

cttcgagcca gccacgatcg acattgatct ggctatcttg ctgacaaaag caagagaaca  12060

tagcgttgcc ttggtaggtc cagcggcgga ggaactcttt gatccggttc ctgaacagga  12120

tctatttgag gcgctaaatg aaaccttaac gctatggaac tcgccgcccg actgggctgg  12180

cgatgagcga aatgtagtgc ttacgttgtc ccgcatttgg tacagcgcag taaccggcaa  12240

aatcgcgccg aaggatgtcg ctgccgactg ggcaatggag cgcctgccgg cccagtatca  12300

gcccgtcata cttgaagcta gacaggctta tcttggacaa gaagaagatc gcttggcctc  12360

gcgcgcagat cagttggaag aatttgtcca ctacgtgaaa ggcgagatca ccaaggtagt  12420

cggcaaataa tgtctaacaa ttcgttcaag ccgacgccgc ttcgcggcgc ggcttaactc  12480

aagcgttaga tgcactaagc acataattgc tcacagccaa actatcaggt caagtctgct  12540

tttattattt ttaagcgtgc ataataagcc ctacacaaat tgggagatat atcatgaaag  12600

gctggctttt tcttgttatc gcaatagttg gcgaagtaat cgcaacatcc gcattaaaat  12660

ctagcgaggg ctttactaag ctagcttgct tggtcgttcc ggtaccgtga acgtcggctc  12720

gattgtacct gcgttcaaat actttgcgat cgtgttgcgc gcctgcccgg tgcgtcggct  12780

gatctcacgg atcgactgct tctctcgcaa cgccatccga cggatgatgt ttaaaagtcc  12840

catgtggatc actccgttgc cccgtcgctc accgtgttgg ggggaaggtg cacatggctc  12900

agttctcaat ggaaattatc tgcctaaccg gctcagttct gcgtagaaac caacatgcaa  12960

gctccaccgg gtgcaaagcg gcagcgg                                      12987

<210>25

<211>13226

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>包含降低ParG表达的嵌合基因的T-DNA载体

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(25)

<223>左T-DNA边界(C)

<220>

<221>misc_feature

<222>(58)..(318)

<223>3’nos(C)

<220>

<221>misc_feature

<222>(337)..(888)

<223>bar编码区(C)

<220>

<221>misc_feature

<222>(889)..(1721)

<223>35S3启动子区(C)

<220>

<221>misc_feature

<222>(1778)..(3123)

<223>35S启动子区

<220>

<221>misc_feature

<222>(3130)..(3431)

<223>玉米的ParG同源物的一部分

<220>

<221>misc_feature

<222>(3464)..(4205)

<223>Pdk-内含子

<220>

<221>misc_feature

<222>(4238)..(4536)

<223>玉米的ParG同源物的一部分(C)

<220>

<221>misc_feature

<222>(4549)..(5259)

<223>3’ocs

<220>

<221>misc_feature

<222>(5281)..(5305)

<223>右T-dNA边界(C)

