腺相关病毒载体制剂和含有该制剂的药物组合物及其用途

摘要

本发明涉及一种包括携带神经营养因子基因的腺相关病毒载体制剂，该制剂中含有3－7％(w/v)的甘露醇，所述的甘露醇可以提高高浓度的重组腺相关病毒载体制剂的稳定性。另外，本发明还涉及含有上述制剂和一种高渗溶液的药物组合物，其中所述的高渗溶液选自甘露醇、阿拉伯糖、尿素、果糖、乳酰胺或甘油。所述的药物组合物作为联合制剂分别或顺序给药用于预防和/或治疗中枢神经元退行性病变。本发明的制剂或药物组合物可用于预防和治疗阿尔茨海默氏病、帕金森氏病等中枢神经元退行性病变；并可用于脑缺血损伤、脑外伤、脑手术创伤后减少神经元死亡，促进脑功能恢复；以及用于幼儿宫内窒息、难产等脑缺氧损伤后预防脑损伤性智力低下或脑发育不良。

说明书

技术领域

本发明涉及一种携带神经营养因子基因的腺相关病毒(adeno-associatedvirus，AAV)载体制剂，所述的制剂含有3-7％的甘露醇。另外，还涉及含有所述制剂和一种高渗溶液的药物组合物，所述的高渗溶液诱导血脑屏障开放而使所述的病毒载体进入脑部感染、表达。本发明还涉及所述的制剂和/或药物组合物在预防和治疗阿尔茨海默氏病、帕金森氏病等中枢神经元退行性疾病中的用途，所述的制剂和/或药物组合物还可用于脑缺血损伤、脑外伤、脑手术创伤后减少神经元死亡，促进脑功能恢复；以及用于幼儿宫内窒息、难产等脑缺氧损伤后预防脑损伤性智力低下或脑发育不良。

背景技术

包括阿尔茨海默氏病(Alzheimer’s disease，AD)在内的神经系统退行性疾病(nerve system progressive degeneration diseases)，最主要的临床表现之一就是学习、记忆能力下降。其原因为前脑基底部胆碱能神经元出现萎缩、死亡，有可能是因为缺乏了从海马和皮层来的营养如神经生长因子(Nerve GrowthFactor，NGF)或其它神经营养因子所致(Heftei F.，J Neurosci 1986；6：2155-2162；Tuszynski MH，Roberts J，Senut MC，et al.，Gene therapy 1996；3：305-314；Smith DE，Roberts J，Gage FH，et al.，Pro Natl Acad Sci USA1999；96：10893-10898.)。而NGF基因在中枢神经系统的表达可有效改善这些症状。因此，基因治疗有可能成为解决以上问题的有效途径。

人神经生长因子(Human Nerve Growth Factorβ，hNGFβ)由于其特殊的生物学功能，自发现以来就倍受关注。虽然众多动物研究证明在脑内注射NGF蛋白后可保护胆碱能神经元，但通过脑内注射外源性NGF是极为困难和不方便的。另一方面NGF作为一大分子蛋白质，是无法在血液注射后通过脑血屏障而进入大脑发挥作用。因此，解决上述困难的一个措施是进行基因治疗，即采用合适的载体系统将NGF基因导入至患者脑内并表达，使机体本身变成一个生产NGF的“工厂”。

与蛋白治疗的方法相比，NGF的基因治疗具有明显的优势：第一，由于NGF在体内产生，因此保持其高活性，并还可避免内毒素等杂质的污染；第二，一次注射NGF的治疗基因可使NGF在患者体内长期稳定表达，使患者容易忍受，并且大大降低了治疗成本；第三，基因治疗能够使体内NGF保持在一个较为恒定的水平，其药物动力学和药效学更加合理。基因治疗的方式恰与连续给药的方式相类似，因此有可能不需要很高的表达量就能达到很好的疗效。但由于血脑屏障的存在，在己进行的NGF基因治疗研究中，多采用脑室内立体定位注射携带NGF的病毒载体或体外转导自体细胞的方式，其共同的缺点就是给药途径复杂，易引起脑部水肿等副作用，治疗基因不能获得长久稳定的表达，并且使患者深感痛苦，致使临床应用难以推广。此外，蛋白载体介导的NGF导入方法，患者需每天给药，不适合于慢性病的治疗；而且目前对小分子所诱导脑内生成NGF的药物研究尚不成熟。

基因治疗的成功有赖于治疗基因、基因转移系统和基因表达系统的完美结合。当治疗基因确定后，如何选择合适的基因转移和表达载体、以及选用何种给药途径就显得尤为重要。大量文献资料表明促进药物通过血脑屏障(Blood Brain Barrier，BBB)的无创伤方法主要有：皮下植入贮器法、利用鼻腔输送治疗脑部疾病的药物、血管活性物质、细菌葡萄糖肽、抗菌抗体、高渗透性开放BBB等血脑屏障开放方法(Neuwelt EA，Barnett PA，Hellstrom I，etal.，Cancer Res 1988；48：4725-4729；Sanovich E，Bartus RT，Friden PM，et al.，Brain Res 1995；705：125-135；Spellerberg B，Prasad S，Cabellos C，et al.，J ExpMed 1995；182：1037-1046；Tuomamen EI，Prasad SM，George JS，et al.，ProcNatl Acad Sci USA 1993；90：7824-7828；Pardridge WM.，2002；3：1753-1757)。其中高渗溶液在以上开放血脑屏障的方法中重现性好，所用BBB开放物质(如甘露醇)可逆安全地开放血脑屏障，并且重现性好，对病毒导入后的表达无潜在干扰，且容易获得；BBB的开放及药物转运的增加主要取决于高渗溶液的浓度、注射时间和速度，相对容易控制，并且这种开放是有时间性和可逆性的。通过该方法可将大小为56±35nm的颗粒透过血脑屏障(Neuwelt EA，Weissleder R，Nilaver G，et al.，Neurosurgery 1994；34：776-784)。

