一种蛋白质分离分析用微流控芯片及分离分析方法

摘要

一种蛋白质分离分析用微流控芯片，由四个基本单元构成，四个基本单元成对称分布；每个基本单元包括四个进样通道，四个基本单元只有一个共用的分离通道。在分离通道内进行蛋白质的筛分分离分析，蛋白质分离和蛋白质分子量测定的筛分介质选自聚乙二醇，甲基聚丙烯酰胺、葡聚糖、聚乙烯醇、线性丙烯酰胺、琼脂糖等；蛋白质分离后用激光诱导荧光检测，蛋白质用荧光染料进行标记。本发明方法提供的多通道微流控芯片平台上蛋白质快速分离和蛋白质分子量的测定技术十分简便有效。对小于100kD的蛋白质分子量的单次测定时间小于240秒，操作简便，通量和准确度高，检测限低。

说明书

技术领域：

本发明主要涉及在多通道蛋白质分离分析用微流控芯片平台上，采用无胶筛分分离体系实现多个蛋白质样品的快速分离和蛋白质分子量的测定。 

背景技术：

蛋白质组的研究是后基因组时代的基本任务之一。蛋白质组学研究的发展更多地依赖分析手段的发展，目前用于蛋白质分析的主要技术为二维凝胶电泳、计算机图象分析、蛋白质鉴定技术、高效液相色谱、毛细管电泳等。目前用于蛋白质分子量鉴定的主要技术为聚丙烯酰胺凝胶电泳，该方法虽然比较成熟，但由于不能实行自动化操作、以及由于技术本身的原因而不能进行高电场下的分析，制胶过程烦琐而耗时，对蛋白质的分子量测定需要多次灌胶多次电泳，整个分析过程烦琐而耗时，且检测限高。

蛋白质的无胶筛分的分离方法是根据蛋白质的分子量的大小进行分离，并且以LOG(蛋白质的分子量)与迁移时间做标准曲线，可以根据未知蛋白质的迁移时间求出该未知蛋白质的分子量。而蛋白质的无胶筛分技术也在毛细管电泳中应用，但是毛细管电泳分析时间较长，灵敏度、分离度偏低，一般能达到的塔板高度仅为10μm，而且毛细管电泳集成化困难，难以同时分析多个样品。

发明内容：

本发明的目的在于提供一种用于蛋白质快速分离和蛋白质分子量测定的多通道微流控芯片为操作平台，以无胶筛分介质为分离体系，以激光诱导荧光为检测手段，具有分离效率高、快速、简便、样品用量少、分析通量高及检测限低等特点。

本发明具体提供了一种蛋白质分离分析用微流控芯片，其特征在于：该芯片由四个基本单元构成，四个基本单元成对称分布；每个基本单元包括四个进样通道，四个基本单元只有一个共用的分离通道。因此，本发明只需要一个检测窗口，就可以同时连续分析十六个蛋白质样品。

本发明蛋白质分离分析用微流控芯片中，供蛋白质分析用微流控芯片材料可以为石英、玻璃、或者PMMA、PDMS聚合物。内表面最好是被修饰的。对于石英或者玻璃芯片可以进行静态修饰，即将有机聚合物或者蛋白质通过偶联剂键合在通道的表面，有机聚合物主要有聚乙烯醇、聚乙烯乙酸酯、羟乙烯纤维素、聚乙二醇、聚丙烯酰胺、聚糖等；或者进行动态修饰，即在缓冲液中加入添加剂，主要是表面活性剂，包括阴离子表面活性剂、阳离子表面活性剂及两性表面活性剂。对于塑料芯片进行表面修饰，包括等离子体处理、光照射处理的物理方法，或者亲水或者疏水性处理的化学方法。

本发明还提供了一种基于上述微流控芯片的蛋白质分离分析方法，在分离通道内进行蛋白质的筛分分离分析，蛋白质分离用无胶筛分介质可以采用常规的蛋白质筛分介质，如聚乙二醇，甲基聚丙烯酰胺，葡聚糖，聚乙烯醇，聚丙烯酰胺，琼脂糖等。该无胶筛分分离体系对蛋白质有很好的筛分效果，并且重复性好。

本发明提供的分离方法可以根据蛋白质的分子量的大小进行分离，并且以LOG(蛋白质的分子量)与迁移时间做标准曲线，可以根据未知蛋白质的迁移时间求出该未知蛋白质的分子量。

本发明提供的分离方法中蛋白质是用荧光染料标记的，荧光染料可以是共价标记型的，也可以是非共价标记型的。共价标记的染料主要有BODIPY系列，Cy系列，罗丹明系列和Alexa Fluor系列等。非共价标记的染料主要有Sypro Red，NanoOrange，Nile Red和MC 540等。

本发明方法提供的多通道微流控芯片平台上蛋白质快速分离和蛋白质分子量的测定技术十分简便有效。对小于100kD的蛋白质分子量的单次测定时间小于240秒，操作简便，通量和准确度高，检测限低。

