双环醇在制备预防和/或治疗急性酒精中毒和急慢性酒精性肝损伤药物中的应用

摘要

本发明公开了如通式(I)所示的双环醇在制备预防或治疗急性酒精中毒和急、慢性酒精性肝损伤的药物中的应用。

说明书

技术领域

本发明涉及双环醇在制备预防或治疗急性酒精中毒和急、慢性酒精性肝损伤的药物中的应用。

背景技术

酒精性肝病按其病理改变可分为酒精性脂肪肝，酒精性肝炎，酒精性肝硬化及酒精性肝硬化并发肝癌。近年来，随着人民生活水平的提高和饮酒消费量增大，酒精性肝病在我国有逐渐增加趋势，是目前仅次于病毒性肝炎的第二大肝病。

目前有关酒精性肝病的确切发生机制尚未完全清楚。一般认为，酒精性肝病的发生发展与酒精及其代谢物乙醛的毒性和随之导致的体内一系列生理、生化反应紊乱密切相关。

目前临床用于治疗酒精性肝病的主要措施是戒酒，药物治疗的种类十分有限。如秋水仙碱虽长期用药有一定疗效，但也存在一定毒性。因此，寻找有效、安全的抗酒精性肝病的药物仍为研究热点。

双环醇，化学名：4、4′-二甲氧基-2、3、2′、3′、-双(亚甲二氧基)-6-羟甲基-6′-甲氧羰基联苯，结构式为

为我所研制的我国一类抗肝炎新药。其肝保护和抗氧化作用在多种化学性、药物性、免疫性实验性肝损伤动物模型上都已得到证实。双环醇具有显著保肝作用并具有一定的抗肝炎病毒效果，对四氯化碳、D-半乳糖胺、扑热息痛引起的小鼠急性肝损伤以及小鼠免疫性肝炎等4种动物模型均有显著的降低升高的血清转氨酶作用，减轻肝脏组织病理形态学损害。此外，对大鼠慢性四氯化碳肝损伤模型，双环醇除有降低升高的血清转氨酶作用外，兼有改善血清白蛋白/球蛋白比值及肝脏脯氨酸含量的效果，即有减轻肝纤维化的作用。双环醇具有抑制乙肝病毒核心抗原(HBeAg)、乙肝病毒核糖核酸(HBV-DNA)及乙肝病毒表面抗原(HbsAg)分泌的效果在长期慢性毒性试验中未发现有毒性，亦无致畸和致突变的毒性。

临床研究结果表明：双环醇对慢性病毒性乙型肝炎和丙型肝炎患者均有很好的改善临床症状和降谷丙转氨酶(ALT)及谷草转氨酶(AST)作用，并可使部分病人的HBeAg、HBV-DNA阴转。疗效显著并无明显副作用，安全性及耐受性好。双环醇以“百赛诺”商品名于2001年获国家药品监督管理局颁发的新药证书，并于2001年10月正式投放市场。

但现有技术中没有双环醇对酒精中毒和酒精性肝损伤保护作用的记载。

发明内容

为了克服现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种预防或治疗急性酒精中毒和急、慢性酒精性肝损伤的化合物，

特别是提供了如通式(I)所示的双环醇

作为预防或治疗急性酒精中毒和急、慢性酒精性肝损伤的药物的应用。

本发明通过建立急性酒精中毒和急、慢性酒精性肝损伤模型，观察双环醇对酒精中毒和酒精性肝损伤的保护作用并探讨其作用机理。研究结果表明，双环醇对实验性急性酒精中毒和急慢性肝损伤具有良好的保护作用。

本发明通过使小鼠口服中毒剂量乙醇(50％，12-24ml/kg)或口服5％Liber-Decarli饲料全营养酒精液体饮食后，记录小鼠翻正反射消失时间、死亡率，测定血清谷丙转氨酶(ALT)、甘油三酯(TG)、胆固醇(CHOL)、高密度脂蛋白(HDL)和低密度脂蛋白LDL水平，肝脏脂质过氧化产物丙二醛(MDA)的生成和抗氧化物谷胱甘肽(GSH)含量，肝脏线粒体膜流动性和肿胀度，肝脏谷胱甘肽-巯基转移酶(GST)活性，血清乙醇脱氢酶(ADH)、乙醛脱氢酶(ALDH)以及血清乙醇浓度，肝脏NDMA-脱甲基酶活性和病理形态改变。