由于病毒具有对细胞具有天然的感染能力，其将外源基因导入细胞效率明显高于其它系统，因此在基因治疗采用载体一直占据主导地位。其中在已进行的约900个临床方案和6000余个病例中，在已进行的约900余个基因治疗临床方案中，以病毒为载体的方案超过80％。除腺相关病毒载体以外，常用的基因治疗用载体主要有逆转录病毒载体、腺病毒载体、单纯疱疹病毒载体。AAV作为基因治疗载体的优点如下：(1)安全性好，未发现野生型AAV对人体致病；(2)宿主范围广，可转导分裂细胞和非分裂细胞；(3)AAV的基因组仅4681bp便于用常规的重组DNA技术进行操作；(4)物理性质稳定好，60℃不能被灭活，并能抵抗多种有机溶剂的处理；(5)能整合致宿主染色体，并长期稳定的表达外源基因；(6)免疫原性弱。AAV作为基因治疗载体的缺点如下：(1)外源基因容量小；(2)病毒滴度较低；(3)建立高效率的包装细胞体系难度大。

由于AAV是目前公认免疫源性最弱、最安全的病毒载体，对其的应用研究一直是基因治疗领域关注的热点，特别是一些目前没有较好治疗方案的遗传病、慢性疾病治疗领域关注的热点。而从AAV载体的特性可以看出，在常用的基因治疗病毒载体中，腺相关病毒载体是最小的一种，并且是现用载体中唯一的单链病毒，因此AAV在感染后必须先复制成双链后才能进行转录、表达，而这些特性导致AAV的表达水平相对较低，表达高峰相对滞后。因此，针对相同的适应症，要达到相同的治疗效果，如果采用AAV病毒载体，就必须导入更多的病毒颗粒。

目前基于生物伦理学和生物安全性的角度考虑，基因治疗一般多采用局部给药，而非系统给药，但由于组织结构及生物利用度等因素导致注射体积的限制，即使对是目前公认免疫源性最弱、最安全的AAV病毒载体，在给药体积上同样受到限制。因此，采用AAV载体进行基因治疗的理想方式就是提高病毒滴度，或者是说提高单位体积内的病毒颗粒数、病毒载体浓度。而在常用的基因治疗病毒载体中，腺相关病毒载体是最小的一种。目前，已进入临床实验的腺相关病毒载体制剂(AAV)病毒颗粒数通常要高出腺病毒载体制剂(Adv)2-3个数量级，即单位体积中的腺相关病毒载体(AAV)数量远远高于腺病毒载体(Adv)，从而导致高浓度的腺相关病毒载体制剂(AAV)在制备、浓缩过程中出现病毒颗粒聚集、沉淀，而导致病毒稳定性与感染能力的下降，因此，如何提高高浓度腺相关病毒载体(AAV)制剂的稳定性，并研究其在基因治疗领域的进一步应用具有重要意义。

发明内容

本发明的目的一是提供一种携带神经营养因子基因的腺相关病毒载体制剂，所述的制剂含有3-7％(W/V)的甘露醇，优选含有5％(W/V)的甘露醇。其中所述的3-7％(W/V)的甘露醇可以提高高浓度的重组腺相关病毒载体在制剂中的稳定性。

本发明的另一目的是提供含有携带神经营养因子基因的腺相关病毒载体制剂(I)和一种高渗溶液(II)的药物组合物，所述的高渗溶液(II)诱导血脑屏障开放而使所述的病毒载体进入脑部感染、表达。其中所述的高渗物质选自甘露醇、阿拉伯糖、尿素、果糖、乳酰胺或甘油，优选为甘露醇。所述的药物组合物作为联合制剂分别或顺序给药用于预防和/或治疗中枢神经元退行性病变，脑缺血损伤、脑外伤、脑手术创伤后减少神经元死亡或促进脑功能恢复，以及用于幼儿宫内窒息、难产时脑缺氧损伤后预防脑损伤性智力低下或脑发育不良。

在上述的制剂或药物组合物中，所述的神经营养因子选自神经生长因子(NGF)，脑源神经营养因子(BDNF)，胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)，胰岛素样生长因子1(IGF1)，神经营养素3(NT-3)，神经营养素(NT4/5)或睫状神经营养因子(CNTF)，优选为人神经生长因子hNGF。所述的腺相关病毒载体为腺相关病毒1型、2型、3型、4型、5型、6型、7型或8型，优选为腺相关病毒2型(rAAV-2)。

在血脑屏障(BBB)稳定开放后，治疗药物或病毒载体能否导入，主要取决于导入病毒载体或药物分子的结构是否小于脑部星型胶质细胞网层出现的56±35nm空隙。腺相关病毒(adeno-associated virus，AAV)属细小病毒科(Parvoviridae)，目前公认已发现的AAV血清型有1-8种，各型AAV病毒的基因结构相同，虽然不同载体在衣壳蛋白氨基酸水平存在一定差异(这些差异主要由于同源重组造成，这也是造成不同血清型病毒在不同组织的感染效率上出现差异的主要原因)，但各型AAV病毒颗粒在大小上差异不大，仍维持在20-26nm左右，因此，本发明的技术方案能在实施BBB开放后，能够保证不同血清型的AAV病毒载体有效导入中枢神经系统，并进行感染、表达。

虽然各血清型的AAV病毒在基因结构、病毒颗粒大小上差异不大，但不同载体在衣壳蛋白氨基酸水平存在一定差异，这也是造成不同血清型的AAV组织或细胞嗜性不同的主要原因。动物实验发现，与AAV2载体相比，AAV1比AAV2能更好地转导肌肉组织，AAV1对肌肉组织的感染效率比AAV2高100-1000倍；而AAV1在除神经组织外的其他组织，比如肌肉组织和肝脏中的转导效率都普遍高于其他血清型；AAV在肝脏和肌肉组织中感染效率由高到低的顺序是1、5、3、2、4；在大鼠视网膜中的感染顺序是5、4、1、2、3。AAV3比其它血清型的AAV能更好地转导巨核细胞。相较AAV2而言，AAV5和AAV6能更有效地转导上呼吸道细胞，特别是AAV5在视网膜、大脑、呼吸道上皮和胰岛中有更好的感染效率。AAV2、AAV4和AAV5都能较好地转导中枢神经系统的细胞，但在其中的分布和靶向的细胞类型存在着差异。AAV7在肌肉组织中的转导效率很高，与AAV1差不多，而AAV8在肝脏中的转基因表达水平比其它血清型AAV要高10到100倍以上。故本发明所涉及的腺相关病毒载体为腺相关病毒1型、2型、3型、4型、5型、6型、7型或8型，优选为腺相关病毒2型(rAAV-2)。