<400>25

cggcaggata tattcaattg taaatggctc catggcgatc gctctagagg atcttcccga     60

tctagtaaca tagatgacac cgcgcgcgat aatttatcct agtttgcgcg ctatattttg    120

ttttctatcg cgtattaaat gtataattgc gggactctaa tcataaaaac ccatctcata    180

aataacgtca tgcattacat gttaattatt acatgcttaa cgtaattcaa cagaaattat    240

atgataatca tcgcaagacc ggcaacagga ttcaatctta agaaacttta ttgccaaatg    300

tttgaacgat ctgcttcgga tcctagacgc gtgagatcag atctcggtga cgggcaggac    360

cggacggggc ggtaccggca ggctgaagtc cagctgccag aaacccacgt catgccagtt    420

cccgtgcttg aagccggccg cccgcagcat gccgcggggg gcatatccga gcgcctcgtg    480

catgcgcacg ctcgggtcgt tgggcagccc gatgacagcg accacgctct tgaagccctg    540

tgcctccagg gacttcagca ggtgggtgta gagcgtggag cccagtcccg tccgctggtg    600

gcggggggag acgtacacgg tcgactcggc cgtccagtcg taggcgttgc gtgccttcca    660

ggggcccgcg taggcgatgc cggcgacctc gccgtccacc tcggcgacga gccagggata    720

gcgctcccgc agacggacga ggtcgtccgt ccactcctgc ggttcctgcg gctcggtacg    780

gaagttgacc gtgcttgtct cgatgtagtg gttgacgatg gtgcagaccg ccggcatgtc    840

cgcctcggtg gcacggcgga tgtcggccgg gcgtcgttct gggtccatgg ttatagagag    900

agagatagat ttatagagag agactggtga tttcagcgtg tcctctccaa atgaaatgaa    960

cttccttata tagaggaagg gtcttgcgaa ggatagtggg attgtgcgtc atcccttacg   1020

tcagtggaga tgtcacatca atccacttgc tttgaagacg tggttggaac gtcttctttt   1080

tccacgatgc tcctcgtggg tgggggtcca tctttgggac cactgtcggc agaggcatct    1140

tgaatgatag cctttccttt atcgcaatga tggcatttgt aggagccacc ttccttttct    1200

actgtccttt cgatgaagtg acagatagct gggcaatgga atccgaggag gtttcccgaa    1260

attatccttt gttgaaaagt ctcaatagcc ctttggtctt ctgagactgt atctttgaca    1320

tttttggagt agaccagagt gtcgtgctcc accatgttga cgaagatttt cttcttgtca    1380

ttgagtcgta aaagactctg tatgaactgt tcgccagtct tcacggcgag ttctgttaga    1440

tcctcgattt gaatcttaga ctccatgcat ggccttagat tcagtaggaa ctaccttttt    1500

agagactcca atctctatta cttgccttgg tttatgaagc aagccttgaa tcgtccatac    1560

tggaatagta cttctgatct tgagaaatat gtctttctct gtgttcttga tgcaattagt    1620

cctgaatctt ttgactgcat ctttaacctt cttgggaagg tatttgatct cctggagatt    1680

gttactcggg tagatcgtct tgatgagacc tgctgcgtag gaacgcggcc gcgtatacgt    1740

atcgatatct tcgaattcga gctcgtcgag cggccgctcg acgaattaat tccaatccca    1800

caaaaatctg agcttaacag cacagttgct cctctcagag cagaatcggg tattcaacac    1860

cctcatatca actactacgt tgtgtataac ggtccacatg ccggtatata cgatgactgg    1920

ggttgtacaa aggcggcaac aaacggcgtt cccggagttg cacacaagaa atttgccact    1980

attacagagg caagagcagc agctgacgcg tacacaacaa gtcagcaaac agacaggttg    2040

aacttcatcc ccaaaggaga agctcaactc aagcccaaga gctttgctaa ggccctaaca    2100

agcccaccaa agcaaaaagc ccactggctc acgctaggaa ccaaaaggcc cagcagtgat    2160

ccagccccaa aagagatctc ctttgccccg gagattacaa tggacgattt cctctatctt    2220

tacgatctag gaaggaagtt cgaaggtgaa ggtgacgaca ctatgttcac cactgataat    2280

gagaaggtta gcctcttcaa tttcagaaag aatgctgacc cacagatggt tagagaggcc    2340

tacgcagcag gtctcatcaa gacgatctac ccgagtaaca atctccagga gatcaaatac    2400

cttcccaaga aggttaaaga tgcagtcaaa agattcagga ctaattgcat caagaacaca    2460