实验结果表明双环醇(150-300mg/kg)可明显降低乙醇引起的血清ALT，肝脏MDA和TG、CHOL、LDL的升高，减轻肝脏GSH和GST的下降，抑制乙醇引起的肝脏线粒体膜流动性下降和线粒体肿胀度上升，显著诱导HDL、ADH和ALDH，抑制升高的NDMA-脱甲基酶活性，降低血中乙醇浓度。此外，双环醇可缩短乙醇中毒引起的翻正反射消失时间，降低死亡率。

本发明可以得出以下结论：双环醇口服给药可明显降低乙醇中毒引起的小鼠死亡和肝损伤，改善肝脏脂肪性变，其保护作用与诱导体内抗氧化物GST和GSH，提高肝细胞抗氧化能力，保护线粒体损伤和功能，调控参与乙醇代谢的药物代谢酶，降低血醇浓度密切相关。

具体讲，本发明发现双环醇对急性乙醇中毒小鼠的保护作用。发明考察了双环醇对急性乙醇中毒小鼠睡眠时间延长的影响。试验动物灌胃50％乙醇16ml/kg后观察小鼠翻正反射消失和恢复时间，将间隔时间定为睡眠时间。结果表明，口服乙醇后，小鼠的睡眠时间长达3.6小时，而双环醇均可明显缩短乙醇引起的睡眠时间，并显示良好的剂量效应关系，其中大剂量组的平均睡眠时间仅为模型组的10％。

双环醇能降低乙醇中毒导致小鼠死亡的影响。试验动物灌胃50％乙醇24ml/kg，记录给乙醇后8，12，24小时动物的死亡数。结果标明，口服乙醇后8，12，24小时小鼠的死亡率分别为60％，80％，100％。口服双环醇可明显降低乙醇中毒小鼠的死亡率。

双环醇对乙醇引起的小鼠急性肝损伤具有保护作用。试验动物灌胃50％乙醇12ml/kg后6后，血清ALT明显升高(1.8倍)，肝脏TG增至正常对照的1.3倍，反映脂质过氧化损伤程度的MDA生成增加，同时肝脏抗氧化物GSH和GST分别降至正常的87％和77％。双环醇可明显抑制乙醇引起的ALT的升高和肝脏GSH的下降，还可降低升高的肝脏TG和MDA，使其恢复至正常水平。此外，大剂量双环醇可诱导肝脏GST，提高机体的抗氧化能力。

双环醇对小鼠急性酒精性肝损伤病理学的改变具有保护作用。灌胃56°白酒10天后，动物肝细胞，主要是中央静脉周围1-2层肝细胞出现肿胀、变圆，肝细胞胞浆疏松，部分肝胞浆内产生空泡，但肝细胞核未见明显改变。近半数模型组动物可见小灶性肝细胞(3-5个肝细胞)坏死，小灶性炎性细胞浸润，未见肝细胞脂肪变性和透明小体形成。而双环醇动物未见明显肝细胞损伤，与正常对照组比无显著差异。

实验动物口服乙醇后，血中乙醇迅速升高，是正常对照的35倍。双环醇可使升高的血醇浓度下降31％。对于乙醇代谢酶，双环醇可显著诱导肝脏ADH和ALDH活性，分别是正常对照组的215％和122％，同时可抑制NDMA-脱甲基酶活性，抑制率为21％。

由于酒精代谢过程中产生的自由基可损伤线粒体膜脂质，导致线粒体膜流动性下降。双环醇可明显改善酒精引起的线粒体膜偏振度和微粘度的升高。肝脏线粒体在高钙条件下肿胀度明显增大，而双环醇可使线粒体肿胀度明显降低，基本维持在正常水平，从而保证线粒体的正常功能。

双环醇对小鼠慢性酒精性肝损伤的保护作用。小鼠经5％酒精液体饮食喂养4周后，血清ALT水平明显上升。双环醇给药后，无论是治疗组还是预防组，ALT水平均恢复至正常水平，提示双环醇具有明显的抗酒精性肝损伤作用。