附图说明：

图1为本发明的多通道蛋白质分离分析用微流控芯片结构图，图中S表示样品，B表示运行缓冲液，W表示废液，D表示检测点；

图2为微流控芯片无胶筛分分离蛋白质的电泳图谱，DYE为染料，LYS为溶菌酶，CA为碳酸酐酶，CO为鸡母鸡卵白蛋白，HAS为人血清白蛋白，CONA为伴清白蛋白，PB为磷酸化酶B；

图3为蛋白质LOG(蛋白质的分子量)与迁移时间的标准曲线图；

图4为微流控芯片无胶筛分分离蛋白质的重复性电泳图谱。

具体实施方式：

以微流控芯片单个基本单元中简单T字结构为例，微流控芯片按图1所示，材料为石英、玻璃、不同的有机材料如PMMA、PDMS等等。在微流控芯片的通道内充满无胶筛分分离缓冲液，在分离通道内进行蛋白质的筛分分离分析，筛分介质为各种形式的高分子化合物，如聚乙二醇，甲基聚丙烯酰胺，葡聚糖，聚乙烯醇，聚丙烯酰胺，琼脂糖等。当样品池和缓冲液池中插入铂电极，高压驱动样品池中的蛋白质进入分离通道内，不同的蛋白质根据大小实现分离。在分离通道内进行蛋白质的分离分析，需要进行各种形式的表面修饰，以防止蛋白质在通道内壁的吸附。修饰过程可以是任何形式的物理或者化学修饰。对于石英和玻璃芯片修饰方法主要有静态和动态两种修饰方法，静态修饰通常是指将一些有机聚合物或者某些蛋白质通过偶联剂键合在通道的表面，有机聚合物主要有聚乙烯醇、聚乙烯乙酸酯、羟乙烯纤维素、聚乙二醇、聚丙烯酰胺、聚糖等；蛋白质有牛血清白蛋白等。动态修饰重要是指在缓冲液中加一些添加剂，主要是一些表面活性剂，包括阴离子表面活性剂、阳离子表面活性剂及两性表面活性剂等。对于塑料芯片的表面修饰，主要是物理或者化学方法，物理方法有等离子体处理、光照射处理等，化学方法主要是根据材料的不同对通道表面进行亲水或者疏水性处理。

实施例1

以微流控芯片单个基本单元中简单T字结构为例，微流控芯片按图1所示，材料为自制的玻璃微流控芯片，通道尺寸为120μm×20μm，通道用线性聚丙烯酰胺进行修饰。该蛋白质分离分析的微流控芯片的进样通道为0.5厘米，分离通道为5厘米，运行缓冲液是一定浓度的葡聚糖和硼酸缓冲液。进样中进样电场为500V/cm，进样时间为30秒，分离电场为350V/cm，分离时间约为210秒，整个过程约为240秒。蛋白质标准为分子量从14.4kD到98.4kD的6种蛋白质，分别为溶菌酶(14.4kD)，碳酸酐酶(30kD)，鸡母鸡卵白蛋白(43kD)，人血清白蛋白(66kD)，伴清白蛋白(78kD)和磷酸化酶B(97.4kD)。蛋白质的总浓度为33μg/ml，蛋白质用SDS和β-ME混合100℃加热变性10min。激光诱导荧光检测，所用染料是BODIPY530-550，SE，激光波长532nm，得到的微流控芯片无胶筛分分离蛋白质的电泳图谱如图2所示。根据微流控芯片无胶筛分分离蛋白质的电泳图谱，得到蛋白质LOG(蛋白质的分子量)与迁移时间的标准曲线如图3所示，回归性系数R²＞99％。

实施例2

以微流控芯片单个基本单元中简单T字结构为例，微流控芯片按图1所示，材料为自制的玻璃微流控芯片，通道尺寸为120μm×20μm，通道用线性聚丙烯酰胺进行修饰。该蛋白质分离分析的微流控芯片的进样通道为0.5厘米，分离通道为5厘米，运行缓冲液是一定浓度的葡聚糖和硼酸缓冲液。整个分离过程中进样电场为500V/cm，进样时间为30秒，分离电场为350V/cm，分离时间约为210秒，整个过程约为240秒。蛋白质标准为分子量从14.4kD到97.4kD的6种蛋白质，分别为溶菌酶(14.4kD)，碳酸酐酶(30kD)，鸡母鸡卵白蛋白(43kD)，人血清白蛋白(66kD)，伴清白蛋白(78kD)和磷酸化酶B(97.4kD)。蛋白质的总浓度为33μg/ml，蛋白质用SDS和β-ME混合100℃加热变性10min。激光诱导荧光检测，所用染料是BODIPY 530-550，SE，激光波长532nm。进行重复性实验，重复次数为6，每次运行后用水冲洗5min，得到相对标准偏差＜0.5％，得到的微流控芯片无胶筛分分离蛋白质的重复性电泳图谱如图4所示，图中1、染料；2、溶菌酶；3、碳酸酐酶；4、鸡卵白蛋白；5、人血清白蛋白；6、伴清白蛋白；7、磷酸化酶B。