gagaaagaca tatttctcaa gatcagaagt actattccag tatggacgat tcaaggcttg    2520

cttcataaac caaggcaagt aatagagatt ggagtctcta aaaaggtagt tcctactgaa    2580

tctaaggcca tgcatggagt ctaagattca aatcgaggat ctaacagaac tcgccgtgaa    2640

gactggcgaa cagttcatac agagtctttt acgactcaat gacaagaaga aaatcttcgt    2700

caacatggtg gagcacgaca ctctggtcta ctccaaaaat gtcaaagata cagtctcaga    2760

agaccaaagg gctattgaga cttttcaaca aaggataatt tcgggaaacc tcctcggatt    2820

ccattgccca gctatctgtc acttcatcga aaggacagta gaaaaggaag gtggctccta    2880

caaatgccat cattgcgata aaggaaaggc tatcattcaa gatctctctg ccgacagtgg    2940

tcccaaagat ggacccccac ccacgaggag catcgtggaa aaagaagacg ttccaaccac    3000

gtcttcaaag caagtggatt gatgtgacat ctccactgac gtaagggatg acgcacaatc    3060

ccactatcct tcgcaagacc cttcctctat ataaggaagt tcatttcatt tggagaggac    3120

acgctcgagg aatctggctg tctcctaagg gaagtgaaca aggcattttg tggatttttc    3180

gatcaatcga aacaccatct ctatgcgaag cttttccagg atttgcacaa caaggatgac    3240

ttttcaagca tcaattccag tgagtacgta ggagtttcaa caggaaactg gggttgtggt    3300

gcttttggtg gaaaccctga aatcaagagc atgattcagt ggattgctgc atcacaggct    3360

cttcgccctt ttgttaatta ctacactttt gagaacgtgt ctctgcaaag attagaggag    3420

gtgatccagt gggtacccca gcttggtaag gaaataatta ttttcttttt tccttttagt    3480

ataaaatagt taagtgatgt taattagtat gattataata atatagttgt tataattgtg    3540

aaaaaataat ttataaatat attgtttaca taaacaacat agtaatgtaa aaaaatatga    3600

caagtgatgt gtaagacgaa gaagataaaa gttgagagta agtatattat ttttaatgaa    3660

tttgatcgaa catgtaagat gatatactag cattaatatt tgttttaatc ataatagtaa    3720

ttctagctgg tttgatgaat taaatatcaa tgataaaata ctatagtaaa aataagaata    3780

aataaattaa aataatattt ttttatgatt aatagtttat tatataatta aatatctata    3840

ccattactaa atattttagt ttaaaagtta ataaatattt tgttagaaat tccaatctgc    3900

ttgtaattta tcaataaaca aaatattaaa taacaagcta aagtaacaaa taatatcaaa    3960

ctaatagaaa cagtaatcta atgtaacaaa acataatcta atgctaatat aacaaagcgc    4020

aagatctatc attttatata gtattatttt caatcaacat tcttattaat ttctaaataa    4080

tacttgtagt tttattaact tctaaatgga ttgactatta attaaatgaa ttagtcgaac    4140

atgaataaac aaggtaacat gatagatcat gtcattgtgt tatcattgat cttacatttg    4200

gattgattac agttgggaag ctgggttcga aatcgatcac tggatcacct cctctaatct    4260

ttgcagagac acgttctcaa aagtgtagta attaacaaaa gggcgaagag cctgtgatgc    4320

agcaatccac tgaatcatgc tcttgatttc agggtttcca ccaaaagcac cacaacccca    4380

gtttcctgtt gaaactccta cgtactcact ggaattgatg cttgaaaagt catccttgtt    4440

gtgcaaatcc tggaaaagct tcgcatagag atggtgtttc gattgatcga aaaatccaca    4500

aaatgccttg ttcacttccc ttaggagaca gccagattct ctagagtcct gctttaatga    4560

gatatgcgag acgcctatga tcgcatgata tttgctttca attctgttgt gcacgttgta    4620

aaaaacctga gcatgtgtag ctcagatcct taccgccggt ttcggttcat tctaatgaat    4680

atatcacccg ttactatcgt atttttatga ataatattct ccgttcaatt tactgattgt    4740

accctactac ttatatgtac aatattaaaa tgaaaacaat atattgtgct gaataggttt    4800

atagcgacat ctatgataga gcgccacaat aacaaacaat tgcgttttat tattacaaat    4860

ccaattttaa aaaaagcggc agaaccggtc aaacctaaaa gactgattac ataaatctta    4920

