东方鲀属河豚鱼早期性别的鉴别方法

摘要

本发明公开了一种东方鲀属河豚鱼早期性别的鉴别方法，其特征是首先提取成熟河豚鱼尾鳍组织mRNA，利用mRNA反转录试剂盒合成双链cDNA，以此为模板，利用cDNA－AFLP法经过预扩增和选择性扩增、AFLP电泳检测，获得雌雄河豚鱼尾鳍组织的差异核酸片段，进一步克隆该片段并测序，后根据测得序列设计出特异引物；利用该引物对1龄以上雌雄河豚鱼进行验证，如存在分子量为316bp的DNA条带，则确定所检河豚鱼为雌性，而该特异带缺失则为雄性。本发明灵敏、快速、高效准确率在92％以上。可在幼鱼阶段对性别进行早期鉴定，能大大提高生产效益并为相关试剂盒的开发提供有益借鉴。

说明书

技术领域

本发明涉及一种东方鲀属河豚鱼早期性别鉴别方法

背景技术

河豚，古称鯸鮧或鰗鱼，为鲀形目鱼类的总称，其中东方鲀属河豚鱼是目前主要的养殖对象。河豚鱼肉味鲜美、营养丰富，有关河豚鱼的药用价值在《本草纲目》中有较多记载，在我国，传统的河豚美食文化源远流长。日本和韩国食用河豚的历史也比较早，特别是日本，形成了一整套有关河豚鱼加工、处理与烹制的完善规章制度，已成为世界上最大的河豚鱼消费国，而我国是其主要的进口国。雌性河豚鱼卵巢含有高强度的河鲀毒素，加工处理不当或误食常可引起中毒，甚至丧生。而雄性河豚鱼的精巢(俗称白子)不含或含极低量河鲀毒素可以食用，且风味独特，雄性个体生长速度也相对较快，因而雄性个体具有更高的市场价值。

河豚鱼的发育成熟期为2-3年，目前，生产中在不解剖鱼体的情况下，还没有有效的方法鉴定河豚鱼的性别，传统的鉴别方法主要靠解剖鱼体性腺组织或是在成熟期进行外部形态观察。但这些方法缺点明显，一是对鱼体组织具有致命的伤害，另一方面外部形态观察只能在发育成熟期，而在未成熟期该方法不能有效地鉴定个体性别。因此，如果在河豚鱼发育早期就能准确的鉴定出个体性别，必将极大提高生产中的经济效益。

近年来，利用聚合酶链式反应(PCR)扩增生物体基因某一特异分子片断进行各类生物的检测、鉴定或诊断的方法已在国际上广泛应用。互补DNA(cDNA)-扩增片段长度多态性(AFLP，Amplified Fragment Length Polymorphism)法是Bachem等提出的一种新的基因差异表达鉴定方法，具有假阳性低、特异性高、重复性好等特点，因而已被广泛应用于植物、动物和微生物的差异表达基因的克隆分离和遗传作图方面。但迄今为止，关于东方鲀属河豚鱼性别的分子鉴定技术国内外尚未见报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种东方鲀属河豚鱼早期性别的鉴别方法，它能解决现有技术中难以对未成熟期的河豚鱼性别进行鉴定的难题。

一种东方鲀属河豚鱼早期性别的鉴别方法，其特征是首先提取成熟河豚鱼尾鳍组织mRNA，利用mRNA反转录试剂盒合成双链cDNA，以此为模板，利用cDNA-AFLP法经过预扩增和选择性扩增、AFLP电泳检测，获得雌雄河豚鱼尾鳍组织的差异核酸片段，进一步克隆该片段并测序，然后根据测得的序列设计出特异引物，利用该引物对1龄以上雌雄河豚鱼进行性别验证：如存在分子量为316 bp的DNA条带，则确定所检河豚鱼为雌性，而该特异带缺失则为雄性。