小鼠经含酒精液体饮食喂养4周后，不仅出现肝脏TG含量显著上升，而且可见血清CHOL、LDL、HDL轻度升高。与模型组相比，给药组肝脏TG，血清CHOL、LDL水平显著下降，血清HDL水平显著升高，提示双环醇能有效防止酒精引起的脂肪堆积，加速脂肪转运。

小鼠长期给予含酒精饮食后，不仅肝内GSH含量下降，而且GST和谷胱甘肽还原酶(GR)活性也明显降低。口服双环醇后，小鼠肝内GSH水平、GST活性恢复至正常水平，同时GR活性上升为对照组的1.2倍。上述结果提示，双环醇具有促进GSH再生，增强肝脏自由基清除能力的作用。

实验动物长期饲以乙醇后，诱导P450 2E1表达增强，可进一步导致脂质过氧化，加重肝损伤。本实验通过测定NDMA-DH间接反应P450 2E1活性。研究发现，双环醇能显著抑制长期摄入酒精引起的P450 2E1的活性增加，使该酶维持在正常水平。与急性酒精性肝损伤结果相似，双环醇能显著诱导ALDH活性，对胞浆ALDH活性诱导尤为明显(为模型组的2.9倍)，加速乙醛的清除，从而减轻由乙醛导致的肝损伤。此外，双环醇对ADH无影响。

双环醇对慢性酒精性肝损伤病理学改变具有保护作用。小鼠进食5％酒精液体饲料4周后可造成肝细胞脂肪变性，以小叶中央静脉肝细胞脂肪变最为严重。某些小叶中央静脉周围的肝细胞虽未发生脂肪变性，但肝细胞肿胀明显，胞浆疏松。此外，还观察到肝脏小静脉淤血等现象，但未见明显炎性细胞浸润及肝细胞坏死。双环醇给药后，肝细胞脂肪变性明显减轻，而且未出现肝细胞肿胀。

根据本发明还涉及含有作为活性成份的双环醇和常规药物赋形剂或辅剂的药物组合物。通常本发明药物组合物含有0.1-95重量％的双环醇。

含有本发明化合物的药物组合物可根据本领域公知的方法制备。用于此目的时，如果需要，可将本发明化合物与一种或多种固体或液体药物赋形剂和/或辅剂结合，制成可作为人药或兽药使用的适当的施用形式或剂量形式。

本发明化合物或含有它的药物组合物可以单位剂量形式给药，给药途径可为肠道或非肠道，如口服、肌肉、鼻腔、口腔粘膜、皮肤、透皮、皮下、皮内、腹膜、直肠、静脉内、肌内、鞘内、硬膜外、眼内、颅内、阴道给药等。

本发明化合物或含有它的药物组合物的给药途径可为注射给药。注射包括静脉注射、肌肉注射、皮下注射、皮内注射、穴位注射、鞘内注射和腹膜内注射等。

给药剂型可以是液体剂型、固体剂型。如液体剂型的溶液性质可以是真溶液类、胶体类、微粒剂型、乳剂剂型、混悬剂型。液体剂型形式可以是糖浆剂、酏剂、注射溶液、非水溶液、悬浮液或乳液；固体剂型例如片剂、锭剂、胶囊、滴丸、丸剂、粒剂、粉剂、霜剂、溶液剂、栓剂、可分散粉剂如冻干粉针剂、气雾剂等。

本发明化合物可以制成普通制剂、也可以是缓释制剂、控释制剂、靶向制剂及各种微粒给药系统。

为了将单位给药剂型制成片剂，可以广泛使用本领域公知的各种载体。关于载体的例子包括，赋形剂例如碳酸钙、乳糖、磷酸钙、磷酸钠；稀释剂与吸收剂例如淀粉、糊精、硫酸钙、乳糖、甘露醇、蔗糖、氯化钠、葡萄糖、尿素、碳酸钙、白陶土、微晶纤维素、硅酸铝、葡聚糖、胶态二氧化硅、阿拉伯胶、明胶、三硅酸镁、角蛋白等；湿润剂与粘合剂例如水、甘油、聚乙二醇、乙醇、丙醇、淀粉浆、糊精、糖浆、蜂蜜、葡萄糖溶液、阿拉伯胶浆、明胶浆、羧甲基纤维素钠、紫胶、甲基纤维素、磷酸钾、聚乙烯吡咯烷酮等；崩解剂例如干燥淀粉、海藻酸盐、琼脂粉、褐藻淀粉、碳酸氢钠与枸橼酸、碳酸钙、聚氧乙烯山梨糖醇脂肪酸酯、十二烷基磺酸钠、甲基纤维素、乙基纤维素等；崩解抑制剂，例如蔗糖、三硬脂酸甘油酯、可可脂、氢化油等；吸收促进剂，例如季铵盐、十二烷基硫酸钠等；润滑剂，例如滑石粉、三乙胺硬脂酸镁、三乙胺硬脂酸、二氧化硅、玉米淀粉、硬脂酸盐、硼酸、液体石蜡、聚乙二醇等。还可以将片剂进一步制成包衣片，例如糖包衣片、薄膜包衣片、肠溶包衣片，或双层片和多层片，以延迟其在胃肠道中的崩解和吸收，并由此提供在较长时间内的持续作用。