腺相关病毒载体是一种具有良好应用前景的基因治疗载体。研究中往往需要高滴度的重组AAV病毒(＞10¹¹v.g/ml)。但部分给药体积、给药时间受到限制的研究则需要更高浓度的病毒，即在一定体积或规定时间内能够导入尽可能多的重组病毒。虽然利用完整的腺相关病毒颗粒具有耐受有机溶剂的特点，采用乙醇沉淀重组AAV病毒的方法，可以达到浓缩AAV载体的目的(10¹³v.g/ml)，但由于病毒颗粒浓度高，经常在存放过程中出现病毒颗粒聚集、沉淀以致影响实验效果。本发明经过研究采用在常规病毒保存液中添加一定浓度(3-7w/v％)甘露醇的方法，使得病毒颗粒在保存过程中保持分散、非聚集状态，可有效解决病毒制剂在保存过程中病毒颗粒的聚集、沉淀问题。该方法不仅提高了病毒载体制剂的稳定性，而且在以高浓度的高渗溶液开放血脑屏障后，可将高近一个数量级的重组病毒(AAV/hNGFβ)导入中枢神经系统，并可预期在中枢神经系统的表达量、以及在相关动物模型的治疗效果会明显优于不含甘露醇的普通制剂。

能形成高渗透压开放BBB的物质有：甘露醇、阿拉伯糖、尿素、果糖、乳酰胺、甘油等。特别是以甘露醇为代表的高渗溶液可逆开放血脑屏障的重现性好，并且所用物质安全、对病毒导入后的表达无潜在干扰。BBB的开放及药物转运的增加主要取决于高渗溶液的浓度、注射时间和速度，并且这种开放是有时间性和可逆性的。在众多可逆开放BBB的高渗溶液中，本发明优选甘露醇进行高浓度腺相关病毒载体(AAV)的稳定性研究的主要原因在于：(1)在部分国家重组蛋白药物理化、生物学活性标准品的研究中，在配方中添加一定的甘露醇可以提高蛋白的稳定性；(2)目前甘露醇是一种较为常用的减轻颅压、血压、和利尿的制剂，其安全性已得到长期的临床验证，在后续的产业化进程中其对整体制剂的安全性不会带来负面影响；(3)甘露醇对病毒颗粒的感染能力没有影响。所用甘露醇的浓度为22-28％(w/v)，优选为25％(w/v)；在使用时，输入甘露醇后保留1-6分钟，BBB开放程度均大于50％，其中以输入甘露醇2分钟时BBB的开放程度最好。

申请人经过研究发现，在病毒载体制剂中加入3-7％(w/v)的甘露醇不仅可以提高高浓度的重组腺相关病毒载体的稳定性，而且在以高浓度的高渗溶液开放血脑屏障后，可将高近一个数量级的重组病毒(AAV/hNGFβ)导入中枢神经系统，并可预期在中枢神经系统的表达量、以及在相关动物模型的治疗效果会明显优于不含甘露醇的普通制剂。该制剂优于不含甘露醇配方的普通制剂的原因如下：血脑屏障的形成主要是由于众多脑部星型胶质细胞的致密排列构成的细胞网层，浓度为22-28％(w/v)甘露醇可以使脑部星型胶质细胞网层出现56±35nm的空隙，优选甘露醇的浓度为25％(w/v)。虽然在注射高浓度的甘露醇后等待2min，BBB可以得到最好程度的开放，但由于甘露醇本身的利尿作用，使得注射高浓度的甘露醇后会因导致的动物体液代谢而造成部分甘露醇的损失，以致影响其对BBB开放的效果。因此，在病毒制剂储存液中添加3-7％(w/v)的甘露醇不仅可以提高病毒颗粒的稳定性，而且可以预测在病毒储存液中的甘露醇可以在一定程度上及时补充由于体液代谢所致的甘露醇流失部分，帮助维持己形成的脑部星型胶质细胞间隙，进而促进BBB的稳定开放；并且根据相似相溶、系统类似的一般实验原则，在注射25％甘露醇，等待2min开放BBB后，所导入的含有3-7％(w/v)甘露醇的病毒载体制剂在管路中与先前导入的溶剂应具有更好的溶解特性，因而，可促进重组病毒的有效导入。在本发明的技术方案中，采用在1min内将高渗溶液注射完毕，然后等待2min，再将病毒载体制剂导入，以有效的导入重组病毒。

神经营养因子是一类由神经元、神经支配的靶组织或胶质细胞产生的的活性蛋白，该家族因子主要包括：神经生长因子(NGF)，脑源神经营养因子(BDNF)，胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)，胰岛素样生长因子1(IGF1)，神经营养素3(NT-3)，神经营养素(NT4/5)，睫状神经营养因子(CNTF)等。该家族的因子分别对黑质多巴胺能神经元，基底前脑和纹状体胆碱能神经元，运动神经元，感觉神经元，交感神经元，背根节神经元，结状神经节神经元等均有一定作用和生理活性，诸如能促进中枢和外周神经元分化、生长、维持各类神经元的存活，以及神经元损伤后的修复，使培养的运动神经元存活数目增多，防止发育期运动神经元的程序化死亡，以及轴突切断引起的运动神经元死亡或萎缩等作用，因而，它们在众多靶神经元的系统发育和生理功能维持中具有重要作用。这些神经营养因子家族成员在神经系统疾病，尤其是在以治疗运动神经元病变，脊髓损伤，神经系统退行性疾病，老年神经系统退行性病变等为目的动物模型、临床中虽然开展了广泛研究，并已取得令人鼓舞的结果、进展，但由于BBB的存在，神经营养因子家族成员在中枢神经系统疾病中的治疗应用研究一直进展缓慢。因此，本发明通过研究发现，通过采用甘露醇高渗溶液可逆开放BBB的技术方案，可用腺相关病毒作为载体携带上述各种神经营养因子家族，获得重组腺相关病毒载体通过基因治疗导入中枢神经系统，而有效的预防和/或治疗中枢神经元退行性病变，脑缺血损伤、脑外伤、脑手术创伤后减少神经元死亡或促进脑功能恢复，以及用于幼儿宫内窒息、难产时脑缺氧损伤后预防脑损伤性智力低下或脑发育不良。

本发明的另一目的在于提供所述的药物组合物在预防和治疗阿尔茨海默氏病、帕金森氏病等中枢神经元退行性疾病中的用途；且所述的药物组合物还可用于脑缺血损伤、脑外伤、脑手术创伤后减少神经元死亡，促进脑功能恢复；以及用于幼儿宫内窒息、难产等脑缺氧损伤后预防脑损伤性智力低下或脑发育不良。