本发明利用从发育成熟的河豚鱼尾鳍组织获得的特异cDNA序列，可以鉴定发育期在1龄以上的河豚鱼性别，经多个个体重复验证，准确率在92％以上。本发明具有客观、科学、准确和快速的特点，为生产中河豚鱼发育早期性别的鉴定、合理规划生产和提高河豚鱼的市场价值提供技术保障。

具体实施方式

1、提取雌雄河豚鱼尾鳍组织mRNA

使用UNIQ-10柱式mRNA抽提纯化试剂盒(上海生物工程有限公司)，按照提取指南分别提取雌雄河豚鱼尾鳍mRNA。步骤如下：

首先取来自同一性别的10个河豚鱼个体的尾鳍组织100mg，每个个体约10mg，加入1ml RNApro溶液，高速匀浆至均匀，向所得匀浆中加入0.1ml 2mol/L的NaAc水溶液，充分混匀后，10,000转/分离心5分钟。然后将含RNA的上清液转移到一只5ml的离心管，加入2.5倍体积-20℃下预冷的无水乙醇。充分混合后在-20℃下至少冷却20分钟。随后将冷却液12,000转/分，离心10分钟，弃去上清液，用预冷的75％乙醇洗沉淀两次。将沉淀溶于100μl RNA Binding Buffer溶液，并将其转移到一只含有0.5mgOligo-dT的1.5ml离心管中，混匀，接着将上述混合物转移到一只离心柱中12,000转/分离心1分钟，弃去废液。随后将离心柱放回原来的离心管中，向离心柱中央加入200μlRNA Binding Buffer，混匀后，12,000转/分离心1分钟，弃去废液。然后将离心柱放到一个新的1.5ml离心管中，加入500μl R-Elution Buffer，彻底混匀后，12,000转/分离心1分钟。将离心出的液体转移到一只5ml的离心管中，加入1/10体积的2mol/LNaAc水溶液和2.5倍体积的预冷无水乙醇，混合后于-20℃至少放置20分钟。最后将冷却液12,000转/分离心10分钟，弃上清，加入20μl R-Elution Buffer溶解mRNA沉淀。

2、合成双链cDNA

用上述mRNA合成cDNA双链，所用的试剂盒为宝生物(大连)公司产品D6130，步骤如下：

(1)合成cDNA第一条链：

首先，在微量离心管中配制下述反应液，模板RNA 2μl(约2g)，5倍lst Strand Synthesis Buffer 4μl，dNTP Mixture1μl，RNase inhibitor 1μl，Oligo(dT) 2μl，Rtase 1μl，RNase-free H₂O 9μl，全量20μl。接着轻柔搅拌混匀上述混合液，室温放置10min后，移至42℃恒温水浴槽内反应1小时。反应结束后置于冰中冷却2分钟。

(2)合成cDNA第二条链以及末端平滑化：

首先，在第一条链合成后的微量离心管中再加入5倍2nd StrandSynthesis Buffer30μl，dNTP Mixture 3μl，RNase-free H₂O 89μl，再加入2μlE.coli DNA Polymerase I和2μl E.coli R Nase H/E.coliDNA Ligase Mixture，总量146μl，轻轻搅拌。随后在16℃反应2小时，并在70℃加热10分钟。接着在上述混合液体中加入4μl T 4 DNA Polymerase，轻轻搅拌。最后将混合液体在37℃下反应10分钟。

(3)双链cDNA的精制

首先在上述反应液中，加入等量(180μl)的苯酚/氯仿/异戊醇(25∶24∶1)溶液，剧烈振荡，混匀；随后在室温下将混合液12,000rpm离心5分钟，取出上层(水相)移至另一个新的微量离心管中；向水相中加入等量(180μl)的氯仿/异戊醇(24∶1)溶液，剧烈振荡混匀，在室温下12,000rpm离心5分钟，液体分为二层，取出上层(水相)移至另一个新的微量离心管中；然后在取出的水相中加入150μl 4mol/L的CH₃COONH₄和2.5倍量的乙醇(825μl)，充分混匀；最后，将混匀液15,000rpm离心15分钟，除去上清，获得沉淀，沉淀用70％乙醇淋洗一遍后，用20μl TE Buffer溶解，-20℃保存。