例如为了将给药单元制成丸剂，可以广泛使用本领域公知的各种载体。关于载体的例子是，例如稀释剂与吸收剂，如葡萄糖、乳糖、淀粉、可可脂、氢化植物油、聚乙烯吡咯烷酮、高岭土、滑石粉等；粘合剂，如阿拉伯胶、黄蓍胶、明胶、乙醇、蜂蜜、液糖、米糊或面糊等；崩解剂，如琼脂粉、干燥淀粉、海藻酸盐、十二烷基磺酸钠、甲基纤维素、乙基纤维素等。

例如为了将给药单元制成胶囊，将有效成分本发明化合物与上述的各种载体混合，并将由此得到的混合物置于硬的明胶胶囊或软胶囊中。也可将有效成分本发明化合物制成微囊剂，混悬于水性介质中形成混悬剂，亦可装入硬胶囊中或制成注射剂应用。

例如为了将给药单元制成口服液体制剂，包括乳液、溶液、悬浮液、糖浆等。合适的载体包括溶液、悬浮液、糖浆等，并任选含有添加剂例如润湿剂、乳化剂和悬浮剂、甜味剂、矫味剂和香料等。

例如，将本发明化合物制成注射用制剂，如溶液剂、混悬剂溶液剂、乳剂、冻干粉针剂，这种制剂可以是含水或非水的，可含一种和/或多种药效学上可接受的载体、稀释剂、粘合剂、润滑剂、防腐剂、表面活性剂或分散剂。如稀释剂可选自水、乙醇、聚乙二醇、1，3-丙二醇、乙氧基化的异硬脂醇、多氧化的异硬脂醇、植物油例如橄榄油和玉米油、明胶、和可注射有机酯例如油酸乙酯、聚氧乙烯山梨醇、脂肪酸酯等。这样的剂型还可以含有辅料例如防腐剂、润湿剂、乳化剂和分散剂。另外，为了制备等渗注射液，可以向注射用制剂中添加适量的氯化钠、葡萄糖或甘油，此外，还可以添加常规的助溶剂、缓冲剂、pH调节剂等。这些辅料是本领域常用的。

此外，如需要，也可以向药物制剂中添加着色剂、防腐剂、香料、矫味剂例如薄荷、冬青油等、甜味剂例如蔗糖、乳糖、糖精等或其它材料。

本发明所用的无菌介质都可以通过本领域技术人员众所周知的标准技术制得。可将它们灭菌，例如通过经由细菌过滤器过滤、通过向组合物中加入灭菌剂、通过将组合物放射处理、或通过将组合物加热宋灭菌。还可以在临用前将它们制成无菌可注射介质。

为达到用药目的，增强治疗效果，本发明的药物或药物组合物可用任何公知的给药方法给药。当然用于实施本发明的化合物的给药途径取决于疾病和需要治疗的部位。因为本发明化合物的药动学和药效学特征会有某种程度的不同，因此在组织中获得治疗浓度的最优选方法是逐渐增加剂量并监测临床效果。对于这样的逐渐增加治疗剂量，初始剂量将取决于给药途径。

对于任何特定患者，本发明化合物药物组合物的具体治疗有效剂量水平取决于许多因素，例如所要预防或治疗疾病的性质、疾病严重程度、给药途径、给药次数、治疗目的、该化合物的清除速度、治疗持续时间，该具体化合物联合或同时使用的具体药物，患者或动物的性别、年龄、体重、性格、饮食、个体反应以及一般健康状况等医药科学领域众所周知的因素，因此本发明的治疗剂量可以有大范围的变化。根据所治疗患者的病症，可能必须对剂量作出某些改变，并且在任何情况下，都由医师决定个体患者的合适剂量。