本发明还涉及一种高效而又对脑无创伤的在脑内直接导入rAAV-NGF基因的方法，特别是利用对人脑无害的高渗溶液将rAAV-NGF基因直接导入脑内的方法。

通常的基因治疗都是将表达基因的载体，如AAV-NGF通过颅内立体定位方式导入大脑。本发明在国际上首次通过短暂开放血脑屏障的方法，将AAV-NGF导入大鼠的大脑，并获得了外源基因的脑内、特别是胆碱能神经元区的高表达。该方法的优势在于不必开颅和立体定位，因而更易被患者和家属接受。

由于血脑屏障的影响，神经营养因子的应用受到了一定限制，外周给以神经营养因子难以透过血脑屏障，影响疗效；而中枢给药技术复杂、损伤大，病人难以接受，而且难以施行。微泵灌注、微囊化缓释生物多聚体或产神经营养因子细胞脑内植入或病毒载体介导的神经营养因子基因脑内直接注射，均为创伤性方法，存在着脑损伤和感染的危险性，病人难以接受；蛋白载体介导的神经营养因子导入方法，需每天给药，不适合于慢性病的治疗；小分子诱导脑内生成神经营养因子的药物的研究尚不成熟。本发明在临床上可通过经桡动脉插管，进入颈总动脉后直接导入载体，无须手术，基本无创，而且数月一次，是临床上病人可接受的方法。这种介入治疗方法是心血管系统疾病的成熟的治疗手段，其安全性已有大量临床资料证明。导入过程简单，可反复进行，对脑无创伤，无危险，病人易于接受；导入后神经营养因子基因在脑神经细胞内高效表达且可持续9个月以上，给药次数少，从而降低了治疗成本。是对阿尔茨海默氏病等中枢神经元退性形病变基因治疗的一大贡献。

本发明的方法是经颈动脉用高渗法诱导血脑屏障开放，并将神经营养因子基因经颈动脉注射入血液后令其直接进入脑组织，在脑神经细胞中获高效表达。

本发明的rAAV-神经营养因子基因导入脑内的过程如下：

1、颈动脉插管：大鼠，雄性，18月龄以上，戊巴比妥钠33mg/kg ip麻醉，颈部剪毛。碘伏消毒皮肤。沿颈正中线切开皮肤。钝性分离左颈总动脉和左颈外动脉。左颈总动脉近心端用丝线结扎，远心端夹一动脉夹。

切开颈颈外动脉，经颈外动脉插一塑料导管(此导管用100U/ml肝素抗凝)，结扎固定导管。

2、高渗溶液灌注：打开颈动脉夹，用微量输液泵输入高渗溶液，如25％甘露醇(预热至37℃)，0.12ml/s，共30s，使血脑屏障开放。

3、经颈动脉导入治疗基因：高渗溶液如甘露醇灌注后即刻或2-4min之间，取rAAV-神经营养因子基因1ml(1×10¹²PV)，经大鼠颈动脉缓慢注入(共1min)。

结扎颈外动脉，开放颈外动脉令大脑恢复血流灌注。缝合皮肤。动物常规饲养。

          老年大鼠(18月龄)，戊巴比妥钠麻醉

                         ↓

          分离颈外动脉、颈总动脉、颈内动脉

                         ↓

            经颈外动脉插管，进入颈内动脉

                         ↓

                  阻断颈总动脉血流

                         ↓

      经插管输入高渗溶液，如25％甘露醇3ml(35s)

                         ↓  输入高渗溶液如甘露醇后2min时开始输入rAAV-神经营养因子1

                     ml(1min)

                         ↓

           开放颈总动脉血流，结扎颈外动脉

                         ↓

                 缝合皮肤，导入完毕

本发明的rAAV-神经营养因子基因导入脑内的方法可用于：(1)，将神经营养因子基因导入脑组织内，用于预防和治疗阿尔茨海默氏病、帕金森氏病等中枢神经元退性形病变；(2)在脑缺血损伤、脑外伤、脑手术创伤后减少神经元死亡，促进脑功能恢复；(3)用于幼儿宫内窒息、难产等脑缺氧损伤后预防脑损伤性智力低下或脑发育不良。

除非另有说明，本发明所涉及的组分的浓度百分比均为重量体积百分比(w/v％)。

附图说明

图1：SDS-PAGE电泳所测定的重组病毒rAAV-2/hNGFβ外壳蛋白分子量及纯度

第1泳道：分子量标准；第2泳道：重组病毒rAAV-2/hNGFβ外壳蛋白

图2：离子交换色谱(TSK gel SP-NPR strong cation-exchange column)所测定的重组病毒rAAV-2/hNGFβ颗粒的纯度。可见，病毒颗粒单一峰，无其他杂质峰出现。

图3：重组病毒rAAV-2/hNGFβ体外感染BHK-21细胞后，细胞上清中hNGFβ的含量测定结果。其中^*P＜0.01vs对照组p，^ΔP＜0.05vs MOI 2.5×10⁴。

图4：重组病毒rAAV-2/hNGFβ体外感染BHK-21细胞后，鸡胚背根神经节法测定上清中hNGFβ生物学活性(×400)结果。

A：阴性对照，可见神经节附着在培养基质上，但并无神经纤维生长；

B：与重组病毒rAAV-2/hNGFβ以MOI 1.0×10⁶vg/cell感染的BHK-21细胞后上清共培养的鸡胚背根神经节，可见神经纤维生长(×400)。

图5：甘露醇诱导血脑屏障开放后导入重组病毒rAAV-2/GFP(绿色荧光蛋白)表达60天，以激光共聚焦显微镜检测导入组大鼠脑切片中的绿色荧光蛋白表达(×100)结果。

A：血脑屏障开放后病毒导入侧左侧大脑切片，可见较多绿色荧光蛋白表达；

B：血脑屏障开放后非病毒导入侧右侧大脑切片，可见一些绿色荧光蛋白表达；

C：血脑屏障开放阴性对照。

图6：甘露醇诱导血脑屏障开放后导入重组病毒rAAV-2/GFP表达60天，以激光共聚焦显微镜扫描检测病毒导入侧单个神经细胞，可见绿色荧光蛋白于神经细胞胞浆表达(×400)结果。