3、AFLP扩增

以合成的cDNA为模板，进行酶切、连接反应，选择接头和引物，进行两次PCR扩增(预扩增和选择性扩增)。

A 所用的接头与引物序列如下(+0为预扩增引物；+2为选择性扩增引物)：

 EcoRI adaptor  MseI adaptor  EcoRI+0 primer MseI+0 primer EcoRI+2 primers MseI+2 primers  5’-CTCGTAGACTGCGTACC-3’  3’-CTGACGCATGGTTAA-5’  5’-GACGATGAGTCCTGAG-3’  3’-TACTCAGGACTCAT-5’  5’-GACTGCGTACCAATTC-3’  5’-GATGAGTCCTGAGTAA-3’  5’-GACTGCGTACCAATTCAorCorGorT/CorGorTor A-3’  5’-GATGAGTCCTGAGTAAAorCorGorT/CorGorTor A-3’

B cDNA酶切

酶切体系包括：河豚鱼尾鳍组织cDNA 20-2000ng，EcoRI5(范围值为1-5)U，MseI5(范围值为1-5)U，酶切缓冲液8μl，加水至40μl。37℃酶切2(范围值为1-5)小时。酶切完后，65℃处理3(范围值为1-20)分钟灭活酶。

C 连接反应

连接反应物总体积为40μl，其中含酶切样品30μl，EcoRI接头2(范围值为1-10)pmol，MseI接头5(范围值为1-40)pmol，10mM ATP 1.0μl，T4-DNA连接酶2(范围值为1-5)U，10倍连接缓冲液3.5μl，加水至40μl。20(范围值为10-40)℃过夜1-20h，连接完成后，65℃处理4(范围值为1-20)分钟。

D 预扩增反应

取5μl(范围值为1-20)cDNA连接样品，加入：MseI引物40(范围值为20-200)ng，EcoRI引物50(范围值为20-200)ng，10×PCR缓冲液5.0μl，2U Taq酶，0.2mMdNTP，加水至50μl。混匀后，在如下PCR条件下扩增：94℃变性2分钟；94℃30秒，56℃30秒，72℃1分钟(30个循环)。完成后取5(范围值为1-20)μl预扩增产物和2(范围值为1-10)μl加样缓冲液，混合后经1％(范围值为1-5％)agarose胶电泳检测预扩增效果。

F 选择性扩增反应

预扩增产物用0.1×IE buffer稀释10(范围值为5-50)倍后，取5(范围值为1-20)μl，加入：EcoRI+2引物10(范围值为1-50)ng，MseI+2引物(范围1-100)10ng，0.2mM dNTP，1U Taq酶，10倍PCR缓冲液2.0μl，加H₂O至20μl。按如下PCR程序扩增：94℃变性2分钟；94℃30秒，65℃30秒，72℃1分钟，进行12个循环，每个循环退火温度降低0.7℃，至56℃。然后94℃30秒，56℃30秒，72℃1分钟再进行23个循环。

4、AFLP产物的检测

A 聚丙烯酰胺变性凝胶电泳步骤如下：

选择性扩增产物中加入等体积变性缓冲液(98％甲酰胺，10mmol/L EDTA pH8.0，0.25％溴酚蓝，0.25％二甲苯腈)，混匀，95℃变性3(范围值为1-10)分钟后立刻转移到冰浴中冷却，以备电泳。制备6％(范围值为4-8％)的聚丙烯酰胺变性凝胶，60W恒功率预电泳30分钟，60W恒功率电泳1.5(范围值为1-3)小时。