给药剂量是指不包括载体重量在内(当使用载体时)的化合物的重量。一般来讲，本发明中药学成分的使用剂量是本领域技术人员公知的。可以根据本发明化合物组合物中最后的制剂中所含有的实际药物数量，加以适当的调整，以达到其治疗有效量的要求，完成本发明的预防或治疗目的。可以是单一剂量形式给药或分成几个，例如二、三或四个剂量形式给药；这受限于给药医生的临床经验以及包括运用其它治疗手段的给药方案。本发明的化合物或组合物可单独服用，或与其他治疗药物或对症药物合并使用并调整剂量。

术语

Liber-Decarli全营养酒精液体饲料；

ALDH：乙醛脱氢酶；

ALT：谷丙转氨酶；

TG：甘油三酯；

CHOL：胆固醇；

HDL：高密度脂蛋白；

DL：低密度脂蛋白；

MDA：丙二醛；

GSH：谷胱甘肽；

GST：谷胱甘肽-巯基转移酶；

ADH：乙醇脱氢酶；

ALDH乙醛脱氢酶；

NDMA-DH：二甲基亚硝胺-脱甲基酶；

GR：谷胱甘肽还原酶

附图说明

图1双环醇对乙醇引起小鼠睡眠时间延长的影响

图2双环醇对乙醇中毒小鼠血中乙醇浓度的影响

图3双环醇对乙醇引起小鼠线粒体膜肿胀度改变的影响。结果以均数±SD表示。

图4双环醇对慢性酒精性肝损伤小鼠血清ALT升高的影响。结果以均值±SD表示。M：乙醇组T2/3：双环醇(200/300mg/kg)治疗组，Y2/3：Bicyclol(200/300mg/kg)预防组。##P＜0.01，与对照组相比^**P＜0.01，与模型组相比。

图5双环醇对小鼠慢性酒精性肝损伤肝脏TG升高的影响。结果以均值±SD。M：乙醇T2/3：(200/300mg/kg)双环醇治疗，Y2/3：双环醇(200/300mg/kg)预防。##P＜0.01与对照组相比，^*P＜0.05，^**P＜0.01与模型组相比。

图6双环醇对小鼠慢性酒精性肝损伤肝脏GSH下降的影响。结果以均值±SD。M：乙醇T2/3：(200/300mg/kg)双环醇治疗，Y2/3：双环醇(200/300mg/kg)预防，##P＜0.01与对照组相比，^*P＜0.05，^**P＜0.01与模型组相比。

图7双环醇对小鼠慢性酒精性肝损伤肝脏GST下降的影响。

图8双环醇对小鼠慢性酒精性肝损伤肝脏GR下降的影响。结果以均值±SD。M：乙醇T2/3：(200/300mg/kg)双环醇治疗，Y2/3：双环醇(200/300mg/kg)预防，##P＜0.01与对照组相比，^*P＜0.05，^**P＜0.01与模型组相比。

图9双环醇对小鼠慢性酒精性肝损伤肝胞浆NDMA-DH活性的影响。结果以均值±SD。M：乙醇T2/3：(200/300mg/kg)双环醇治疗，Y2/3：双环醇(200/300mg/kg)预防。##P＜0.01与对照组相比，^*P＜0.05，^**P＜0.01与模型组相比。

具体实施方式

下面的实施例可以帮助本领域的技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。

一.双环醇对急性乙醇中毒小鼠的保护作用

实施例1.双环醇对急性乙醇中毒小鼠睡眠时间延长的影响

雄性昆明种小鼠，体重22-24克，随机分为4组，每组10只，其中3组分别于实验首日下午和次日上下午口服双环醇75，150，300mg/kg。对照组给同体积赋形剂。各组动物禁食过夜后，灌胃50％乙醇16ml/kg。观察口服乙醇后小鼠翻正反射消失和恢复时间，将间隔时间定为睡眠时间。

结果表明，口服乙醇后，小鼠的睡眠时间长达3.6小时，双环醇150，300mg/kg均可明显缩短乙醇引起的睡眠时间，并显示良好的剂量效应关系，其中大剂量组的平均睡眠时间仅为模型组的10％。结果见图1。