A：甘露醇诱导血脑屏障开放后，导入侧单个神经细胞；

B：表示阴性对照。

图7：甘露醇诱导血脑屏障开放后导入重组病毒rAAV-2/GFP表达60天，以激光共聚焦显微镜检测病毒导入组肝脏切片(×100)结果。

A：病毒导入组肝脏切片中绿色荧光蛋白表达；

B：阴性对照。

具体实施方式

以下将结合实施例具体说明本发明，本发明的实施例仅用于说明本发明的技术方案，并非限定本发明的实质。并且在如下实施例中，未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法。

实施例1  载体构建

首先抽提人肝组织总RNA，RT-PCR扩增得到人hNGFβcDNA(mRNA纯化及RT-PCR试剂盒购自美国Promega公司)，PCR引物为：5’-ACGCGTCGACAGAGAGCGCTGGGA  GCCGGA-3’，5’-ACGCGTCGACGCTTCCAAAAATTTAATAAAT-3’，扩增片段长度为1067bp，与质粒pUC18连接得到重组克隆质粒pUC18/hNGFβ，DNA序列测定证实其核苷酸序列与文献记载相一致。hNGFβ基因与rAAV-2通用载体质粒pSNAV-1(Wu ZJ，Wu XB，HOU YD，Chin J virol 2000；16：1-6.)连接得到重组载体质粒pSNAV-l/hNGFβ，并以该质粒转染BHK-21细胞，在G418(新霉素)压力下筛选得到携带载体质粒pSNAV-1/hNGFβ3的载体细胞株SN，扩大培养后在辅助病毒HSV1-rc/AUL2(含有编码病毒复制、包装必需蛋白的rep、cap基因)的参与下包装病毒，最终纯化(Wu XB，Dong XY，Wu ZJ，et al.，Chin Sci Bull 2000；45：2071-2075.)得到具有感染性的成熟病毒rAAV-2/hNGFβ。

携带绿色荧光蛋白(GFP)报告基因的重组腺相关病毒rAAV-2/GFP构建及纯化方法同上。

以SDS-PAGE电泳(Bio-rad Mini PROTEAN，USA)和HPLC法(Waters2690，USA，TSK gel SP-NPR阳离子交换柱，Japan)(Debelak D，Fisher J，IulianoS，et al.，Journal of Chromatography B 2000；740：195-202.)对所获得的rAAV-2/hNGFβ和rAAV-2/GFP进行纯度测定。病毒颗粒数的测定采用DNA斑点杂交法(Debelak D，Fisher J，Iuliano S，et al.，Journal of Chromatography B2000；740：195-202.)，以启动子为模板合成探针，分别以携带表达盒的载体质粒作为阳性对照来杂交，用凝胶成相系统及软件(Amersham pharmacia biotech，ImageMaster VDS，USA)对阳性对照曲线和待测样品的杂交信号进行了量化，以杂交信号的强度分析判定病毒颗粒数。

经SDS-PAGE电泳检测，rAAV-2/hNGFβ外壳蛋白VP1、VP2、VP3的分子量分别为87kD、72kD、62kD，三种外壳蛋白总量占总蛋白量百分比大于98％(见图1)。rAAV-2/hNGFβ病毒颗粒经TSK gel SP-NPR强阳离子交换柱分析后，样品主峰保留时间为12.5min，病毒颗粒HPLC纯度大于98％(见图2)。点杂交后，用凝胶成相系统对杂交信号强度进行量化分析，经确定rAAV-2/hNGFβ与rAAV-2/GFP病毒颗粒数均为1.0×10¹²vg/ml。

实施例2  rAAV-2/hNGFβ体外表达及生物学活性测定

1.体外表达

rAAV-2/hNGFβ转导细胞的能力是通过感染BHK-21细胞后，测定细胞上清中hNGFβ含量和生物学活性来确定的。以含10％小牛血清(小牛血清为HyClone公司产品)的1640培养基(RPMI 1640培养基购自美国GIBCO公司)，于37℃，5％CO₂条件下培养BHK-21细胞。BHK-21细胞按4×10⁵/孔接入六孔板，8h后按MOI 2.5×10⁴与1.0×10⁶加入重组rAAV-2/hNGFβ病毒颗粒。加入病毒颗粒前细胞先用新鲜无血清的1640洗两遍。并以无血清的1640调节好病毒与细胞的比例(MOI)，然后以无血清1640将终体积补足为1ml，加入已清洗备用的6孔板细胞中；并在37℃，5％CO₂条件下培养，让病毒吸附于细胞。病毒吸附1h后，加入1ml含10％血清的1640，加毒后每24h吸取培养上清，连续取样3天。然后，采用ELISA(美国Chemicon公司)检测细胞上清中hNGFβ含量，操作方法详见说明书，并采用t检验对表达量测定结果进行统计分析。

2.体外生物学活性测定

于25cm²细胞培养瓶中接种BHK-21细胞3.0×10⁶/瓶，24h后细胞先以新鲜无血清的1640洗三遍，并以无血清的1640调节好病毒与细胞的比例(MOI 1.0×10⁶)，然后以无血清的1640将终体积补足为1ml，将这1ml含有rAAV-2/hNGFβ病毒颗粒的1640培养液充分混匀，加入已清洗备用的细胞培养瓶中；并在37℃，5％CO₂条件下培养，让病毒吸附于细胞。1h后加入2ml含10％牛血清的1640。培养过夜后弃去含牛血清的培养液，以新鲜无血清的1640充分清洗三遍后，加入3ml无血清的1640培养72小时，吸取培养上清立即以鸡胚背根神经节法(参见WANG JZ eds.Research，development and quality control ofbio-pharmaceutics.1st ed.Beiiing：Science press；2002：476-478.)进行NGF的生物学活性测定。

结果表明：rAAV-2/hNGFβ体外转导BHK-21细胞后，在连续3天的表达量测定中，MOI 2.5×10⁴和1.0×10⁶两组均在第二天达到最高，分别为115.0±31.8pg/ml和188.0±28.6pg/ml(见图3)；在连续3天的测定中，不同MOI病毒感染组hNGFβ表达量经过T检验统计，均比对照组有极显著提高，P＜0.01；并且在对第2、3天测定结果的进行T检验统计中发现，MOI 1.00E+06组hNGFβ表达量较MOI 2.50E+04组有显著提高，P＜0.05。此结果提示腺相关病毒载体于体外可以介导基因表达，并且表达在病毒感染第1天后逐渐达到高峰。鸡胚背根神经节法测定证明，rAAV-2/hNGFβ以MOI 1.0×10⁶感染BHK-21组无血清表达上清可刺激神经节生长(见图4)。