ttcaaatttc aaaaggcccc aggggctagt atctacgaca caccgagcgg cgaactaata    4980

acgttcactg aagggaactc cggttccccg ccggcgcgca tgggtgagat tccttgaagt    5040

tgagtattgg ccgtccgctc taccgaaagt tacgggcacc attcaacccg gtccagcacg    5100

gcggccgggt aaccgacttg ctgccccgag aattatgcag catttttttg gtgtatgtgg    5160

gccccaaatg aagtgcaggt caaaccttga cagtgacgac aaatcgttgg gcgggtccag    5220

ggcgaatttt gcgacaacat gtcgaggctc agcaggacct gcaggtcgac ggccgagtac    5280

tggcaggata tataccgttg taatttgtcg cgtgtgaata agtcgctgtg tatgtttgtt    5340

tgattgtttc tgttggagtg cagcccattt caccggacaa gtcggctaga ttgatttagc    5400

cctgatgaac tgccgagggg aagccatctt gagcgcggaa tgggaatgga tttcgttgta    5460

caacgagacg acagaacacc cacgggaccg agcttcgatc gagcatcaaa tgaaactgca    5520

atttattcat atcaggatta tcaataccat atttttgaaa aagccgtttc tgtaatgaag    5580

gagaaaactc accgaggcag ttccatagga tggcaagatc ctggtatcgg tctgcgattc    5640

cgactcgtcc aacatcaata caacctatta atttcccctc gtcaaaaata aggttatcaa    5700

gtgagaaatc accatgagtg acgactgaat ccggtgagaa tggcaaaagt ttatgcattt    5760

ctttccagac ttgttcaaca ggccagccat tacgctcgtc atcaaaatca ctcgcatcaa    5820

ccaaaccgtt attcattcgt gattgcgcct gagcgagacg aaatacgccg ctgttaaaag    5880

gacaattaca aacaggaatc gaatgcaacc ggcgcaggaa cactgccagc gcatcaacaa    5940

tattttcacc tgaatcagga tattcttcta atacctggaa tgctgttttt ccggggatcg    6000

cagtggtgag taaccatgca tcatcaggag tacggataaa atgcttgatg gtcggaagag    6060

gcataaattc cgtcagccag tttagtctga ccatctcatc tgtaacatca ttggcaacgc    6120

tacctttgcc atgtttcaga aacaactctg gcgcatcggg cttcccatac aatcgataga    6180

ttgtcgcacc tgattgcccg acattatccg aatctggcaa ttccggttcg cttgctgtcc    6240

ataaaaccgc ccagtctagc tatcgccatg taagcccact gcaagctacc tgctttctct    6300

ttgcgcttgc gttttccgga tcttcttgag atcctttttt tctgcgcgta atctgctgct    6360

tgcaaacaaa aaaaccaccg ctaccagcgg tggtttgttt gccggatcaa gagctaccaa    6420

ctctttttcc gaaggtaact ggcttcagca gagcgcagat accaaatact gtccttctag    6480

tgtagccgta gttaggccac cacttcaaga actctgtagc accgcctaca tacctcgctc    6540

tgctaatcct gttaccagtg gctgctgcca gtggcgataa gtcgtgtctt accgggttgg    6600

actcaagacg atagttaccg gataaggcgc agcggtcggg ctgaacgggg ggttcgtgca    6660

cacagcccag cttggagcga acgacctaca ccgaactgag atacctacag cgtgagctat    6720

gagaaagcgc cacgcttccc gaagggagaa aggcggacag gtatccggta agcggcaggg    6780

tcggaacagg agagcgcacg agggagcttc cagggggaaa cgcctggtat ctttatagtc    6840

ctgtcgggtt tcgccacctc tgacttgagc gtcgattttt gtgatgctcg tcaggggggc    6900

ggagcctatg gaaaaacgcc agcaacgcgg cctttttacg gttcctggcc ttttgctggc    6960

cttttgctca catgttcttt cctgcgttat cccctgattc tgtggataac cgtattaccg    7020

cctttgagtg agctgatacc gctcgccgca gccgaacgac cgagcgcagc gagtcagtga    7080

gcgaggaagc ggaagagcgc ctgatgcggt attttctcct tacgcatctg tgcggtattt    7140

cacaccgcat atggtgcact ctcagtacaa tctgctctga tgccgcatag ttaagccagt    7200

atacactccg ctatcgctac gtgactgggt catggctgcg ccccgacacc cgccaacacc    7260

cgctgacgcg ccctgacggg cttgtctgct cccggcatcc gcttacagac aagctgtgac    7320

cgtctccggg agctgcatgt gtcagaggtt ttcaccgtca tcaccgaaac gcgcgaggca    7380