实施例2.双环醇对乙醇中毒导致小鼠死亡的影响

雄性昆明种小鼠，体重22-24克，随机分为4组，每组10只，其中3组分别于实验首日下午和次日上下午口服双环醇100，200，300mg/kg，对照组给同体积赋形剂。各组动物禁食过夜后，灌胃50％乙醇24ml/kg，记录给乙醇后8，12，24小时动物的死亡数。结果如表1所示，口服乙醇后8，12，24小时小鼠的死亡率分别为60％，80％，100％。口服双环醇(200，300mg/kg)可明显降低乙醇中毒小鼠的死亡率。

               表1  双环醇对乙醇引起小鼠死亡的影响

            乙醇                双环醇        双环醇         双环醇

死亡率      50％24ml·kg^-1     100mg·kg^-1  200mg·kg^-1   300mg·kg^-1

给药后  8h  60％                50％          30％           0％^b

时间    12  80％                60％          30％a          0％^c

        24  100％               70％          40％b          10％^c

二.双环醇对乙醇引起小鼠急性肝损伤的保护作用

实施例3.双环醇对乙醇引起小鼠血清ALT、肝脏TG、MDA升高以及GSH、GST改变的影响

雄性昆明种小鼠，体重22-24克，随机分为5组，每组10只，其中3组分别于实验首日下午和次日上下午口服双环醇75，150，300mg/kg，对照组给同体积赋形剂。各组动物禁食过夜后，除正常对照组外，其余各组动物灌胃50％乙醇12ml/kg，对照组给同等能量的20％葡萄糖液。给乙醇后6小时将动物处死，取血清测定ALT，取肝脏测定TG、MDA和GSH以及GST含量。如表2所示，小鼠口服乙醇后，肝脏TG增至正常对照的1.3倍，血清ALT也明显升高(1.8倍)，反映脂质过氧化损伤程度的MDA生成增加，同时肝脏抗氧化物GSH和GST分别降至正常的87％和77％。双环醇(75，150，300mg/kg)可明显抑制乙醇引起的sALT的升高和肝脏GSH的下降。与此同时，双环醇(150，300mg/kg)还可降低升高的肝脏TG和MDA，使其恢复至正常水平。此外，大剂量双环醇可诱导肝脏GST，提高机体的抗氧化能力。

                             表2  双环醇对乙醇引起肝损伤小鼠肝脏TG，GSH；GST，MDA和

                                                血清ALT水平的影响

  组别  肝TG/   mg·dL^-1  ALT/U·dL^-1  MDA/   nmol·g^-1  GSH/   nmol·g^-1liver  GST/   nmol·min^-1·mg^-1prot  正常对照  乙醇50％   12ml·kg^-1  双环醇75   mg·kg^-1  双环醇150   mg·kg^-1  双环醇300   mg·kg^-1  290.8±62.3^a   377.0±30.0    368.8±42.4    226.6±53.3^c    225±22.7^c  31.10±7.58^c   55.42±8.37    31.10±5.58^c    30.70±7.58^c    28.71±5.18^c  45.50±6.77^a   57.24±6.12    53.90±2.56    41.30±7.62^b    37.31±4.41^c  5.17±0.41^a   4.51±0.48    5.90±0.63^c    6.41±0.84^c    7.61±0.71^c   85.57±6.74^a   65.48±19.46          114.58±11.14^c

a.P＜0.05，b P＜0.01，c P＜0.001，与模型组相比。

实施例4.双环醇对小鼠急性酒精性肝损伤病理学改变的保护作用

灌胃56°白酒10天后，动物肝细胞，主要是中央静脉周围1-2层肝细胞出现肿胀、变圆，肝细胞胞浆疏松，部分肝胞浆内产生空泡，但肝细胞核未见明显改变。近半数模型组动物可见小灶性肝细胞(3-5个肝细胞)坏死，小灶性炎性细胞浸润，未见肝细胞脂肪变性和透明小体形成。双环醇(300mg/kg)组动物未见明显肝细胞损伤，与正常对照组比无显著差异。