实施例3  影响甘露醇诱导BBB开放的因素

1、甘露醇浓度的影响：甘露醇的适宜浓度为22-28％(w/v)

采用Wistar大鼠为实验动物，体重为250g±20g，♀♂均用。(n＝20，每组5只)4组大鼠以37℃，0.12ml·s^-1，30s的速度输入浓度分别为20％、22％、25％、28％的甘露醇后2min时，给EB组的左侧蓝染区灰度分别为181.5±1.41、115.5±1.32、81.1±1.21和80.25±1.46，左脑蓝染面积百分比(％)分别为32.42±1.12、49.85±1.70、92.10±1.50、94.31±1.32。但见给予28％甘露醇组大鼠有出血点，且28％甘露醇更易在室温时析出，说明在以37℃，0.12ml·s^-1，30s给予上述不同浓度的甘露醇，可见，注射给予25％甘露醇后等待2min时，对BBB的开放程度最好。

2、输入甘露醇的速度：

0.10ml·s^-1-0.15ml·s^-1，输入时间为40-25sec，当输入速度减慢或输入时间缩短以后，BBB的开放程度降低。

3、输入甘露醇后的保留时间：适宜时间为1-6min

采用Wistar大鼠为实验动物，体重为250g±20g，♀♂均用。(n＝40，每组5只)8组大鼠分别为输入25％甘露醇(37℃，0.12ml·s^-1，30s)后0、1、2、4、5、6、8、10min时给EB(2mg·kg^-1，1min内推完)，以比较不同保留时间对甘露醇诱导BBB开放作用的影响。结果，6组大鼠大脑均有不同程度的蓝染，左侧蓝染区灰度分别为120.0±1.39、114.11±1.42、81.1±1.21、100.0±1.36、108.0±1.16、110.0±1.12、106.5±1.40、122.0±1.47。左脑蓝染面积百分比(％)分别为24.11±1.46、62.3.11±2.18、96.07±1.90、85.21±1.19、80.16±1.10、79.41±1.40、43.34±1.20、19.13±1.20。以上结果说明：输入25％的甘露醇后1-6min内，BBB开放程度均大于50％，且在输入甘露醇后2min时左脑蓝染面积最大，灰度最小，说明在给25％甘露醇(37℃，0.12ml·s^-1，30s)后2min时对BBB的开放程度最好。

4、实验温度：

溶液适宜预热温度为35℃-39℃，在此温度范围内实验动物存活率较好(80-90％)，低于此温度实验动物存活率约为60-70％；其中以37℃为最佳。

适宜环境温度为22℃-26℃：在此温度范围内浓度为22％-28％(w/v)的甘露醇维持溶液状态，不会析出，其中以25℃为最佳。

上述结果表明，影响甘露醇诱导BBB开放的因素有以下四方面因素：甘露醇的浓度、输入甘露醇的速度和时间、输入甘露醇后的保留时间、实验温度。对输入甘露醇的耐受性与动物的体重有关而和性别无关。甘露醇诱导BBB开放的最佳条件为：环境温度25℃，25％(w/v)甘露醇溶液预热温度37℃，以0.12ml·s^-1输入30sec、等待2min后导入重组病毒或相关治疗药品。

实施例4  高渗溶液开放大鼠血脑屏障后，rAAV-2载体介导基因在中枢神经系统的表达

成年Wistar大鼠15只，体重275g±25g，♀♂均用(实验大鼠由国家实验动物中心提供)。以戊巴比妥钠麻醉后(27mg/kg ip)，沿颈正中线切开皮肤，钝性分离左颈总动脉和左颈外动脉(单侧)。左颈总动脉近心端用丝线结扎，远心端夹一动脉夹。切开颈外动脉，经颈外动脉插一塑料导管，此导管用1×10²U/ml肝素抗凝，结扎固定导管。以流速0.12ml/s，用微量输液泵输入预热至37℃的25％(w/v)的甘露醇水溶液，共30s(Doran SE，Xiao DR，Lorris-BetzA，et al.，Neurosurgery 1995；36：965-969；Muldoon LL，Nilaver G，Kroll R.A.，etal.，Am J Pathology 1995；147：1840-1851)。甘露醇注入后等待2min，以颈动脉插管的方式将1.5ml含有rAAV-2/hNGFβ(1.5×10¹² vg，n＝4)或rAAV-2/GFP(1.5×10¹² vg，n＝5)病毒的生理盐水导入大鼠脑内，并于1min注射完毕。对照组大鼠(n＝6)则以相同速度和时间，头向于颈动脉内注入37℃的生理盐水。大鼠注射完毕后缝合，并观察手术后状态。术后60天，注射过量戊巴比妥钠处死动物，取rAAV-2/hNGFβ导入组的大鼠脑沿大脑纵裂切开，左、右脑称重后分别按重量体积比1∶3加入冰浴匀浆缓冲液(按试剂说明书配制)，以超声波匀浆，匀浆液于12,000r/min离心30min离心后，用ELISA检测匀浆液离心上清中的hNGFβ含量，并采用t检验对hNGFβ含量测定结果进行统计分析。对rAAV-2/GFP导入组的大鼠脑组织、肝脏以100μm间隔进行连续冰冻切片，用激光共聚焦显微镜观察GFP表达情况(Leica TCS NT，German)。

        表1.rAAV-2/hNGFβ病毒导入后60天各组大鼠脑组织hNGFβ表达含量比较

组别 导入条件 右侧脑(非导入 侧)hNGFβ含量 pg/ml  左侧脑(导入  侧)hNGFβ含  量pg/ml 全脑hNGFβ 含量pg/ml未开放血脑屏障 1：NS+ NS 100.14±82.97  68.89±30.78 169.03±89.14(注射生理盐水NS) 2：NS+ rAAV2/hN GFβ 54.44±38.34^a  45.45±30.92^a 99.88±54.58^a开放血脑屏障组 3：Mannitol + NS 218.15±24.23  231.43±16.46 449.59±33.44(注射甘露醇) 4：Mannitol + rAAV2/hN GFβ 306.15±66.38^ei  330.02±  75.56^ei 636.17± 140.57^ei

