食品微生物学能力验证菌落总数样品及其制备方法

摘要

食品微生物学能力验证菌落总数样品，涉及微生物学检测方面的质量控制的技术领域，样品为基质中添加有主导菌蜡样芽胞杆菌和背景菌，其中基质为食品实物，背景菌为粘质沙雷氏菌、弗氏枸橼酸杆菌、产气肠杆菌和大肠埃希氏菌中的一种或多种。本发明样品菌落总数含量均匀，样品制法成功率高，制得的样品具有较好的均匀性和稳定性，可用于国内和国际实验室间菌落总数测试项目的能力验证活动。同时该能力验证样品也可用于检测方法的验证、测试仪器的校准、测试结果的质量控制与考核等。

说明书

技术领域：

本发明涉及微生物学检测方面的质量控制领域，尤其涉及微生物学能力验证样品，及其样品的制备方法。

背景技术：

在WTO与APEC致力于国际贸易自由化的趋势下，测试结果的溯源性与可比性愈来愈受关注。近年来，由于各国政府的重视和市场需求的增长，国际上能力验证活动的规模和领域发展很快，能力验证在政府监督管理、实验室认可、工业产品质量管理等领域都得到了广泛的应用。能力验证已经成为国际间实验室互认的重要条件。另一方面，随着全球经济一体化程度的提高，能力验证工作越来越趋向于规范化、标准化、国际化。因此，能力验证在消除技术性障碍的符合性评定中扮演着重要角色。参加国际间能力验证有助于实验室的客户、官方机构和认可组织了解和检验实验室的测量能力和水平，也有助于实验室了解自身的不足，从而采取相应的纠正措施，为实验室测量结果取得国际间相互承认打下良好的基础。

在能力验证活动中，不能由于样品的均匀性、稳定性等因素的影响而导致参试实验室的结果产生差异，从而得出对实验室结果的不恰当结论。由于食品微生物学检验领域的特殊性，食品微生物学能力验证尚未有高可信度、大规模的微生物能力验证样品，国外也未系统地举办大规模的国际间食品微生物学能力验证，总体而言，在能力验证的微生物学样品的制备方面等方面均无详尽的文献报道。

微生物样品形式多样，微生物样品中含有活的微生物，而该活的微生物易发生变化(繁殖和死亡等)，导致样品的保存期短，样品的均匀性和稳定性很差，样品的均匀性和稳定性仍是普遍存在的问题，也是制约国际间食品微生物学能力验证开展的主要因素。国外菌落总数测试项目大多采用冷冻的形式，对运输条件要求特别高(低温运输)，运输保存期限也特别短(一般为4天)，曾有两个国外著名的食品实验室申请承办APLAC食品微生物学能力验证，但终因样品的均匀性和稳定性等原因不能适应国外参试实验室的要求而无法进行。菌落总数样品制备的工艺技术要求比较高，并且样品的均匀性和稳定性与冻干的菌种、冻干的工艺条件、冻干保护剂的使用、再水化的介质等均有密切的关系。许多因素都是未知的，是亟待研究和解决的课题。

食品中菌落总数的多少，直接反映着食品的卫生质量。如果食品中菌落总数多于10万个，就足以引起细菌性食物中毒；食品的变质反映与菌落总数的增多有一定联系，从食品卫生观点来看，食品中菌落总数越多，说明食品质量越差，也就应考虑到病原菌污染的可能性愈大；当菌落总数仅少量存在时，则病原菌污染的可能性就会降低，或者几乎不存在。但由于在菌落总数检测项目上无标准物质，这就造成菌落总数检验的随意性和不确定性，实验室间的检验结果差别较大，而人们对食品的安全卫生特别重视，食品卫生指标尤其是微生物的检测就显得特别重要，同时，检测结果的国际间互认，实验室认可的要求和食品贸易的要求等使国际间食品微生物学能力验证具有特殊重要的意义。

发明内容：

本发明的目的是克服菌落总数测定样品中总的活的细菌数目在运输、储存和测试等过程中菌落数都可发生变化的问题，提供一种食品微生物学能力验证菌落总数样品，均匀性、稳定性符合能力验证要求，另外还提供该样品的制备方法，工艺简单，成功率高。

本发明为实现上述目的所采用的技术方案是：食品微生物学能力验证菌落总数样品，基质中添加有主导菌蜡样芽胞杆菌Bacilluscereus和混合背景菌，其中基质为模拟食品实物，混合背景菌由粘质沙雷氏菌Serratia marcescens，弗氏枸橼酸杆菌Citrobacterfreundii，产气肠杆菌Enterobacter aerogenes，大肠埃希氏菌E.coli组成。