实施例5.双环醇对血中乙醇浓度和乙醇代谢酶的影响

(1)双环醇对小鼠血清乙醇浓度的影响

雄性昆明种小鼠，体重22-24克，随机分为3组，每组7只。给药组于实验首日下午和次日上下午口服双环醇300mg/kg，对照组给同体积赋形剂。末次给药后各组动物禁食过夜。次日晨除正常对照组外，其余动物口服50％乙醇16ml/kg。给乙醇后1小时将动物处死，取血测定乙醇含量。结果表明，口服乙醇后，血中乙醇迅速升高，是正常对照的35倍。双环醇可使升高的血醇浓度下降31％。

(2)双环醇对小鼠肝脏ADH、ALDH和NDMA-脱甲基酶活性的影响

雄性昆明种小鼠，体重22-24克，随机分为2组，每组10只。给药组分别于实验首日下午和次日上下午口服双环醇300mg/kg，对照组给同体积赋形剂。末次给药后各组动物禁食过夜。次日晨将动物断头处死，取肝脏测定ADH，ALDH和NDMA脱甲基酶活性。结果表明，双环醇可显著诱导肝脏ADH和ALDH活性，分别是正常对照组的215％和122％，同时可抑制NDMA-脱甲基酶活性，抑制率为21％。

表3  双环醇对小鼠肝脏ADH，ALDH and NDMA-脱甲基酶活性的影响

组别         ADH/nmol·min^-1·g^-1 NDMA demethylase          ALDH

             liver                  /nmol·min^-1·mg^-1pro   /μg·min^-1·mg^-1protein

                                    tein

对照         6.16±1.72             2.03±0.06                3.27±0.11

双环醇       13.25±0.56^c          1.61±0.13^c             4.02±0.52^b

300mg·kg^-1

实施例6.双环醇对小鼠肝线粒体功能完整性的影响

(1)双环醇对小鼠急性酒精性肝损伤引起的肝线粒体膜流动性下降的影响

雄性昆明种小鼠，体重22-24克，随机分为三组，每组10只。小鼠灌胃56°白酒10ml/kg后，由于酒精代谢过程中产生的自由基可损伤线粒体膜脂质，导致线粒体膜流动性下降。双环醇(200，300mg/kg)可明显改善酒精引起的线粒体膜偏振度和微粘度的升高。

表4  双环醇对乙醇引起小鼠线粒体膜流动性改变的影响

组别            P                    η

正常对照        0.164±0.02          1.12±0.23

乙醇            0.183±0.006^#       1.33±0.07^#

乙醇+双环醇

                0.170±0.01^*        1.17±0.15^*

(200mg/kg)

乙醇+双环醇

                0.173±0.007^**      1.21±0.08^**

(300mg/kg)

结果以均数±SD表示

#P＜0.05，与对照组相比

^*P＜0.05，^**P＜0.01与模型组相比

(2)双环醇对小鼠肝线粒体肿胀度的影响

雄性昆明种小鼠，体重22-24克，随机分为四组，每组10只。小鼠灌胃56°白酒10ml/kg 10天后，肝脏线粒体在高钙条件下肿胀度明显增大，而双环醇(200，300mg/kg)可使线粒体肿胀度明显降低，基本维持在正常水平，从而保证线粒体的正常功能。结果见图3

三.双环醇对小鼠慢性酒精性肝损伤的保护作用

实施例7双环醇对小鼠慢性酒精性肝损伤血清ALT升高的影响

雄性昆明种小鼠，体重22-24克，随机分为六组，每组10只。小鼠经5％酒精液体饮食喂养4周后，血清ALT水平明显上升。双环醇给药后，无论是治疗组(200mg和300mg/kg)还是预防组(200mg和300mg/kg)，ALT水平均恢复至正常水平，提示双环醇具有明显的抗酒精性肝损伤作用。结果见图4

实施例8双环醇对小鼠慢性酒精性肝损伤脂肪堆积的影响

小鼠经含酒精液体饮食喂养4周后，不仅出现肝脏TG含量显著上升，而且可见血清CHOL、LDL、HDL轻度升高。与模型组相比，给药组肝脏TG，血清CHOL、LDL水平显著下降，血清HDL水平显著升高，提示双环醇能有效防止酒精引起的脂肪堆积，加速脂肪转运。结果见图5