gggtgccttg atgtgggcgc cggcggtcga gtggcgacgg cgcggcttgt ccgcgccctg    7440

gtagattgcc tggccgtagg ccagccattt ttgagcggcc agcggccgcg ataggccgac    7500

gcgaagcggc ggggcgtagg gagcgcagcg accgaagggt aggcgctttt tgcagctctt    7560

cggctgtgcg ctggccagac agttatgcac aggccaggcg ggttttaaga gttttaataa    7620

gttttaaaga gttttaggcg gaaaaatcgc cttttttctc ttttatatca gtcacttaca    7680

tgtgtgaccg gttcccaatg tacggctttg ggttcccaat gtacgggttc cggttcccaa    7740

tgtacggctt tgggttccca atgtacgtgc tatccacagg aaagagacct tttcgacctt    7800

tttcccctgc tagggcaatt tgccctagca tctgctccgt acattaggaa ccggcggatg    7860

cttcgccctc gatcaggttg cggtagcgca tgactaggat cgggccagcc tgccccgcct    7920

cctccttcaa atcgtactcc ggcaggtcat ttgacccgat cagcttgcgc acggtgaaac    7980

agaacttctt gaactctccg gcgctgccac tgcgttcgta gatcgtcttg aacaaccatc    8040

tggcttctgc cttgcctgcg gcgcggcgtg ccaggcggta gagaaaacgg ccgatgccgg    8100

gatcgatcaa aaagtaatcg gggtgaaccg tcagcacgtc cgggttcttg ccttctgtga    8160

tctcgcggta catccaatca gctagctcga tctcgatgta ctccggccgc ccggtttcgc    8220

tctttacgat cttgtagcgg ctaatcaagg cttcaccctc ggataccgtc accaggcggc    8280

cgttcttggc cttcttcgta cgctgcatgg caacgtgcgt ggtgtttaac cgaatgcagg    8340

tttctaccag gtcgtctttc tgctttccgc catcggctcg ccggcagaac ttgagtacgt    8400

ccgcaacgtg tggacggaac acgcggccgg gcttgtctcc cttcccttcc cggtatcggt    8460

tcatggattc ggttagatgg gaaaccgcca tcagtaccag gtcgtaatcc cacacactgg    8520

ccatgccggc cggccctgcg gaaacctcta cgtgcccgtc tggaagctcg tagcggatca    8580

cctcgccagc tcgtcggtca cgcttcgaca gacggaaaac ggccacgtcc atgatgctgc    8640

gactatcgcg ggtgcccacg tcatagagca tcggaacgaa aaaatctggt tgctcgtcgc    8700

ccttgggcgg cttcctaatc gacggcgcac cggctgccgg cggttgccgg gattctttgc    8760

ggattcgatc agcggccgct tgccacgatt caccggggcg tgcttctgcc tcgatgcgtt    8820

gccgctgggc ggcctgcgcg gccttcaact tctccaccag gtcatcaccc agcgccgcgc    8880

cgatttgtac cgggccggat ggtttgcgac cgtcacgccg attcctcggg cttgggggtt    8940

ccagtgccat tgcagggccg gcagacaacc cagccgctta cgcctggcca accgcccgtt    9000

cctccacaca tggggcattc cacggcgtcg gtgcctggtt gttcttgatt ttccatgccg    9060

cctcctttag ccgctaaaat tcatctactc atttattcat ttgctcattt actctggtag    9120

ctgcgcgatg tattcagata gcagctcggt aatggtcttg ccttggcgta ccgcgtacat    9180

cttcagcttg gtgtgatcct ccgccggcaa ctgaaagttg acccgcttca tggctggcgt    9240

gtctgccagg ctggccaacg ttgcagcctt gctgctgcgt gcgctcggac ggccggcact    9300

tagcgtgttt gtgcttttgc tcattttctc tttacctcat taactcaaat gagttttgat    9360

ttaatttcag cggccagcgc ctggacctcg cgggcagcgt cgccctcggg ttctgattca    9420

agaacggttg tgccggcggc ggcagtgcct gggtagctca cgcgctgcgt gatacgggac    9480

tcaagaatgg gcagctcgta cccggccagc gcctcggcaa cctcaccgcc gatgcgcgtg    9540

cctttgatcg cccgcgacac gacaaaggcc gcttgtagcc ttccatccgt gacctcaatg    9600

cgctgcttaa ccagctccac caggtcggcg gtggcccata tgtcgtaagg gcttggctgc    9660

accggaatca gcacgaagtc ggctgccttg atcgcggaca cagccaagtc cgccgcctgg    9720

ggcgctccgt cgatcactac gaagtcgcgc cggccgatgg ccttcacgtc gcggtcaatc    9780

gtcgggcggt cgatgccgac aacggttagc ggttgatctt cccgcacggc cgcccaatcg    9840