所述样品以谷氨酸钠和海藻糖为基质，基质中添加主导菌10³～10⁴cfu/mL和背景菌10³cfu/mL。 

所述基质为谷氨酸钠8％和海藻糖4.8％混合物。

本发明食品微生物学能力验证菌落总数样品的制备方法包括如下步骤：

菌株复苏传代过程、增菌过程、菌悬液配制过程、冻干和包装过程、储存过程，经稳定性试验和均匀性试验，检查样品的均匀性和稳定性。

a.菌株复苏传代过程

将标准菌株加入到营养肉汤或营养琼脂斜面培养基中，在36±1℃下使其复苏和生长，并对复苏的菌株进行鉴定。

b.增菌过程

当单一的活菌株在适宜的条件下生长，当主导菌蜡样芽胞杆菌培养至稳定期，其它背景菌培养至对数生长期末后离心分离，得到含有相应单一菌种的菌泥。

c.菌悬液配制过程

将上一过程得到的菌泥与基质混合，基质为：4.8％海藻糖+8％谷氨酸钠，以基质为溶剂，根据样品制备的最终要求不同，将分别含有主导菌或背景菌的多个菌悬液按不同比例充分混合，得到混合菌悬液，在不断搅拌分装到样品瓶(西林瓶)中，加上瓶塞，但要留有空隙，不要盖实。

d.冻干和包装过程

将装有混合菌悬液的样品瓶开盖放入冻干机中，冷冻干燥整个过程25～35个小时。当样品冷冻干燥结束后，直接进行箱内加塞；关闭机器，西林瓶中样品为真空状态。

e.储存过程

将样品放置在4～8℃条件下避光保存，从全部样品中随机挑选样品发放给参试实验室或进行均匀性和稳定性试验。

f.样品的均匀性和稳定性试验

对样品中目标菌的均匀性和稳定性进行检查。检查样品均匀性和稳定性采用了被广泛接受的相关文献中提出的方法[J.AOACInternational，1993，76(4)：926-940]。

本发明菌种的选择：采用无毒的蜡样芽胞杆菌作为样品中的主导菌，该菌株为治疗人类和动物腹泻的微生态制剂的生产菌株，也是食品中的常见污染菌，该菌在恶劣环境下易生存，在22～37℃培养条件下或在不同的非选择培养基上菌落总数结果不会有明显的统计学上差异，所以比较适合用于国际实验室间食品中菌落总数的能力验证；采用的背景菌：粘质沙雷氏菌Serratia marcescens，弗氏枸橼酸杆菌Citrobacter freundii，产气肠杆菌Enterobacteraerogenes，大肠埃希氏菌E.coli；样品中蜡样芽胞杆菌的活菌数量高于其它菌尤其是大肠菌群和粪大肠菌群的一类细菌，如果在运输或储存过程中大肠菌群或粪大肠菌群的含量发生变化，以至于不会影响菌落总数的结果。

本发明的菌落总数能力验证样品有着其特殊性(①活的微生物、②数量不发生变化、③生化特征不发生变异)和满足特殊运输的条件着手，通过特殊工艺的研究、稳定性和均匀性的研究等形成一套完善的能力验证的样品制备技术，获得适合国际实验室间能力验证要求的菌落总数样品，成功实施国际间菌落总数能力验证，正确评价能力验证结果。同时，填补我国认证认可机构在这一方面的空白。也为亚太实验室认可合作组织(APLAC)等国际区域性合作组织提供菌落总数能力验证样品，并承担其能力验证(APLAC在食品微生物学能力验证方面是空白)。这对加快我国认证认可工作国际化步伐、消除技术性壁垒、促进我国对外贸易发展，加强与亚太地区的经济合作等将产生积极重大的推动作用。

附图说明：

图1为本发明工艺流程图。

图2为本发明稳定性试验结果图。

具体实施方式：

实施例1：

a菌株复苏传代过程

所有标准菌株均购于政府指定的机构，并附有菌株证书，保证了菌株的溯源性。将标准菌株加入到营养肉汤中，保持温度36℃使其复苏和生长，并对复苏的菌株进行鉴定。

b增菌过程

复苏后单一的活菌株在营养丰富的肉汤中生长，当生长到一定程度后离心分离，得到含有相应单一菌种的菌泥。

主导菌蜡样芽胞杆菌培养至稳定期，其它背景菌培养至对数生长期末。

c菌悬液配制过程

将上一过程得到的菌泥与基质混合，基质浓度为：4.8％海藻糖+8％谷氨酸钠，在该过程中，为保证得到的最终样品中含有设计量的菌株——主导菌10⁴cfu/重组样品、背景菌10³cfu/重组样品，在配制含有每个菌株的菌悬液后，采用了比浊法检查了菌株含量，即按主导菌的浓度10⁶～10⁷cfu/mL和背景菌10⁶cfu/mL配置菌悬液，将含有背景菌的4个菌悬液按1∶1体积比例混合后形成背景菌混悬液，再与主导菌按1∶1体积比例充分混合得到混合菌悬液，在不断搅拌下取1.0mL分装到样品瓶(西林瓶)中。