B 银染过程：先取适合胶面大小的塑料盒，加入两升新配置的10％(重量百分数，下同)冰醋酸溶液，轻轻摇动30(范围值为20-60)分钟至胶全部脱色。后用重蒸水冲洗胶板3次，每次2分钟，接着加入两升染色水溶液(含2g AgNO₃，3m1甲醛)，轻轻摇动染色30(范围值为20-60)分钟，随即用重蒸水冲洗胶板不超过5秒钟，接着把胶板快速转移到两升冷却的显色水溶液(含60g Na₂CO₃，3ml甲醛)并轻轻摇动，直至带纹出现。此时加入两升的固定/停止液并轻摇4(范围值为3-10)分钟。最后用重蒸水冲洗两次，每次2(范围值为1-5)分钟。

5、差异片段的回收、克隆和测序：

首先，找到凝胶上的雌雄差异片段，用刀片将差异片段切下，放入1.5mlEP管中，加20(范围值为5-100)μl双蒸水捣碎胶带，4℃过夜。次日离心(＜3000rpm，5min)上述浸出液，取上清作为模板，该模板用与AFLP扩增时对应的选择性引物进行PCR扩增。产物用低熔点胶电泳回收。最后将回收产物连接在载体pMD18T上，转化到大肠杆菌，挑选阳性克隆，用ABI 3730测序仪进行测序。.

获得序列为：雌性河豚鱼尾鳍cDNA差异片段核酸序列(517bp)。

CTGTTTTCCATTCTACCAAATACGGGTGTCATCACCACGGTAACGGACAGCCTGGACAGAGAGACTAAAGATA

AGTACCTGGTCACAGTGAAAATCCAGGACATGGCGGGCGCCTCGAGCGGTCTCTCCAACACAGGCACAGCCAC

CATCGTCGTGGGCGACATCAACGACAACCCGCCGACGTTCACGGAGACGTCCTACGACGCCAGCGTGAAGGAG

AACGAAATTGACAAGTTCATCCTGCGAATCCCGGTCAACGACAAGGATATGGAGAACACGCCCAACTGGGTTT

CTAAATTTGAAATAACTAAAGGGAATGAAAGTGGGAATTTCAGGGTGGAAACGGATCCCAAAACCAACGGCGC

GCTGCTGTATGTGTCGAAGGCCTTGGATCACGAGAAGGCCAAAACCGTAGCGCTAGAGATCACGGCCCGCAAC

GAAGCTGAGCTGAGCGGCACCAGCGCCGGCTGGAACTCCATTCCAGTGAATCTCAACGTCCTCAATGTCGATG

AGGGCC

根据上述序列设计的用于RT-PCR特异扩增的引物为：上游引物(P1)为TCTACCAAATACGGGTGTCA，下游引物(P2)为CCCACTTTCATTCCCTTTA。

6、RT-PCR鉴定河豚鱼性别

利用上述特异性引物，以河豚鱼尾鳍组织cDNA为模板，进行RT-PCR扩增，可以快速、准确的鉴定1龄以上河豚鱼的性别。

(1)、PCR反应

PCR反应物包含：cDNA 50ng、1mmol/μl的引物P1和P2各2μl、0.2mmol/μl的dNTP 2μl、0.15mmol/μl的MgCl₂ 1.5μl、1U Taq酶0.5μl、10倍PCR缓冲液2.5μl，加H₂O至25μl。

PCR反应程序：94℃变性4分钟；94℃30秒，59℃40秒，72℃1分钟，进行30个循环；72℃5分钟，4℃保温。

(2)、电泳检测

PCR扩增产物采用1.0％(范围值为1-5.0％)的琼脂糖凝胶，在100(范围值为70-100)V下电泳30(范围值为20-40)分钟，紫外灯下检测，雌性河豚鱼个体存在分子量为316bpDNA条带，而雄性个体不存在该条带。

用本发明所用的方法对20尾1龄东方鲀属河豚鱼进行性别鉴定，结果显示在12尾中出现雌性特异核酸条带，由此判断为雌鱼；另外8尾该特异条带缺失，判断为雄鱼。这些结果与通过解剖学观察得到的结果相一致。