备注：^aP＞0.05，^bp＜0.05，^cP＜0.01 vs Group 1；

      ^dp＞0.05，^eP＜0.05，^fP＜O.01 vs Group 3；

      ^gP＞0.05，^hp＜0.05，ⁱp＜0.01 vs Group 2；

结果表明，甘露醇诱导血脑屏障开放后，导入重组病毒rAAV-2/hNGFβ的大鼠脑组织中的hNGFβ含量较血脑屏障开放对照组明显提高，全脑hNGFβ表达可达636.2pg/ml。导入侧左脑相对于非导入侧右脑的hNGFβ含量有一定提高P＞0.05；右侧脑、导入侧左脑、全脑的hNGFβ含量较血脑屏障开放对照组均有显著提高，P＜0.05(见表1)。

激光共聚集荧光显微镜扫描(100×，激发波长465±10nm)观察rAAV-2/GFP导入组脑组织切片，可见：病毒导入组导入侧左脑有较多GFP表达，病毒导入组非导入侧右脑也有GFP表达，但相对导入侧左脑GFP表达量低(见图5.)。导入侧左脑单神经细胞核断层扫描结果可见：GFP表达主要位于神经细胞胞浆内(见图6.)。以上结果说明，甘露醇诱导血脑屏障开放时，rAAV-2/hNGFβ亦可透过血脑屏障间隙进入中枢神经系统表达。

此外，rAAV-2/GFP导入组肝脏切片经激光共聚集荧光显微镜扫描，可观察到在肝脏有GFP表达(见图7)。此结果提示颈动脉插管导入rAAV-2/GFP后，有部分病毒会随血液流经至机体其他部分。

rAAV-2/GFP与rAAV-2/hNGFβ病毒在颗粒大小、病毒外壳蛋白组成及结构、病毒颗粒带电性、病毒重组基因结构等理化特性指标上完全一致，只是所含表达盒不同。将rAAV-2/GFP与rAAV-2/hNGFβ以相同方法开放血脑屏障后导入中枢神经系统后，GFP在脑组织中的表达位置及分布情况，可以更加直观的从另一角度证明rAAV-2/hNGFβ可在甘露醇开放血脑屏障后在中枢神经系统的分布和表达。

实施例5  开放大鼠血脑屏障后rAAV-2/hNGFβ病毒导入组安全性评价

病毒导入后第60天，称大鼠体重、采血进行血液生化、血液学检测后，将大鼠处死分离各组大鼠脏器进行病理检查。并以PCR(ASTEC PC-801，Japan)方法初步测定rAAV-2病毒载体在大鼠脑、心、肝、性腺中的生物分布，所用引物为针对rAAV-2病毒载体的特征序列ITR-CMV，引物序列为(正向引物：r5-CTCCATCACTAGGGGTTCCT-3’，反向引物：5-CTTATATAGACCTCCCACC-3’)，扩增条件为：(1)94℃5min；(2)94℃，30s；55℃，30s；72℃，1min；30cycles(3)72℃，5min。

结果表明，rAAV-2/hNGFβ颈动脉插管导入大鼠脑内60天后，经体重变化、血液生化学(包括丙氨酸氨基转移酶、碱性磷酸酶、血尿氮等)、血液学指标(包括红细胞、白细胞、血红蛋白单核细胞分化等)和脏器病检，病毒导入组与对照组检测结果无显著差异(P＞0.05，数据略)，初步证明rAAV-2/hNGFβ导入大鼠脑内表达后没有引起异常。在甘露醇诱导血脑屏障开放后，PCR方法检测rAAV-2病毒载体是否可被递送至非靶器官(即生物分布)的结果发现，该组的4只动物中的脑、心脏、肝脏、性腺中载体阳性检出的数量分别为4，3，2，1。

实施例6  5％的甘露醇对高浓度重组病毒AAV-2/hNGFβ注射液稳定性的影响

1、长期性试验：考察重组病毒分别在2-8℃和-20℃条件下的稳定性将经浓缩和初步纯化了的AAV-2/hNGFβ病毒通过亲和层析、阴离子交换层析和分子筛层析进行纯化获得重组AAV-2/hNGFβ病毒。用-20℃预冷无水乙醇与所需浓缩的样品AAV-2/hNGFβ的量以3∶1的体积比混合，-20℃放置1-2h，15000rpm/min，4℃离心20min，弃上清，待残余乙醇基本挥发后，加入相应体积的保存液(即含有5％甘露醇的保存液2，或不含有甘露醇的保存液1)溶解沉淀，0.22μml滤膜过滤除菌储存。

供试品：保存液1(NaCl：8g；Na₂HPO₄·12H₂O：29g；KCl：0.2g；KH₂PO₄：0.2g；加适量注射用水溶解，定容至1000ml。)、保存液2(甘露醇50g，NaCl：8g，Na₂HPO₄·12H₂O：29g，KCl：0.2g，KH₂PO₄：0.2g，加适量注射用水溶解，定容至1000ml)，配方各3批。

存放温度：分别在2-8℃和-20℃下存放

存放时间：2年

检测时间：0-3个月：每月检测一次；

          第4-12月：每3个月检测一次；

          第12-24月：每6个月检测一次。

检测项目：外观性状、pH值、无菌试验、滴度测定、BCA测蛋白、电泳纯度、体外表达、高效液相、电镜。

(1)外观性状

参照中华人民共和国药典2000版附录IXB，附录68的方法进行。

(2)pH值

仪器：瑞士Metrohm pH计

方法：按仪器操作说明书进行。

(3)BCA测蛋白

材料：PIERCE公司的BCA蛋白检测试剂盒(NO.23225)

酶标仪：Wellscan MK3型酶标仪

方法：以PIERCE公司BCA蛋白检测试剂盒(No.23225)的方法进行。将标准蛋白稀释配制成标准浓度系列，与样品同时显色30分钟，酶标仪读数(λ＝570nm)，据标准曲线和样品的吸光值求出样品的蛋白浓度。

(4)无菌检查

按照《生物制品的无菌试验检定规程》进行。

(5)电泳纯度

材料：电泳仪：DYY-III-8B型稳压稳流电泳仪

凝胶成像系统：Alphalmager型成像系统

分子量标准蛋白：华美(MG0041)

方法：采用SDS-PAGE法。分离胶12％，浓缩胶5％(配制方法见《分子克隆》第二版)。恒流8mA，电泳约2小时。电泳后用考马斯亮蓝染色，应见AAV-2外壳蛋白VP1、VP2、VP3(87KD、72KD、62KD)三条主带。用凝胶成像系统分析扫描后计算VP1、VP2、VP3蛋白总量占总蛋白量的百分比。