cgggcactgc cctggggatc ggaatcgact aacagaacat cggccccggc gagttgcagg    9900

gcgcgggcta gatgggttgc gatggtcgtc ttgcctgacc cgcctttctg gttaagtaca    9960

gcgataacct tcatgcgttc cccttgcgta tttgtttatt tactcatcgc atcatatacg   10020

cagcgaccgc atgacgcaag ctgttttact caaatacaca tcaccttttt agacggcggc   10080

gctcggtttc ttcagcggcc aagctggccg gccaggccgc cagcttggca tcagacaaac   10140

cggccaggat ttcatgcagc cgcacggttg agacgtgcgc gggcggctcg aacacgtacc   10200

cggccgcgat catctccgcc tcgatctctt cggtaatgaa aaacggttcg tcctggccgt   10260

cctggtgcgg tttcatgctt gttcctcttg gcgttcattc tcggcggccg ccagggcgtc   10320

ggcctcggtc aatgcgtcct cacggaaggc accgcgccgc ctggcctcgg tgggcgtcac  10380

ttcctcgctg cgctcaagtg cgcggtacag ggtcgagcga tgcacgccaa gcagtgcagc  10440

cgcctctttc acggtgcggc cttcctggtc gatcagctcg cgggcgtgcg cgatctgtgc  10500

cggggtgagg gtagggcggg ggccaaactt cacgcctcgg gccttggcgg cctcgcgccc  10560

gctccgggtg cggtcgatga ttagggaacg ctcgaactcg gcaatgccgg cgaacacggt  10620

caacaccatg cggccggccg gcgtggtggt gtcggcccac ggctctgcca ggctacgcag  10680

gcccgcgccg gcctcctgga tgcgctcggc aatgtccagt aggtcgcggg tgctgcgggc  10740

caggcggtct agcctggtca ctgtcacaac gtcgccaggg cgtaggtggt caagcatcct  10800

ggccagctcc gggcggtcgc gcctggtgcc ggtgatcttc tcggaaaaca gcttggtgca  10860

gccggccgcg tgcagttcgg cccgttggtt ggtcaagtcc tggtcgtcgg tgctgacgcg  10920

ggcatagccc agcaggccag cggcggcgct cttgttcatg gcgtaatgtc tccggttcta  10980

gtcgcaagta ttctacttta tgcgactaaa acacgcgaca agaaaacgcc aggaaaaggg  11040

cagggcggca gcctgtcgcg taacttagga cttgtgcgac atgtcgtttt cagaagacgg  11100

ctgcactgaa cgtcagaagc cgactgcact atagcagcgg aggggttgga tcgatccctg  11160

ctcgcgcagg ctgggtgcca agctctcggg taacatcaag gcccgatcct tggagccctt  11220

gccctcccgc acgatgatcg tgccgtgatc gaaatccaga tccttgaccc gcagttgcaa  11280

accctcactg atccgcatgc ccgttccata cagaagctgg gcgaacaaac gatgctcgcc  11340

ttccagaaaa ccgaggatgc gaaccacttc atccggggtc agcaccaccg gcaagcgccc  11400

ggacggccga ggtcttccga tctcctgaag ccagggcaga tccgtgcaca gcacttgccg  11460

tagaagaaca gcaaggccgc caatgcctga cgatgcgtgg agaccgaaac cttgcgctcg  11520

ttcgccagcc aggacagaaa tgcctcgact tcgctgctgc ccaaggttgc cgggtgacgc  11580

acaccgtgga aacggatgaa ggcacgaacc cagtggacat aagcctgttc ggttcgtaag  11640

ctgtaatgca agtagcgtat gcgctcacgc aactggtcca gaaccttgac cgaacgcagc  11700

ggtggtaacg gcgcagtggc ggttttcatg gcttgttatg actgtttttt tggggtacag  11760

tctatgcctc gggcatccaa gcagcaagcg cgttacgccg tgggtcgatg tttgatgtta  11820

tggagcagca acgatgttac gcagcagggc agtcgcccta aaacaaagtt aaacatcatg  11880

agggaagcgg tgatcgccga agtatcgact caactatcag aggtagttgg cgtcatcgag  11940

cgccatctcg aaccgacgtt gctggccgta catttgtacg gctccgcagt ggatggcggc  12000

ctgaagccac acagtgatat tgatttgctg gttacggtga ccgtaaggct tgatgaaaca  12060

acgcggcgag ctttgatcaa cgaccttttg gaaacttcgg cttcccctgg agagagcgag  12120

attctccgcg ctgtagaagt caccattgtt gtgcacgacg acatcattcc gtggcgttat  12180

ccagctaagc gcgaactgca atttggagaa tggcagcgca atgacattct tgcaggtatc  12240

ttcgagccag ccacgatcga cattgatctg gctatcttgc tgacaaaagc aagagaacat  12300

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