d冻干和包装过程

将装有混合菌悬液的样品瓶开盖放入冻干机中，冷冻干燥。

冷冻干燥机参数设置如下：

冷冻速度(Cooling Rate)0.5℃/min

早期冷冻点(Incipient Freezing Point)-1℃  15min

冷冻温度(Cooling temperature)-40℃

共熔点(Melting Point Eutectic temperature)-29℃

加热温度(Heating temperature)20℃  120min

冷冻干燥过程：将分装好的西林瓶上放置塞子(不要塞紧)，启动冷冻干燥机，机器直接进入程序化的冷冻干燥过程，整个冻干过程25～35个小时。

当样品冷冻干燥结束后，直接进行箱内加塞；关闭机器。剔除塞子不紧的西林瓶，西林瓶中样品为真空状态。

e储存过程

将样品放置在一定的环境条件下保存，并对保存的样品进行适当管理和检测。根据食品微生物学样品的特点，一般要求在4℃的温度下避光保存。

f、样品的均匀性和稳定性试验：

对样品中目标菌的均匀性和稳定性检查是验证样品制备过程有效性的主要方法。检查样品均匀性和稳定性采用了被广泛接受的相关文献中提出的方法[J.AOAC International，1993，76(4)：926-940]。

实施例2

按照实施例1相同的制备方法，制备食品微生物学菌落总数能力验证样品，其中，菌株培养基选用营养琼脂斜面培养基，基质样品相同，样品中主导菌8×10⁴cfu/重组样品、背景菌2×10³cfu/重组样品，最终经均匀性和稳定性试验得能力验证样品。

实施例3

按照实施例1相同的制备方法，制备食品微生物学菌落总数能力验证样品，其中，菌株培养基选用营养琼脂斜面培养基，基质样品相同，样品中主导菌5×10⁴cfu/重组样品、背景菌6×10³cfu/重组样品，最终经均匀性和稳定性试验得能力验证样品。

所得样品均匀性和稳定性检测方法及结果如下：

分别随机选取16个样品，采用AOAC 990.12菌落总数测试方法，在重复条件测试2×16份样品的菌落总数。结果数据用单因素方差分析(ANOV)进行统计处理，统计步骤及结果如下：

方差分析公式

$>>C>=>>>(>>>\Sigma >i>>>>\Sigma >j>{}_{}$

  样品编号  结果1  结果2    结果对数变换(log₁₀cfu/mL)    结果1    结果2  1  7600  7300    3.88    3.86  2  7500  7800    3.88    3.89  3  8500  8700    3.93    3.94  4  8500  8200    3.93    3.91  5  9400  9000    3.97    3.95  6  9900  9500    4.00    3.98  7  9700  8600    3.99    3.93  8  7600  7700    3.88    3.89  9  10000  8100    4.00    3.91  10  9000  7500    3.95    3.88  11  8000  9400    3.90    3.97  12  11000  8100    4.04    3.91  13  8900  7500    3.95    3.88  14  8700  8200    3.94    3.91  15  7000  6900    3.85    3.84  16  9800  8400    3.99    3.92

样品均匀性试验方差分析结果

变异来源自由度，v离均差平方和，SS    均方，MS  F值样品间150.04923    0.0033  2.01分  析160.02615    0.0016

按α＝0.05，v1＝15，v2＝16查附表，F临界值＝2.35＞2.01，表明样品间没有显著性差异，能够满足水平测试的要求。

同样采用两种类型的稳定性试验：一种是在贮存温度(4℃)下的稳定性试验，随机取样品12份，每个星期检测1份，共计12个星期；另一种是在高的温度(模拟样品的运输条件)下的稳定性试验，选用三个温度，分别为20℃、37℃和45℃。在20℃条件下每个样品取14份，每3天检测1份共计42天，37℃条件下每个样品10份，每3天检测1份共计30天，45℃条件下每个样品7份，每3天检测1份共计21天，测试结果见图2。

图2中画出平均值线及±2S区间线。由图2中可以看出，该样品在4℃条件下12个星期内菌落总数随时间变化的曲线无明显上升或下降的趋势，即观察值在测定方法的随机误差范围内的时间期限是稳定的。