(6)滴度测定

材料：Roche公司地高辛DNA标记和检测试剂盒(Cat.No.1093657)Roche公司正电荷标记尼龙膜

方法：以Roche公司地高辛DNA标记和检测试剂盒(Cat.No.1093657)的方法进行，以系列稀释的质粒pSNAV-1/hNGFβ为标准对照，将样品的杂交信号与标准对照进行比较、定量。

(7)体外表达

材料：细胞培养用小牛血清，购自Gibco公司。

ELISA检测试剂：ELISA(美国Chemicon公司)检测细胞上清中hNGFβ含量，操作方法详见说明书。

方法：BHK-21细胞按2×10⁵/孔接入六孔板，加含10％小牛血清的1640培养24小时后计数，按1×10⁵MOI加入重组AAV-2/hNGFβ病毒颗粒。加毒前先用新鲜无血清的1640洗两遍，然后加入1ml无血清1640，病毒吸附5小时后，加入1ml含10％小牛血清的1640，加毒后48小时吸取培养上清作ELISA检测hNGFβ表达。

(8)电镜

方法：用钨酸盐进行负染，滴于200目铜网上，在电子显微镜下观察，照相(本项目委托预科院病毒研究所检查)。

(9)高效液相

仪器：HPLC Agilent 1100，0.58mlTSKgel SP-NPR(Tosohaas)离子交换柱。

试剂：

BufferA：50mM Hepes，1mM EDTA，5Mm MgCl₂，100mM NaCl，pH 7.5。

Buffer B：50mM Hepes，1mM EDTA，5Mm MgCl₂，500mM NaCl，pH 7.5。

方法：流速1ml/min，Buffer A充分对柱平衡，上样100ul。记录病毒峰的面积占总面积的百分率。

注：无菌试验于整个试验的开始和结束时检测，体外表达在第1、2个月，电镜和高效液相在第1、2、3个月不考察。

在2-8℃的温度条件下放置6个月，20010908-M、20010909-M、20010910-M(5％甘露醇保存液)三批样品在外观性状均为无色透明液体，无异物，未见明显沉淀，该制剂在2-8℃条件下肉眼观察没有明显病毒聚集。pH值在一个很小的变化范围内波动，制剂的内部酸碱度没有发生明显改变。制剂蛋白含量无明显变化，SDS-PAGE电泳纯度、HPLC纯度均在95.0％以上，证明了病毒外壳蛋白无降解，且6个月内电镜观察观察病毒颗粒的结构完整。制剂活性检测结果(体外表达)没有明显降低，均在20ng/ml以上，在2-8℃的温度条件下放置6个月的rAAV-2/hNGFβ注射液的稳定性良好。而没有加入5％甘露醇由常规保存液的三批样品20010908、20010909、20010910在2-8℃的温度条件下放置6个月，在三批样品的外观检测中，每批均有部分样品出现有微量絮状沉淀，除pH值、蛋白含量外，该3批HPLC纯度、活性(体外表达)等方面均有不同程度降低，以此初步推断，甘露醇具有一定阻止高浓度病毒颗粒聚集、沉淀的作用，并且其在保存液中的存在不影响病毒的理化、感染特性。

在-20℃的温度条件下放置6个月，20010908-M、20010909-M、20010910-M(5％甘露醇保存液)三批样品在外观性状均为无色透明液体，无异物，未见明显沉淀，该制剂其他特性与在2-8℃的温度条件下放置6个月后的结果基本相当。而没有加入5％甘露醇由常规保存液的三批样品20010908、20010909、20010910在-20℃的温度条件下放置6个月时肉眼观察可见有微量絮状沉淀，可能是在-20℃、一定时间条件下病毒颗粒有微量聚集所致，但其pH值在一个很小的变化范围内波动，该条件下该制剂的内部酸碱度稳定。该三批样品的HPLC纯度、活性(体外表达)等方面均有不同程度降低，以此初步推断，甘露醇具有一定阻止高浓度病毒颗粒聚集、沉淀的作用，并且其在保存液中的存在不影响病毒的理化、感染特性。

2、加速试验

供试品：保存液1、2配方(配方同上)各3批，

存放温度：25±2℃

存放时间：6个月

检测时间：每月检测一次

检测项目：外观性状、pH值、无菌试验、滴度测定、BCA测蛋白、电泳纯度、体外表达、高效液相、电镜(检测方法同上)。

注：无菌试验于整个试验的开始和结束时检测，高效液相在第0、6月考察，电镜在第0、3、6月考察。

加速试验稳定性结果表明，在25±2℃的温度条件下放置6个月，不同储存液的各三批样品pH值在一个很小的变化范围内波动，该条件对其pH无影响，该制剂的内部酸碱度稳定。

外观性状上，在0-3个月均为无色透明液体，无异物。20010909、20010910-M在第4个月开始肉眼观察可见微量的絮状沉淀，20010908、20010910、20010908-M、20010909-M在第5个月开始有肉眼观察微量絮状沉淀，其原因可能是在该条件下病毒颗粒有聚集，该聚集情况与蛋白的浓度有一定关系，浓度越高，越容易聚集。

无菌试验在整个加速试验的开始和结束时均无菌生长，说明该条件下保证了样品的无菌，也保证了其他项目实验数据的可靠性。

蛋白浓度、电泳纯度、体外表达等项目随时间的延长，有一个逐步下降的趋势。可能是因为25±2℃条件下病毒颗粒有微量聚集，或有少量病毒外壳破裂，蛋白发生降解，蛋白浓度有一个缓慢的下降趋势，病毒基因拷贝数并无减少，故滴度下降不明显，但表达活性受病毒聚集的影响，病毒颗粒外壳蛋白降解的影响，所以活性降低，但总的说来，活性下降速度缓慢。

通过对批号为20010908、20010909、20010910、20010908-M、20010909-M、20010910-M的6批样品在不同温度条件下稳定性的考察，可以得出如下结论：

本发明纯化制备的高浓度rAAV-2/hNGFβ重组病毒(10¹³v.g/ml)制剂中，在其储存液中加入5％(w/v)甘露醇，可使重组病毒制剂在2～8℃和-20℃条件下长期保存，且稳定性良好。并且，含有5％(w/v)甘露醇的rAAV-2/hNGFβ注射液在25±2℃条件下，表现热稳定性较好，支持rAAV-2/hNGFβ注射液的有效期定为2年。贮存及运输条件在2～8℃或-20℃。