表5  双环醇对小鼠慢性酒精性肝损伤血清HDL，LDL and CHOL水

                          平的影响

  组别  HDL  (mmol/L)  LDL  (mmol/L)  CHOL  (mmol/L)  正常对照  乙醇  乙醇+双环醇   (200mg/kg，治疗)  乙醇+双环醇   (300mg/kg，治疗)  乙醇+双环醇   (200mg/kg，预防)  乙醇+双环醇   (300mg/kg，预防)  5.26±1.22  5.60±1.33   9.56±1.48^**    9.03±1.38^**  >**    10.54±1.27^**  0.92±0.18  1.16±0.36   0.84±0.21^*    0.83±0.30^*    0.68±0.26^**    0.76±0.19^**  2.61±0.34  2.98±0.52   2.22±0.64^**    2.43±0.39^*    2.15±0.43^**    2.38±0.39^** 

结果以均值±SD  M：乙醇T2/3：双环醇(200/300mg/kg)治疗

Y2/3：双环醇(200/300mg/kg)预防  ^*P＜0.05，^**P＜0.01，与模型组相比。

实施例9双环醇对小鼠肝脏抗氧化作用的影响

小鼠长期给予含酒精饮食后，不仅肝内GSH含量下降，而且GST和谷胱甘肽还原酶(GR)活性也明显降低。口服双环醇后，小鼠肝内GSH水平、GST活性恢复至正常水平，同时GR活性上升为对照组的1.2倍。上述结果提示，双环醇具有促进GSH再生，增强肝脏自由基清除能力的作用。结果见图6，7，8

实施例10双环醇对小鼠乙醇代谢酶的影响

酒精经微粒体乙醇氧化系统(MEOS)氧化代谢的量约占乙醇总摄入量的10％左右。此代谢过程产生的超氧阴离子，可在镁离子催化下生成羟基。现已证实，MEOS代谢酒精过程依赖细胞色素P4502E1。而实验动物长期饲以乙醇后，诱导P4502E1表达增强，可进一步导致脂质过氧化，加重肝损伤。

本实验通过测定NDMA-DH间接反应P4502E1活性。研究发现，双环醇能显著抑制长期摄入酒精引起的P4502E1的活性增加，使该酶维持在正常水平。

与急性酒精性肝损伤结果相似，双环醇能显著诱导ALDH活性，对胞浆ALDH活性诱导尤为明显(为模型组的2.9倍)，加速乙醛的清除，从而减轻由乙醛导致的肝损伤。此外，双环醇对ADH无影响。

表6  双环醇对小鼠慢性酒精性肝损伤血清ADH，ALDH水平的影响

  组别  ADH  (U/mg蛋白)  ALDH  (U/mg蛋白)    肝匀浆  正常对照  乙醇   乙醇+双环醇   (300mg/kg，预防)  7.42±1.73  6.17±1.04    6.95±1.32  8.79±0.88  9.02±0.96    10.73±1.65^**    胞浆     正常对照  乙醇   乙醇+双环醇   (300mg/kg，预防)  2.60±0.26  2.62±0.43    2.85±0.39  3.89±0.81  2.71±0.91#    8.09±1.33^**

结果以均值±SD

M：乙醇  T2/3：(200/300mg/kg)双环醇治疗，Y2/3：双环醇(200/300mg/kg)预防，##P＜0.01与对照组相比，^*P＜0.05，^**P＜0.01与模型组相比。

实施例11双环醇对慢性酒精性肝损伤病理学改变的保护作用

小鼠进食5％酒精液体饲料4周后可造成肝细胞脂肪变性，以小叶中央静脉肝细胞脂肪变最为严重。某些小叶中央静脉周围的肝细胞虽未发生脂肪变性，但肝细胞肿胀明显，胞浆疏松。此外，还观察到肝脏小静脉淤血等现象，但未见明显炎性细胞浸润及肝细胞坏死。双环醇给药后，肝细胞脂肪变性明显减轻，而且未出现肝细胞肿胀。

表7  环醇对小鼠慢性酒精性肝损伤病理指数改变的影响

组别                                病理指数

正常对照                            0.2±0.27

乙醇                                2.50±0.53##

乙醇+双环醇(300mg/kg，预防)         1.35±1.25^*

乙醇+双环醇(300mg/kg，)             0.65±0.53^**

结果以均值±SD

##P＜0.01与对照组相比，^*P＜0.05，^**P＜0.01与模型组相比。